Wykorzystanie sortowania komórek aktywowanego fluorescencją do zbadania ekspresji genów specyficznych dla typu komórki w tkance mózgowej szczura

Ogólnym celem niniejszej procedury jest wyizolowanie poszczególnych typów komórek nerwowych z tkanki mózgowej do dalszych analiz. Cel ten osiąga się poprzez wstępną dysocjację tkanki nerwowej do postaci zawiesiny pojedynczych komórek. W drugim kroku z zawiesiny usuwa się mielinę, a następnie komórki barwi się przeciwciałami specyficznymi dla danego typu komórek.

W końcowym kroku poszczególne populacje komórek są sortowane za pomocą cytometrii przepływowej. Ostatecznie ta metoda izolacji specyficznej dla danego typu komórek pozwoli użytkownikom na badanie zmian w ekspresji genów lub białek oraz modyfikacji epigenetycznych w sposób specyficzny dla konkretnego typu komórek. Metoda ta może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania z dziedziny neuronauki, takie jak to, które typy komórek wykazują ekspresję określonych receptorów, które wykazują ekspresję konkretnych białek, a które wykazują określone modyfikacje epigenetyczne, co pozwoli na lepsze zrozumienie mechanizmów specyficznych dla poszczególnych typów komórek w mózgu.

Rozpocznij dysocjację neuronów, używając sterylnych żyletek do posiekania każdej próbki pobranej z tkanek mózgowych dorosłych osobników na niewielkie fragmenty o masie od 30 do 400 mg na pokrywce sześciodołowej płytki hodowlanej. Następnie zanurz tkankę w 1 mL HBSS pozbawionego wapnia i magnezu, a po zebraniu wszystkich tkanek przenieś próbki za pomocą pipety do sterylnych probówek wirówkowych o pojemności 2 mL. Odwiruj próbki i odessaj nadsączniki.

Dodać 1 900 µL ciepłego enzymu. Wymieszać i inkubować próbki przez 15 minut w kąpieli wodnej o temperaturze 37 °C, odwracając probówkę kilka razy co pięć minut w celu resuspensji osiadłych fragmentów tkanki.

Po zakończeniu inkubacji dodać 30 µL świeżo przygotowanego enzymu. Wymieszać każdą próbkę i delikatnie odwrócić probówki. Następnie, używając pipety o oznaczeniu 1, rozbić każdą próbkę, wykonując 30 powtórzeń aplikacji i aspiracji płynu.

Należy uważać, aby nie doprowadzić do powstania pęcherzyków powietrza. Próbki inkubować przez kolejne 15 minut w temperaturze 37 °C, odwracając probówki co pięć minut, a następnie rozbić zawiesinę w próbkach za pomocą pipety typu pest pipette numer dwa, zgodnie z wcześniejszą demonstracją.

Następnie należy przejść do pipety numer trzy, powtórzyć dysocjację i inkubować próbki przez kolejne 10 minut. W kąpieli wodnej, odwracając naczynia co pięć minut, a po zakończeniu inkubacji przefiltrować zawiesiny pojedynczych komórek przez sita komórkowe o rozmiarze 80 µm do probówek Falcon o pojemności 15 ml. Każde sito należy przemyć 10 ml HBSS wolnego od wapnia i magnezu, aby zatrzymać reakcje enzymatyczne. Po przefiltrowaniu ostatniej próbki należy odwirować probówki i odessać supernatanty, aby usunąć mielinę z komórek.

W suspensjach dokładnie resuspender osady w 400 µL buforu do usuwania mieliny, a następnie dodać do każdej probówki odpowiednią ilość kulek do usuwania mieliny. Pipetować roztwory w górę i w dół, aż komórki i kulki zostaną dokładnie wymieszane. Następnie inkubować próbkę w temperaturze 4 °C przez 15 minut.

Po inkubacji przemyj każdą próbkę pięcioma mililitrami buforu do usuwania mieliny podczas wirowania komórek; umieść jedną kolumnę dla każdej próbki w polu magnetycznym sortera magnetycznego, a na wierzchu każdej kolumny połóż czysty filtr o rozmiarze 80 mikronów. Przepłucz każdy filtr i kolumnę jeden mililitr buforu do usuwania mieliny trzy razy, zbierając cały przeływ do pojemnika na odpady. Po końcowym płukaniu umieść pod każdą kolumną polistyrenowe probówki o okrągłym dnie o pojemności pięciu mililitrów, aby zebrać eluat.

