Name: Oznaczanie struktury i koordynacji kompleksów peptyd-metal metodą 1D i 2D 1H NMR (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-12-16T13:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 44 s
Description: Poznaj metodę NMR do oznaczania struktury kompleksów peptyd-miedź w biologii strukturalnej. Protokół obejmuje przygotowanie próbki w środowisku beztlenowym, akwizycję danych 1D i 2D oraz analizę przestrzennych interakcji wodorowych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy za wsparcie finansowe Programowi Human Frontier Science (Young investigator grant (RGY)0068-2006).

1. Przygotowanie próbki
<ol>
	<li>Próbka Apo: Rozpuść około 1-2 mg peptydu w 450-500 μl deuterowanego rozpuszczalnika klasy NMR (preferowane roztwory dla próbek biologicznych to 10% D2O w wodzie lub d6-DMSO 11-12, jeśli próbka nie rozpuszcza się w wodzie lub reaguje z nią).</li>
	<li>Próbka przechodząca z miedzią: Rozpuścić około 1-2 mg peptydu w równomolowej ilości soli metalu w 450-500 μl rozpuszczalnika NMR.</li>
	<li>Przefiltrować roztwór za pomocą szkła spiekanego, bibuły filtracyjnej lub innej techniki, która pasuje do badanych związków i nie adsorbuje ich. Jest to niezbędne do usunięcia wszelkich cząstek metalicznych, które wpłyną na jednorodność.</li>
	<li>Przenieś roztwór do probówki NMR i zamknij ją. Upewnij się, że jakość rurki odpowiada zastosowanej sile magnesu (więcej szczegółów znajduje się w tabeli wyposażenia).</li>
	<li>Jeśli próbka jest wrażliwa na tlen, czynności te należy wykonać w środowisku obojętnym, a rurkę uszczelnić, aby zapobiec utlenianiu.</li>
</ol>
2. Gromadzenie i przetwarzanie danych NMR13
<ol>
	<li>Zapisać widma 1D 1H próbek przechodzących reakcje apo i miedzi i porównać. Widmo peptydów zawierających miedź powinno wykazywać znaczącą zmianę przesunięcia chemicznego w regionie amidu, a piki ustąpiły, ponieważ apeptyd jest elastyczny i wykazuje średnią konformacji, ale po reakcji z miedzią amidy peptydów związanych mają pojedynczą strukturę (ryc. 2).
	<ol>
		<li>Jeśli widmo nie uległo zmianie, zakłada się, że reakcja się nie powiodła.</li>
		<li>Jeśli próbka zmieni kolor na zielony, miedź utleni się w atmosferze, co może zmienić jej właściwości wiążące.</li>
		<li>W obu tych przypadkach próbka będzie musiała zostać ponownie wykonana.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Znajdź optymalne warunki temperaturowe dla pomiarów NMR, które zapewniają minimalne nakładanie się reszt amidowych o wąskich szerokościach linii.</li>
	<li>Skonfiguruj eksperymenty COSY14, TOCSY15 i NOESY16 lub ROESY17 NMR w identycznych warunkach (temperatura, pH itp.) i uruchom w sekwencji.
	<ol>
		<li>Eksperymenty COSY (Rysunek 3) i TOCSY (Rysunek 4) wykryją odpowiednio oddziaływania wiązań przelotowych sąsiednich i sąsiednich oddziaływań proton-proton o większym zasięgu. Widmo COSY dostarcza informacji o korelacjach HN-Hα, podczas gdy widmo TOCSY daje dodatkowo informacje o HN i innych protonach alifatycznych H skorelowanych reszt.</li>
		<li>Eksperymenty NOESY i ROESY (ryc. 5) wykrywają bliskość w przestrzeni bez zależności od wiązań w celu dostarczenia informacji strukturalnych. Wybór między nimi zależy od efektywnej wielkości związku i natężenia pola. Niektóre takie kombinacje dają teoretyczne sygnały zerowe (rysunek 6) i konieczne będzie przeprowadzenie eksperymentu ROESY w celu wykrycia oddziaływań NOE10,18.</li>
		<li>Jeśli próbka znajduje się w wodzie, eksperymenty muszą zawierać składnik tłumienia wody. Najefektywniej osiąga się to za pomocą gradientów19. W takim przypadku korzystne jest ponowne uruchomienie próbki, po przypisaniu, w czystym D2O w celu uzyskania interakcji z wodorami Hα i między nimi.</li>
		<li>Zoptymalizuj czas mieszania TOCSY i NOESY lub ROESY, przeprowadzając szereg krótkich eksperymentów w celu znalezienia maksymalnego narastania sygnału przy minimalnych stratach dyfuzji spinowej. Upewnij się, że jest to obszar liniowy krzywej narastania. Wartości wspólne dla peptydów w polach 600 MHz obejmują czasy mieszania wynoszące około 100 ms dla eksperymentów TOCSY i 150 ms dla eksperymentów NOESY lub ROESY.</li>
		<li>Przeprowadzaj eksperymenty 1D pomiędzy każdym eksperymentem, aby upewnić się, że skład próbki pozostaje niezmienny przez cały czas pozyskiwania danych (rysunek 7).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przetwarzaj widma za pomocą odpowiednich funkcji apodyzacji, aby uzyskać maksymalną rozdzielczość przy minimalnej utracie siły sygnału, dodając zerowe wypełnienie wymiaru t1.
	<ol>
		<li>Następnie popraw linię bazową w wymiarze F2, a następnie F1 za pomocą kwadratowej funkcji wielomianowej.</li>
		<li>Dokładnie skalibrować przesunięcie chemiczne widm zgodnie z resztkowymi pikami wody lub DMSO w odpowiednich rozpuszczalnikach zgodnie z ich przesunięciem w stosunku do znanych wzorców (odpowiednio TMSP lub TMS).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Szczytowe przypisywanie i integracja za pomocą SPARKY20
