Wykorzystanie sortowania komórek aktywowanego fluorescencją do zbadania ekspresji genów specyficznych dla typu komórki w tkance mózgowej szczura
May 28th, 2015
Celem tego protokołu jest użycie techniki sortowania komórek aktywowanych fluorescencją (FACS) do sortowania określonych typów komórek nerwowych w celu późniejszej analizy ekspresji genów specyficznych dla typu komórki, markerów epigenetycznych i/lub ekspresji białek.
Ogólnym celem tej procedury jest wyizolowanie poszczególnych typów komórek nerwowych z tkanki mózgowej w celu późniejszej analizy. Osiąga się to poprzez najpierw dysocjację tkanki nerwowej w zawiesinę pojedynczej komórki. W drugim etapie mielina jest usuwana z zawiesiny, a następnie komórki są barwione pod kątem przeciwciał specyficznych dla typu komórki.
W ostatnim etapie poszczególne populacje komórek są sortowane za pomocą cytometrii przepływowej. Ostatecznie ta metoda izolacji specyficznej dla typu komórki pozwoli użytkownikom na oznaczanie zmian w ekspresji genów lub białek lub modyfikacji epigenetycznych w sposób specyficzny dla typu komórki. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie neuronauki, takie jak to, które typy komórek wyrażają określone receptory, które wyrażają określone białka i które wyrażają pewne modyfikacje epigenetyczne, abyśmy mogli lepiej zrozumieć mechanizmy specyficzne dla typu komórki w mózgu.
Rozpocznij dysocjację neuronalną za pomocą sterylnych żyletek, aby pokroić każdą próbkę pobraną z dorosłych tkanek mózgowych na małe kawałki o wielkości od 30 do 400 miligramów na pokrywie sześciodołkowej płytki hodowlanej. Następnie zanurz tkankę w jednym mililitrze HBSS bez wapnia i magnezu i za pomocą pipety przenieś próbki do sterylnych dwumililitrowych probówek wirówkowych, gdy wszystkie tkanki zostaną zebrane. Odwirować próbki i odessać supernatanty.
Dodaj 1 900 mikrolitrów ciepłego enzymu. Wymieszaj jeden z nich i inkubuj próbki przez 15 minut. W kąpieli wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza należy kilkakrotnie odwrócić rurkę co pięć minut, aby ponownie zawiesić osadzone kawałki tkanki.
Pod koniec inkubacji dodać 30 mikrolitrów świeżo przygotowanego enzymu. Wymieszaj po dwie z każdą próbką i delikatnie odwróć probówki. Następnie, używając pipety oznaczonej jako jedna, oddziel każdą próbkę za pomocą 30 iteracji w górę iw dół.
Uważaj, aby nie generować bąbelków. Inkubować próbki przez kolejne 15 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza z odwróceniem co pięć minut, a następnie dysocjacją próbek za pomocą pipety szkodnika. Po drugie, jak właśnie zademonstrowano.
Następnie przełącz się na pipetę numer trzy, powtórz dysocjację i inkubuj próbki jeszcze przez 10 minut. W łaźni wodnej z inwersją co pięć minut pod koniec inkubacji przefiltrować zawiesiny pojedynczych komórek przez sitka komórkowe o średnicy 80 mikronów do 15-mililitrowych probówek Falcona. Mycie każdego sitka 10 mililitrami HBSS bez wapnia i magnezu w celu zatrzymania reakcji enzymatycznych po przefiltrowaniu ostatniej próbki, odwirować probówki i zassać supernatanty w celu zubożenia mieliny z komórki.
Zawiesiny dokładnie ponownie zasmają granulki w 400 mikrolitrach buforu do usuwania mieliny i dodaj odpowiednią ilość kulek do usuwania mieliny do każdej probówki. Pipetować roztwory w górę i w dół, aż komórki i kulki dokładnie się wymieszają. Następnie inkubować próbkę w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 15 minut.
