Badania strukturalne układów makromolekularnych w skali atomowej za pomocą spektroskopii magnetycznego rezonansu jądrowego w ciele stałym

Ogólnym celem niniejszego protokołu jest badanie struktur nierozpuszczalnych i niekrystalicznych supermolekularnych kompleksów białkowych w rozdzielczości atomowej za pomocą spektroskopii NMR w stanie ciało z rotacją w kącie magicznym (MAS). Przedstawimy kluczowe kroki metodologiczne służące do badania struktur atomowych biomolekularnych kompleksów białkowych metodą NMR w stanie ciało. Badanie struktur atomowych tych kompleksów jest niezwykle trudne, ponieważ są one z natury nierozpuszczalne i niekrystaliczne.

NMR w stanie stałym to rozwijająca się technika pozwalająca na badanie struktury i dynamiki cząsteczkowej z rozdzielczością atomową, bez ograniczeń wynikających z rozmiaru złożonego obiektu lub jego rozpuszczalności. Przedstawiamy tutaj kluczowe etapy wizualizacji struktur atomowych biomolekularnych kompleksów białkowych za pomocą NMR w stanie stałym, w tym przygotowanie próbek znakowanych izotopowo, gromadzenie oraz analizę danych strukturalnych z NMR w stanie stałym. Pierwszym krokiem w procesie NMR w stanie stałym jest produkcja podjednostek białkowych znakowanych C13 N15 oraz ich montaż in vitro.

Zaszczep 15 ml prekultury w uprzednio ogrzanym medium LB, używając jednej kolonii transformowanych komórek E.coli. Inkubuj przez noc w temperaturze 37°C przy wytrząsaniu z prędkością 200 RPM. Aby zaszczepić kulturę główną, przenieś całą prekulturę do jednego litra uprzednio ogrzanego medium N9 zawierającego niezbędne izotopowo znakowane źródła węgla i azotu.

Mogą to być: chlorek amonu znakowany $^{15}\text{N}$, glukoza jednolicie znakowana $^{13}\text{C}$, glukoza selektywnie znakowana $^{13}\text{C}$ lub glicerol selektywnie znakowany $^{13}\text{C}$. Inkubować w temperaturze 37 °C i pomierzyć gęstość optyczną przy 600 nm, gdy tylko hodowla stanie się mętna. Po osiągnięciu wartości OD wynoszącej 0,8, indukować ekspresję białka za pomocą 0,75 mM IPTG przez cztery godziny. Należy pamiętać, że optymalne warunki indukcji mogą różnić się w zależności od białka.

Odzyskać komórki poprzez wirowanie przez 30 minut przy 6 000 G i temperaturze czterech stopni. Po oczyszczeniu podjednostek białkowych są one składane in vitro. Skoncentrować białko do stężenia około jednego mili mola w jednostce filtra wirowarkowego.

Aby to osiągnąć, należy wprowadzić próbkę do jednostki filtrującej i wirować przy 4 000 G przez 30 minut. Między etapami wirowania należy delikatnie wymieszać roztwór w jednostce filtrującej za pomocą pipety, aby uniknąć osadzania się białek na membranie filtra. Powtarzać procedurę aż do uzyskania pożądanego stężenia.

Przenieś próbkę do probówki typu Falcon i inkubuj pod wpływem mieszania przez tydzień w temperaturze pokojowej. Zazwyczaj polimeryzacji podjednostek w filamenty towarzyszy zmętnienie roztworu. Dodaj 0,02% w/v azotku sodu, aby zapobiec kontaminacji bakteryjnej.

Aby zebrać kompleks białkowy, odwiruj próbkę przez jedną godzinę przy 20 000 G i temperaturze czterech stopni. Odessaj większość supernatantu, pozostawiając jedynie ilość płynu wystarczającą do pokrycia powierzchni, aby zapobiec wyschnięciu próbki, a następnie przechowuj ją w temperaturze czterech stopni do momentu pomiaru. Przedstawimy kluczowe eksperymenty niezbędne do analizy strukturalnej metodą NMR w stanie stałym.

Jednowymiarowe eksperymenty polaryzacji krzyżowej (cross polarization, CP) oraz INEPT, przeprowadzane na jądrach C13, są wykorzystywane odpowiednio do wykrywania sztywnych i elastycznych segmentów białek w kompleksie, a także do oceny stopnia homogeniczności strukturalnej i polimorfizmu lokalnego. W niniejszej pracy stosujemy standardowe wartości eksperymentalne.

Typowe zakresy parametrów są wskazane w protokole. Wsuń rotor do magnesu NMR i uruchom wirowanie pod kątem magicznym zgodnie z opisem w protokole. Ustaw pożądaną częstotliwość wirowania i upewnij się, że stabilizacja mieści się w granicach plus lub minus 10 hertz.

