Name: Ocena funkcji tętnicy oporowej myszy za pomocą miografii ciśnieniowej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-06-07T12:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 25 s
Description: Poznaj ocenę reaktywności naczyń myszy za pomocą miografii ciśnieniowej tętnicy krezkowej. Ta technika pozwala badać rozkurcz naczyń zależny od śródbłonka w czasie rzeczywistym.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy chcieliby podziękować doktorom Paulowi Huangowi i Dmitriyowi Atochinowi za użycie miografu ciśnieniowego DMT oraz doktorom Binglan Yu i Chong Lei za dostarczenie myszom diety wysokotłuszczowej lub standardowej.
Źródła finansowania
Ta praca była wspierana przez Scientist Development Grant 10SDG2610313 od American Heart Association (dla E. S. Buys) oraz program stypendialny Eleanor and Miles Shore 50th Anniversary Fellowship dla naukowców z Harvard Medical School (dla E. S. Buys).

1. Przygotowanie roztworu
<ol>
	<li>500X EDTA: zważyć 500 mg EDTA-Na2•2H2O i rozpuścić w 50 ml wody dejonizowanej. Przechowywać w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Roztwór depolaryzujący KCl.
	<ol>
		<li>Przygotować roztwór podstawowy K10X: 3,69 g NaCl, 18,64 g KCl, 0,36 gMgSO4 bezwodny, 0,41 g KH2PO4, 0,46 g CaCl2•2H2O. Rozpuścić w 250 ml wody dejonizowanej. Przechowywać w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Na 100 ml końcowego roztworu depolaryzującego KCl 1X: Rozpuścić 0,21 NaHCO3, 0,18 g glukozy w 90 ml wody dejonizowanej. Dodać 10 ml roztworu podstawowego K10X. Dodać 95 μl 500X roztworu EDTA. Dobrze wymieszaj. Przechowywać w temperaturze 4 °C. Zużyć w ciągu tygodnia.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotuj świeży roztwór HEPES-PSS w dniu eksperymentu (na 1 litr).
	<ol>
		<li>6,96 g NaCl, 0,35 g KCl, 0,288 g MgSO4•7H2O, 0,1605 g KH2PO4, 2,38 g HEPES. Rozpuścić w 100 ml wody dejonizowanej. Oznaczyć jako kolbę A.</li>
		<li>0,312 g CaCl2•2H2O. Rozpuścić w 100 ml wody dejonizowanej. Oznaczyć jako kolbę B.</li>
		<li>1,25 g NaHCO3, 0,991 g glukozy. Rozpuścić w 98 ml wody dejonizowanej. Oznaczyć jako kolbę C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Dodać 2 ml 500X EDTA do kolby C. Weź 700 ml wody dejonizowanej do dużej kolby. Wlać zawartość kolby A, B i C do dużej kolby z ciągłym wirowaniem. Dostosuj pH do 7,4 za pomocą NaOH.</li>
</ol>
2. Używane narkotyki
<ol>
	<li>Fenylefryna (10-2 M): Rozpuść 20,37 mg w 10 ml wody dejonizowanej. Podwielokrotność porcji 1 ml i przechowywać w temperaturze -80 °C. Seryjnie rozcieńczyć do uzyskania 10-3, 10-4, 10-5 i 10-6 mol/l w dniu doświadczenia.</li>
	<li>Acetylocholina (10-2 M): Rozpuść 18,17 mg w 10 ml wody dejonizowanej. Podwielokrotność porcji 1 ml i przechowywać w temperaturze -80 °C. Seryjnie rozcieńczyć do uzyskania 10-3, 10-4, 10-5 i 10-6 mol/l w dniu doświadczenia.</li>
</ol>
3. Myszy
Męskie myszy WT i sGCα1-/- na tle S6 i B6 były badane w trakcie tego badania. sGCα1-/- zostały wygenerowane zgodnie z wcześniejszym opisem 4,5. Pomieszczenia i procedury z udziałem zwierząt doświadczalnych (myszy) zostały zatwierdzone przez Podkomitet ds. Opieki nad Zwierzętami Badawczymi Szpitala Ogólnego Massachusetts w Bostonie.
4. Pomiar reaktywności naczyniowej w tętnicy krezkowej
<ol>
	<li>Poddaj myszy eutanazji pentobarbitalem (200 mg/kg, i.p.). Otwórz jamę brzuszną i wypreparuj tkankę krezkową. Wyizolować i wypreparować tętnicę krezkową3 rzędu wolną od tkanki łącznej i tłuszczowej, a następnie umieścić tętnicę w lodowatym roztworze HEPES-PSS wstępnie zrównoważonym z 95% O2 / 5% CO2 przez 15 minut. Wytnij pierścienie o długości 2-3 mm bez rozgałęzień od tętnicy krezkowej. Różnicowanie tętnic i żył na poziomie mikronaczyń jest problematyczne, gdy w naczyniach nie ma krwi. Dlatego zalecamy zidentyfikowanie naczynia, gdy jest ono jeszcze nienaruszone u zwierzęcia przed jego wypreparowaniem.</li>
	<li>Napełnij szklane kaniule w komorze miografu ciśnieniowego (DMT Model 110P&11P wersja 1.31, Rysunek 2) roztworem HEPES-PSS za pomocą strzykawki o pojemności 10 ml przez zawory wlotowe i wylotowe. Napełnianie kaniuli powinno odbywać się delikatnie i ostrożnie, ponieważ nadmierny nacisk może uszkodzić delikatny przetwornik połączony z kaniulami. Po napełnieniu kaniul należy szczelnie zamknąć zarówno zawór wlotowy, jak i wylotowy.</li>
