Oznaczanie struktury i koordynacji kompleksów peptyd-metal metodą 1D i 2D ¹H NMR

Ogólnym celem tej procedury jest określenie struktury peptydu mimetycznego białka opiekuńczego Metallo skompleksowanego z miedzią. Osiąga się to poprzez uprzednie przygotowanie próbki w środowisku beztlenowym. Drugim krokiem jest pozyskanie danych z magnetycznego rezonansu jądrowego lub spektroskopii NMR pokazujących oddziaływania między atomami wodoru.

Następnie oddziaływania przestrzenne są odwzorowywane na liniową matrycę peptydową. Ostatnim krokiem jest znalezienie reprezentatywnej struktury niskoenergetycznej, która pasuje do danych. Ostatecznie struktury pochodne NMR są wykorzystywane do określenia sposobu wiązania i przeprowadzenia analizy strukturalnej kompleksu związanego z miedzią.

Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi technikami, takimi jak krystalografia rentgenowska, jest to, że można jej używać do patrzenia na tygodniowe kompleksy wiążące, a także na cząsteczki i kompleksy, które nie krystalizują. Chociaż ta metoda może zapewnić wgląd w białka wiążące miedź. Można go również zastosować do innych systemów, takich jak inne metalowe ogniwa do badań, w jaki sposób białka umożliwiają bezpieczne dostarczanie niezbędnych, ale potencjalnie toksycznych jonów metali w środowisku linii komórkowej.

Aby rozpocząć, przygotuj próbki w środowisku beztlenowym, aby zapobiec utlenianiu się miedzi, aby przygotować próbkę APO, rozpuść około jednego do dwóch miligramów peptydu w 450 do 500 mikrolitrach deuterowanego rozpuszczalnika klasy NMR dla próbki przereagowanej miedzi, rozpuść taką samą ilość jak peptyd APO w molowej ilości soli metalu EQU w 450 do 500. Mikrolitry rozpuszczalnika NMR przefiltrować każdy roztwór za pomocą środkowej szklanej bibuły filtracyjnej lub innej techniki, która pasuje do badanych związków i nie wchłania ich. Jest to niezbędne do usunięcia wszelkich cząstek metalicznych, które wpłyną na jednorodność.

Przenieś roztwory do probówek NMR i zamknij próbki w probówkach. Przed opuszczeniem schowka na rękawiczki należy wyjąć próbki z komory rękawicowej i zapieczętować je. Zapisz jednowymiarowe widma protonów APO i próbek przereagowanych miedzi w maszynie NMR i porównaj.

Peptyd APO jest elastyczny i wykazuje średnią potwierdzeń, ale w reakcji z miedzią związane amidy peptydowe mają bardziej sztywną strukturę. W związku z tym widmo peptydów zawierających miedź powinno wykazywać znaczącą zmianę w przesunięciu chemicznym w regionie amidowym, a piki mogą ustąpić. Skonfiguruj zoptymalizowane, przytulne eksperymenty z toksyną, wścibstwem lub różem NMR w identycznych warunkach, jak opisano w protokole tekstowym i uruchom je po kolei.

Przeprowadzaj jednowymiarowe eksperymenty między każdym eksperymentem, aby upewnić się, że skład próbki pozostaje niezmienny przez cały czas pozyskiwania danych. Po przetworzeniu danych zgodnie z opisem w protokole tekstowym, przygotuj zestaw przytulnych i do widm nałożonych na widmo noea i różowe. Aby przypisać wszystkie piki NOE w widmie.

Zacznij od przypisania szczytów, które nakładają się na sygnały toksyny w obszarze odcisku palca. Ponieważ ułatwi to późniejsze wpisy przypisywania pików za pomocą rekordu programu Sparky, przypisane piki przekształcają wartości sprzężenia H alfa z białkiem amidowym na kąty dedalacji. Przekształcaj również szczyty w ograniczenia odległości, integrując szczyty z programu i tłumacząc je przy użyciu interakcji znanej odległości.

