Wykorzystanie sortowania komórek aktywowanego fluorescencją do zbadania ekspresji genów specyficznych dla typu komórki w tkance mózgowej szczura
28 maja 2015
Celem tego protokołu jest użycie techniki sortowania komórek aktywowanych fluorescencją (FACS) do sortowania określonych typów komórek nerwowych w celu późniejszej analizy ekspresji genów specyficznych dla typu komórki, markerów epigenetycznych i/lub ekspresji białek.
Ogólnym celem tej procedury jest wyizolowanie poszczególnych typów komórek nerwowych z tkanki mózgowej w celu późniejszej analizy. Osiąga się to poprzez najpierw dysocjację tkanki nerwowej w zawiesinę pojedynczej komórki. W drugim etapie mielina jest usuwana z zawiesiny, a następnie komórki są barwione pod kątem przeciwciał specyficznych dla typu komórki.
W ostatnim etapie poszczególne populacje komórek są sortowane za pomocą cytometrii przepływowej. Ostatecznie ta metoda izolacji specyficznej dla typu komórki pozwoli użytkownikom na oznaczanie zmian w ekspresji genów lub białek lub modyfikacji epigenetycznych w sposób specyficzny dla typu komórki. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie neuronauki, takie jak to, które typy komórek wyrażają określone receptory, które wyrażają określone białka i które wyrażają pewne modyfikacje epigenetyczne, abyśmy mogli lepiej zrozumieć mechanizmy specyficzne dla typu komórki w mózgu.
Rozpocznij dysocjację neuronalną za pomocą sterylnych żyletek, aby pokroić każdą próbkę pobraną z dorosłych tkanek mózgowych na małe kawałki o wielkości od 30 do 400 miligramów na pokrywie sześciodołkowej płytki hodowlanej. Następnie zanurz tkankę w jednym mililitrze HBSS bez wapnia i magnezu i za pomocą pipety przenieś próbki do sterylnych dwumililitrowych probówek wirówkowych, gdy wszystkie tkanki zostaną zebrane. Odwirować próbki i odessać supernatanty.
Dodaj 1 900 mikrolitrów ciepłego enzymu. Wymieszaj jeden z nich i inkubuj próbki przez 15 minut. W kąpieli wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza należy kilkakrotnie odwrócić rurkę co pięć minut, aby ponownie zawiesić osadzone kawałki tkanki.
Pod koniec inkubacji dodać 30 mikrolitrów świeżo przygotowanego enzymu. Wymieszaj po dwie z każdą próbką i delikatnie odwróć probówki. Następnie, używając pipety oznaczonej jako jedna, oddziel każdą próbkę za pomocą 30 iteracji w górę iw dół.
Uważaj, aby nie generować bąbelków. Inkubować próbki przez kolejne 15 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza z odwróceniem co pięć minut, a następnie dysocjacją próbek za pomocą pipety szkodnika. Po drugie, jak właśnie zademonstrowano.
Następnie przełącz się na pipetę numer trzy, powtórz dysocjację i inkubuj próbki jeszcze przez 10 minut. W łaźni wodnej z inwersją co pięć minut pod koniec inkubacji przefiltrować zawiesiny pojedynczych komórek przez sitka komórkowe o średnicy 80 mikronów do 15-mililitrowych probówek Falcona. Mycie każdego sitka 10 mililitrami HBSS bez wapnia i magnezu w celu zatrzymania reakcji enzymatycznych po przefiltrowaniu ostatniej próbki, odwirować probówki i zassać supernatanty w celu zubożenia mieliny z komórki.
Zawiesiny dokładnie ponownie zasmają granulki w 400 mikrolitrach buforu do usuwania mieliny i dodaj odpowiednią ilość kulek do usuwania mieliny do każdej probówki. Pipetować roztwory w górę i w dół, aż komórki i kulki dokładnie się wymieszają. Następnie inkubować próbkę w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 15 minut.
