Oznaczanie struktury i koordynacji kompleksów peptyd-metal metodą 1D i 2D ¹H NMR

Ogólnym celem niniejszej procedury jest określenie struktury kompleksu miedzi z mimetycznym peptydem białka chaperonowego metalo-zależnego. Zostanie to osiągnięte poprzez przygotowanie próbki w środowisku beztlenowym, a następnie pozyskanie danych spektroskopii magnetycznego rezonansu jądrowego (NMR), wykazujących oddziaływania między atomami wodoru.

Następnie oddziaływania przestrzenne są nanoszone na liniowy szablon peptydowy. Ostatnim krokiem jest znalezienie reprezentatywnej struktury o niskiej energii, która odpowiada danym. W końcowym etapie struktury wyznaczone metodą NMR są wykorzystywane do określenia sposobu wiązania oraz do przeprowadzenia analizy strukturalnej kompleksu związanego z miedzią.

Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak krystalografia rentgenowska, jest możliwość wykorzystania jej do badania słabo wiążących się kompleksów, a także cząsteczek i kompleksów, które nie krystalizują. Choć metoda ta pozwala uzyskać wgląd w białka wiążące miedź, może być ona zastosowana również w innych układach, takich jak inne białka szaperonowe metali, aby zbadać, w jaki sposób białka umożliwiają bezpieczny transport niezbędnych, lecz potencjalnie toksycznych jonów metali w środowisku linii komórkowych.

Aby rozpocząć, przygotuj próbki w środowisku beztlenowym, aby zapobiec utlenianiu miedzi. W celu przygotowania próbki APO rozpuść około 1-2 mg peptydu w 450–500 µL deuterowanego rozpuszczalnika klasy NMR. W przypadku próbki z reakcją miedzi rozpuść taką samą ilość peptydu jak w próbce APO wraz z równomolową ilością soli metalu w 450–500 µL rozpuszczalnika NMR. Przefiltruj każdy roztwór, używając szklanego filtra centrum lub jakiejkolwiek innej techniki odpowiedniej dla badanych związków, która nie powoduje ich absorpcji. Jest to niezbędne do usunięcia wszelkich cząstek metalicznych, które wpływałyby na homogeniczność.

Przenieś roztwory do probówek NMR i zamknij próbki w probówkach. Przed opuszczeniem rukawicy, wyjmij próbki z komory i je zapieczętuj. Zarejestruj jednowymiarowe widma protonowe próbek APO oraz próbek po reakcji z miedzią w spektrometrze NMR i porównaj je.

Peptyd APO jest elastyczny i wykazuje uśrednione konformacje, jednak po reakcji z miedzią amidy peptydu w kompleksie przyjmują bardziej sztywną strukturę. W związku z tym widmo peptydu zawierającego miedź powinno wykazać znaczną zmianę przesunięcia chemicznego w regionie amidowym, a piki mogą stać się rozdzielone. Należy przygotować zoptymalizowane eksperymenty NMR COSY, TOCSY, NOESY lub ROESY w identycznych warunkach, jak opisano w protokole tekstowym, i przeprowadzić je sekwencyjnie.

Pomiędzy poszczególnymi eksperymentami należy przeprowadzać eksperymenty jednowymiarowe, aby upewnić się, że skład próbki pozostaje stały podczas akwizycji danych. Po przetworzeniu danych zgodnie z opisem w protokole tekstowym, należy przygotować zestaw nałożonych na siebie widm COSY i TOCSY na widmo NOESY i ROSY. Pozwoli to na przypisanie wszystkich sygnałów NOE w widmie.

Rozpocznij od przypisania pików, które nakładają się na sygnały toksyczne w obszarze odcisków palców (fingerprint region). Ponieważ ułatwi to późniejsze wprowadzanie przypisań pików w programie Sparky, zapisz przypisane piki, przekształcając wartości sprzężeń H alpha z amidem białka na kąty hedralne. Przekształć również piki w więzy odległości, integrując piki wewnątrz programu i przeliczając je, korzystając z oddziaływania o znanej odległości.

