Ocena funkcji tętnicy oporowej myszy za pomocą miografii ciśnieniowej

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest określenie reaktywności naczyniowej tętnicy oporowej myszy in vitro w czasie rzeczywistym w warunkach zbliżonych do fizjologicznych. Osiąga się to poprzez zamocowanie krótkiego odcinka naczynia na dwóch mikrokanulach i utrzymywanie w nim fizjologicznego ciśnienia w świetle naczynia. Następnie naczynie jest skurczone za pomocą fenylefryny, która jest agonistą receptorów alfa 1, aby zbadać zdolność dowolnego leku do rozszerzenia naczynia.

Obciążenie zwężonego naczynia acetylocholiną pozwala ocenić jego zdolność do rozszerzania się w czasie rzeczywistym poprzez mechanizm zależny od śródbłonka. Wyniki pokazują procentową zmianę średnicy światła naczynia w odpowiedzi na acetylocholinę i potwierdzają, że niedobór SGC alpha one prowadzi do upośledzenia zależnego od śródbłonka rozszerzania naczyń. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak manometria drutowa, jest to, że manometria ciśnieniowa umożliwia charakterystykę małych mikronaczyń, które mają większe znaczenie dla utrzymania homeostazy ciśnienia tętniczego niż większe naczynia przewodzące.

Niniejsza metoda może pomóc w uzyskaniu odpowiedzi na kluczowe pytania z zakresu kardiologii i angiologii, takie jak nadciśnienie tętnicze, w którym naczynia makrooporne odgrywają krytyczną rolę. Rozpocznij od eutanazji myszy za pomocą pentobarbitalu. Następnie otwórz jamę brzuszną i przystąp do wypreparowania tkanki krezkowej.

Następnie zidentyfikuj tętnicę krezkową trzeciego rzędu i odizoluj ją od tkanki łącznej i tłuszczowej. Rozróżnienie tętnic i żył na poziomie mikronaczyniowym jest problematyczne, gdy w naczyniach nie ma krwi. Dlatego preferowane jest wykonywanie tej czynności u żywego zwierzęcia.

Następnie odetnij segment tętnicy krezkowej trzeciego rzędu o długości od dwóch do trzech milimetrów i umieść go w naczyniu zawierającym bufor PSS. Segment tętnicy nie powinien zawierać żadnych rozgałęzień.

Przygotuj komorę miograficzną, delikatnie napełniając kaniule poprzez zawory wlotowy i wylotowy roztworem HEPES-PSS za pomocą strzykawki o pojemności 10 ml; należy pamiętać, że nadmierne ciśnienie może uszkodzić delikatny przetwornik połączony z kaniulami. Po całkowitym napełnieniu kaniul zamknij oba zawory. Następnie przenieś wyizolowany segment tętnicy do komory i zamocuj jeden koniec naczynia na prawej kaniuli.

Należy starannie zawiązać koniec za pomocą cienkiej nici z nylonowej szwy, a następnie, używając strzykawki, przepłukać i napełnić naczynie roztworem HEPES poprzez zawór wlotowy. Teraz należy zamocować drugi koniec naczynia do lewej kaniuli i zabezpieczyć kaniulę przy naczyniu nylonową szwą. Napełnić komorę do 10 ml roztworu HEPES.

Sprawdź szczelność, delikatnie wtłaczkując roztwór HEP poprzez zawór wlotowy za pomocą strzykawki. Następnie umieść komorę pod kamerą wideo. Włącz dopływ tlenu i podgrzej komorę do 37 °C przy zamkniętym zaworze wlotowym, podłączonym do rurki P1 z pierwszego zbiornika z roztworem HEP.

Pozostaw pęcherzyki powietrza i roztwór w rurce, aż w jej wnętrzu nie będzie już żadnych pęcherzyków. Następnie otwórz zawór. Podłącz do lewego zaworu komory za pomocą rurki P two.

Upewniając się, że w całym układzie, od regulatora ciśnienia, nie ma pęcherzyków powietrza ani wycieków, przejdź do menu ciśnienia na panelu interfejsu myo lub w oprogramowaniu i włącz pompę, wyłączając jednocześnie przepływ. Otwórz program i kliknij „collect” (zbierz).