Po inkubacji umyj każdą próbkę w pięciu mililitrach buforu do usuwania mieliny, podczas gdy komórki się obracają, umieść jedną kolumnę dla każdej próbki w polu magnetycznym sortownika magnetycznego i umieść czysty filtr o średnicy 80 mikronów na górze każdej kolumny. Przepłukać każdy filtr i kolumnę jednym mililitrem buforu do usuwania mieliny trzy razy, zbierając cały przepływ w pojemniku na odpady. Po ostatnim płukaniu umieść pięć mililitrowych rurek z okrągłym dnem polistyrenu bezpośrednio pod każdą kolumną, aby zebrać eluat.
Następnie odessać super nazwany z próbek i ponownie zawiesić granulki w 500 mikrolitrach buforu do usuwania mieliny. Natychmiast nałóż zawiesiny komórek na kolumny, zbierając komórki w probówkach poniżej. Następnie przepłucz każdy filtr i kolumnę cztery razy jednym mililitrem usuwania mieliny, buforem na pranie.
Po ostatnim płukaniu odwirować komórki i odessać supernatanty w celu wybarwienia komórek do sortowania za pomocą cytometrii przepływowej. Wiruj każdą próbkę przez około dwie sekundy, aby oddzielić granulki i przenieś jeden mikrolitr komórek z każdej probówki do pojedynczych probówek. W celu kontroli barwienia natychmiast dodaj pięć mikrolitrów bloku FC do każdej probówki, łącznie z kontrolami barwienia.
Następnie ponownie zawirować próbki i inkubować je w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Po pięciu minutach dodaj 100 mikrolitrów odpowiedniego koktajlu przeciwciał pierwotnych. Przykryj probówki, aby chronić przeciwciała przed światłem i inkubuj komórki w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 20 minut.
Pod koniec inkubacji przemyć próbki w dwóch mililitrach buforu do przemywania wodą, następnie odessać supernatanty i oznaczyć każdą próbkę 100 mikrolitrami odpowiedniego przeciwciała wtórnego. Przykryj probówki i umieść je w temperaturze czterech stopni Celsjusza na 15 minut. Następnie umyj próbki w dwóch mililitrach buforu do mycia, odwiruj próbki, a następnie odessać.
Supernatants Resus, zawiesić granulki w 250 mikrolitrach sterylnego PBS i posortować komórki tutaj pokazano, że reprezentatywne populacje komórek nerwowych posortowane przepływowo z jednego męskiego hipokampa są zagrożone najpierw ze wszystkich możliwych zdarzeń w oparciu o ich właściwości rozpraszania do przodu i na boki. Następnie pojedyncze komórki lub pojedyncze komórki zostały bramkowane z dowolnych dubletów lub większych skupisk komórek w zależności od ich wielkości, aby umożliwić dokładne sortowanie poszczególnych typów komórek, a następnie pojedyncze komórki posortowano na populacje komórek CD 11, B dodatnich i CD 11 B ujemnych z dalszym sortowaniem komórek ujemnych CD 11 B na komórki dodatnie GT jeden i TH jeden. Program analityczny został następnie wykorzystany do określenia całkowitej liczby zdarzeń w każdej populacji, a także procentu populacji rodzicielskich w celu potwierdzenia czystości posortowanych komórek.
W tym konkretnym przykładzie względna ekspresja genów specyficznych dla alternatywnego typu komórki została przeanalizowana za pomocą PCR w czasie rzeczywistym. Zgodnie z oczekiwaniami, dane te potwierdziły czystość posortowanych komórek, a także zidentyfikowały kilka interesujących różnic między badanymi regionami mózgu. Po potwierdzeniu czystości rodzaju, ekspresja innych genów będących przedmiotem zainteresowania może być mierzona w celu określenia konkretnego typu komórek, w których są one wyrażane, lub czy ich ekspresja ulega zmianie po podaniu działaniu substancji w sposób specyficzny dla typu komórki.
Na przykład tutaj badano ekspresję krowiego wiązania, białka wiążącego wapń często używanego do identyfikacji neuronów w hipokampie i móżdżku. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak izolować określone typy komórek nerwowych, takie jak pokazana tutaj komórka nerwowa, używając odpowiednich przeciwciał na powierzchni komórki.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Ten protokół opisuje metodę izolowaniu określonych typów komórek nerwowych z tkanki mózgowej za pomocą selekcji komórek aktywowanej fluorescencyjnie (FACS). Procedura umożliwia późniejszą analizę ekspresji genów specyficznych dla typu komórki, markerów epigenetycznych i ekspresji białek.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauki
- Biologia komórki
- Analiza ekspresji genów
Tło
- Izolacja typów komórek nerwowych jest kluczowa dla zrozumienia mechanizmów mózgu.
