Ocena funkcji tętnicy oporowej myszy za pomocą miografii ciśnieniowej

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest określenie reaktywności naczyniowej tętnicy opornej na mysz w czasie rzeczywistym in vitro w warunkach zbliżonych do fizjologicznych. Osiąga się to poprzez zamontowanie niewielkiego segmentu naczynia na dwóch mikrokaniulach i utrzymanie go w fizjologicznym ciśnieniu świetlnym. Naczynie jest następnie zwężane za pomocą agonisty receptora alfa jeden, fenylefryny, w celu zbadania zdolności dowolnego leku do rozszerzania naczynia.

Wyzwanie dla zwężonego naczynia za pomocą acetylocholiny ocenia jego zdolność do rozszerzania się w czasie rzeczywistym za pomocą mechanizmu zależnego od śródbłonka. Wyniki pokazują procentową zmianę średnicy światła w odpowiedzi na acetylocholinę i potwierdzają, że niedobór SGC alfa one powoduje upośledzone rozszerzenie naczyń krwionośnych zależne od śródbłonka. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak mamografia drutowa, jest to, że mamografia ciśnieniowa pozwala na scharakteryzowanie małych mikronaczyń, które są bardziej istotne w utrzymaniu homeostazy ciśnienia krwi niż większe naczynia przewodzące.

Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie układu sercowo-naczyniowego, takie jak nadciśnienie, w którym makrooporne naczynia odgrywają kluczową rolę. Zacznij od eutanazji myszy za pomocą pentobarbitalu. Teraz otwórz jamę brzuszną i zacznij wycinać tkankę krezkową.

Teraz zidentyfikuj tętnicę krezkową trzeciego rzędu i odizoluj ją od tkanki łącznej i tłuszczowej. Różnicowanie tętnic i żył na poziomie mikronaczyń jest problematyczne, gdy w naczyniach nie ma krwi. Dlatego lepiej jest zrobić to w nienaruszonym zwierzęciu.

Następnie wytnij odcinek tętnicy krezkowej trzeciego rzędu o długości od dwóch do trzech milimetrów i umieść go w naczyniu zawierającym stosy. Bufor PSS. Odcinek tętniczy nie powinien zawierać żadnych rozgałęzień.

Przygotuj komorę myo, delikatnie wypełniając kaniule przez zawory wlotowe i wylotowe roztworem PSS w stertach W przypadku strzykawki o pojemności 10 mililitrów należy pamiętać, że nadmierne ciśnienie może uszkodzić delikatny przetwornik podłączony do kaniul. Po szczelnym napełnieniu kaniul zamknij oba zawory. Teraz przenieś izolowany odcinek tętniczy do komory i zamontuj jeden koniec naczynia na prawej kaniuli.

Ostrożnie zawiąż go cienkim pasmem nylonowego szwu za pomocą strzykawki do płukania i napełnij naczynie roztworem hałdy przez zawór wlotowy. Teraz zamontuj drugi koniec naczynia na lewej kaniuli i przymocuj kaniulę do naczynia za pomocą nylonowego szwu. Napełnij komorę do 10 mililitrów roztworu hałdy.

Sprawdź, czy nie ma wycieków, delikatnie przepychając roztwór hałdy przez zawór wlotowy za pomocą strzykawki. Teraz umieść komorę pod kamerą wideo. Uruchom tlen i podgrzej komorę do 37 stopni Celsjusza, podczas gdy zawór wlotowy jest zamknięty, podłączony do P jedną rurkę z pierwszego zbiornika roztworu hałdy.

Pozwól, aby wszelkie pęcherzyki i roztwór przeszły przez probówkę, aż w probówce nie będzie pęcherzyków. Następnie otwórz zawór. Podłączyć do lewego zaworu komory za pomocą rurki P dwa.

Wychodząc z regulatora ciśnienia, upewnij się, że w całym układzie nie ma pęcherzyków ani wycieków. Przejdź do menu ciśnienia na panelu interfejsu myo lub w oprogramowaniu i włącz pompę, jednocześnie wyłączając przepływ. Otwórz program i kliknij zbierz.

