Name: Zoptymalizowana procedura sortowania komórek aktywowanych fluorescencją (FACS) izolacji autonomicznych progenitorów nerwowych z narządów trzewnych płodów myszy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-08-17T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 7 s
Description: Naucz się izolować progenitory nerwowe z tkanek płodowych myszy za pomocą FACS. Ta metoda umożliwia badanie ekspresji genów w różnych populacjach komórkowych i etapach rozwoju.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy chcieliby podziękować Catherine Alford za sugestie dotyczące metod dysocjacji komórek, a Kevinowi Wellerowi, Davidowi Flaherty'emu i Brittany Matlock z Flow Cytometry Shared Resource w Vanderbilt University Medical Center za wsparcie, oraz Melissie A. Musser za pomoc artystyczną przy ilustracjach. Dziękujemy dr. Jackowi Mosherowi i dr. Seanowi Morrisonowi za porady w zakresie wdrażania izolacji progenitorów neuronalnych. VMC Flow Cytometry Shared Resource jest wspierane przez Vanderbilt Ingram Cancer Center (P30 CA68485) oraz Vanderbilt Digestive Disease Research Center (P30 DK058404). Praca ta była finansowana z grantów US National Institutes of Health DK064251, DK086594 oraz DK070219.

1. Przygotowanie pożywek (wszystkie etapy wykonane w komorze z laminarnym przepływem powietrza)
<ol>
 <li>Połączyć następujące składniki: 44 ml pożywki L-15, 0,5 ml 100X penicyliny/streptomycyny (P/S), 0,5 ml 100 mg/ml albuminy surowicy bydlęcej (BSA), 0,5 ml 1M HEPES, 5 ml wody jakości do hodowli tkankowych. Przed dodaniem należy dokładnie wymieszać BSA i P/S. Ta objętość powinna być wystarczająca do dysocjacji do pięciu różnych typów tkanek. Pożywka ta zostanie wykorzystana w kroku 3.4 do przygotowania roztworów gaszących używanych po enzymatycznej dysocjacji tkanki.</li>
 <li>Przefiltrować pożywkę przez filtr polietersulfonowy (PES) 0,22 μm.</li>
 <li>Przygotować 1X zrównoważony roztwór soli Hanksa (HBSS) oraz 1X roztwór soli fizjologicznej z buforem fosforanowym (PBS) z roztworów stokowych 10X, używając wody jakości do hodowli tkankowych. Przefiltrować przez filtr PES 0,22 μm. Duże objętości tych odczynników można przygotować wcześniej i przechowywać w temperaturze 4 °C, rozdzielając mniejsze objętości w komorze do hodowli tkankowych w razie potrzeby.</li>
 <li>Napełnić kilka stożkowych probówek 15 ml roztworem 1X HBSS (liczba probówek powinna odpowiadać liczbie tkanek przeznaczonych do dalszej dysekcji), utrzymując probówki w lodzie.</li>
</ol>
2. Disekcja
<ol>
 <li>Uśmierć mysz w określonym dniu ciąży zgodnie z protokołami zatwierdzonymi przez instytucjonalną komisję ds. opieki i wykorzystania zwierząt, a następnie przenieś macicę do szalki Petriego o średnicy 60 lub 100 mm zawierającej lodowaty 1X PBS.</li>
 <li>Wyjmij zarodki z macicy i uśmierć je poprzez dekapitację w lodowatym 1X PBS. Przesiewaj je pojedynczo pod oświetleniem fluorescencyjnym, dzieląc na grupy zarodków transgenicznych dodatnich oraz nienależących do transgenicznych typu dzikiego (WT). Przez cały czas trwania sekcji utrzymuj zarodki w lodowatym 1X PBS.</li>
 <li>Pod mikroskopem stereoskopowym przeprowadź precyzyjną sekcję układu moczowo-płciowego. Przytrzymaj zarodek pęsetą na poziomie przedniej kończyny. Usuń wnętrzności od wątroby w dół do guzka narządów płciowych, wprowadzając pęsetę na poziomie przepony, a następnie gwałtownie pociągnij organy wewnętrzne w dół i z dala od grzbietowej ściany ciała.</li>
 <li>Dalej wycinaj interesującą tkankę z otaczających ją tkanek (Rycina 1). Umieść każdy rodzaj wyizolowanej tkanki w stożkowej probówce 15 ml zawierającej lodowaty 1X HBSS. Grupuj poszczególne rodzaje tkanek zgodnie z fenotypem zarodka (t.j. wszystkie próbki jelita płodowego GFP+ zostają zgrupowane w jednej stożkowej probówce 15 ml).</li>
 <li>Równolegle wyizoluj porównywalne tkanki z zarodków typu dzikiego, aby wykorzystać je jako kontrole kompensacyjne w cytometrii przepływowej.</li>
</ol>
3. Dysocjacja podsekcjonowanych tkanek
<ol>
 <li>Odwirować sub-dydsekcjonowaną tkankę przy użyciu siły odśrodkowej 210 rcf, 4 °C przez 5 min. Po wirowaniu odessać jak największą ilość HBSS.</li>
 <li>Resuspendować osad tkankowy w roztworze Accumax (Innovative Cell Technologies, Inc), pamiętając o zmianie końcówek pipety między każdą próbką, aby uniknąć kontaminacji krzyżowej typów tkanek. Ilość dodawanego Accumax można dostosować do większej lub mniejszej ilości tkanki. Zazwyczaj dla 1-5 próbek jelita płodowego stosuje się 1 ml Accumax, jednak większe pule tkankowe będą wymagać większej objętości w celu uzyskania dysocjacji.</li>