	<li>Zamontuj jeden koniec naczynia na prawej kaniuli i ostrożnie zawiąż go jednym cienkim pasmem nylonowego szwu. Za pomocą strzykawki przepłukać i napełnić naczynie roztworem HEPES przez zawór wlotowy. Przyłóż lewą kaniulę bliżej naczynia i zamontuj na nim drugi koniec naczynia. Zawiąż go nylonowym szwem. Napełnij komorę do 10 ml roztworem HEPES. Sprawdź, czy nie ma wycieków, delikatnie przepychając roztwór HEPES przez zawór wlotowy za pomocą strzykawki.</li>
	<li>Zamontuj komorę na miografie i pod kamerą wideo. Uruchomić dopływ tlenu i ciepła (37 °C) w komorze. Połączyć zawór wlotowy z rurką P1 z pierwszego zbiornika roztworu HEPES, gdy zawór jest zamknięty. Pozwól, aby wszelkie pęcherzyki i roztwór przeszły przez probówkę, aż w probówce nie będzie pęcherzyków. Otwórz zawór.</li>
	<li>Połączyć lewy zawór komory z rurką P2 pochodzącą z regulatora ciśnienia. Ponownie sprawdź, czy nie ma bąbelków. W całym systemie nie powinno być żadnych pęcherzyków ani wycieków.</li>
	<li>Przejdź do menu ciśnienia na panelu myo-interface lub w oprogramowaniu i włącz pompę, jednocześnie wyłączając przepływ.</li>
	<li>Otwórz program i kliknij przycisk ODBIERZ. Naczynie powinno być teraz widoczne na ekranie (Rysunek 3). Naczynie jest wizualizowane za pomocą kamery zamontowanej na mikroskopie, co pozwala na monitorowanie i analizę światła naczynia, średnicy naczynia i grubości ścianki.</li>
	<li>Stopniowo zwiększaj ciśnienie międzyświetlne za pomocą zaworu P1, wybierając ciśnienie P1 w panelu interfejsu myo lub w programie i wprowadź wartość ciśnienia w następujący sposób: 5 mmHg → 10 → 20 → 40 → 60 mmHg. Naczynie czasami ma tendencję do skręcania się lub zawijania podczas wzrostu ciśnienia; odpowiednio wyreguluj napięcie lub naprężenie za pomocą pionowego lub podłużnego mikropozycjonera (rysunek 2). Równoważyć naczynie przy 60 mmHg i temperaturze 37 °C co najmniej przez 45 minut. Jednorazową wymianę roztworu do kąpieli za pomocą wstępnie podgrzanego HEPES podczas równoważenia.</li>
	<li>Nałożyć 10 ml roztworu depolaryzującego KCl, podgrzanego w temperaturze 37 °C, do kąpieli, aby całkowicie zdepolaryzować komórki mięśni gładkich i osiągnąć maksymalne zwężenie. Po ustabilizowaniu zwężenia spłukać kąpiel roztworem HEPES 3 razy co 10 minut.</li>
	<li>Sprawdź żywotność naczynia i integralność śródbłonka poprzez stabilne i powtarzalne reakcje na dodanie fenylefryny (10-5 M) i acetylocholiny (10-5 M). Płukać 3 razy roztworem HEPES co 10 minut.</li>
	<li>Dodać fenylefrynę (10-5 M) w celu wstępnego zwężenia naczynia, a po uzyskaniu stabilnego zwężenia wykonać skumulowaną krzywą odpowiedzi stężenie-rozszerzenie naczyń krwionośnych (CRC) poprzez sekwencyjne dodawanie zwiększających się dawek acetylocholiny (10-9, 3 x 10-9, 10-8, 3 x 10-8, 10-7, 3 x 10-7, 10-6, 3 x 10-6, i 10-5 M). Po ostatniej dawce płukać 3 razy roztworem HEPES co 10 minut przed rozpoczęciem nowego CRC.</li>
	<li>Określ pasywną średnicę światła, stosując PSS wolny od Ca2+ zawierający 2 mM EGTA. Na podstawie zarejestrowanych śladów zmierz średnicę światła dla każdej odpowiedzi na dawkę (rysunek 4), która zostanie wykorzystana do obliczenia wszystkich parametrów.</li>
	<li>Wyrazić wszystkie reakcje relaksacji acetylocholiny jako procentową zmianę średnicy światła po wstępnym zwężeniu fenylefryny w porównaniu z różnicą między średnicą wolną od wapnia a średnicą po zwężeniu fenylefryny, stosując następujące równanie:</li>
	<li>Dylatacja procentowa = 100% x [(Dx - Di)/(Dbez Ca-free - Di)], gdzie D jest zmierzoną średnicą światła, a x, i Ca-free oznaczają średnice tętnic przy każdej dawce agonisty (x), średnicę początkową po zwężeniu fenylefryny (i) oraz w buforze wolnym od Ca2+ (bez Ca).</li>
</ol>
5. Analiza statystyczna
Wszystkie ciągłe pomiary są wyrażone jako średnia ±SEM. Reaktywność naczyniowa w tętnicach krezkowych jest analizowana za pomocą dwukierunkowej ANOVA z powtarzanymi pomiarami. We wszystkich przypadkach P < 0,05 jest uważane za statystycznie istotne.