<ol>
	<li>Przygotuj zestaw widm COSY i TOCSY nałożonych na widmo NOESY lub ROESY (ryc. 8).</li>
	<li>Przypisz wszystkie piki NOE w widmie zgodnie z metodologią sekwencyjnego przypisywania opracowaną przez Wüthrich21.
	<ol>
		<li>Zacznij od przypisania pików, które nakładają się na sygnały TOCSY w obszarze odcisku palca, ponieważ ułatwi to późniejsze przypisywanie pików za pomocą programu SPARKY (ilustracja 9). Zarejestruj przypisanie przesunięcia chemicznego (rysunek 10) i wartości 3JHNHα (rysunek 11).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przekształć szczyty w wiązania odległości, a wartości 3JHNHα w kąty dwuścienne.
	<ol>
		<li>Można to osiągnąć, całkując piki z poziomu programu i przekształcając je w ograniczenia odległości za pomocą interakcji znanej odległości (takiej jak odległość między dwoma protonami grupy metylenowej lub aromatycznymi atomami wodoru aminokwasu aromatycznego).</li>
		<li>Jeśli piki nakładają się na siebie i nie można zastosować metod całkowania, można je oznaczyć jako silne-średnie-słabe-bardzo słabe za pomocą oszacowania wizualnego, a oznaczenia te można przetłumaczyć na odległości odpowiednio do 2,5, 3,5, 4,5 i 5,5 A. Ma to być najbardziej skuteczne w pracy z peptydami.</li>
		<li>3JWartości HNHα wskazują na kąty dwuścienne zgodnie z równaniem Karplusa, gdzie większość podanych wartości sprzężenia może wynikać z więcej niż jednego kąta dwuściennego. Mogą one wskazywać na strukturę drugorzędową (helisy lub arkusze), losowe zwoje lub ich średnie konformacyjne. Dlatego ważne jest, aby ostrożnie korzystać z ograniczeń lub używać ich jako potwierdzenia wyników konformacyjnych.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Obliczenia mechaniki molekularnej do generowania zespołu strukturalnego za pomocą XPLOR22
<ol>
	<li>Zaimportuj wiązania odległości i kąty dwuścienne w formacie odpowiednim dla XPLOR. (Rysunek 12, tylko ograniczenia międzyrezydualne). XPLOR przeszuka przestrzeń konformacyjną w celu znalezienia struktur, które przestrzegają kanonicznych geometrycznych ograniczeń chemicznych, takich jak długości wiązań, kąty, chiralność itp., oprócz eksperymentalnie znalezionych ograniczeń odległości, aby wygenerować zespół, w którym żaden z powyższych parametrów nie jest naruszony. Będzie to zespół wyjściowy.</li>
	<li>Pierwszy przebieg określania struktury będzie przebiegał bez użycia żadnych ograniczeń dla metalu. Pokaże to, które pozostałości uczestniczą w wiązaniu metalu bez żadnych odchyleń. Przejdź do kroku 4.4.</li>
	<li>Oprócz ograniczeń odległości wyprowadzonych przez NMR, należy dodać wiązania metali do wyznaczonych pozostałości.
	<ol>
		<li>Dodaj odpowiednie parametry, aby opisać jon metalu i jego topologię.</li>
		<li>Odpowiednie informacje fizyczne (masa, długości wiązań z innymi atomami, kąty i parametry odpychania bez wiązania) muszą być umieszczone w pliku parametrów.</li>
		<li>Dodaj informacje o powiązaniu do pliku topologii: Które wiązania są tworzone i zrywane oraz które ładunki formalne są zmieniane w wyniku wiązania.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Stwórz mały zespół składający się zwykle z 10 członków.
	<ol>
		<li>Wprowadzaj ograniczenia stopniowo, zaczynając od interakcji między szkieletem a szkieletem, następnie od szkieletu do łańcucha bocznego, a następnie od interakcji łańcucha bocznego do łańcucha bocznego i przechodząc od interakcji wewnątrzresztkowych, sekwencyjnych do interakcji o coraz większym zasięgu. Ułatwia to identyfikację błędów w przyporządkowaniu.</li>
		<li>Wprowadzić energię NOE jako potencjał kwadratowo-studzienkowy o stałej stałej siły 50 kcal/mol•Å2. Symulowane wyżarzanie powinno być wykonywane w krokach co 1 500 stóp i 3 sekundy w temperaturze 1 500 K i 3 000 w krokach co 1 sekundę podczas chłodzenia do 500 K. Na koniec zminimalizuj struktury za pomocą sprzężonej minimalizacji energii gradientu dla 4,000 iteracji; są to zmienne, które można zmieniać w XPLOR.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Stwórz ostateczny zespół składający się zwykle z 50 członków. Wykonaj kroki z kroku 4.4 na całym zespole.
	<ol>
		<li>Należy podać liczbę każdego rodzaju interakcji NOE, które zostały znalezione, jak pokazano na rysunku 13.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Utwórz zestaw struktur, które są zgodne z kanoniczną geometrią chemiczną i empirycznymi ograniczeniami pochodzącymi z NMR.
	<ol>
		<li>Proszę podać łączną liczbę konformacji, liczbę tych, które naruszają ograniczenia pochodzące z NMR, oraz wartość RMSD całego zespołu, zarówno szkieletu, jak i wszystkich wartości RMSD ciężkich atomów.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. Analiza struktury
<ol>