 <li>Umieścić probówki w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C na 20-45 min, w zależności od stadium izolowanej tkanki (np. jelito 13,5 dpc 20 min, jelito 15,5 dpc 35 min). W połowie czasu dysocjacji rozbić tkankę mechanicznie, uderzając probówką o ściankę łaźni wodnej (lub dowolną twardą powierzchnię) oraz poprzez „strząsanie” probówki (podobnie jak w przypadku starego termometru rtęciowego). Po zakończeniu czasu dysocjacji powtórzyć procedurę strząsania wielokrotnie, aby dalej dysocjować próbkę. W przypadku próbek bardziej delikatnych należy zmniejszyć intensywność strząsania i zamiast tego zastosować tryturację pipetą w kroku 3.5, aby uzyskać odpowiedni stopień dysocjacji. Typowe czasy dysocjacji dla LUT 14,5 dpc i 15,5 dpc wynoszą odpowiednio 35 i 45 min.</li>
 <li>Podczas inkubacji tkanki w Accumax przygotować roztwory wygaszające, nazwane Quench oraz Quench 1:5. Roztwór Quench przygotowuje się poprzez dodanie 45 μl DNase I (5 mg/ml) do 6 ml Medium L-15. Roztwór Quench 1:5 przygotowuje się poprzez dodanie 45 μl DNase I (5 mg/ml) do 30 ml Medium L-15.</li>
 <li>Po zakończeniu dysocjacji przenieść probówki 15 ml na lód i natychmiast dodać 1 ml Quench do każdej probówki. Tryturować każdą próbkę góra-dół, aż tkanka zostanie niemal całkowicie zdysocjowana (Ryc. 2). W roztworze nadal będą obecne niewielkie fragmenty tkanki. Uzyskanie całkowicie homogenicznej próbki nie jest łatwo osiągalne ani pożądane, ponieważ może to prowadzić do obniżenia żywotności komórek.</li>
 <li>Przez resztę protokołu przechowywać próbkę na lodzie tak długo, jak to możliwe. Należy używać nowej końcówki pipety podczas pobierania Quench lub Quench 1:5, aby uniknąć kontaminacji krzyżowej próbek.</li>
</ol>
4. Filtrowanie zawiesiny komórkowej
<ol>
 <li>Używając pęsety namoczonej w 70% etanolu, umieść kwadrat o boku 3 cm membrany z nylonowej siatki o wielkości oczek 38 μm (Sefar America) nad wlotem nowej probówki stożkowej o pojemności 15 ml. Przefiltruj komórki przez siatkę, pipetując zawiesinę do środka membrany za pomocą końcówek o wąskim światle. Jeśli membrana nasyci się podczas filtrowania, należy ją usunąć, osuszyć wlot probówki chusteczką typu kimwipe i użyć nowego kawałka nylonowej siatki do przefiltrowania pozostałej części zawiesiny komórkowej. Po przefiltrowaniu wszystkich komórek użyj 1 ml roztworu Quench 1:5, aby wypłukać probówkę i przefiltrować wszelkie pozostałe komórki.</li>
 <li>Po zakończeniu filtrowania lub podczas wymiany zapchanej membrany, użyj pęsety, aby zwinąć boki siatki i przetrzyj membraną górną krawędź probówki, aby usunąć wiszące krople z komórkami.</li>
 <li>Zcentryfuguj zawiesinę komórkową w celu uzyskania osadu przy 210 rcf, 4 °C przez 5 min. Odessaj nadsącz i resuspenduj osad w 1 ml roztworu Quench 1:5.</li>
 <li>Przefiltruj zawiesinę komórkową przez nylonową siatkę do polistyrenowych probówek o pojemności 5 ml. Wypłucz probówkę 15 ml za pomocą 1 ml roztworu Quench 1:5 i przefiltruj, aby odzyskać wszystkie pozostałe komórki.</li>
</ol>
5. Przygotowanie próbek do FACS
<ol>
 <li>W przypadku wykorzystania tej samej tkanki do sortowania oraz do kontroli kompensacji, przenieś 1/10th do 1/20th objętości próbki do nowej polistyrenowej probówki o pojemności 5 ml, która zostanie wykorzystana do kontroli kompensacji. Próbkę tkanki typu dzikiego należy podzielić na dwie części. Jedna część będzie stanowić niebarwioną próbkę typu dzikiego (tylko WT), natomiast do drugiej połowy należy dodać 7-aminoaktynominę D (7-AAD, fluorescencyjny interkalator wykluczany z żywych komórek, stosowany jako „barwnik żywotności”) (tylko 7-AAD). Poszczególne kontrole te są niezbędne, aby umożliwić kompensację wszelkich nakładek widmowych między emisjami poszczególnych fluoroforów w sorterze przepływowym. Na przykład w przypadku pojedynczego reportera fluorescencyjnego, takiego jak EGFP, niezbędne kontrole obejmowałyby: tylko EGFP, niebarwione komórki WT oraz probówkę zbarwioną tylko 7-AAD. (Rysunek 3).</li>
 <li>Napełnić wszystkie probówki o pojemności 5 ml zawierające zawiesinę komórek roztworem Quench 1:5 i odwirować przy 210 rcf, 4 °C przez 5 min. Odessać nadsącz, pozostawiając około 200 μl cieczy w probówce.</li>
 <li>Rozcieńczyć 7-AAD w stosunku 1:1000 w roztworze Quench w stosunku 1:5. Dodać rozcieńczenie barwiące 7-AAD do kontroli kompensacji zawierającej tylko 7-AAD oraz do próbek przeznaczonych do sortowania. Nie dodawać 7-AAD do kontroli kompensacji zawierających tylko EGFP lub tylko WT. Objętość dodawanego 7-AAD będzie zależeć od ilości materiału wyjściowego i wielkości otrzymanego osadu komórkowego. Po dodaniu 7-AAD do odpowiednich probówek próbki są gotowe do sortowania.
 <table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Tkanka</td>
 <td>Wielkość puli próbek</td>
 <td>Objętość 7-AAD do dodania do probówki*</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Jelito w 15,5 dniu ciąży (dpc)</td>
 <td>1-5</td>
 <td>200 μl</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>15,5 dpc LUT</td>
 <td>1-5</td>
 <td>150 μl</td>
 </tr>
 </tbody>
 </table>
 