<ol><li>Bridges, L. E., Williams, C. L., Pointer, M. A., Awumey, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenteric+artery+contraction+and+relaxation+studies+using+automated+wire+myography%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis+.Exp%22%5BJournal%5D)">Mesenteric artery contraction and relaxation studies using automated wire myography.</a> J. Vis .Exp. (55), e3119(2011).</li>
<li>Arribas, S. M., Daly, C. J., McGrath, I. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurements+of+vascular+remodeling+by+confocal+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Measurements of vascular remodeling by confocal microscopy.</a> Methods Enzymol. 307, 246-273 (1999).</li>
<li>Lei, C., Yu, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhaled+Nitric+Oxide+Attenuates+the+Adverse+Effects+of+Transfusing+Stored+Syngeneic+Erythrocytes+in+Mice+with+Endothelial+Dysfunction+after+Hemorrhagic+Shock%5BTitle%5D)+AND+%22Anesthesiology%22%5BJournal%5D)">Inhaled Nitric Oxide Attenuates the Adverse Effects of Transfusing Stored Syngeneic Erythrocytes in Mice with Endothelial Dysfunction after Hemorrhagic Shock.</a> Anesthesiology. , (2012).</li>
<li>Buys, E. S., Cauwels, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((sGC%CE%B11%CE%B21+attenuates+cardiac+dysfunction+and+mortality+in+murine+inflammatory+shock+models%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Heart+Circ.+Physiol%22%5BJournal%5D)">sGCα1β1 attenuates cardiac dysfunction and mortality in murine inflammatory shock models.</a> Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 297 (2), H654-H663 (2009).</li>
<li>Buys, E. S., Sips, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gender-specific+hypertension+and+responsiveness+to+nitric+oxide+in+sGC%CE%B11+knockout+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovasc.+Res%22%5BJournal%5D)">Gender-specific hypertension and responsiveness to nitric oxide in sGCα1 knockout mice.</a> Cardiovasc. Res. 79 (1), 179-186 (2008).</li>
<li>Panza, J. A., Quyyumi, A. A., Brush, J. E., Epstein, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Abnormal+endothelium-dependent+vascular+relaxation+in+patients+with+essential+hypertension%5BTitle%5D)+AND+%22N.+Engl.+J.+Med%22%5BJournal%5D)">Abnormal endothelium-dependent vascular relaxation in patients with essential hypertension.</a> N. Engl. J. Med. 323 (1), 22-27 (1990).</li>
<li>Huang, P. L., Huang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypertension+in+mice+lacking+the+gene+for+endothelial+nitric+oxide+synthase%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Hypertension in mice lacking the gene for endothelial nitric oxide synthase.</a> Nature. 377 (6546), 239-242 (1995).</li>
<li>Friebe, A., Koesling, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+function+of+NO-sensitive+guanylyl+cyclase%3A+what+we+can+learn+from+genetic+mouse+models%5BTitle%5D)+AND+%22Nitric+Oxide%22%5BJournal%5D)">The function of NO-sensitive guanylyl cyclase: what we can learn from genetic mouse models.</a> Nitric Oxide. 21 (3-4), 149-156 (2009).</li>
<li>Ehret, G. B., Munroe, P. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+variants+in+novel+pathways+influence+blood+pressure+and+cardiovascular+disease+risk%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Genetic variants in novel pathways influence blood pressure and cardiovascular disease risk.</a> Nature. 478 (7367), 103-109 (2011).</li>
<li>Buys, E. S., Raher, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+modifiers+of+hypertension+in+soluble+guanylate+cyclase+alpha1-deficient+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">Genetic modifiers of hypertension in soluble guanylate cyclase alpha1-deficient mice.</a> J. Clin. Invest. 122 (6), 2316-2325 (2012).</li>
<li>Kauffenstein, G., Laher, I., Matrougui, K., Guerineau, N. C., Henrion, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emerging+role+of+G+protein-coupled+receptors+in+microvascular+myogenic+tone%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovascular+Research%22%5BJournal%5D)">Emerging role of G protein-coupled receptors in microvascular myogenic tone.</a> Cardiovascular Research. 95 (2), 223-232 (2012).</li>
<li>Ruilope, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypertension+in+2010%3A+Blood+pressure+and+the+kidney%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Nephrol%22%5BJournal%5D)">Hypertension in 2010: Blood pressure and the kidney.</a> Nat. Rev. Nephrol. 7 (2), 73-74 (2011).</li>
<li>Michael, S. K., Surks, H. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+blood+pressure+arising+from+a+defect+in+vascular+function%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">High blood pressure arising from a defect in vascular function.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105 (18), 6702-6707 (2008).</li>
<li>Mendelsohn, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+hypertension%2C+the+kidney+is+not+always+the+heart+of+the+matter%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">In hypertension, the kidney is not always the heart of the matter.</a> J. Clin. Invest. 115 (4), 840-844 (2005).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Myszy są modelem eksperymentalnym wybieranym przez wielu badaczy, częściowo ze względu na możliwość wprowadzenia modyfikacji genetycznych, a tym samym uzyskania mysich modeli patofizjologii człowieka. Stan wazoaktywny małego oporu, ale nie większych naczyń przewodowych, w dużej mierze określa regulację przepływu krwi w całym układzie naczyniowym 11. Wielkość tętnic oporowych u małych zwierząt, takich jak myszy, uniemożliwia użycie miografu drucianego do badania funkcji mikrokrążenia. Miografy ciśnieniowe nie t...