Jeśli piki nakładają się na siebie lub automatyczne metody całkowania nie mogą zostać zastosowane, piki można oznaczyć jako silne, średnie, słabe lub bardzo słabe na podstawie oceny wizualnej, a oznaczenia te można przełożyć odpowiednio na odległości do 2.5, 3.5, 4.5 i 5.5 angstroms. Następnie należy zaimportować ograniczenia odległości i kąty dwuścienne w formacie zgodnym z programem Explore. Program Explore przeszuka przestrzeń konformacyjną, aby znaleźć struktury zgodne z kanoniczną geometrią chemiczną.

Oprócz eksperymentalnie wyznaczonych ograniczeń odległości, w celu wygenerowania ansamblu, w którym żaden z tych parametrów nie jest naruszony. Będzie on stanowił ansambl początkowy. Przeprowadź pierwsze wyznaczenie struktury bez zastosowania jakichkolwiek ograniczeń względem metalu, aby bez uprzedzeń ustalić, które reszty uczestniczą w wiązaniu metalu.

Wprowadzaj więzy stopniowo, aby ułatwić identyfikację błędów w przypisaniach, energii NOE oraz symulowanych parametrach kneeling, zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Przed minimalizacją struktur przy użyciu metody sprzężonych gradientów przez 4 000 iteracji, stwórz końcowy zespół składający się zazwyczaj z 50 członków, wprowadzając więzy w sposób iteracyjny na cały zespół; zgłoś liczbę znalezionych oddziaływań NOE każdego typu. Na koniec stwórz zespół struktur zgodnych z kanoniczną geometrią chemiczną oraz empirycznymi więzami pochodzącymi z NMR. Zgłoś całkowitą liczbę konformacji, liczbę tych, które wykazują naruszenia więzów pochodnych z NMR, a także wartość RMSD dla całego zespołu, uwzględniając wartości RMSD dla szkieletu białkowego oraz dla wszystkich ciężkich atomów.

Przeanalizuj zespół niskich energii i określ, które łańcuchy boczne reszt znajdują się w odpowiedniej bliskości względem siebie, aby umożliwić związanie jonu metalu. Po ich wyznaczeniu powtórz analizę, uwzględniając dane dotyczące wiązania miedzi. Do ograniczeń odległości wynikających z NMR dodaj teraz ograniczenia wiązania metalu dla określonych reszt.

Dodaj odpowiednie parametry opisujące jon metalu oraz jego topologię. Wprowadź do pliku parametrów właściwe informacje fizyczne, takie jak masa, długości wiązań z innymi atomami, kąty oraz parametry odpychania niewiążącego. Dodaj informacje o wiązaniach do pliku topologii.

Informacje te obejmują to, które wiązania są tworzone i zrywane oraz jakie ładunki formalne ulegają zmianie w wyniku wiązania. Na koniec należy pozyskać zespół struktur w taki sam sposób jak wcześniej, ponieważ rozwiązany zespół reprezentuje przestrzeń konformacyjną przyjętą przez peptyd. Podczas pomiaru NMR należy zaimportować wszystkie konformacje struktury do programu Mal Mall w celu stworzenia zespołu startowego.

Przeanalizuj zespół struktur, aby określić lokalną stabilność cząsteczki. Wyznacz wartości RMSD dla szkieletu i łańcuchów bocznych, wybierając kolejne regiony po cztery reszty wzdłuż sekwencji i zlecając programowi obliczenie RMSD względem struktury o najniższej energii lub struktury średniej. Określ, które regiony cząsteczki wykazują stabilność lokalną, wykreślając lokalne RMSD jako funkcję sekwencji, nałóż na siebie struktury z zespołu w tym regionie cząsteczki i wykorzystaj ten zespół do dalszych analiz. Wybierz konformacje o niskiej energii, które są zgodne z ograniczeniami wynikającymi z NMR.

Będą one tworzyć zapis zespołu niskiej energii oraz raportować liczbę konformacji w zespołach, kryteria ich wyboru oraz wartości RMSD. Jeśli tryb wiązania metalu nie został jeszcze ustalony, należy przeanalizować zespół niskiej energii i określić, które łańcuchy boczne reszt są nieprawidłowe pod kątem bliskości względem siebie, aby umożliwić wiązanie jonu metalu.

Użyj programu KYMERA, aby określić odległości wewnątrzcząsteczkowe między atomami podejrzewanymi o wiązanie metalu. Po ich wyznaczeniu oblicz średnie odległości w ansamblu. Powtórz analizę, uwzględniając dane dotyczące wiązania miedzi.