 Tabela 1. Ilość 7-AAD dodana do różnych dysocjatów tkankowych * Końcowa całkowita ilość w każdej probówce będzie różnić się o wartość w zakresie 50-100 μl Ponieważ odsysanie medium jest procesem przybliżonym i wykonuje się je w celu uniknięcia usunięcia osadu, objętości końcowe nie są mierzone, aby zminimalizować manipulacje komórkami w roztworze.</li>
 <li>Przygotować probówki do zbierania komórek na potrzeby izolacji RNA, dodając 0,75 ml TRIzol-LS do probówek do mikrocentryfugi o pojemności 1,5 ml.</li>
 <li>W przypadku zbierania komórek do in vitro zamiast izolacji RNA, należy sortować komórki bezpośrednio do pożywki do samoodnowy w 6-dołkowych płytkach hodowlanych, pokrytych fibronektyną i wypełnionych pożywką zgodnie z wcześniejszym opisem.2,6,7</li>
</ol>
6. Cytometria przepływowa
<ol>
 <li>Na cytometrze przepływowym należy w pierwszej kolejności ocenić kontrole kompensacji, pamiętając o płukaniu wstecznym pomiędzy każdą próbką, aby uniknąć kontaminacji. Profile próbek kompensacyjnych należy wykorzystać do ustawienia napięć/bramek do sortowania. Należy zauważyć, że jeśli w pożądanej tkance komórki pozytywne występują w ograniczonej liczbie, do ustalenia ustawień kompensacji można użyć innej tkanki, pod warunkiem, że intensywność fluorescencji i wielkość komórek w próbkach są porównywalne.</li>
 <li>Należy ustawić parametry kompensacji oraz bramki tak, aby wykluczyć martwe komórki pochłaniające barwnik 7-AAD i zebrać komórki wykazujące wysoką intensywność fluorescencji GFP w stosunku do niebarwionych kontroli (Rysunek 4).</li>
 <li>Do każdej probówki do mikrocentryfugi należy posortować maksymalnie 25 000 komórek. Sortowanie powinno być przeprowadzane przy jak najniższym ciśnieniu, z dyszą o szerokim prześwicie i niskim przepływie (np. 17 psi, dysza 100 μm, 3 000 zdarzeń/s), aby zachować żywotność progenitorów neuronalnych. W celu izolacji komórek EGFP+ przeprowadzamy izolacje na urządzeniu BD Biosciences FACSAriaII, używając lasera 488 nm 20 mW do wzbudzenia reportera EGFP.</li>
 <li>Jeśli próbki zawierają wysokie stężenia komórek, zaleca się dalsze rozcieńczenie zawiesiny komórkowej przy użyciu barwnika 7-AAD w stosunku 1:1000, aby uzyskać wyższą wydajność przechwytywania podczas sortowania.</li>
 <li>Każdą probówkę z komórkami przechwyconymi w TRIzol-LS należy wymieszać na wortexie niezwłocznie po sortowaniu.</li>
</ol>
7. Reprezentatywne wyniki
Dysocjacja tkanek w celu przygotowania zawiesiny komórek do sortowania przepływowego wymaga precyzyjnego zrównoważenia odpowiedniego trawienia enzymatycznego i unikania nadmiernej dysocjacji, która może prowadzić do niskiej żywotności komórek. Przykład pożądanego poziomu dysocjacji tkanki przedstawiono na Rysunku 2. W tkance poddanej odpowiedniemu trawieniu, przed manualną tryturacją, fragmenty podsekcjonowanych organów są wciąż wyraźnie widoczne (Rysunek 2b, 2f). W tkankach traktowanych enzymatycznie przez zbyt długi czas lub przy zbyt wysokim stężeniu enzymu, w otrzymanej zawiesinie brak jest wszelkich pozostałych dużych fragmentów tkanki (Rysunek 2d, 2h).
Odpowiednia dysocjacja i filtrowanie ręczne pozwalają na uzyskanie profili sortowania w cytometrii przepływowej, które zazwyczaj wykazują ponad 90% żywotnych komórek i wysoki poziom ekspresji EGFP (Rycina 4). Populacje komórek uzyskane tą metodą cechują się dobrą żywotnością i mogą zostać wyizolowane do dalszej hodowli lub analizy ekspresji genów poprzez bramkowanie w celu przechwycenia neuronalnych progenitorów EGFP+.
<img alt="Obrazy z mikroskopu fluorescencyjnego anatomii owada z zaznaczonymi tkankami: przednia, nerka, pęcherz." src="/files/ftp_upload/4188/4188fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1. Rozkład neuronalnych progenitorów TH-EGFP+ w płodowym LUT myszy. Cały układ moczowo-płciowy w 15,5 dpc widziany od strony brzusznej w oświetleniu w polu jasnym (a) w porównaniu z rozkładem komórek EGFP+ znakowanych przez ekspresję transgenu TH-EGFP zidentyfikowanych w oświetleniu fluorescencyjnym (b). Ekspresja TH-EGFP występuje w nadnerczach (a) oraz położonych pośrodkowo zwojach trzewnych (cg). Widok boczny (c) wypreparowanego pęcherza w 15,5 dpc wykazuje fluorescencję z ekspresji transgenu w zwojach miednicznych (pg), ścianie pęcherza (bla) i cewce moczowej (u). W widoku grzbietowym (d) komórki EGFP+ są widoczne w przedniej części grzbietowej cewki moczowej. Pozostałe oznaczenia: nerki (k), jądra (t), pęcherz (bla) i guzek płciowy (gt).
<img alt="Obraz mikroskopowy rozwijających się embrionów nicieni, ukazujący stadia i wzorce w badaniu embriogenezy." src="/files/ftp_upload/4188/4188fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2. Obrazy w świetle przechodzącym płodowego LUT w 15 dpc (a) oraz jelita (e), odpowiednio obrazowane w połowie okresu inkubacji dysocjacyjnej, na koniec inkubacji dysocjacyjnej przed rozbiciem (b, f), po manualnym rozbiciu (c, g) oraz w próbce nadmiernie dysocjowanej (d, h).
<img alt="Schemat tkanek transgenicznych, EGFP+7AAD, kontrole kompensacji, pobieranie próbek eksperymentalnych." src="/files/ftp_upload/4188/4188fig3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3. Schemat ilustrujący kontrole kompensacji niezbędne do ustalenia rygorystycznych parametrów bramkowania FACS.
<img alt="Wykresy cytometrii przepływowej przedstawiające fluorescencję GFP, żywotność oraz wyselekcjonowane populacje EGFP+ w 14. i 15. dniu po poczęciu (dpc)." src="/files/ftp_upload/4188/4188fig4.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 4"> 
Rysunek 4. Reprezentatywny obraz profili sortowania przepływowego w 14,5 dpc (a) i 15,5 dpc (b). Populacja czarna składa się z pojedynczych komórek, określonych na podstawie rozproszenia światła przedniego i bocznego, które są martwe i znakowane fluorescencją 7-AAD. Populacja szara składa się z pojedynczych komórek, określonych na podstawie rozproszenia światła przedniego i bocznego, które nie przyjęły 7-AAD, a zatem są żywotne. Zielona wyselekcjonowana populacja jest wskazana obramowanym obszarem „GFP+” i składa się z pojedynczych komórek, które nie przyjęły 7-AAD (żywotne) i wykazują fluorescencję EGFP.