Systemy miografów ciśnieniowych są używane do pomiaru funkcji fizjologicznych i właściwości małych tętnic, żył i innych naczyń. Nienaruszony mały odcinek tętnicy lub żyły jest montowany na dwóch małych szklanych kaniulach i poddawany ciśnieniu do odpowiedniego ciśnienia świetlnego, co pozwala naczyniu zachować większość swoich cech in vivo (ryc. 1 i 2). Stan zbliżony do fizjologicznego na miografie ciśnieniowym odzwierciedla zachowanie łożyska naczyniowego in vivo, co pozwala na badanie wewnętrznych właściwości (np. tonu miogennego) izolowanych naczyń. Niektóre z zalet miografii ciśnieniowej w porównaniu z miografią drucianą, w której skurcz mięśni jest oceniany przez bezpośrednie sprzężenie mechaniczne z przetwornikiem siły 1, obejmują (i) możliwość badania tętnic z mikrooporem, które definiują ogólny opór wytwarzany w układzie naczyniowym, podczas gdy miograf drutowy jest ograniczony do większych tętnic przewodowych, (ii) ryzyko uszkodzenia śródbłonka jest zmniejszone, ponieważ żadne przewody nie muszą być przewodzone przez światło naczynia, (iii) że naturalny kształt zbiornika jest lepiej zachowany, oraz (iv) że wymiary zbiornika mogą być badane w szerokim zakresie ciśnień lub naprężeń ścinających 2.
Badanie mikronaczyń może być bardziej pouczające niż badanie większych tętnic przewodowych, aby pomóc zrozumieć patofizjologię i mechanizmy molekularne, które przyczyniają się do zmiany napięcia naczyniowego w chorobach sercowo-naczyniowych, takich jak nadciśnienie. Na przykład upośledzenie funkcji śródbłonka związane z karmieniem myszy dietą wysokotłuszczową przez 8 tygodni można wykazać w tętnicach krezkowych 2. rzędu 3, ale nie w pierścieniach aortalnych (ryc. 3). Kolejną zaletą miografii ciśnieniowej jest to, że występuje wewnętrzne zwężenie miogenne naczynia ciśnieniowego oraz że można badać rolę i funkcję śródbłonka w tym zjawisku. W tym miejscu opisujemy zastosowanie miografu ciśnieniowego do badania reaktywności naczyniowej mysich tętnic oporowych krezki 3. rzędu w warunkach upośledzonej sygnalizacji tlenku azotu (NO)-cGMP.