Możliwe jest teraz monitorowanie i analiza średnicy naczynia świetlnego i grubości ścianki. Aby stopniowo zwiększać ciśnienie międzyświetlne, wybierz ciśnienie P one i wprowadź sekwencję ciśnienia rosnącego. Wartości od pięciu do 60 milimetrów zbiorników rtęciowych czasami skręcają się lub zawijają wraz ze wzrostem ciśnienia, dlatego należy odpowiednio dostosować napięcie lub naprężenie za pomocą pionowego lub podłużnego mikropozycjonera.

Gdy ciśnienie osiągnie 60 milimetrów, a kąpiel osiągnie temperaturę 37 stopni Celsjusza, należy równoważyć naczynie przez co najmniej 45 minut i do jednej godziny w okresie równowagi. Zmień roztwór do kąpieli raz za pomocą wstępnie rozgrzanych pryzmy. Teraz, gdy odcinek tętniczy jest zrównoważony, nałóż 10 mililitrów roztworu depolaryzującego chlorku potasu w temperaturze 37 stopni Celsjusza.

Mięśnie gładkie ulegną pełnej depolaryzacji i osiągną maksymalne zwężenie. Po uzyskaniu stabilnego zwężenia spłukać kąpiel roztworem z hałdy trzy razy w odstępach 10-minutowych. Teraz sprawdź żywotność naczynia i integralność śródbłonka.

Po pierwsze, wstępnie zwęź naczynie, dodając fenylefrynę, aby osiągnąć ujemne pięć moli na litr. Po uzyskaniu stabilnego zwężenia należy wykonać krzywą odpowiedzi rozszerzenia naczyń krwionośnych o skumulowanym stężeniu poprzez sekwencyjne dodawanie rosnących dawek acetylocholiny od 10 do ujemnej, od 9 do 10 do ujemnych pięciu moli na litr po ostatniej dawce acetylocholiny. Preparat należy przepłukać hałdami trzy razy w odstępach 10-minutowych.

Teraz określ pasywną średnicę światła, stosując wolny od wapnia PSS zawierający dwa milimole EGTA na litr z zarejestrowanych śladów. Zmierz średnicę światła dla każdej odpowiedzi na dawkę, która zostanie wykorzystana do obliczenia wszystkich parametrów. Wyraź odpowiedź relaksacyjną acetylocholiny jako porównanie między leczeniem agonistą a buforem wolnym od wapnia pod względem tego, jak bardzo każdy z nich zmienił średnicę światła w wyniku zwężenia wywołanego fenylefryną.

Miografia ciśnienia stanowego została wykorzystana do zbadania relaksacji naczyń krwionośnych w odpowiedzi na acetylocholinę w tętnicach oporności krezkowej wyizolowanych od myszy z nokautem typu dzikiego i SGC alfa one na tle S sześć i czarnych sześciu i wstępnie zwężonych fenylefryną. Niedobór SGC alfa one był związany ze zmniejszoną zdolnością acetylocholiny do wywoływania relaksu naczyniowego, niezależnie od tła genetycznego badanych myszy. Jednak zależna od śródbłonka relaksacja myszy zerowych SGC Alpha one była bardziej wyraźnie upośledzona w tle S six niż w czarnym szóstym tle.

Razem te odkrycia sugerują, że zmniejszona wrażliwość układu krwionośnego na relaksację zależną od śródbłonka może przyczyniać się do nadciśnienia specyficznego dla szczepu u myszy z nokautem SGC Alpha one Po opanowaniu tę technikę można wykonać w ciągu jednej lub dwóch godzin, jeśli zostanie wykonana prawidłowo. Oprócz tej procedury inne metody, takie jak mikroskopia konfokalna, mogą być wykonywane jednocześnie na naczyniach krwionośnych. Pozwoliłoby to na przykład na pomiar wewnątrzkomórkowych stężeń żelaza, który może pomóc w identyfikacji podstawowych mechanizmów sygnalizacyjnych.