<ol><li>Gong, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+gene+expression+atlas+of+the+central+nervous+system+based+on+bacterial+artificial+chromosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A gene expression atlas of the central nervous system based on bacterial artificial chromosomes.</a> Nature. 425, 917-925 (2003).</li>
<li>Morrison, S. J., White, P. M., Zock, C., Anderson, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prospective+identification%2C+isolation+by+flow+cytometry%2C+and+in+vivo+self-renewal+of+multipotent+mammalian+neural+crest+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Prospective identification, isolation by flow cytometry, and in vivo self-renewal of multipotent mammalian neural crest stem cells.</a> Cell. 96, 737-749 (1999).</li>
<li>Kruger, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+crest+stem+cells+persist+in+the+adult+gut+but+undergo+changes+in+self-renewal%2C+neuronal+subtype+potential%2C+and+factor+responsiveness%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Neural crest stem cells persist in the adult gut but undergo changes in self-renewal, neuronal subtype potential, and factor responsiveness.</a> Neuron. 35, 657-669 (2002).</li>
<li>Bixby, S., Kruger, G. M., Mosher, J. T., Joseph, N. M., Morrison, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-intrinsic+differences+between+stem+cells+from+different+regions+of+the+peripheral+nervous+system+regulate+the+generation+of+neural+diversity%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Cell-intrinsic differences between stem cells from different regions of the peripheral nervous system regulate the generation of neural diversity.</a> Neuron. 35, 643-656 (2002).</li>
<li>Walters, L. C., Cantrell, V. A., Weller, K. P., Mosher, J. T., Southard-Smith, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+background+impacts+developmental+potential+of+enteric+neural+crest-derived+progenitors+in+the+Sox10Dom+model+of+Hirschsprung+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Molecular+Genetics%22%5BJournal%5D)">Genetic background impacts developmental potential of enteric neural crest-derived progenitors in the Sox10Dom model of Hirschsprung disease.</a> Human Molecular Genetics. , (2010).</li>
<li>Corpening, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+live+imaging+of+enteric+progenitors+based+on+Sox10-Histone2BVenus+transgene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">Isolation and live imaging of enteric progenitors based on Sox10-Histone2BVenus transgene expression.</a> Genesis. 49, 599-618 (2011).</li>
<li>Morrison, S. J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMorrison%2C+SJ+%22Isolation+of+fetal+rat+neural+crest+stem+cells+%28NCSC%29+from+gut+and+sciatic+nerve%22">Isolation of fetal rat neural crest stem cells (NCSC) from gut and sciatic nerve</a>. , Available from: 
		