<table><tbody><tr><td>NaCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP358</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2 (2H2O)</td><td>Fisher Scientific</td><td>C79-500</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>P9333</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4 </td><td>Fisher Scientific</td><td>M65-500</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4 </td><td>Sigma</td><td>P3786</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3 </td><td>Fisher Scientific</td><td>BP328</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Fisher Scientific</td><td>S318</td><td></td></tr><tr><td>D-Glucose</td><td>Sigma</td><td>G8270</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP121</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>Phenylephrine</td><td>Acros Organics</td><td>AC20724</td><td></td></tr><tr><td>Acetylocholina</td><td>Sigma</td><td>A6625</td><td></td></tr><tr><td>System miografu ciśnieniowego</td><td>DMT</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

ocena funkcji tętnicy oporowej myszy za pomocą miografii ciśnieniowej

Assessing Murine Resistance Artery Function Using Pressure Myography

Systemy miografu ciśnieniowego są niezwykle przydatne w ocenie funkcjonalnej małych tętnic, poddanych ciśnieniu do odpowiedniego ciśnienia przezściennego. Stan zbliżony do fizjologicznego osiągnięty w miografii ciśnieniowej pozwala na dogłębną charakterystykę wewnętrznych odpowiedzi na bodźce farmakologiczne i fizjologiczne, które można ekstrapolować na zachowanie łożyska naczyniowego in vivo. Miograf ciśnieniowy ma kilka zalet w porównaniu z konwencjonalnymi miografami drutowymi. Na przykład mniejsze naczynia oporowe mogą być badane przy ściśle kontrolowanych i fizjologicznie istotnych ciśnieniach śródświetlnych. Tutaj badamy zdolność tętnic krezkowych3 rzędu (o długości 3-4 mm), wstępnie zwężonych fenylefryną, do rozluźniania naczyń krwionośnych w odpowiedzi na acetylocholinę. Tętnice krezkowe są zamontowane na dwóch kaniulach połączonych z ciśnieniowym i szczelnym systemem, który jest utrzymywany pod stałym ciśnieniem 60 mmHg. Światło i zewnętrzna średnica naczynia są w sposób ciągły rejestrowane za pomocą kamery wideo, co pozwala na ilościowe określenie w czasie rzeczywistym zwężenia naczyń krwionośnych i wazorelaksacji w odpowiedzi odpowiednio na fenylefrynę i acetylocholinę.
	Aby zademonstrować możliwość zastosowania miografii ciśnieniowej do badania etiologii chorób sercowo-naczyniowych, oceniliśmy funkcję naczyń krwionośnych zależną od śródbłonka w mysim modelu nadciśnienia układowego. Myszy z niedoborem podjednostki α1 rozpuszczalnej cyklazy guanylanowej (sGCα1-/-) mają nadciśnienie, gdy znajdują się na tle 129S6 (S6) (sGCα1-/- S6), ale nie na tle C57BL / 6 (B6) (sGCα1-/-B6). Za pomocą miografii ciśnieniowej wykazujemy, że niedobór sGCα1 powoduje upośledzenie wazorelaksacji zależnej od śródbłonka. Dysfunkcja naczyń krwionośnych jest bardziej wyraźna u sGCα1-/- S6 niż u myszy sGCα1-/-B6, prawdopodobnie przyczyniając się do wyższego ciśnienia krwi u sGCα1-/- S6 niż u myszy sGCα1-/- B6. 
	Miografia ciśnieniowa jest stosunkowo prostą, ale czułą i mechanistycznie użyteczną techniką, która może być wykorzystana do oceny wpływu różnych bodźców na skurcz i rozluźnienie naczyń krwionośnych, zwiększając tym samym nasz wgląd w mechanizmy leżące u podstaw chorób sercowo-naczyniowych.

Tlenek azotu (NO) odgrywa centralną rolę w utrzymaniu homeostazy ciśnienia tętniczego krwi zarówno u ludzi 6 oraz w modelach zwierzęcych 7Zdolność NO do kontrolowania rozkurczu mięśni gładkich naczyń krwionośnych jest zapośredniczona przez rozpuszczalną cyklazę guanylową (sGC), zawierający hem heterodimeryczny enzym, który generuje cGMP. 8Niedawno zidentyfikowano wariant genetyczny modyfikujący ciśnienie tętnicze w locus zawierającym sGCα1 oraz sGCβ1 geny, ilustrując...