	<li>Rozwiązany zespół reprezentuje przestrzeń konformacyjną przyjętą przez peptyd podczas pomiaru NMR. Elastyczność lokalna może się zmieniać w różnych regionach cząsteczki i można to przypisać przyczynom strukturalnym lub funkcjonalnym (celem analizy strukturalnej jest określenie strukturalnych podstaw stabilności i mechanizmu działania).
	<ol>
		<li>Zaimportuj wszystkie konformacje struktury do programu MolMol23, aby utworzyć zespół początkowy (Rysunek 14) .</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zbadaj zespół, aby określić lokalną stabilność cząsteczki.
	<ol>
		<li>Określ wartości RMSD szkieletu i łańcucha bocznego, wybierając kolejne regiony z czterema resztami wzdłuż sekwencji i prosząc program o obliczenie RMSD do najniższej struktury energetycznej lub średniej.</li>
		<li>Określ, które regiony cząsteczki wykazują stabilność lokalną (ryc. 15), wykreślając lokalną wartość RMSD w funkcji sekwencji.</li>
		<li>Nałóż zespół wzdłuż tego obszaru cząsteczki i użyj tego zespołu do dalszej analizy (ryc. 16).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wybierz konformacje o niskiej energii, które są zgodne z ograniczeniami pochodzącymi z NMR (nienaruszone). Będą one tworzyć "zespół niskoenergetyczny".
	<ol>
		<li>Należy podać liczbę zgodności w zestawie, kryteria ich wyboru oraz wartości RMSD zdefiniowane w kroku 4.6.1.</li>
		<li>Jeśli tryb wiązania metalu został już określony, przejdź do następnego kroku. W przeciwnym razie: Przeanalizuj zespół o niskiej energii i określ, które łańcuchy boczne reszt znajdują się w odpowiedniej odległości od siebie, aby móc związać jon metalu. Po ich ustaleniu wróć do kroku 3.3 i ponownie wykonaj analizę, w tym dane dotyczące wiązania miedzi (rysunek 17 dla zespołu i rysunek 18 dla konformisty o niskiej energii).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zbadaj zespół i określ lokalną strukturę drugorzędową w cząsteczce, korzystając z domyślnych parametrów wyszukiwania programu MolMol. Struktury drugorzędowe są utrzymywane przez wiązania wodorowe i wskazują stabilne regiony cząsteczki.
	<ol>
		<li>Określ strukturę drugorzędową każdego konformera (rysunek 19).
		<ol>
			<li>Utwórz tabelę z procentem konformerów zespołu, które pokazują każdą strukturę drugorzędną.</li>
			<li>Określ, czy regiony o strukturze drugorzędowej nakładają się na regiony, które zostały określone jako regiony stabilne przez local-RMSD. Dzieje się tak często.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Określ odległości i wiązania wodorowe w cząsteczce.
	<ol>
		<li>Zaimportuj zespół do Chimera24.</li>
		<li>Użyj Chimery do określenia odległości wewnątrzcząsteczkowych między atomami, co do których istnieje podejrzenie, że wiążą się z metalami. Oblicz średnie odległości w zespole.</li>
		<li>Użyj Chimery, aby określić wewnątrzcząsteczkowe wiązania wodorowe w każdym konformerze zespołu (rysunek 20), używając domyślnych parametrów zrelaksowanych wiązań wodorowych (o 20%) programu.</li>
		<li>Utwórz tabelę z procentem konformerów zespołu, które pokazują każde wiązanie wodorowe. Wiązania wodorowe, które powtarzają się w większości konformacji, wskazują na stabilne wiązanie, które zwiększa stabilność struktury.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Określ oddziaływania elektrostatyczne w cząsteczce.
	<ol>
		<li>Zidentyfikuj interakcje między naładowanymi łańcuchami bocznymi.</li>
		<li>Utwórz tabelę z procentem konformerów zespołu, które pokazują każdą interakcję elektrostatyczną.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Oblicz rozkład potencjału elektrostatycznego za pomocą pola siłowego Amber25 w programie Delphi26.
	<ol>
		<li>Z zespołu należy wybrać pojedynczą reprezentatywną konformację, na której zostaną przeprowadzone obliczenia potencjału elektrostatycznego.</li>
		<li>Wyprowadź potencjał elektrostatyczny za pomocą równania Poissona-Boltzmana i pełnych obliczeń kulombowskich. Wymagane parametry obejmują siłę jonową roztworu, wartości dielektryczne roztworu (80 dla wody; 40 dla DMSO); peptyd wewnętrzny (zwykle około 5,0); wielkość siatki (zwykle 65'65'65 punktów); oraz minimalna odległość między peptydem a krawędzią siatki (10 A). Wyniki są zwykle dość solidne w odniesieniu do tych wartości, ponieważ główny wynik jest regulowany przez sam peptyd (Rysunek 21).</li>
		<li>Zbadaj potencjał elektrostatyczny odwzorowany na powierzchni peptydu Van der Waalsa (rysunek 22).</li>
		<li>Zbadaj izopowierzchnie potencjału elektrostatycznego, które opisują pozycje o tym samym potencjale. Znajdź powierzchnie izo, które sugerują znaczenie biologiczne, takie jak rozszerzone powierzchnie dodatnie lub ujemne, które mogą przyciągać lub odpychać inne białka lub ligandy, lub rozkłady, które wskazują na istotność, takie jak dystrybucja amfipatyczna lub plamy o różnych właściwościach (ryc. 23).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zsumuj wszystkie ustalenia strukturalne, aby zobaczyć, jak wzajemnie się wzmacniają.</li>
	<li>W stosownych przypadkach powtórzyć kroki 4.3–5.7.4.</li>
</ol>