	 <a target="_blank" href="http://www4.utsouthwestern.edu/morrisonlab/protocols.html">http://www4.utsouthwestern.edu/morrisonlab/protocols.html</a> (2012).</li>
<li>Skarnes, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+conditional+knockout+resource+for+the+genome-wide+study+of+mouse+gene+function%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A conditional knockout resource for the genome-wide study of mouse gene function.</a> Nature. 474, 337-342 (2011).</li>
<li>Harding, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+GUDMAP+database--an+online+resource+for+genitourinary+research%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">The GUDMAP database--an online resource for genitourinary research.</a> Development. 138, 2845-2853 (2011).</li>
<li>Joseph, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enteric+glia+are+multipotent+in+culture+but+primarily+form+glia+in+the+adult+rodent+gut%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">Enteric glia are multipotent in culture but primarily form glia in the adult rodent gut.</a> J. Clin. Invest. 121, 3398-3411 (2011).</li>
<li>Newgreen, D. F., Murphy, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+crest+cell+outgrowth+cultures+and+the+analysis+of+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Neural crest cell outgrowth cultures and the analysis of cell migration.</a> Methods Mol. Biol. 137, 201-211 (2000).</li>
</ol>

Nie zadeklarowano żadnych konfliktów interesów.

Linie reporterowe myszy wykazujące ekspresję reporterów fluorescencyjnych stają się powszechnie dostępne dzięki licznym staraniom społeczności genetyki mysiej1,8,9. W rezultacie przedstawiona tutaj metoda dysocjacji może być szeroko stosowana do izolacji konkretnych podtypów neuronów z tkanek płodowych lub dorosłych na podstawie wzorców ekspresji neuroprzekaźników lub receptorów. Choć zoptymalizowaliśmy tę metodę w oparciu o ekspresję fluorescencyjnego transgenu reporterowego, można ją również zastosować do pr...

The authors middle initials were omitted from the publication of <a href="http://www.jove.com/video/4188">An Optimized Procedure for Fluorescence-activated Cell Sorting (FACS) Isolation of Autonomic Neural Progenitors from Visceral Organs of Fetal Mice</a>.