W miografii ciśnieniowej, nienaruszony mały fragment naczynia jest montowany na dwóch małych kaniulach i podbudowywany do odpowiedniego ciśnienia świetlnego. Tutaj opisujemy metodę pomiaru odpowiedzi wazorelaksacyjnej myszy tętnic krezkowych 3. rzędu u myszy c57 i sGCα1-/- myszy za pomocą miografii ciśnieniowej.

Ocena funkcji tętnicy oporowej myszy za pomocą miografii ciśnieniowej

Pressure myograph systems are  exquisitely useful in the functional assessment of small arteries, pressurized  to a suitable transmural pressure. The  ...

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest określenie reaktywności naczyniowej tętnicy oporowej myszy in vitro w czasie rzeczywistym w warunkach zbliżonych do fizjologicznych. Osiąga się to poprzez zamocowanie krótkiego odcinka naczynia na dwóch mikrokanulach i utrzymywanie w nim fizjologicznego ciśnienia w świetle naczynia. Następnie naczynie jest skurczone za pomocą fenylefryny, która jest agonistą receptorów alfa 1, aby zbadać zdolność dowolnego leku do rozszerzenia naczynia.Obciążenie zwężonego naczynia acetylocholiną pozwala ocenić jego zdolność do rozszerzania się w czasie rzeczywistym poprzez mechanizm zależny od śródbłonka. Wyniki pokazują procentową zmianę średnicy światła naczynia w odpowiedzi na acetylocholinę i potwierdzają, że niedobór SGC alpha one prowadzi do upośledzenia zależnego od śródbłonka rozszerzania naczyń. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak manometria drutowa, jest to, że manometria ciśnieniowa umożliwia charakterystykę małych mikronaczyń, które mają większe znaczenie dla utrzymania homeostazy ciśnienia tętniczego niż większe naczynia przewodzące.Niniejsza metoda może pomóc w uzyskaniu odpowiedzi na kluczowe pytania z zakresu kardiologii i angiologii, takie jak nadciśnienie tętnicze, w którym naczynia makrooporne odgrywają krytyczną rolę. Rozpocznij od eutanazji myszy za pomocą pentobarbitalu. Następnie otwórz jamę brzuszną i przystąp do wypreparowania tkanki krezkowej.Następnie zidentyfikuj tętnicę krezkową trzeciego rzędu i odizoluj ją od tkanki łącznej i tłuszczowej. Rozróżnienie tętnic i żył na poziomie mikronaczyniowym jest problematyczne, gdy w naczyniach nie ma krwi. Dlatego preferowane jest wykonywanie tej czynności u żywego zwierzęcia.Następnie odetnij segment tętnicy krezkowej trzeciego rzędu o długości od dwóch do trzech milimetrów i umieść go w naczyniu zawierającym bufor PSS. Segment tętnicy nie powinien zawierać żadnych rozgałęzień.Przygotuj komorę miograficzną, delikatnie napełniając kaniule poprzez zawory wlotowy i wylotowy roztworem HEPES-PSS za pomocą strzykawki o pojemności 10 ml; należy pamiętać, że nadmierne ciśnienie może uszkodzić delikatny przetwornik połączony z kaniulami. Po całkowitym napełnieniu kaniul zamknij oba zawory. Następnie przenieś wyizolowany segment tętnicy do komory i zamocuj jeden koniec naczynia na prawej kaniuli.Należy starannie zawiązać koniec za pomocą cienkiej nici z nylonowej szwy, a następnie, używając strzykawki, przepłukać i napełnić naczynie roztworem HEPES poprzez zawór wlotowy. Teraz należy zamocować drugi koniec naczynia do lewej kaniuli i zabezpieczyć kaniulę przy naczyniu nylonową szwą. Napełnić komorę do 10 ml roztworu HEPES.Sprawdź szczelność, delikatnie wtłaczkując roztwór HEP poprzez zawór wlotowy za pomocą strzykawki. Następnie umieść komorę pod kamerą wideo. Włącz dopływ tlenu i podgrzej komorę do 37 °C przy zamkniętym zaworze wlotowym, podłączonym do rurki P1 z pierwszego zbiornika z roztworem HEP.Pozostaw pęcherzyki