Nagraj pojedyncze jednowymiarowe widmo protonowe z impulsem, wykorzystując 16 skanów. Przygotuj eksperyment CP 1D proton-węgiel. Eksperymenty CP wykazują sygnały pochodzące z reszt o sztywnej konformacji. Początkowe parametry eksperymentu zostały przyjęte ze standardowej procedury optymalizacji na związku referencyjnym.

Parametry kalibracji i rozsprzęgania impulsów można zoptymalizować na próbce, gdy czułość jest wystarczająco wysoka. W tym przypadku rejestrujemy sygnał CP z 16 skanami. Czas kontaktu CP oraz poziomy mocy są dobierane na podstawie maksymalnej intensywności sygnału, co zaprezentowano tutaj w przypadku optymalizacji czasu kontaktu CP.

Maksymalna intensywność w tym przykładzie zostaje osiągnięta w 800 milisekundach. Parametry rozsprzęgania powinny zostać ponownie dostrojone względem wartości pierwotnie ustalonych podczas kalibracji związku referencyjnego. Na koniec należy uważnie monitorować położenie bocznych pasm wirowania przy danej częstotliwości magicznego kąta wirowania, przedstawionej tutaj jako 18 kilohertz, aby uniknąć nakładania się na sygnał.

Należy zarejestrować referencyjne jednowymiarowe widmo CP proton-węgiel, które posłuży jako jednowymiarowy odcisk widmowy. W tym celu gromadzimy 128 skanów przy czasie kontaktu CP wynoszącym 800 ms, sile rozsprzęgania 100 kHz, czasie recyklingu trzech sekund oraz czasie akwizycji 20 ms. Eksperyment CP należy przetworzyć bez apatyzacji.

Wybierz i wyizoluj pik, aby oszacować C39 w próbce, co jest wskaźnikiem uporządkowania strukturalnego i jednorodności. W tym przypadku szerokość linii, mierzona jako pełna szerokość po połowie maksymalnej wysokości (FWHM), wynosi około 60 do 70 hertz, co wskazuje na dobrze uporządkowaną strukturę białka w kompleksie. Konfiguruj jednowymiarowy eksperyment INEPT dla protonów i węgla, aby zbadać wysoce mobilne części kompleksu białkowego.

Należy zarejestrować referencyjny eksperyment INEPT, który będzie służył jako wzorzec dla ruchomych segmentów białek. Typowe parametry to 128 skanów oraz czas akwizycji wynoszący 25 milisekund. Następnie należy przetworzyć dane z eksperymentu INEPT dla protonów i węgla.

Liczba sygnałów oraz ich położenie świadczą odpowiednio o stopniu mobilności reszt oraz o składzie aminokwasowym. W tym przypadku obserwuje się jedynie sygnał z grupy CH2 w buforze skrętnym (twist buffer), ponieważ całe białko w strukturze kompleksu znajduje się w reżimie sztywnym. Analiza konformacyjna struktury białka opiera się na przypisaniach rezonansów NMR w stanie stałym dla wszystkich sztywnych reszt w kompleksie.

Jest to możliwe, ponieważ przesunięcia chemiczne są bardzo czułymi wskaźnikami lokalnego środowiska chemicznego i mogą być wykorzystane do przewidywania struktury drugorzędowej białka. Pełne wyznaczenie struktury 3D opiera się następnie na zbiorze danych strukturalnych, takich jak ograniczenia dystansu, które kodują bliskość atomów wewnątrz- i międzycząsteczkowych do dziewięciu angstromów. W tej części pokażemy, w jaki sposób rejestruje się podstawowe eksperymenty dwuwymiarowe oraz przedstawimy przykład przypisania sekwencyjnego.

Następnie przeprowadzimy krótką demonstrację sposobu zbierania ograniczeń odległości z eksperymentów zarejestrowanych na próbkach selektywnie znakowanych C13. Skonfiguruj dwuwymiarowy eksperyment carbon carbon PDSD z krótkim czasem mieszania, aby wykryć korelacje carbon carbon w obrębie jednego reszty. Skopiuj wartości dla początkowego etapu polaryzacji krzyżowej proton carbon z jednowymiarowego eksperymentu CP.

W przypadku próbek jednorodnie znakowanych C13 czas mieszania można ustawić na 50 milisekund. W tym przypadku wybrano czas akwizycji wynoszący odpowiednio 15 i 20 milisekund w wymiarze pośrednim i bezpośrednim. Do przetwarzania widma PDSD zastosowano funkcję okna QSINE z przesunięciem sine-bell wynoszącym 3,5.