<ol><li>Robinson, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+epitope+mimetics+as+anti-infectives%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Chem.+Biol%22%5BJournal%5D)">Protein epitope mimetics as anti-infectives.</a> Curr. Opin. Chem. Biol. 15, 379-386 (2011).</li>
<li>Huffman, D. L., Function O'Halloran, T. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((structure%2C+and+mechanism+of+intracellular+copper+trafficking+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Biochem%22%5BJournal%5D)">structure, and mechanism of intracellular copper trafficking proteins.</a> Annu. Rev. Biochem. 70, 677-701 (2001).</li>
<li>Tapiero, H., Townsend, D. M., Tew, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trace+elements+in+human+physiology+and+pathology%5BTitle%5D)+AND+%22Copper.+Biomed.%2C+%26+Pharmacotherapy%22%5BJournal%5D)">Trace elements in human physiology and pathology.</a> Copper. Biomed., & Pharmacotherapy. 57, 386-398 (2003).</li>
<li>Boal, A. K., Rosenzweig, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+Biology+of+Copper+Trafficking%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Rev%22%5BJournal%5D)">Structural Biology of Copper Trafficking.</a> Chem. Rev. 109, 4760-4779 (2009).</li>
<li>Rubino, J. T., Franz, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coordination+chemistry+of+copper+proteins%3A+How+nature+handles+a+toxic+cargo+for+essential+function%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Inorg.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Coordination chemistry of copper proteins: How nature handles a toxic cargo for essential function.</a> J. Inorg. Biochem. 107, 129-143 (2012).</li>
<li>Wernimont, A. K., Huffman, D. L., Lamb, A. L., O'Halloran, T. V., Rosenzweig, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+basis+for+copper+transfer+by+the+metallochaperone+for+the+Menkes%2FWilson+disease+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Struct.+Biol%22%5BJournal%5D)">Structural basis for copper transfer by the metallochaperone for the Menkes/Wilson disease proteins.</a> Nat. Struct. Biol. 7, 766-771 (2000).</li>
<li>Singleton, C., Hearnshaw, S., Zhou, L., Le Brun, N. E., Hemmings, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanistic+insights+into+Cu%28I%29+cluster+transfer+between+the+chaperone+CopZ+and+its+cognate+Cu%28I%29-transporting+P-type+ATPase%2C+CopA%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+J%22%5BJournal%5D)">Mechanistic insights into Cu(I) cluster transfer between the chaperone CopZ and its cognate Cu(I)-transporting P-type ATPase, CopA.</a> Biochem. J. 424, 347-356 (2009).</li>
<li>Hearnshaw, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Tetranuclear+Cu%28I%29+Cluster+in+the+Metallochaperone+Protein+CopZ%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem%22%5BJournal%5D)">A Tetranuclear Cu(I) Cluster in the Metallochaperone Protein CopZ.</a> Biochem. 48, 9324-9326 (2009).</li>
<li>Shoshan, M. S., Tshuva, E. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+MXCXXC+class+of+metallochaperone+proteins%3A+model+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Soc.+Rev%22%5BJournal%5D)">The MXCXXC class of metallochaperone proteins: model studies.</a> Chem. Soc. Rev. 40, 5282-5292 (2011).</li>
<li>Shoshan, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NMR+characterization+of+a+Cu%28I%29-bound+peptide+model+of+copper+metallochaperones%3A+Insights+on+the+role+of+methionine%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Comm%22%5BJournal%5D)">NMR characterization of a Cu(I)-bound peptide model of copper metallochaperones: Insights on the role of methionine.</a> Chem. Comm. 47, 6407-6409 (2011).</li>
<li>Schmitt, W., Zanotti, G., Wieland, T., Kessler, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conformation+of+different+S-deoxo-Xaa%283%29-amaninamide+analogues+in+DMSO+solution+as+determined+by+NMR+spectroscopy.+Strong+CD+effects+induced+by+beta+I%2C+beta+II+conformational+change%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Conformation of different S-deoxo-Xaa(3)-amaninamide analogues in DMSO solution as determined by NMR spectroscopy. Strong CD effects induced by beta I, beta II conformational change.</a> J. Am. Chem. Soc. 118 (3), 4380-4387 (1996).</li>
<li>Behrens, S., Matha, B., Bitan, G., Gilon, C., Kessler, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure-activity+relationship+of+the+ring+portion+in+backbone-cyclic+C-terminal+hexapeptide+analogs+of+substance+P+-+NMR+and+molecular+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Peptide+and+Protein+Res%22%5BJournal%5D)">Structure-activity relationship of the ring portion in backbone-cyclic C-terminal hexapeptide analogs of substance P - NMR and molecular dynamics.</a> Int. J. Peptide and Protein Res. 48, 569-579 (1996).</li>
<li>Overview TopSpin NMR - Software for NMR Data Analysis and NMR Spectra Data Procession | Bruker Corporation [Internet]. , Bruker Corporation. Available from: 
 <a target="_blank" href="http://www.bruker.com/products/mr/nmr/nmr-software/software/topspin">http://www.bruker.com/products/mr/nmr/nmr-software/software/topspin</a> (2013).</li>
<li>Aue, W. P., Bartholdi, E., Ernst, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((2-Dimensionsl+spectroscopy-+application+to+nuclear+magnetic+resonance%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Chem.+Phys%22%5BJournal%5D)">2-Dimensionsl spectroscopy- application to nuclear magnetic resonance.</a> J. Chem. Phys. 64, 2229-2246 (1976).</li>
<li>Bax, A., Davis, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MLEV-17-based+two-dimensional+homonuclear+magnetization+transfer+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Magn.+Reson%22%5BJournal%5D)">MLEV-17-based two-dimensional homonuclear magnetization transfer spectroscopy.</a> J. Magn. Reson. 65, 355-360 (1985).</li>
<li>Kumar, A., Ernst, R. R., Wüthrich, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+two-dimensional+nuclear+overhauser+enhancement+%282D+NO%29+experiment+for+the+elucidation+of+complete+proton-proton+cross-relaxation+networks+in+biological+macromolecules%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+Biophys.+Res.+Comm%22%5BJournal%5D)">A two-dimensional nuclear overhauser enhancement (2D NO) experiment for the elucidation of complete proton-proton cross-relaxation networks in biological macromolecules.</a> Biochem. Biophys. Res. Comm. 95, 1-6 (1980).</li>
<li>Bax, A., Davis, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Practical+aspects+of+two-dimensional+transverse+NOE+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Magn.+Reson%22%5BJournal%5D)">Practical aspects of two-dimensional transverse NOE spectroscopy.</a> J. Magn. Reson. 63, 207-213 (1985).</li>
<li>Williamson, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chapter+3+Applications+of+the+NOE+in+Molecular+Biology%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Reports+on+NMR+Spectroscopy%22%5BJournal%5D)">Chapter 3 Applications of the NOE in Molecular Biology.</a> Annu. Reports on NMR Spectroscopy. 65, 77-109 (2009).</li>
<li>Piotto, M., Saudek, V., Sklenar, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gradient-tailored+excitation+for+single-quantum+NMR-spectroscopy+of+aqueous+solutions%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomol.+NMR%22%5BJournal%5D)">Gradient-tailored excitation for single-quantum NMR-spectroscopy of aqueous solutions.</a> J. Biomol. NMR. 2, 661-665 (1992).</li>
<li>Sparky - NMR Assignment Program. , Available from: 
	 <a target="_blank" href="http://www.cgl.ucsf.edu/home/sparky">http://www.cgl.ucsf.edu/home/sparky</a> (2008).</li>
<li>Wüthrich, K. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aW%C3%BCthrich%2C+K+%22NMR+of+proteins+and+nucleic+acids%22">NMR of proteins and nucleic acids</a>. , J. Wiley & Sons Inc. (1986).</li>
<li>Nilges, M., Kuszewski, J., Brünger, A. T. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aNilges%2C+M+%22Comp.+aspects+study+biol.+macromol.+by+NMR%22">Comp. aspects study biol. macromol. by NMR</a>. , Plenum Press. (1991).</li>
<li>Koradi, R., Billeter, M., Wüthrich, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MOLMOL%3A+A+program+for+display+and+analysis+of+macromolecular+structures%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Molecular+Graphics%22%5BJournal%5D)">MOLMOL: A program for display and analysis of macromolecular structures.</a> J. Molecular Graphics. 14, 51(1996).</li>
<li>Pettersen, E. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((UCSF+chimera+-+A+visualization+system+for+exploratory+research+and+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Computational+Chem%22%5BJournal%5D)">UCSF chimera - A visualization system for exploratory research and analysis.</a> J. Computational Chem. 25, 1605-1612 (2004).</li>
<li>Pearlmen, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AMBER%2C+a+package+of+computer+programs+for+applying+molecular+mechanics%2C+normal+mode+analysis%2C+molecular+dynamics+and+free+energy+calculations+to+simulate+the+structural+and+energetic+properties+of+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Comp.+Phys%22%5BJournal%5D)">AMBER, a package of computer programs for applying molecular mechanics, normal mode analysis, molecular dynamics and free energy calculations to simulate the structural and energetic properties of molecules.</a> Comp. Phys. 91, 1-41 (1995).</li>
<li>Honig, B., Sharp, K., Yang, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macroscopic+models+of+aqueous+solutions-+biological+and+chemical+applications%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Phys.+Chem%22%5BJournal%5D)">Macroscopic models of aqueous solutions- biological and chemical applications.</a> J. Phys. Chem. 97, 1101-1109 (1993).</li>
</ol>