Obecnie możliwe jest monitorowanie i analiza średnicy światła naczynia oraz grubości jego ścian. Aby stopniowo zwiększać ciśnienie w świetle naczynia, wybierz parametr ciśnienia P1 i wprowadź sekwencję rosnącego ciśnienia. Przy wartościach od 5 do 60 mmHg naczynia mogą czasami skręcać się lub zwijać w miarę wzrostu ciśnienia, dlatego należy odpowiednio dostosować naprężenie lub rozciąganie za pomocą mikropozycjonera w pionie lub wzdłuż osi.

Gdy ciśnienie osiągnie 60 mm Hg, a kąpiel 37 °C, stabilizuj naczynie przez co najmniej 45 minut, maksymalnie przez jedną godzinę w okresie równowagowania. Wymień raz roztwór w kąpieli na wcześniej podgrzane buforowe roztwory. Po ustabilizowaniu odcinka tętnicy podaj 10 ml depolaryzującego roztworu chlorku potasu w temperaturze 37 °C.

Mięśnie gładkie ulegną pełnej depolaryzacji i osiągną maksymalny skurcz. Po uzyskaniu stabilnego skurczu, wypłucz kąpiel roztworem HEP trzy razy w odstępach 10 minut. Następnie sprawdź żywotność naczynia oraz integralność śródbłonka.

Najpierw należy obkurczyć naczynie, dodając fenylefrynę do stężenia 10⁻⁵ mol/l. Po uzyskaniu stabilnego skurczu należy przeprowadzić krzywą odpowiedzi rozszerzenia naczyń na kumulatywne stężenie poprzez sekwencyjne dodawanie wzrastających dawek acetylocholiny od 10⁻⁹ do 10⁻⁵ mol/l. Po podaniu ostatniej dawki acetylocholiny preparat należy trzykrotnie przepłukać roztworem HEPES w odstępach 10 minut.

Następnie, na podstawie zarejestrowanych zapisów, wyznacz pasywną średnicę światła naczynia, stosując PSS bez wapnia zawierający 2 mmol/L EGTA. Zmierz średnicę światła dla każdej odpowiedzi na dawkę, co zostanie wykorzystane do obliczenia wszystkich parametrów. Wyraź odpowiedź rozkurczową na acetylocholinę jako porównanie efektu działania agonisty i buforu bez wapnia pod kątem stopnia, w jakim każdy z nich zmienił średnicę światła naczynia w stosunku do skurczu wywołanego fenylefryną.

W celu zbadania rozkurczu naczyń w odpowiedzi na acetylocholinę wykorzystano myografię ciśnieniową w naczyniach oporowych krezki wyizolowanych od myszy typu dzikiego oraz myszy z nokautem SGC alpha one na tłach genetycznych S six i black six, które uprzednio zwężono za pomocą fenylefryny. Niedobór SGC alpha one wiązał się ze zmniejszoną zdolnością acetylocholiny do indukowania rozkurczu naczyniowego, niezależnie od tła genetycznego badanych myszy. Jednakże rozkurcz zależny od śródbłonka u myszy z nokautem SGC Alpha one był znacznie bardziej upośledzony na tle S six niż na tle black six.

Wspólnie wyniki te sugerują, że zmniejszona wrażliwość naczyń krwionośnych na rozkurcz zależny od śródbłonka może przyczyniać się do nadciśnienia specyficznego dla szczepu u myszy z nokautem genu SGC Alpha one. Po opanowaniu technika ta może zostać wykonana w ciągu jednej lub dwóch godzin, jeśli jest przeprowadzona prawidłowo. Oprócz tej procedury, równolegle na żywych naczyniach krwionośnych można zastosować inne metody, takie jak mikroskopia konfokalna. Pozwoliłoby to, na przykład, na pomiar wewnątrzkomórkowych stężeń żelaza, co może pomóc w identyfikacji podstawowych mechanizmów sygnalizacyjnych.