powietrza i roztwór w rurce, aż w jej wnętrzu nie będzie już żadnych pęcherzyków. Następnie otwórz zawór. Podłącz do lewego zaworu komory za pomocą rurki P two.Upewniając się, że w całym układzie, od regulatora ciśnienia, nie ma pęcherzyków powietrza ani wycieków, przejdź do menu ciśnienia na panelu interfejsu myo lub w oprogramowaniu i włącz pompę, wyłączając jednocześnie przepływ. Otwórz program i kliknij „collect” (zbierz).Obecnie możliwe jest monitorowanie i analiza średnicy światła naczynia oraz grubości jego ścian. Aby stopniowo zwiększać ciśnienie w świetle naczynia, wybierz parametr ciśnienia P1 i wprowadź sekwencję rosnącego ciśnienia. Przy wartościach od 5 do 60 mmHg naczynia mogą czasami skręcać się lub zwijać w miarę wzrostu ciśnienia, dlatego należy odpowiednio dostosować naprężenie lub rozciąganie za pomocą mikropozycjonera w pionie lub wzdłuż osi.Gdy ciśnienie osiągnie 60 mm Hg, a kąpiel 37 °C, stabilizuj naczynie przez co najmniej 45 minut, maksymalnie przez jedną godzinę w okresie równowagowania. Wymień raz roztwór w kąpieli na wcześniej podgrzane buforowe roztwory. Po ustabilizowaniu odcinka tętnicy podaj 10 ml depolaryzującego roztworu chlorku potasu w temperaturze 37 °C.Mięśnie gładkie ulegną pełnej depolaryzacji i osiągną maksymalny skurcz. Po uzyskaniu stabilnego skurczu, wypłucz kąpiel roztworem HEP trzy razy w odstępach 10 minut. Następnie sprawdź żywotność naczynia oraz integralność śródbłonka.Najpierw należy obkurczyć naczynie, dodając fenylefrynę do stężenia 10⁻⁵ mol/l. Po uzyskaniu stabilnego skurczu należy przeprowadzić krzywą odpowiedzi rozszerzenia naczyń na kumulatywne stężenie poprzez sekwencyjne dodawanie wzrastających dawek acetylocholiny od 10⁻⁹ do 10⁻⁵ mol/l. Po podaniu ostatniej dawki acetylocholiny preparat należy trzykrotnie przepłukać roztworem HEPES w odstępach 10 minut.Następnie, na podstawie zarejestrowanych zapisów, wyznacz pasywną średnicę światła naczynia, stosując PSS bez wapnia zawierający 2 mmol/L EGTA. Zmierz średnicę światła dla każdej odpowiedzi na dawkę, co zostanie wykorzystane do obliczenia wszystkich parametrów. Wyraź odpowiedź rozkurczową na acetylocholinę jako porównanie efektu działania agonisty i buforu bez wapnia pod kątem stopnia, w jakim każdy z nich zmienił średnicę światła naczynia w stosunku do skurczu wywołanego fenylefryną.W celu zbadania rozkurczu naczyń w odpowiedzi na acetylocholinę wykorzystano myografię ciśnieniową w naczyniach oporowych krezki wyizolowanych od myszy typu dzikiego oraz myszy z nokautem SGC alpha one na tłach genetycznych S six i black six, które uprzednio zwężono za pomocą fenylefryny. Niedobór SGC alpha one wiązał się ze zmniejszoną zdolnością acetylocholiny do indukowania rozkurczu naczyniowego, niezależnie od tła genetycznego badanych myszy. Jednakże rozkurcz zależny od śródbłonka u myszy z nokautem SGC Alpha one był znacznie bardziej upośledzony na tle S six niż na tle black six.Wspólnie wyniki te sugerują, że zmniejszona wrażliwość naczyń krwionośnych na rozkurcz zależny od śródbłonka może przyczyniać się do nadciśnienia specyficznego dla szczepu u myszy z nokautem genu SGC Alpha one. Po opanowaniu technika ta może zostać wykonana w ciągu jednej lub dwóch godzin, jeśli jest przeprowadzona prawidłowo. Oprócz tej procedury, równolegle na żywych naczyniach krwionośnych można zastosować inne metody, takie jak mikroskopia konfokalna. Pozwoliłoby to, na przykład, na pomiar wewnątrzkomórkowych stężeń żelaza, co może pomóc w identyfikacji podstawowych mechanizmów sygnalizacyjnych.