Autorzy deklarują, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Wkład informacji strukturalnych w zrozumienie mechanizmów wiązania jest powszechnie akceptowany. Peptydy są przydatne jako modele wiązania i interakcji białek; jednak nie podlegają głównej metodzie określania struktury, krystalografii rentgenowskiej. NMR jest szczególnie przydatny w tych systemach, ponieważ struktury można łatwo rozwiązać w roztworze. Dotyczy to zwłaszcza mimetyki metalochaperonu, które dodatkowo wymagają określenia struktury w środowisku obojętnym, aby zapobiec utlenianiu jonów metalu.
<p class="jov...

Peptydy są powszechnie używane jako modele białek, potencjalne leki prowadzące i środki terapeutyczne same w sobie. Jednak ich niewielkie rozmiary i wysoki stopień elastyczności często uniemożliwiają określenie struktury za pomocą promieniowania rentgenowskiego ze względu na trudności w krystalizacji.
Magnetyczny rezonans jądrowy (NMR) może być używany do określania struktur i oddziaływań peptydowych. Metoda może dostarczyć informacji dotyczących lokalnej i ogólnej struktury, wiązań i oddziaływań o niższym powinowactwie i ma zastosowanie do trudnych próbek, ponieważ można to zrobić w stanie roztworu.
Transport miedzi w systemach biologicznych jest osiągany przez wewnątrzkomórkowe białka metalochaperonu miedzi, które specyficznie wiążą jony Cu (I) i dostarczają je do docelowych białek poprzez szereg interakcji białko-białko, aby chronić jony przed utlenianiem i zapobiec uwalnianiu toksycznej miedzi2-5. Miejsce wiązania charakteryzuje się konserwatywną sekwencją, MXH / TCXanyXanyC, która, jak wykazano zarówno za pomocą NMR, jak i krystalografii, wiąże Cu (I) przez miękkie ligandy tiolatonowe dwóch reszt cysteiny, chociaż zaproponowano również dodatkowy ligand zewnętrzny6-8. Zależność struktura-funkcja tych białek jest przedmiotem intensywnych badań9.
W prezentowanym tutaj badaniu, model peptydowy, który zawiera konserwowaną sekwencję miedzianych metalochaperonów, został zsyntetyzowany i przechodził reakcję z Cu (I) w obojętnym środowisku. Prezentowany protokół opisuje etapy wyznaczania struktury za pomocą NMR, w tym przygotowanie próbki, zbieranie danych, przetwarzanie danych, generowanie struktury i analizę statyczno-wytrzymałościową. Analizę przeprowadzono w dwóch etapach: Najpierw wygenerowano struktury bez informacji na temat sposobu wiązania peptydu z jonem miedzi. Po empirycznym ustaleniu trybu wiązania wprowadzono te ograniczenia, aby zapewnić strukturę o wysokiej rozdzielczości. Sposób wiązania jest zasadniczym punktem w modelu i dlatego został określony w sposób bezstronny.
Strukturalne określanie modelowych peptydów metodą NMR jest niezwykle cenną techniką, często używaną przez chemików i biologów. Może być stosunkowo łatwo stosowany do różnych peptydów w różnych warunkach, a tym samym może rzucić światło na odpowiednie mechanizmy10. Zrozumienie procesu wyjaśniania struktury zapewnia lepsze zrozumienie mocnych i słabych stron proponowanych struktur.

<table><tbody><tr><td>Spektrometr Avance DMX 600 MHz</td><td>Probówki na próbki Bruker</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NMR&nbsp;</td><td>Wilmad</td><td>535-PP</td><td></td></tr><tr><td>Schowek na rękawiczki</td><td>MBraun</td><td>LM05-019</td><td></td></tr><tr><td>Liofilizator&nbsp; &nbsp;</td><td>VirTis</td><td>benchtopK</td><td></td></tr><tr><td>Peptide</td><td>BioChemia</td><td>Wykonane na zamówienie</td><td>>95% czystości</td></tr><tr><td>Chlorek miedzi (1)</td><td>Aldrich</td><td>224332</td><td></td></tr><tr><td>Kwas solny</td><td>BioLab</td><td>231-595-7</td><td></td></tr><tr><td>Wodorotlenek sodu</td><td>Gadot</td><td>1310-73-2</td><td></td></tr><tr><td>d6-dimetylosulfotlenek</td><td>Aldrich</td><td>236926</td><td></td></tr><tr><td>Tlenek deuteru</td><td>Aldrich</td><td>151882</td><td></td></tr></tbody></table>

oznaczanie struktury i koordynacji kompleksów peptyd-metal metodą 1d i 2d 1h nmr

Structure and Coordination Determination of Peptide-metal Complexes Using 1D and 2D 1H NMR

Wiązanie miedzi (I) przez białka transportujące metalochaperon zapobiega utlenianiu miedzi i uwalnianiu toksycznych jonów, które mogą uczestniczyć w szkodliwych reakcjach redoks. Kompleks Cu (I) peptydowego modelu białka metalochaperonu wiążącego Cu (I), który obejmuje sekwencję MTCSGCSRPG (podkreślenie jest konserwatywne), oznaczono w roztworze w warunkach obojętnych za pomocą spektroskopii NMR.
NMR jest powszechnie akceptowaną techniką określania struktur roztworów białek i peptydów. Ze względu na trudności w krystalizacji w celu uzyskania monokryształów odpowiednich do krystalografii rentgenowskiej, technika NMR jest niezwykle cenna, zwłaszcza że dostarcza informacji o stanie roztworu, a nie w stanie stałym. W tym miejscu opisujemy wszystkie kroki, które są wymagane do pełnego wyznaczenia struktury trójwymiarowej za pomocą NMR. Protokół obejmuje przygotowanie próbki w probówce NMR, gromadzenie i przetwarzanie danych 1D i 2D, przypisywanie i całkowanie pików, obliczenia mechaniki molekularnej i analizę struktury. Co ważne, analiza została najpierw przeprowadzona bez żadnych wstępnie ustawionych wiązań metal-ligand, aby zapewnić wiarygodne określenie struktury w bezstronny sposób.