- Analiza specyficzna dla typu komórki może ujawnić różnice w ekspresji receptorów i białek.
- FACS pozwala na precyzyjne sortowanie pojedynczych populacji komórek.
- Ta metoda może pomóc w badaniu modyfikacji epigenetycznych w komórkach nerwowych.
Cel badania
- Izolacja pojedynczych typów komórek nerwowych w celu szczegółowej analizy.
- Badanie ekspresji genów i białek w określonych populacjach komórek.
- Zgłębienie zrozumienia mechanizmów specyficznych dla typu komórki w mózgu.
Zastosowanie metod
- Dysocjację tkanki nerwowej w pojedyncze zawieszenie komórek.
- Usuwanie mieliny z zawiesiny komórkowej.
- Barwienie komórek antyciałami specyficznymi dla typu komórki.
- Sortowanie pojedynczych populacji komórek za pomocą cytometrii przepływowej.
Główne wyniki
- Udana izolacja różnych typów komórek nerwowych.
- Możliwość ocen zmian w ekspresji genów specyficznych dla typu komórki.
- Identyfikacja typów komórek ekspresujących określone receptory i białka.
- Wgląd w modyfikacje epigenetyczne w różnych populacjach nerwowych.
Wnioski
- Technika FACS jest skuteczna w izolowaniu typów komórek nerwowych.
- Ta metoda zapewnia podstawę do badania mechanizmów specyficznych dla typu komórki.
- Przyszły badania mogą wykorzystać to podejście do eksploracji różnych pytań z dziedziny neuronauki.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Understanding cell-type-specific mechanisms in the brain is critical for de-risking target validation in neuroscience drug discovery. Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS) enables precise isolation of neural populations, supporting mechanistic de-risking by linking gene expression changes to specific cell types. This approach enhances predictive confidence in target selection by revealing cell-type-specific expression patterns that may be masked in whole-tissue analyses.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by determining which neural cell types express specific receptors, proteins, or epigenetic markers.
- Operational Value: Enables biological de-risking through direct measurement of target engagement in defined cell populations.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by identifying cell-type-specific expression patterns that inform target prioritization.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated neural cell populations for downstream screening of compounds affecting gene or protein expression.
- Operational Value: Standardizes input material for assays, improving reproducibility and reducing variability in readouts.
- Scalability: Enables platform reuse across multiple targets and brain regions through consistent cell isolation workflows.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Maintains disease relevance by preserving cell-type-specific epigenetic and expression profiles from discovery through validation.
- Operational Value: Provides quantitative, sortable outputs that align with translational biomarker strategies.
- Risk Mitigation: Supports risk-adjusted advancement decisions by confirming target expression in relevant human-equivalent cell types.
Pipeline & Workflow Integration
FACS integrates into the discovery continuum from target hypothesis testing through lead identification, enabling cell-type-specific readouts that inform go/no-go decisions.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by isolating cell types to assess target expression and pathway activity.
- Screening: Delivers purified cell populations for assay readiness, ensuring consistent compound evaluation.
- Analytics: Generates quantitative data on gene, protein, and epigenetic expression for comparative condition analysis.
- Translational Research: Connects discovery findings to preclinical continuity through preserved cell-type-specific molecular profiles.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable isolation capability applicable across multiple neuroscience projects and therapeutic areas.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence by reducing mechanistic ambiguity in target validation.
- Operational Value: Enhances standardization and reproducibility of neural cell preparations.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision quality and capital efficiency in early discovery.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization based on cell-type-specific target validation data.
Implementation Considerations
- Requires expertise in neural tissue dissociation, flow cytometry, and antibody panel design.
- Depends on access to cell sorters, centrifugation equipment, and myelin removal reagents.
- Necessitates cross-team standardization of staining protocols and gating strategies.
- Involves adaptation considerations for different brain regions and cell surface markers.
- Limited by tissue availability and viability constraints during enzymatic dissociation.