assessing-murine-resistance-artery-function-using-pressure-myography

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Ocena funkcji muryny tętnicy oporowej z wykorzystaniem mikrografii ciśnieniowej

Opisano zautomatyzowaną metodę miografii do pomiarów siły w izolowanych tętnicach krezkowych. Wykorzystuje ona urządzenie Mulvany-Halpern Auto Dual Wire Myograph 510A do określania reakcji na fenylefrynę oraz wapń zewnątrzkomórkowy. Metoda ta pozwala na spójne określanie odpowiedzi izometrycznych na agonistów w małych naczyniach o średnicach od 60 do 300 μm, niezależnie od siebie.

Badania skurczu i rozkurczu tętnicy krezkowej z wykorzystaniem zautomatyzowanej miografii drucianej

Opisano pasywne badania mechaniczne tętnic szyjnych myszy, ze szczególnym uwzględnieniem dostosowania do różnego wieku preparatów. Procedury obejmują wyznaczanie długości tętnicy in vivo, montaż w myografie ciśnieniowym, rejestrację danych, pomiar wymiarów w stanie nieobciążonym oraz analizę uzyskanych danych.

Badania mechaniczne tętnic szyjnych myszy: od noworodka do osobnika dorosłego

Miografia ciśnieniowa służy do oceny wazoaktywności małych tętnic, które rozwijają trwałe zwężenie pod wpływem ciśnienia. Manuskrypt ten zawiera szczegółowy protokół oceny w izolowanych odcinkach małych tętnic krezkowych u szczurów, wazoaktywności i wpływu ciśnienia śródświetlnego na średnicę naczyń krwionośnych.

Ocena odpowiedzi miogennej i wazoaktywności w opornych tętnicach krezkowych za pomocą miografii ciśnieniowej

Niewydolność serca jest główną przyczyną hospitalizacji i główną przyczyną śmiertelności. Model trwałego podwiązania lewej przedniej zstępującej tętnicy wieńcowej u myszy stosuje się do badania przebudowy komór i dysfunkcji serca po zawale mięśnia sercowego. Przedstawiono technikę inwazyjnych pomiarów hemodynamicznych u myszy.

Trwałe podwiązanie lewej przedniej zstępującej tętnicy wieńcowej u myszy: model przebudowy po zawale mięśnia sercowego i niewydolności serca

Rezerwa przepływu wieńcowego (CFR) jest przydatna do oceny zapotrzebowania tlenu w mięśniu sercowym i oceny ryzyka sercowo-naczyniowego. W badaniu tym ustanowiono krok po kroku metodę echokardiografii dopplerowskiej przezklatkowej (TTDE) do podłużnego monitorowania zmian CFR, mierzonych z tętnicy wieńcowej u myszy, pod eksperymentalnym przeciążeniem ciśnieniowym pasma aorty.

Ultradźwiękowa ocena przepływu w tętnicach wieńcowych i rezerwy przepływu wieńcowego przy użyciu modelu przeciążenia ciśnieniowego u myszy

Ten manuskrypt opisuje protokoły mikroskopii wideo in vitro do oceny funkcji naczyniowej w tętnicach oporowych mózgu szczurów. W manuskrypcie opisano również techniki oceny gęstości mikronaczyń za pomocą znakowanej fluorescencyjnie lektyny i perfuzji tkanek za pomocą laserowej przepływometrii dopplerowskiej.

Ocena mechanizmów kontroli naczyniowej z wykorzystaniem wideomikroskopii izolowanych tętnic opornych szczurów

Technika wirekowego miografu jest używana do badania funkcji mięśni gładkich naczyń krwionośnych i badania przesiewowego nowych leków. Przedstawiamy szczegółowy protokół pomiaru izometrycznej kurczliwości tętnicy krezkowej myszy oraz badań przesiewowych nowych środków zwiotczających mięśnie gładkie naczyń krwionośnych.

Izometryczny pomiar kurczliwości tętnicy krezkowej myszy za pomocą miografii drutowej

Niniejszy protokół opisuje koncepcje i techniczne zastosowanie techniki miografu tensometrycznego z wykorzystaniem wielokomorowego systemu miograficznego w eksperymentalnej ocenie ex vivo funkcji śródbłonka aorty myszy.

Pomiar zależnej od śródbłonka wazorelaksacji w aorcie piersiowej myszy za pomocą tensometrycznej miografii komory o małej objętości

Obecny protokół opisuje uzyskanie zależności ciśnienie-objętość poprzez stymulację przezprzełykową, co służy jako cenne narzędzie do oceny funkcji rozkurczowej w mysich modelach niewydolności serca.

Kontrolowana stymulacja procedura oceny funkcji rozkurczowych zależnych od częstości akcji serca w modelach mysiej niewydolności serca

8-kanałowy system CODA do wysokoprzepustowego nieinwazyjnego pomiaru ciśnienia tętniczego pozwala na jednoczesny pomiar ciśnienia krwi u maksymalnie 8 myszy lub szczurów. Ten system z mankietem ogonowym wykorzystuje metodę Volume Pressure Recording (VPR) do pomiaru ciśnienia krwi poprzez wyznaczanie objętości krwi w ogonie.

Pomiar ciśnienia tętniczego u myszy z wykorzystaniem rejestracji objętościowo-ciśnieniowej metodą mankietu ogonowego

Poznaj ocenę reaktywności naczyń myszy za pomocą miografii ciśnieniowej tętnicy krezkowej. Ta technika pozwala badać rozkurcz naczyń zależny od śródbłonka w czasie rzeczywistym.

Ocena funkcji tętnicy oporowej myszy za pomocą miografii ciśnieniowej

Przeglądaj więcej filmów