Jeśli piki nakładają się na siebie lub nie można zastosować metod automatycznej integracji, piki można oznaczyć jako silne, średnie, słabe lub bardzo słabe za pomocą oszacowania wizualnego, a oznaczenia te można przetłumaczyć na odległości odpowiednio do 2,5, 3,5, 4,5 i 5,5 angstremów. Importuj ograniczenia odległości i kąty dedalacji z odpowiednim formatem do eksploracji. Eksploruj przeszuka przestrzeń potwierdzeniową, aby znaleźć struktury, które są zgodne z kanoniczną geometrią chemiczną.

Oprócz eksperymentalnie znalezionych ograniczeń odległości w celu wygenerowania zespołu, w którym żaden z tych parametrów nie jest naruszony. Będzie to zespół wyjściowy. Wykonaj pierwszy przebieg określania struktury bez użycia żadnych ograniczeń dla metalu, aby znaleźć, które pozostałości uczestniczą w wiązaniu metalu bez żadnych uprzedzeń.

Wprowadzaj ograniczenia stopniowo, aby ułatwić identyfikację błędów w przypisaniu, a także energii NOE i symulowanych parametrów klęczenia, jak opisano w protokole tekstowym, zanim zminimalizujesz struktury za pomocą minimalizacji energii sprzężonego gradientu przez 4 000 iteracji, stwórz końcowy zespół składający się zwykle z 50 członków, wykonując wprowadzanie ograniczeń w sposób iteracyjny na całym zespole, zgłaszaj liczbę każdego typu znalezionej interakcji NOE. Na koniec utwórz zespół struktur, które są zgodne z kanoniczną geometrią chemiczną i empirycznym raportem o ograniczeniach pochodnych NMR. Całkowita liczba potwierdzeń, liczba tych, które naruszają ograniczenia NM Rived i RMSD całego zespołu, w tym zarówno wartości RMSD szkieletu, jak i wszystkich ciężkich atomów.

Przeanalizuj zespół o niskiej energii i określ, które łańcuchy boczne reszt znajdują się w odpowiedniej odległości od siebie, aby móc związać jon metalu. Po ich ustaleniu należy powtórzyć analizę, łącznie z danymi dotyczącymi wiązania miedzi. Oprócz ograniczeń odległości wyprowadzonych z NMR, należy teraz dodać wiązania metalu do wyznaczonych pozostałości.

Dodaj odpowiednie parametry, aby opisać jon metalu i jego topologię. Wprowadź do pliku parametrów odpowiednie informacje fizyczne, takie jak długość wiązania masowego z innymi atomami, kąty i parametry odpychania bez wiązania. Dodaj informacje o powiązaniu do pliku topologii.

Informacje te obejmują m.in., które wiązania są tworzone i zrywane oraz jakie opłaty formalne są zmieniane w wyniku związania. Na koniec uzyskaj zespół struktur, tak jak poprzednio, rozwiązany zespół reprezentuje przestrzeń potwierdzającą przyjętą przez peptyd. Podczas pomiaru NMR zaimportuj wszystkie potwierdzenia konstrukcji do programu Mal Mall, aby utworzyć zespół startowy.

Zbadaj zespół, aby określić lokalną stabilność cząsteczki. Określ wartości RMSD szkieletu i łańcucha bocznego, wybierając kolejne cztery regiony reszty wzdłuż sekwencji i zlecając programowi obliczenie RMSD do najniższej struktury energetycznej lub średniej, określ, które regiony cząsteczki wykazują lokalną stabilność, wykreślając lokalną wartość RMSD jako funkcję sekwencji, nałóż zespół wzdłuż tego regionu cząsteczki i użyj tego zespołu do dalszej analizy. Wybierz potwierdzenia o niskiej energii, które są zgodne z ograniczeniami pochodzącymi z NMR.

Będą one tworzyć zapis zespołu o niskiej energii i informować o liczbie potwierdzeń w zespole, kryteriach ich wyboru oraz wartościach RMSD. Jeśli tryb wiązania metalu nie został jeszcze określony, przeanalizuj zespół niskoenergetyczny i określ, które łańcuchy boczne pozostałości są nieprawidłowe. Bliskość od siebie, aby móc związać jon metalu.

Za pomocą KYMERA można określić odległości wewnątrzcząsteczkowe między atomami, co do których istnieje podejrzenie, że wiążą się z metalami. Oblicz średnie odległości w zespole po ich ustaleniu. Powtórzyć analizę, uwzględniając dane dotyczące wiązania miedzi.