Erratum: An Optimized Procedure for Fluorescence-activated Cell Sorting (FACS) Isolation of Autonomic Neural Progenitors from Visceral Organs of Fetal Mice

<table><tbody><tr><td>Accumax</td><td>Sigma(mfr: Innovative Cell Technologies)</td><td>A7089-100ML</td><td>Przechowywać w zamrożonych alikwotach po 1 ml</td></tr><tr><td>DNase I</td><td>Sigma</td><td>D-4527</td><td>Przechowywać w zamrożeniu w -20 &amp;deg;C, 5 mg/ml w 1xHBSS,&lt;br/&gt; (Stosowane w Quench, Quench 1:5)</td></tr><tr><td>10X PBS pH 7,4</td><td>Gibco</td><td>70011-044</td><td>Dorowadzić do stężenia 1x wodą jakości tkankowej, następnie przefiltrować sterylnie</td></tr><tr><td>10X HBSS bez Ca lub Mg</td><td>Gibco</td><td>14185-052</td><td>Dorowadzić do stężenia 1x wodą jakości tkankowej, następnie przefiltrować sterylnie</td></tr><tr><td>Pożywka Leibovitz's L-15</td><td>Gibco</td><td>21083027</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina / Streptomycyna 100X</td><td>Gibco</td><td>15140-133</td><td>Przechowywać w alikwotach w -20 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>A3912-100G</td><td>Przechowywać w alikwotach w -20 &amp;deg;C, 100 mg/ml w wodzie</td></tr><tr><td>Biowhittaker 1M HEPES w 0,85% NaCl</td><td>Lonza</td><td>17-737E</td><td></td></tr><tr><td>Membrana nylonowa NITEX 38 &amp;mu;m</td><td>Sefar America</td><td>3-38/22</td><td>Wyciąć kwadraty o boku ok. 3 cm. Sterylizować na noc pod działaniem promieni UV w komorze laminarnej</td></tr><tr><td>7-AAD</td><td>Invitrogen</td><td>A1310</td><td>1 mg/ml</td></tr><tr><td>TRIzol LS</td><td>Invitrogen</td><td>10296-028</td><td></td></tr><tr><td>Probówki polistyrenowe 5 ml</td><td>Falcon</td><td>352058</td><td></td></tr><tr><td>Probówki stożkowe 15 ml</td><td>Corning</td><td>430790</td><td></td></tr><tr><td>Precyzyjna pęseta anatomiczna</td><td>Fine Science Instruments</td><td>11251-30</td><td>Pęseta Dumont#5, Dumoxel, standardowa końcówka 0,1x0,06 mm</td></tr><tr><td>Łyżeczka do sekcji</td><td>Fine Science Instruments</td><td>10370-18</td><td></td></tr></tbody></table>

zoptymalizowana procedura izolacji autonomicznych progenitorów neuronalnych z narządów trzewnych płodów myszy przy użyciu sortowania komórek aktywowanego fluorescencją (facs)

An Optimized Procedure for Fluorescence-activated Cell Sorting (FACS) Isolation of Autonomic Neural Progenitors from Visceral Organs of Fetal Mice

Podczas rozwoju neuronalne progenitory pochodzące z grzebienia neuronalnego (NC) migrują z rurki nerwowej, aby tworzyć zwoje autonomiczne w narządach trzewnych, takich jak jelita i dolny odcinek dróg moczowych. Zarówno podczas rozwoju, jak i w tkankach dojrzałych, komórki te są często szeroko rozproszone w tkankach, co sprawia, że izolacja dyskretnych populacji za pomocą metod takich jak mikrodysekcja laserowa jest trudna. Można je jednak bezpośrednio zwizualizować dzięki ekspresji fluorescencyjnych reporterów sterowanych przez regiony regulacyjne genów specyficznych dla neuronów, takich jak Tyrozynowa hydroksylaza (TH). Opisujemy metodę zoptymalizowaną pod kątem uzyskania wysokiej wydajności żywych progenitorów neuronalnych TH+ z płodowych tkanek trzewnych myszy, w tym z jelit i dolnego odcinka dróg moczowo-płciowych (LUT), opartą na dysocjacji i fluorescencyjnym sortowaniu komórek (FACS). 
Gen Th koduje enzym limitujący szybkość produkcji katecholamin. Enteryczne progenitory neuronalne zaczynają wykazywać ekspresję TH podczas migracji w jelitach płodowych1, a TH występuje również w podzbiorze neuronów zwojów miednicznych u osobników dorosłych2-4. Pierwsze pojawienie się tej linii komórkowej, rozmieszczenie tych neuronów w innych obszarach dolnych dróg moczowych (LUT) oraz ich izolacja nie zostały dotąd opisane. Progenitory neuronalne wykazujące ekspresję TH można łatwo zwizualizować dzięki ekspresji EGFP u myszy niosących konstrukt transgenu Tg(Th-EGFP)DJ76Gsat/Mmnc1. Obrazowano ekspresję tego transgenu u płodów myszy, aby udokumentować rozmieszczenie komórek TH+ w rozwijającym się LUT w 15,5 dniu po kopulacji (dpc), przyjmując poranek wykrycia czopu za 0,5 dpc; zaobserwowano, że podzbiór progenitorów neuronalnych w zlewających się zwojach miednicznych wykazuje ekspresję EGFP.
W celu wyizolowania progenitorów neuronalnych LUT TH+, zoptymalizowaliśmy metody pierwotnie stosowane do oczyszczania komórek macierzystych grzebienia nerwowego z jelita myszy płodowej2-6. Poprzednie próby izolacji populacji pochodzących z grzebienia nerwowego opierały się na trawieniu koktajlem kolagenazy i trypsyny w celu uzyskania zawiesin komórkowych do cytometrii przepływowej. W naszych badaniach metody te pozwalały na uzyskanie zawiesin komórkowych z LUT o stosunkowo niskiej żywotności. Biorąc pod uwagę i tak niską częstość występowania progenitorów neuronalnych w tkankach płodowego LUT, podjęliśmy próbę optymalizacji metod dysocjacji w taki sposób, aby zwiększyć przeżywalność komórek w końcowych preparatach. Ustaliliśmy, że łagodna dysocjacja w Accumax (Innovative Cell Technologies, Inc), filtrowanie ręczne oraz sortowanie przepływowe przy niskim ciśnieniu pozwoliły nam na osiągnięcie konsekwentnie wyższej przeżywalności (&gt;70% całkowitej liczby komórek), przy jednoczesnym uzyskaniu wydajności progenitorów neuronalnych wystarczającej do dalszych analiz. Opisana przez nas metoda może znaleźć szerokie zastosowanie w izolacji różnych populacji neuronalnych z tkanek mysich, zarówno płodowych, jak i dorosłych.