W ramach trwającego badania modeli białek wiążących miedź, struktura konserwowanej sekwencji MT/HCXXC w liniowym peptydzie MTCSGCSRPG została określona za pomocą NMR w stanie roztworu. Peptyd poddano reakcji z CuCl w środowisku obojętnym, a pH zmierzono za pomocą uniwersalnego papierka wskaźkowego i wyniosło ono ~3,0. Region amidowy peptyd`) po reakcji z miedzią wykazał rozszerzenie, z zakresu 6,7-8,5 do 6,6-9,0 ppm (Rysunek 2). W linii bazowej widoczne jest poszerzenie sygnałów wynikające z niewielkiego...

Struktura roztworu NMR peptydu modelowego metalochaperonu z Cu (I) została określona, a szczegółowy protokół od przygotowania próbki i zbierania danych 1D i 2D do struktury trójwymiarowej jest opisany.

Oznaczanie struktury i koordynacji kompleksów peptyd-metal metodą 1D i 2D 1H NMR

Copper (I) binding by metallochaperone transport proteins prevents copper oxidation and release of the toxic ions that may participate in harmful redox ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest określenie struktury kompleksu miedzi z mimetycznym peptydem białka chaperonowego metalo-zależnego. Zostanie to osiągnięte poprzez przygotowanie próbki w środowisku beztlenowym, a następnie pozyskanie danych spektroskopii magnetycznego rezonansu jądrowego (NMR), wykazujących oddziaływania między atomami wodoru.Następnie oddziaływania przestrzenne są nanoszone na liniowy szablon peptydowy. Ostatnim krokiem jest znalezienie reprezentatywnej struktury o niskiej energii, która odpowiada danym. W końcowym etapie struktury wyznaczone metodą NMR są wykorzystywane do określenia sposobu wiązania oraz do przeprowadzenia analizy strukturalnej kompleksu związanego z miedzią.Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak krystalografia rentgenowska, jest możliwość wykorzystania jej do badania słabo wiążących się kompleksów, a także cząsteczek i kompleksów, które nie krystalizują. Choć metoda ta pozwala uzyskać wgląd w białka wiążące miedź, może być ona zastosowana również w innych układach, takich jak inne białka szaperonowe metali, aby zbadać, w jaki sposób białka umożliwiają bezpieczny transport niezbędnych, lecz potencjalnie toksycznych jonów metali w środowisku linii komórkowych.Aby rozpocząć, przygotuj próbki w środowisku beztlenowym, aby zapobiec utlenianiu miedzi. W celu przygotowania próbki APO rozpuść około 1-2 mg peptydu w 450–500 µL deuterowanego rozpuszczalnika klasy NMR. W przypadku próbki z reakcją miedzi rozpuść taką samą ilość peptydu jak w próbce APO wraz z równomolową ilością soli metalu w 450–500 µL rozpuszczalnika NMR. Przefiltruj każdy roztwór, używając szklanego filtra centrum lub jakiejkolwiek innej techniki odpowiedniej dla badanych związków, która nie powoduje ich absorpcji. Jest to niezbędne do usunięcia wszelkich cząstek metalicznych, które wpływałyby na homogeniczność.Przenieś roztwory do probówek NMR i zamknij próbki w probówkach. Przed opuszczeniem rukawicy, wyjmij próbki z komory i je zapieczętuj. Zarejestruj jednowymiarowe widma protonowe próbek APO oraz próbek po reakcji z miedzią w spektrometrze NMR i porównaj je.Peptyd APO jest elastyczny i wykazuje uśrednione konformacje, jednak po reakcji z miedzią amidy peptydu w kompleksie przyjmują bardziej sztywną strukturę. W związku z tym widmo peptydu zawierającego miedź powinno wykazać znaczną zmianę przesunięcia chemicznego w regionie amidowym, a piki mogą stać się rozdzielone. Należy przygotować zoptymalizowane eksperymenty NMR COSY, TOCSY, NOESY lub ROESY w identycznych warunkach, jak opisano w protokole tekstowym, i przeprowadzić je sekwencyjnie.Pomiędzy poszczególnymi eksperymentami należy przeprowadzać eksperymenty jednowymiarowe, aby upewnić się, że skład próbki pozostaje stały podczas akwizycji danych. Po przetworzeniu danych zgodnie z opisem w protokole tekstowym, należy przygotować zestaw nałożonych na siebie widm COSY i TOCSY na widmo NOESY i ROSY. Pozwoli to na przypisanie wszystkich sygnałów NOE w widmie.Rozpocznij od przypisania pików, które nakładają się na sygnały toksyczne w obszarze odcisków palców (fingerprint region). Ponieważ ułatwi to późniejsze wprowadzanie przypisań pików w programie Sparky, zapisz przypisane piki, przekształcając wartości sprzężeń H alpha z amidem białka na kąty hedralne. Przekształć również piki w więzy odległości, integrując piki wewnątrz programu i przeliczając je, korzystając z oddziaływania o znanej odległości.Jeśli piki nakładają się na siebie lub automatyczne metody całkowania nie mogą zostać zastosowane, piki można oznaczyć jako silne, średnie, słabe lub bardzo słabe na podstawie oceny wizualnej, a oznaczenia te można przełożyć odpowiednio na odległości do 2.5, 3.5, 4.5 i 5.5 angstroms. Następnie należy zaimportować ograniczenia odległości i kąty dwuścienne w formacie zgodnym z programem Explore. Program Explore przeszuka przestrzeń konformacyjną, aby znaleźć struktury zgodne z kanoniczną geometrią chemiczną.Oprócz eksperymentalnie wyznaczonych ograniczeń odległości, w celu wygenerowania ansamblu, w którym żaden z tych parametrów nie jest naruszony. Będzie on stanowił ansambl początkowy. Przeprowadź pierwsze wyznaczenie struktury bez zastosowania jakichkolwiek ograniczeń względem metalu, aby bez uprzedzeń ustalić, które reszty uczestniczą w wiązaniu metalu.Wprowadzaj więzy stopniowo, aby ułatwić identyfikację błędów w przypisaniach, energii NOE oraz symulowanych parametrach kneeling, zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Przed minimalizacją struktur przy użyciu metody sprzężonych gradientów przez 4 000 iteracji, stwórz końcowy zespół składający się zazwyczaj z 50 członków, wprowadzając więzy w sposób iteracyjny na cały zespół; zgłoś liczbę znalezionych oddziaływań NOE każdego typu. Na koniec stwórz zespół struktur zgodnych z kanoniczną geometrią chemiczną oraz empirycznymi więzami pochodzącymi z NMR. Zgłoś całkowitą liczbę konformacji, liczbę tych, które wykazują naruszenia więzów pochodnych z NMR, a także wartość RMSD dla całego zespołu, uwzględniając wartości RMSD dla szkieletu białkowego oraz dla wszystkich ciężkich atomów.Przeanalizuj zespół niskich energii i określ, które łańcuchy boczne reszt znajdują się w odpowiedniej bliskości względem siebie, aby umożliwić