Po inkubacji umyj każdą próbkę w pięciu mililitrach buforu do usuwania mieliny, podczas gdy komórki się obracają, umieść jedną kolumnę dla każdej próbki w polu magnetycznym sortownika magnetycznego i umieść czysty filtr o średnicy 80 mikronów na górze każdej kolumny. Przepłukać każdy filtr i kolumnę jednym mililitrem buforu do usuwania mieliny trzy razy, zbierając cały przepływ w pojemniku na odpady. Po ostatnim płukaniu umieść pięć mililitrowych rurek z okrągłym dnem polistyrenu bezpośrednio pod każdą kolumną, aby zebrać eluat.
Następnie odessać super nazwany z próbek i ponownie zawiesić granulki w 500 mikrolitrach buforu do usuwania mieliny. Natychmiast nałóż zawiesiny komórek na kolumny, zbierając komórki w probówkach poniżej. Następnie przepłucz każdy filtr i kolumnę cztery razy jednym mililitrem usuwania mieliny, buforem na pranie.
Po ostatnim płukaniu odwirować komórki i odessać supernatanty w celu wybarwienia komórek do sortowania za pomocą cytometrii przepływowej. Wiruj każdą próbkę przez około dwie sekundy, aby oddzielić granulki i przenieś jeden mikrolitr komórek z każdej probówki do pojedynczych probówek. W celu kontroli barwienia natychmiast dodaj pięć mikrolitrów bloku FC do każdej probówki, łącznie z kontrolami barwienia.
Następnie ponownie zawirować próbki i inkubować je w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Po pięciu minutach dodaj 100 mikrolitrów odpowiedniego koktajlu przeciwciał pierwotnych. Przykryj probówki, aby chronić przeciwciała przed światłem i inkubuj komórki w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 20 minut.
Pod koniec inkubacji przemyć próbki w dwóch mililitrach buforu do przemywania wodą, następnie odessać supernatanty i oznaczyć każdą próbkę 100 mikrolitrami odpowiedniego przeciwciała wtórnego. Przykryj probówki i umieść je w temperaturze czterech stopni Celsjusza na 15 minut. Następnie umyj próbki w dwóch mililitrach buforu do mycia, odwiruj próbki, a następnie odessać.
Supernatants Resus, zawiesić granulki w 250 mikrolitrach sterylnego PBS i posortować komórki tutaj pokazano, że reprezentatywne populacje komórek nerwowych posortowane przepływowo z jednego męskiego hipokampa są zagrożone najpierw ze wszystkich możliwych zdarzeń w oparciu o ich właściwości rozpraszania do przodu i na boki. Następnie pojedyncze komórki lub pojedyncze komórki zostały bramkowane z dowolnych dubletów lub większych skupisk komórek w zależności od ich wielkości, aby umożliwić dokładne sortowanie poszczególnych typów komórek, a następnie pojedyncze komórki posortowano na populacje komórek CD 11, B dodatnich i CD 11 B ujemnych z dalszym sortowaniem komórek ujemnych CD 11 B na komórki dodatnie GT jeden i TH jeden. Program analityczny został następnie wykorzystany do określenia całkowitej liczby zdarzeń w każdej populacji, a także procentu populacji rodzicielskich w celu potwierdzenia czystości posortowanych komórek.
W tym konkretnym przykładzie względna ekspresja genów specyficznych dla alternatywnego typu komórki została przeanalizowana za pomocą PCR w czasie rzeczywistym. Zgodnie z oczekiwaniami, dane te potwierdziły czystość posortowanych komórek, a także zidentyfikowały kilka interesujących różnic między badanymi regionami mózgu. Po potwierdzeniu czystości rodzaju, ekspresja innych genów będących przedmiotem zainteresowania może być mierzona w celu określenia konkretnego typu komórek, w których są one wyrażane, lub czy ich ekspresja ulega zmianie po podaniu działaniu substancji w sposób specyficzny dla typu komórki.
Na przykład tutaj badano ekspresję krowiego wiązania, białka wiążącego wapń często używanego do identyfikacji neuronów w hipokampie i móżdżku. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak izolować określone typy komórek nerwowych, takie jak pokazana tutaj komórka nerwowa, używając odpowiednich przeciwciał na powierzchni komórki.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Przegląd
Ten protokół opisuje metodę izolowaniu określonych typów komórek nerwowych z tkanki mózgowej za pomocą selekcji komórek aktywowanej fluorescencyjnie (FACS). Procedura umożliwia późniejszą analizę ekspresji genów specyficznych dla typu komórki, markerów epigenetycznych i ekspresji białek.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauki
- Biologia komórki
- Analiza ekspresji genów
Tło
- Izolacja typów komórek nerwowych jest kluczowa dla zrozumienia mechanizmów mózgu.