Zbadaj zespół i określ lokalną strukturę drugorzędową w cząsteczce, korzystając z domyślnych parametrów wyszukiwania programu MAL Mall. Następnie zaimportuj zespół do kymery. Struktury drugorzędowe są utrzymywane przez wiązania wodorowe i wskazują stabilne regiony cząsteczki.

Określ wiązanie wodoru za pomocą narzędzia kymera. Kontynuuj analizę statyczno-wytrzymałościową zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Następnie zsumuj wszystkie odkrycia strukturalne, aby ujawnić, w jaki sposób wzajemnie się wzmacniają Aby zbadać modele białek wiążących miedź, strukturę konserwatywnej sekwencji wiązania białka w pochodnym peptydzie liniowym określono za pomocą NMR stanu roztworu, regionu amidowego peptydu od 6,7 do 8,5.

PP M wykazywał ekspansję w reakcji z miedzią do 6,6 do 9,0 PP M. Rozszerzenie linii spowodowane niewielkim utlenianiem miedzi jest widoczne w linii podstawowej. Pokazano tutaj nakładkę obszarów odcisków palców Roy Toxi i przytulne widma peptydu związanego z miedzią. Próbka była stabilna w czasie, a widma były dobrze rozdzielone i dały 81 oddziaływań NOE, które zostały uzyskane w różowym eksperymencie.

Ponieważ cząsteczka dawała bliskie zeru oddziaływania NOE w eksperymencie NO C, zespół peptydu uzyskany dla przereagowanej próbki, ale bez żadnych ograniczeń dla metalu, dał 47 z 50 nie-struktur o wartości RMSD wynoszącej odpowiednio 1,44 i 2,07 angstremów na szkielecie i ciężkich atomach. Spośród tych 13 niskoenergetycznych konformerów wybrano do dalszej analizy o wartościach RMSD wynoszących odpowiednio 0,25 i 0,61 angstrema na szkielecie i ciężkich atomach. Lokalny wykres RMSD wykazał obszar stabilności między resztami trzecim i siódmym Oprócz sztywnego obszaru końcowego C, w tym reszty prolenu, obszar ten znajduje się w potwierdzeniu zgięcia między resztą czwartą i siódmą we wszystkich potwierdzeniach.

Potwierdzenie zgięcia jest stabilizowane przez wiązania wodorowe między donorami i akceptorami szkieletu: glicyną piątą i trzecią aniną drugą, a także cysteiną szóstą i cysteiną trzecią. To zagięcie jest również widoczne w cystynie trzeciej i sinusoidalnej siódmej przez zmniejszone wartości sprzężenia w tym obszarze. Potwierdzenia nałożono na ten region i przeanalizowano pod kątem możliwych reszt wiążących, biorąc pod uwagę cystynę trzy, cystynę sześć i metioninę jeden jako potencjalne reszty wiążące.

Najkrótsza odległość między atomami siarki wynosiła między grupami foliowymi cysteiny trzeciej i cysteiny szóstej, wprowadzono wiązanie miedzi i powtórzono obliczenia, aby uzyskać zespół użyty do analizy. Niskoenergetyczny zespół peptydu związanego z miedzią pokazuje, że końcowa amina końcowa jest bliska związanej miedzi. Pokazano tutaj izopowierzchnię rozkładu potencjału elektrostatycznego z potencjałem dodatnim pokazanym na niebiesko i potencjałem ujemnym pokazanym na czerwono.

Reszta argininy rozciąga się od szkieletu peptydu, tworząc dodatni płat o potencjale elektrostatycznym, podczas gdy uzysk węgla w szkielecie jest ułożony w linię tworzącą mniej widoczny ujemny potencjał elektrostatyczny Po opanowaniu, określenie strukturalne można wykonać w ciągu około tygodnia czasu NMR i kolejnych kilku dni pracy w celu uzyskania zestawu potwierdzeń, które można wykorzystać do analizy strukturalnej. Zgodnie z tą procedurą, inne mutany peptydowe i różne warunki mogą być analizowane w celu udzielenia odpowiedzi na dodatkowe pytania, które dotyczą warunków wymaganych dla różnych stopni wiązania i uwalniania jonu miedzi.