Zoptymalizowana procedura sortowania komórek aktywowanych fluorescencją (FACS) izolacji autonomicznych progenitorów nerwowych z narządów trzewnych płodów myszy

Ogólnym celem tej procedury jest uzyskanie populacji oczyszczonych progenitorów neuronalnych ze zwojów obwodowego układu nerwowego. Osiąga się to poprzez najpierw wypreparowanie narządu lub określonych zwojów będących przedmiotem zainteresowania u płodów myszy. Tkanki są następnie częściowo dysocjowane, aby uwolnić poszczególne komórki do otaczających pożywek.

Następnie zawiesina komórkowa jest filtrowana w celu usunięcia wszelkich resztek grudek tkanek lub dużych agregatów. Na koniec zawiesina komórkowa jest sortowana przepływowo w celu wyizolowania populacji będącej przedmiotem zainteresowania na podstawie ekspresji reportera fluorescencyjnego w tej populacji komórek. Ostatecznie wzorce ekspresji genów można porównać między progenitorami, wyizolowanymi na różnych etapach rozwoju, lub między oczyszczonymi populacjami różnych typów komórek neuronalnych.

Główną zaletą tej techniki w porównaniu z izolacją populacji komórek na podstawie znakowania przeciwciałami jest to, że często odczynniki immunologiczne nie są dostępne. Oznaczając komórki wyrażające określony gen, genetycznie zmodyfikowane linie myszy, które wytwarzają białko fluorescencyjne w dyskretnych podzbiorach neuronalnych, umożliwiają izolację tych populacji komórek. Chociaż demonstrujemy tę metodę izolacji neuronalnych komórek progenitorowych ze ścieżki jelitowej i neurogenowej jamy ustnej, można ją również zastosować do innych systemów modelowych, które wyrażają reportery fluorescencyjne.

Ogólnie rzecz biorąc, osoby, które dopiero zaczynają korzystać z tej metody, będą miały problemy, ponieważ mają tendencję do nadmiernego trawienia tkanek źródłowych, co powoduje utratę żywotności komórek. Przed rozpoczęciem sekcji należy obejrzeć zarodki w świetle jasnego pola, aby upewnić się, że odpowiednie struktury są ostre. Następnie zidentyfikuj zarodki transgeniczne poprzez badanie przesiewowe pod kątem ekspresji fluorescencyjnego reportera za pomocą fluorescencyjnego mikroskopu stereoskopowego.

Po eutanazji zarodki rozpoczynają się od dodania minimalnej ilości PBS do naczynia sekcyjnego, aby zarodek nie unosił się na wodzie podczas preparowania tkanek. Otwórz skórę zarodka wzdłuż boków ciała i w poprzek brzucha na poziomie wątroby. Przetocz zarodek na plecy i użyj cienkich kleszczy, aby przypiąć go na miejscu.

Na poziomie kończyn przednich włóż kolejną parę kleszczy na poziomie przepony, a następnie energicznie. Pociągnij narządy wewnętrzne w dół w kierunku ogona i odsuń się od grzbietowej ściany ciała, aby usunąć wnętrzności z wątroby w dół do guzka narządów płciowych. Jeśli jakiekolwiek narządy z klatki piersiowej, takie jak serce lub płuca, wyjdą przyczepione do wnętrzności, usuń je przed kontynuowaniem.

Gdy wnętrzności brzuszne zostaną oddzielone od tuszy, włóż parę kleszczy poniżej wątroby, w pobliżu żołądka i delikatnie odsuń wątrobę od jelita. Następnie ostrożnie wypreparuj tylne jelito z dala od grzbietowej cewki moczowej i usuń jelito z dróg moczowo-płciowych. Na koniec odwróć jelito tak, aby śledziona była widoczna pod żołądkiem.

Usuń śledzionę i trzustkę. Rozsuń pętle jelita, trzymając się mesentariusza. Następnie zdejmij mesentariusza i towarzyszące mu naczynia krwionośne z jelita, delikatnie pociągając za mesentariusza.

Unikaj trzymania jelita bezpośrednio kleszczami. Jeśli jelito pęknie, po prostu połącz oddzielne kawałki na etapie dysocjacji. Połącz każdy typ tkanki razem w 15-mililitrowej stożkowej probówce zawierającej lodowaty HBSS zgodnie z typem tkanki i typem fenotypu zarodka.

Po granulowaniu wypreparowane tkanki odsysają jak najwięcej HBSS. Następnie ponownie zawiesić osad tkankowy w jednym do kilku mililitrów ACU max. Wymiana końcówek pipet między każdą próbką.

Aby uniknąć zanieczyszczenia krzyżowego rodzajów tkanek, umieść probówki w łaźni wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza na 20 do 45 minut. W zależności od etapu izolacji tkanki, dysocjacja i filtrowanie tkanki jest najtrudniejszą częścią procedury, aby zapobiec jawnej dysocjacji tkanki. W rezultacie niska żywotność komórek.

Ogranicz czas dysocjacji i nie próbuj całkowicie oddzielić wszystkich fragmentów tkanki w połowie. A pod koniec czasu dysocjacji ręcznie rozbij tkankę, energicznie uderzając rurką o bok łaźni wodnej i rzucając rurkę w dół gwałtownym ruchem nadgarstka. Teraz przenieś zdysocjowane próbki na lód i natychmiast dodaj jeden mililitr świeżo przygotowanego środka hartowniczego do każdej probówki za pomocą nowej końcówki pipety dla każdej próbki, tri próbki w górę iw dół, aż tkanka zostanie prawie całkowicie zdysocjowana.