związanie jonu metalu. Po ich wyznaczeniu powtórz analizę, uwzględniając dane dotyczące wiązania miedzi. Do ograniczeń odległości wynikających z NMR dodaj teraz ograniczenia wiązania metalu dla określonych reszt.Dodaj odpowiednie parametry opisujące jon metalu oraz jego topologię. Wprowadź do pliku parametrów właściwe informacje fizyczne, takie jak masa, długości wiązań z innymi atomami, kąty oraz parametry odpychania niewiążącego. Dodaj informacje o wiązaniach do pliku topologii.Informacje te obejmują to, które wiązania są tworzone i zrywane oraz jakie ładunki formalne ulegają zmianie w wyniku wiązania. Na koniec należy pozyskać zespół struktur w taki sam sposób jak wcześniej, ponieważ rozwiązany zespół reprezentuje przestrzeń konformacyjną przyjętą przez peptyd. Podczas pomiaru NMR należy zaimportować wszystkie konformacje struktury do programu Mal Mall w celu stworzenia zespołu startowego.Przeanalizuj zespół struktur, aby określić lokalną stabilność cząsteczki. Wyznacz wartości RMSD dla szkieletu i łańcuchów bocznych, wybierając kolejne regiony po cztery reszty wzdłuż sekwencji i zlecając programowi obliczenie RMSD względem struktury o najniższej energii lub struktury średniej. Określ, które regiony cząsteczki wykazują stabilność lokalną, wykreślając lokalne RMSD jako funkcję sekwencji, nałóż na siebie struktury z zespołu w tym regionie cząsteczki i wykorzystaj ten zespół do dalszych analiz. Wybierz konformacje o niskiej energii, które są zgodne z ograniczeniami wynikającymi z NMR.Będą one tworzyć zapis zespołu niskiej energii oraz raportować liczbę konformacji w zespołach, kryteria ich wyboru oraz wartości RMSD. Jeśli tryb wiązania metalu nie został jeszcze ustalony, należy przeanalizować zespół niskiej energii i określić, które łańcuchy boczne reszt są nieprawidłowe pod kątem bliskości względem siebie, aby umożliwić wiązanie jonu metalu.Użyj programu KYMERA, aby określić odległości wewnątrzcząsteczkowe między atomami podejrzewanymi o wiązanie metalu. Po ich wyznaczeniu oblicz średnie odległości w ansamblu. Powtórz analizę, uwzględniając dane dotyczące wiązania miedzi.Przeanalizuj zespół struktur i określ lokalną strukturę drugorzędową w obrębie cząsteczki, korzystając z domyślnych parametrów wyszukiwania programu MAL mall. Następnie zaimportuj zespół struktur do programu kymera. Struktury drugorzędowe są stabilizowane przez wiązania wodorowe i wskazują stabilne regiony cząsteczki.Wyznacz wiązania wodorowe przy użyciu narzędzia kymera. Kontynuuj analizę strukturalną zgodnie ze szczegółami opisanymi w protokole tekstowym. Następnie podsumuj wszystkie ustalenia strukturalne, aby wykazać, w jaki sposób wzajemnie się uzupełniają. Aby zbadać modele białek wiążących miedź, strukturę konserwowanej sekwencji wiążącej białka w pochodnym peptydzie liniowym określono za pomocą NMR w stanie roztworu, analizując obszar amidowy peptydu od 6,7 do 8,5.PP M wykazał ekspansję po reakcji z miedzią do 6,6–9,0 PP M. W linii bazowej widoczne jest poszerzenie linii wynikające z niewielkiego utlenienia miedzi. Przedstawiono tutaj nałożenie obszarów w odcinku „fingerprint” widm Roy Toxi i cozy dla peptydu związanego z miedzią. Próbka była stabilna w czasie, a widma były dobrze rozdzielone i pozwoliły na uzyskanie 81 oddziaływań NOE, które pozyskano za pomocą eksperymentu rosy.Ponieważ cząsteczka wykazała niemal zerowe oddziaływania NOE w eksperymencie NO C, zespół konformacyjny peptydu wyprowadzony dla próbki po reakcji, ale bez zastosowania więzów względem metalu, dał 47 na 50 struktur z wartością RMSD wynoszącą odpowiednio 1,44 i 2,07 angstroms dla szkieletu i ciężkich atomów. Z tych struktur wybrano 13 konformerów o niskiej energii do dalszej analizy, z wartościami RMSD wynoszącymi odpowiednio 0,25 i 0,61 angstroms dla szkieletu i ciężkich atomów. Wykres lokalnego RMSD wykazał obszar stabilności między resztami trzecią a siódmą. Oprócz sztywnego regionu C-końcowego, zawierającego resztę proliny, region ten występuje w konformacji zakola między resztami czwartą a siódmą we wszystkich konformacjach.Potwierdzona konformacja zgięcia jest stabilizowana przez wiązania wodorowe między donorami i akceptorami szkieletu: glicyną 5 i 3, anionem 2, a także cysteiną 6 i cysteiną 3. Zgięcie to jest również widoczne w przypadku cysteiny 3 i seryny 7, co wynika z obniżonych wartości sprzężenia w tym obszarze. Konformacje zostały nałożone na siebie w tym regionie i przeanalizowane pod kątem potencjalnych reszt wiążących, przyjmując cysteinę 3, cysteinę 6 i metioninę 1 jako potencjalne reszty wiążące.Najkrótsza odległość między atomami siarki występowała pomiędzy grupami folianowymi cysteiny trzy i cysteiny sześć; następnie wprowadzono wiązanie miedzi i powtórzono obliczenia, aby uzyskać zespół wykorzystany do analizy. Zespół o niskiej energii peptydu związanego z miedzią wykazuje, że amina terminalna znajduje się w bliskim sąsiedztwie związanej miedzi. Przedstawiona tutaj izopowierzchnia rozkładu potencjału elektrostatycznego ukazuje potencjał dodatni w kolorze niebieskim, a potencjał ujemny w kolorze czerwonym.Pozostałość argininy wystaje z szkieletu peptydu, tworząc dodatni obszar potencjału elektrostatycznego, podczas gdy węgle szkieletowe są rozmieszczone w linii, tworząc mniej wyraźny ujemny potencjał elektrostatyczny. Po opanowaniu tej techniki wyznaczenie struktury może zająć około tygodnia czasu pracy z NMR oraz kilka kolejnych dni obróbki danych w celu uzyskania zespołu konformacji, które można wykorzystać do analizy strukturalnej. Po zastosowaniu tej procedury można przeanalizować inne mutanty peptydów oraz różne warunki, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania dotyczące warunków wymaganych dla różnych stopni wiązania i uwalniania jonu miedzi.

structure-coordination-determination-peptide-metal-complexes-using-1d

Research

JoVE Journal

Chemistry

Chemia

Struktura i koordynacja związków peptyd-metal używająca spektroskopii 1D i 2D 1H NMR

Ten protokół opisuje użycie reakcji sprzęgania amidowego kwasu izonikotynowego i diaminoalkanów do tworzenia ligandów mostkowych odpowiednich do użycia w syntezie wielojądrowych kompleksów platynowych, które łączą aspekty leków przeciwnowotworowych BBR3464 i pikoplatyny.