Opisano zoptymalizowaną procedurę oczyszczania neuronalnych progenitorów pochodzących z grzebienia neuronalnego z tkanek zarodkowych myszy. Metoda ta wykorzystuje ekspresję fluorescencyjnych alleli reporterowych do izolowania odrębnych populacji za pomocą fluorescencyjnego sortowania komórek (FACS). Technikę tę można zastosować do izolowania neuronalnych subpopulacji na różnych etapach rozwoju lub z tkanek dorosłych.

Zoptymalizowana procedura izolacji autonomicznych progenitorów neuronalnych z narządów trzewnych płodów myszy przy użyciu sortowania komórek aktywowanego fluorescencją (FACS)

Podczas rozwoju neurony progenitorowe pochodzące z grzebienia neuronalnego (NC) migrują z rurki neuralnej, aby tworzyć zwoje autonomiczne w organach trzewnych, takich jak...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest uzyskanie populacji oczyszczonych progenitorów neuronalnych z zwojów obwodowego układu nerwowego. Osiąga się to poprzez wypreparowanie narządu lub konkretnych zwojów z płodów myszy. Następnie tkanki są częściowo dysocjowane, aby uwolnić poszczególne komórki do otaczającego medium.Następnie zawiesinę komórkową filtruje się, aby usunąć wszelkie pozostałe grudki tkanki lub duże agregaty. Na koniec zawiesinę komórkową poddaje się sortowaniu przepływowemu w celu wyizolowania interesującej populacji na podstawie ekspresji fluorescencyjnego reportera w tej populacji komórek. W efekcie można porównać wzorce ekspresji genów między progenitorami, wyizolowanymi na różnych etapach rozwoju, lub między oczyszczonymi populacjami różnych typów komórek neuronalnych.Główną zaletą tej techniki w porównaniu z izolacją populacji komórek opartą na znakowaniu przeciwciałami jest fakt, że odczynniki immunologiczne często nie są dostępne. W takich przypadkach izolację tych populacji komórek umożliwiają genetycznie zmodyfikowane linie myszy produkujące białko fluorescencyjne w określonych podzbiorach neuronów, które znakują komórki wykazujące ekspresję konkretnego gen

an-optimized-procedure-for-fluorescence-activated-cell-sorting-facs

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Zoptymalizowana procedura do sortowania komórek aktywowanych fluorescencyjnie (FACS) w celu izolowaniu autonomicznych progenitorów nerwowych z narządów wewnętrznych płodów myszy

Niniejszy protokół wideo demonstruje nową metodę generowania i następnego oczyszczania neuronalnych komórek progenitorowych z odnawialnego źródła neuralnych komórek macierzystych (NSCs) w oparciu o ich właściwości fizyczne (rozmiar i ziarnistość wewnętrzną) oraz fluorescencyjne, z wykorzystaniem technologii cytometrii przepływowej.

Analiza neuroblastów: metoda generowania i wzbogacania populacji neuronalnych komórek progenitorowych z różnicujących się potomków neuronalnych komórek macierzystych z wykorzystaniem cytometrii przepływowej

Ten film demonstruje technikę izolowania i hodowli fluorescencyjnie znakowanych komórek macierzystych pochodzących z grzebienia nerwowego (ADSC) z mysiej tkanki tłuszczowej łuku okołoaortalnego. Po wyizolowaniu NCADSC są wykrywane, sortowane za pomocą sortowania komórek aktywowanego fluorescencją, a następnie hodowane na płytce, co sprzyja proliferacji komórek.