Teraz za pomocą pary kleszczy sterylizowanych etanolem umieść trzycentymetrową kwadratową membranę z nylonowej siatki o grubości 38 mikronów nad ustami nowej stożkowej rurki o średnicy 15 mililitrów. Następnie użyj końcówek o wąskim otworze, aby przefiltrować pojedynczy zawieszony roztwór komórkowy przez siatkę, pipetując do środka membrany. Po przefiltrowaniu zawiesiny komórek przepłukać probówkę z próbką jednym mililitrem hartowania od jednego do pięciu i przefiltrować pozostałe komórki.

Następnie zdejmij membranę, uważając, aby nie dopuścić do przedostania się niefiltrowanych próbek tkanek do probówki. Po granulowaniu zawiesiny komórek zasysają supernatant i ponownie zawieszają osad w jednym mililitrze hartowania od jednego do pięciu. Następnie przefiltruj każdą zawiesinę komórkową przez nylonową siatkę do pięciu mililitrowych rurek polistyrenowych, jak pokazano.

Rozpocząć od zarezerwowania małej podwielokrotności próbki fluorescencji do kontroli kompensacji tylko EGFP. Następnie podzielić próbkę tkanki typu dzikiego na dwie części, oznaczając tylko jeden typ dziki, a pozostałe siedem Tylko A a d. Teraz napełnij wszystkie probówki z próbkami hartowaniem od jednego do pięciu, a po granulowaniu próbek odessać wszystkie oprócz ostatnich 200 mikrolitrów supernatantu w każdej probówce.

Na koniec dodać siedem a a d do próbek, które mają być sortowane, a siedem a d tylko kontrolować. Następnie dodaj 0,75 mililitra triazolu LS do 1,5 mililitra mikrowirówki. Probówki do pobierania próbek rozpoczynają się od użycia próbek kontrolnych do ustawienia parametrów kompensacji i bramek, aby uniknąć siedmiu martwych komórek A a D dodatnich i zebrać komórki wykazujące wysoką intensywność fluorescencji GFP.

Po ustawieniu parametrów kompensacji rozpocznij sortowanie przy najniższym możliwym ciśnieniu z dyszą o szerokim otworze i niskim natężeniu przepływu. Zebrać maksymalnie 25 000 komórek do każdej probówki mikrowirówki, tak aby triol LS nie był nadmiernie rozcieńczony. Natychmiast po sortowaniu wiru, każda probówka komórek przechwyconych w triolu ls.

Na tym pierwszym rysunku pokazano cały układ moczowy narządów płciowych Euro w 15,5 dnia po stosunku, oglądany brzusznie w świetle jasnego pola. Ta sama próbka jest oglądana w oświetleniu fluorescencyjnym w celu wykazania rozmieszczenia komórek dodatnich EGFP w nadnerczach i przyśrodkowo zlokalizowanych zwojach trzewnych, zgodnie z ich ekspresją transgenu TH EGFP. Ten boczny widok 15,5 dnia po wycięciu pęcherza moczowego TH EGFP pokazuje fluorescencję ekspresji transgenu w zwojach miednicy, ścianie pęcherza moczowego i cewce moczowej.

W tym grzbietowym widoku tych samych komórek dodatnich EGFP są widoczne w dysocjacji tkanki przedniej grzbietowej cewki moczowej w celu wytworzenia zawiesin komórkowych do sortowania przepływowego, co jest delikatną równowagą między odpowiednim trawieniem enzymatycznym a unikaniem nadmiernego trawienia, które może skutkować niską zmiennością komórek. Te mikrofotografie pokazują dolne drogi moczowo-płciowe i tkanki jelitowe w połowie czasu dysocjacji. Jak widać na tych zdjęciach odpowiednio strawionej tkanki przed i po manualnym zabiegu, trzy fragmenty wypreparowanych narządów są nadal wyraźnie widoczne w tkankach, które są poddawane obróbce enzymatycznej zbyt długo lub przy zbyt wysokim stężeniu enzymu.

Jednak powstała zawiesina nie ma żadnych szczątkowych dużych kawałków tkanki, odpowiednia dysocjacja, a ręczne filtrowanie wytwarza profile cytometrii przepływowej, które zwykle wykazują więcej niż 90% żywotnych komórek, a te komórki, które wyrażają reportera w tej żywotnej populacji, komórki zachowują ekspresję EGFP o wysokiej intensywności. populacja składa się z pojedynczych komórek, które są martwe i znakowane przez wychwyt siedmiu a d fluorescencyjnej matrycy. Szara populacja składa się z komórek singletowych opartych na rozproszeniu do przodu i boku, które wykluczyły siedem a d, a zatem są żywotne.

Zielona populacja pochodzi z bramkowanego obszaru GFP dodatniego i składa się z pojedynczych żywotnych komórek, które wykluczyły siedem A a d i które wykazują fluorescencję EGFP. Dzięki tej procedurze można przeprowadzić izolację neuronalnych komórek progenitorowych od innych tkanek obwodowych, takich jak łańcuch współczulny, korzeń grzbietowy, zwoje lub płuco, aby odpowiedzieć na pytania dotyczące różnic w profilach ekspresji genów między populacjami lub rozwoju odrębnych linii.