Reakcja sprzęgania amidowego do syntezy ligandów na bazie bispirydyny i ich kompleksowania do platyny jako dwujądrowych środków przeciwnowotworowych

Kompleksy fosforowo-wodorowe rutenu są powszechnie stosowane w jednorodnych reakcjach katalitycznych, takich jak uwodornienie. Przedstawiono syntezę szeregu nowych kompleksów rutenu trójzębnego zawierających ligand N-trifosu N(CH2PPh2)3. Dodatkowo opisano reakcję stechiometryczną kompleksu dwuwodorkowego Ru–N-trifosu z kwasem lewulinowym.

Synteza, charakterystyka i reaktywność szeregu kompleksówPh N-trifosu rutenu

Ten artykuł opisuje budowę serii wiązań wodorowych supramolekularnych klastrów w kryształach przy użyciu pierwotnych octanu amonu trifeny, które są rekrystalizowane z niepolarnych rozpuszczalników. Ta selektywna konstrukcja klastrów supramolekularnych prowadzi do efektywnych systematycznych badań symetrycznych dotyczących korelacji między klastrami supramolekularnymi a ich składnikami.

Budowa i systematyczne badania symetryczne szeregu klastrów supramolekularnych z binarnymi lub trójskładnikowymi trifenyooctaniami amonu

Przedstawiono charakterystykę kompleksów powstałych w różnych względnych proporcjach tetrapeptydów rtęci(II) do tetrapeptydów dicysteinylu za pomocą spektrometrii mas orbitrap z jonizacją elektrorozpylającą.

Badanie kompleksacji rtęci(II) z tetrapeptydami dicysteinylowymi za pomocą spektrometrii mas z jonizacją elektrorozpylania

Struktury supramolekularnych zespołów białkowych w rozdzielczości atomowej mają duże znaczenie ze względu na ich kluczowe role w różnych zjawiskach biologicznych. W niniejszym artykule przedstawiamy protokół do wykonywania wysokorozdzielczych badań strukturalnych nierozpuszczalnych i niekrystalicznych zespołów białek wielkocząsteczkowych za pomocą spektroskopii magnetycznego rezonansu jądrowego w stanie stałym z wirowaniem pod magicznym kątem (MAS SSNMR).

Badania strukturalne układów makromolekularnych w skali atomowej za pomocą spektroskopii magnetycznego rezonansu jądrowego w ciele stałym

Peptydy bogate w cysteinę składają się w odrębne trójwymiarowe struktury w zależności od ich połączeń dwusiarczkowych. Ukierunkowana synteza pojedynczych izomerów dwusiarczkowych jest wymagana, gdy utlenianie buforu nie prowadzi do pożądanego połączenia dwusiarczkowego. Protokół dotyczy selektywnej syntezy peptydów z wiązaniami 3-dwusiarczkowymi oraz ich analizy strukturalnej z wykorzystaniem badań NMR i MS/MS.

Synteza i oznaczanie struktury izomerów PIIIA μ-konotoksyny o różnych połączeniach dwusiarczkowych

Nowy katalizator metalowy grupy IV do metatezy aminy jest przygotowywany przez szczepienie kompleksu aminometalu na zdehydroksylowanej krzemionce. Powierzchniowe fragmenty metalu są charakteryzowane za pomocą FT-IR, mikroanalizy elementarnej i spektroskopii NMR w ciele stałym. Dalsze eksperymenty spektroskopii NMR z dynamiczną polaryzacją jądrową uzupełniają wyznaczanie sfery koordynacyjnej.

Metateza iminowa za pomocą katalizatorów na bazie krzemionki z wykorzystaniem metodologii chemii powierzchniowo-metaloorganicznej

Mobilność jonów-spektrometria mas i techniki modelowania molekularnego mogą scharakteryzować selektywną wydajność chelatacji metali zaprojektowanych peptydów wiążących metale oraz peptydu wiążącego miedź metanobaktyny. Opracowanie nowych klas peptydów chelatujących metale pomoże w opracowaniu metod leczenia chorób związanych z nierównowagą jonów metali.

Techniki spektrometrii ruchliwości jonów i mas do określania struktury i mechanizmów rozpoznawania jonów metali i aktywności redoks oligopeptydów wiążących metale

Przygotowanie kompleksów modelowych SNS z kleszczami kobaltu(II) dehydrogenazy alkoholowej wątroby jest przedstawione tutaj. Kompleksy można otrzymać w reakcji prekursora liganda z CoCl2·6H2O, a następnie można je rekrystalizować, pozwalając eterowi dietylowemu powoli dyfundować do roztworu acetonitrylu zawierającego kompleks kobaltu.

Otrzymywanie kompleksów modelu cęgowego SNS kobaltu(II) dehydrogenazy alkoholowej wątroby

Analiza kształtu linii widm NMR zebranych w różnych temperaturach służy jako przewodnik do przegrupowania wewnętrznych atomów sfery koordynacyjnej w chiralnym, ośmiowspółrzędnym kompleksie poliwodorkowym renu(V), ReH5(PPh3)2(sec-butyloamina). Analiza kształtu linii jest również wykorzystywana do określenia parametrów aktywacji ΔH‡, ΔS‡ i ΔG‡ dla tych przegrupowań atomów.

Analiza kształtu linii dynamicznych widm NMR w celu scharakteryzowania przegrupowań sfer koordynacyjnych w chiralnym kompleksie poliwodorku renu

Poznaj metodę NMR do oznaczania struktury kompleksów peptyd-miedź w biologii strukturalnej. Protokół obejmuje przygotowanie próbki w środowisku beztlenowym, akwizycję danych 1D i 2D oraz analizę przestrzennych interakcji wodorowych.

Oznaczanie struktury i koordynacji kompleksów peptyd-metal metodą 1D i 2D ¹H NMR

Przeglądaj więcej filmów