- Analiza specyficzna dla typu komórki może ujawnić różnice w ekspresji receptorów i białek.
- FACS pozwala na precyzyjne sortowanie pojedynczych populacji komórek.
- Ta metoda może pomóc w badaniu modyfikacji epigenetycznych w komórkach nerwowych.
Cel badania
- Izolacja pojedynczych typów komórek nerwowych w celu szczegółowej analizy.
- Badanie ekspresji genów i białek w określonych populacjach komórek.
- Zgłębienie zrozumienia mechanizmów specyficznych dla typu komórki w mózgu.
Zastosowanie metod
- Dysocjację tkanki nerwowej w pojedyncze zawieszenie komórek.
- Usuwanie mieliny z zawiesiny komórkowej.
- Barwienie komórek antyciałami specyficznymi dla typu komórki.
- Sortowanie pojedynczych populacji komórek za pomocą cytometrii przepływowej.
Główne wyniki
- Udana izolacja różnych typów komórek nerwowych.
- Możliwość ocen zmian w ekspresji genów specyficznych dla typu komórki.
- Identyfikacja typów komórek ekspresujących określone receptory i białka.
- Wgląd w modyfikacje epigenetyczne w różnych populacjach nerwowych.
Wnioski
- Technika FACS jest skuteczna w izolowaniu typów komórek nerwowych.
- Ta metoda zapewnia podstawę do badania mechanizmów specyficznych dla typu komórki.
- Przyszły badania mogą wykorzystać to podejście do eksploracji różnych pytań z dziedziny neuronauki.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Understanding cell-type-specific mechanisms in the brain is critical for de-risking target validation in neuroscience drug discovery. Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS) enables precise isolation of neural populations, supporting mechanistic de-risking by linking gene expression changes to specific cell types. This approach enhances predictive confidence in target selection by revealing cell-type-specific expression patterns that may be masked in whole-tissue analyses.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by determining which neural cell types express specific receptors, proteins, or epigenetic markers.
- Operational Value: Enables biological de-risking through direct measurement of target engagement in defined cell populations.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by identifying cell-type-specific expression patterns that inform target prioritization.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated neural cell populations for downstream screening of compounds affecting gene or protein expression.
- Operational Value: Standardizes input material for assays, improving reproducibility and reducing variability in readouts.
- Scalability: Enables platform reuse across multiple targets and brain regions through consistent cell isolation workflows.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Maintains disease relevance by preserving cell-type-specific epigenetic and expression profiles from discovery through validation.
- Operational Value: Provides quantitative, sortable outputs that align with translational biomarker strategies.
- Risk Mitigation: Supports risk-adjusted advancement decisions by confirming target expression in relevant human-equivalent cell types.
Pipeline & Workflow Integration
FACS integrates into the discovery continuum from target hypothesis testing through lead identification, enabling cell-type-specific readouts that inform go/no-go decisions.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by isolating cell types to assess target expression and pathway activity.
- Screening: Delivers purified cell populations for assay readiness, ensuring consistent compound evaluation.
- Analytics: Generates quantitative data on gene, protein, and epigenetic expression for comparative condition analysis.
- Translational Research: Connects discovery findings to preclinical continuity through preserved cell-type-specific molecular profiles.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable isolation capability applicable across multiple neuroscience projects and therapeutic areas.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence by reducing mechanistic ambiguity in target validation.
- Operational Value: Enhances standardization and reproducibility of neural cell preparations.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision quality and capital efficiency in early discovery.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization based on cell-type-specific target validation data.
Implementation Considerations
- Requires expertise in neural tissue dissociation, flow cytometry, and antibody panel design.
- Depends on access to cell sorters, centrifugation equipment, and myelin removal reagents.
- Necessitates cross-team standardization of staining protocols and gating strategies.
- Involves adaptation considerations for different brain regions and cell surface markers.
- Limited by tissue availability and viability constraints during enzymatic dissociation.