Następnie odessaj znad próbek nadnadkład i resuspenduj osady w 500 µL buforu do usuwania mieliny. Natychmiast nanieś zawiesiny komórkowe na kolumny, zbierając komórki do probówek znajdujących się poniżej. Następnie przepłucz każdy filtr i kolumnę czterokrotnie, używając 1 mL buforu do usuwania mieliny na każde płukanie.

Po ostatnim przemyciu odwiruj komórki i odessij nadsączyny, aby przygotować komórki do barwienia przed sortowaniem metodą cytometrii przepływowej. Wymieszaj każdą próbkę w wortexie przez około dwie sekundy w celu rozbicia osadu, a następnie przenieś 1 µL komórek z każdej probówki do osobnych probówek. W przypadku kontroli barwienia natychmiast dodaj 5 µL blokera FC do każdej probówki, wliczając w to próbki kontrolne.

Następnie ponownie wymieszaj próbki w wirówce typu vortex i inkubuj je w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Po pięciu minutach dodaj 100 µL odpowiedniego koktajlu przeciwciał pierwszorzędowych. Przykryj probówki, aby chronić przeciwciała przed światłem, i inkubuj komórki w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 20 minut.

Po zakończeniu inkubacji przemyj próbki dwiema mililitrami buforu do mycia, następnie odessij nadsącz i dodaj do każdej próbki 100 µL odpowiedniego przeciwciała wtórnego. Przykryj probówki i pozostaw je w temperaturze 4 °C na 15 minut. Następnie przemyj próbki dwiema mililitrami buforu do mycia, odwiruj je w wirówce, a następnie odessij ciecz.

Resuspensja supernatantów; pellety zawiesić w 250 µL sterylnego PBS i przeprowadzić sortowanie komórek. Tutaj przedstawiono reprezentatywne, posortowane przepływowo populacje komórek neuronalnych z hipokampa jednego samca. Komórki zostały najpierw wyodrębnione ze wszystkich możliwych zdarzeń na podstawie ich właściwości rozproszenia światła w przód (forward scatter) i z boku (side scatter). Następnie, na podstawie wielkości, wyodrębniono pojedyncze komórki (singlety) z dubletów lub większych skupisk komórek. Aby umożliwić dokładne sortowanie poszczególnych typów komórek, pojedyncze komórki posortowano na populacje komórek CD 11 B dodatnich i CD 11 B ujemnych, z dalszym sortowaniem komórek CD 11 B ujemnych na komórki GT1 i TH1 dodatnie. Następnie wykorzystano program analizy do określenia całkowitej liczby zdarzeń w każdej populacji oraz procentowego udziału w populacjach rodzicielskich w celu potwierdzenia czystości posortowanych komórek.

W tym konkretnym przykładzie analizie względnej ekspresji genów specyficznych dla alternatywnych typów komórek poddano badanie za pomocą real-time PCR. Zgodnie z oczekiwaniami, dane te potwierdziły czystość posortowanych komórek, a także pozwoliły zidentyfikować interesujące różnice pomiędzy badanymi obszarami mózgu. Po potwierdzeniu czystości sortowania można zmierzyć ekspresję innych wybranych genów, aby określić specyficzny typ komórek, w których są one wyrażane, lub sprawdzić, czy ich ekspresja ulega zmianie po zastosowaniu leczenia w sposób specyficzny dla danego typu komórek.

Na przykład zbadano tutaj ekspresję białka wiążącego krowiego (cow binding), białka wiążącego wapń, które jest często wykorzystywane do identyfikacji neuronów w hipokampie i móżdżku. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo dobrze zrozumieć, jak izolować konkretne, interesujące rodzaje komórek nerwowych, takie jak komórka nerwowa pokazana tutaj, przy użyciu odpowiednich przeciwciał przeciwko antygenom powierzchniowym komórek.