Przeanalizuj zespół struktur i określ lokalną strukturę drugorzędową w obrębie cząsteczki, korzystając z domyślnych parametrów wyszukiwania programu MAL mall. Następnie zaimportuj zespół struktur do programu kymera. Struktury drugorzędowe są stabilizowane przez wiązania wodorowe i wskazują stabilne regiony cząsteczki.

Wyznacz wiązania wodorowe przy użyciu narzędzia kymera. Kontynuuj analizę strukturalną zgodnie ze szczegółami opisanymi w protokole tekstowym. Następnie podsumuj wszystkie ustalenia strukturalne, aby wykazać, w jaki sposób wzajemnie się uzupełniają. Aby zbadać modele białek wiążących miedź, strukturę konserwowanej sekwencji wiążącej białka w pochodnym peptydzie liniowym określono za pomocą NMR w stanie roztworu, analizując obszar amidowy peptydu od 6,7 do 8,5.

PP M wykazał ekspansję po reakcji z miedzią do 6,6–9,0 PP M. W linii bazowej widoczne jest poszerzenie linii wynikające z niewielkiego utlenienia miedzi. Przedstawiono tutaj nałożenie obszarów w odcinku „fingerprint” widm Roy Toxi i cozy dla peptydu związanego z miedzią. Próbka była stabilna w czasie, a widma były dobrze rozdzielone i pozwoliły na uzyskanie 81 oddziaływań NOE, które pozyskano za pomocą eksperymentu rosy.

Ponieważ cząsteczka wykazała niemal zerowe oddziaływania NOE w eksperymencie NO C, zespół konformacyjny peptydu wyprowadzony dla próbki po reakcji, ale bez zastosowania więzów względem metalu, dał 47 na 50 struktur z wartością RMSD wynoszącą odpowiednio 1,44 i 2,07 angstroms dla szkieletu i ciężkich atomów. Z tych struktur wybrano 13 konformerów o niskiej energii do dalszej analizy, z wartościami RMSD wynoszącymi odpowiednio 0,25 i 0,61 angstroms dla szkieletu i ciężkich atomów. Wykres lokalnego RMSD wykazał obszar stabilności między resztami trzecią a siódmą. Oprócz sztywnego regionu C-końcowego, zawierającego resztę proliny, region ten występuje w konformacji zakola między resztami czwartą a siódmą we wszystkich konformacjach.

Potwierdzona konformacja zgięcia jest stabilizowana przez wiązania wodorowe między donorami i akceptorami szkieletu: glicyną 5 i 3, anionem 2, a także cysteiną 6 i cysteiną 3. Zgięcie to jest również widoczne w przypadku cysteiny 3 i seryny 7, co wynika z obniżonych wartości sprzężenia w tym obszarze. Konformacje zostały nałożone na siebie w tym regionie i przeanalizowane pod kątem potencjalnych reszt wiążących, przyjmując cysteinę 3, cysteinę 6 i metioninę 1 jako potencjalne reszty wiążące.

Najkrótsza odległość między atomami siarki występowała pomiędzy grupami folianowymi cysteiny trzy i cysteiny sześć; następnie wprowadzono wiązanie miedzi i powtórzono obliczenia, aby uzyskać zespół wykorzystany do analizy. Zespół o niskiej energii peptydu związanego z miedzią wykazuje, że amina terminalna znajduje się w bliskim sąsiedztwie związanej miedzi. Przedstawiona tutaj izopowierzchnia rozkładu potencjału elektrostatycznego ukazuje potencjał dodatni w kolorze niebieskim, a potencjał ujemny w kolorze czerwonym.

Pozostałość argininy wystaje z szkieletu peptydu, tworząc dodatni obszar potencjału elektrostatycznego, podczas gdy węgle szkieletowe są rozmieszczone w linii, tworząc mniej wyraźny ujemny potencjał elektrostatyczny. Po opanowaniu tej techniki wyznaczenie struktury może zająć około tygodnia czasu pracy z NMR oraz kilka kolejnych dni obróbki danych w celu uzyskania zespołu konformacji, które można wykorzystać do analizy strukturalnej. Po zastosowaniu tej procedury można przeanalizować inne mutanty peptydów oraz różne warunki, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania dotyczące warunków wymaganych dla różnych stopni wiązania i uwalniania jonu miedzi.