Izolowanie komórek macierzystych pochodzących z tkanki tłuszczowej myszy okołoortowej

Celem tego protokołu jest użycie techniki sortowania komórek aktywowanych fluorescencją (FACS) do sortowania określonych typów komórek nerwowych w celu późniejszej analizy ekspresji genów specyficznych dla typu komórki, markerów epigenetycznych i/lub ekspresji białek.

Wykorzystanie sortowania komórek aktywowanego fluorescencją do zbadania ekspresji genów specyficznych dla typu komórki w tkance mózgowej szczura

Opisujemy metodę opartą na Fluorescencyjnym Sortowaniu Komórek Aktywowanych (FACS) w celu izolacji nerwowych komórek macierzystych (NSC) i ich potomstwa ze strefy podkomorowej (SVZ) mózgu dorosłej myszy. Stosowany do transgenicznych myszy z fluorescencyjnym wskaźnikiem ubikwitynacji cyklu komórkowego (FUCCI), umożliwia badanie progresji cyklu komórkowego za pomocą obrazowania na żywo.

Sortowanie komórek nerwowych komórek macierzystych i progenitorowych ze strefy podkomorowej dorosłej myszy i obrazowanie na żywo ich dynamiki cyklu komórkowego

Tutaj opisujemy procedurę opartą na wykorzystaniu cząsteczek lentiwirusowych do długoterminowej modyfikacji genetycznej nerwowych komórek macierzystych i/lub ich sąsiadujących komórek wyściółkowych w dorosłej komorowo-podkomorowej niszy neurogennej, która pozwala na oddzielną analizę autonomicznych i nieautonomicznych, zależnych od niszy efektów na neuronalne komórki macierzyste.

Stabilna i wydajna modyfikacja genetyczna komórek dorosłej myszy V-SVZ do analizy autonomicznych i nieautonomicznych efektów neuronalnych komórek macierzystych

Ta praca przedstawia protokół do uzyskania jednorodnych kultur komórkowych pierwotnych neuronów ruchowych okoruchowych, bloczkowych i rdzeniowych. Kultury te można wykorzystać do analiz porównawczych cech morfologicznych, komórkowych, molekularnych i elektrofizjologicznych neuronów ruchowych oka i rdzenia.

Izolacja i hodowla neuronów ruchowych okoruchowych, bloczkowych i rdzeniowych myszy transgenicznych z grupy prenatalnej mn:GFP

Przedstawiamy protokół izolacji, hodowli i indukcji adipogennej komórek macierzystych pochodzących z tkanki tłuszczowej pochodzącej z grzebienia nerwowego (NCADSC) z okołoaortalnej tkanki tłuszczowej Wnt-1 Cre+/-; Myszy Rosa26RFP/+. NCADSC mogą być łatwo dostępnym źródłem ADSC do modelowania adipogenezy lub lipogenezy in vitro.

Izolacja, hodowla i indukcja adipogenna grzebienia nerwowego Oryginalne komórki macierzyste pochodzące z tkanki tłuszczowej okołoorciowej

Prezentujemy prostą metodę izolowania wysoce żywotnych komórek progenitorowych tkanki tłuszczowej z najądrzy myszy za pomocą sortowania komórek aktywowanego fluorescencją.

Preparat komórek progenitorowych tkanki tłuszczowej tkanki tłuszczowej najądrza myszy

Precyzyjna identyfikacja fibro-adipogennych komórek progenitorowych (FAP) i komórek macierzystych mięśni (MuSCs) jest kluczowa dla badania ich funkcji biologicznej w warunkach fizjologicznych i patologicznych. Protokół ten zawiera wytyczne dotyczące izolacji, oczyszczania i hodowli FAP i MuSC z mięśni dorosłych myszy.

FACS-Izolacja i hodowla włóknisto-adipogennych progenitorów i mięśniowych komórek macierzystych z niezakłóconych i uszkodzonych mięśni szkieletowych myszy

Aby uzyskać perycyte kory mózgowej myszy spełniające wymagania scRNA-seq, przedstawiamy krytycznie zoptymalizowany protokół FACS oparty na selekcji CD13⁺/CD31⁻. Nasze kluczowe udoskonalenia znacząco poprawiają żywotność komórek i integralność RNA, umożliwiając niezawodne profilowanie transkryptomowe.

Izolacja perycytów z tkanki kory mysiego mózgu za pomocą FACS do sekwencjonowania pojedynczych komórek

Naucz się izolować progenitory nerwowe z tkanek płodowych myszy za pomocą FACS. Ta metoda umożliwia badanie ekspresji genów w różnych populacjach komórkowych i etapach rozwoju.

Zoptymalizowana procedura sortowania komórek aktywowanych fluorescencją (FACS) izolacji autonomicznych progenitorów nerwowych z narządów trzewnych płodów myszy (Wideo) | JoVE Journal

Zoptymalizowana procedura izolacji autonomicznych progenitorów neuronalnych z narządów trzewnych płodów myszy przy użyciu sortowania komórek aktywowanego fluorescencją (FACS)

Przeglądaj więcej filmów