Aby umożliwić przypisanie sygnałów do konkretnych reszt, należy zastosować ustawienia PDSD z krótkim czasem mieszania, aby zarejestrować PDSD z pośrednim czasem mieszania wynoszącym od 100 do 200 milisekund. Należy pamiętać, że do pełnego przypisania rezonansów często wymagane są dodatkowe widma, w tym eksperymenty z detekcją azotu, co zostało szczegółowo opisane w protokole. Należy wybrać program do analizy NMR, taki jak CCPNMR Analysis.

Wczytaj widma 2D do oprogramowania i utwórz obiekt cząsteczki z główną sekwencją białka. Rozpocznij od identyfikacji typów aminokwasów widocznych w widmie PDSD przy krótkim czasie mieszania. Połączenie atomów węgla systemów spinowych umożliwia przypisanie specyficzne dla typu reszty.

W tej części przypisujemy system spinowy reszty treoniany. Transfer polaryzacji między jądrami C-alfa, C-beta i C-gamma prowadzi do powstania fizycznych pików korelacyjnych w spektrum PDSD. Spróbuj zidentyfikować tak wiele reszt, jak to możliwe, stosując tę procedurę.

Nałóż na siebie widma PDSD dla krótkiego i średniego czasu mieszania. Dodatkowe piki widoczne w PDSD dla średniego czasu mieszania zazwyczaj wynikają z kontaktu między następującymi po sobie resztami. Zaznacz piki rezonansowe danego układu spinowego i znajdź w PDSD dla średniego czasu mieszania korelacje z częstotliwościami rezonansowymi innych układów spinowych.

Przedstawiamy sekwencyjną przypisanie od thenium 33 do isolutane 32 w naszej strukturze białka włóknistego. Częstotliwości rezonansowe systemu spinowego thenium są widoczne przy częstotliwości węgla isolutów w 32, i na odwrót. Procedury przypisywania z wykorzystaniem widm z detekcją azotu oraz metody wyznaczania struktury drugorzędowej białka na podstawie przypisań zostały opisane w protokole.

Po dokładnym przyporządkowaniu rezonansów można przejść do identyfikacji więzów dalekozasięgowych. Więzy dalekozasięgowe to wewnątrzcząsteczkowe lub międzycząsteczkowe zbliżenia węgiel-węgiel pomiędzy oddalonymi od siebie resztami, które definiują zarówno trzeciorzędową strukturę podjednostek monomerów, jak i ułożenie podjednostek w obrębie kompleksu. W tym przypadku szczególne znaczenie mają próbki selektywnie znakowane izotopem C13.

Nałóż na siebie widmo PDSD z pośrednim czasem mieszania oraz widmo PDSD węgiel-węgiel z długim czasem mieszania, zarejestrowane przy czasie mieszania od 400 milisekund do jednej sekundy na próbce selektywnie znakowanej C13. Jeśli to możliwe, oba widma PDSD powinny zostać zarejestrowane na tej samej selektywnie znakowanej próbce. Piki dodatkowe wynikają z korelacji między bardziej oddalonymi atomami C13.

Podczas przypisywania rezonansów należy wziąć pod uwagę schemat znakowania selektywnego. W tym przypadku jest to 1-3-glicerol. Tutaj wyróżniliśmy przykład piku kontaktu dalekiego zasięgu z jednoznacznym przypisaniem w obu wymiarach.

Threonina 33 C-beta z białkiem 45 C-alpha. Po zakończeniu identyfikacji odległości dalekiego zasięgu, więzy są klasyfikowane jako jednoznaczne lub niejednoznaczne, a także jako wewnątrz- lub międzycząsteczkowe. Listy więzów, które należy przygotować do modelowania strukturalnego, są wymienione w protokole.

W sieci dostępne są samouczki dotyczące modelowania strukturalnego z wykorzystaniem różnych programów. Dane NMR stanu stałego, zarówno samodzielnie, jak i w połączeniu z danymi komplementarnymi, mogą pozwolić na wyznaczenie struktury zgromadzeń supramolekularnych na poziomie atomowym. Zaletą NMR stanu stałego jest z jednej strony możliwość dostarczenia informacji o strukturze drugorzędowej oraz ograniczeń dystansów atomowych z interfejsów wewnątrzmolekularnych, które mogą zostać zintegrowane w procesie modelowania.

Z drugiej strony unikalną cechą spektroskopii NMR w fazie stałej jest możliwość wyznaczania ograniczeń odległości atomowych na interfejsach międzycząsteczkowych w nienaruszonych kompleksach supermolekularnych. Wykrywanie i rozróżnianie między przypisaniami ograniczeń wewnątrz- i międzycząsteczkowych może być jednak żmudnym procesem i zazwyczaj wymaga przygotowania próbek selektywnie znakowanych izotopem C13. Dzięki nowym osiągnięciom w strategiach selektywnego znakowania, konstrukcji sprzętowej spektrometrów oraz metodologii NMR w fazie stałej, technika ta coraz lepiej realizuje swój teoretyczny potencjał dostarczania informacji molekularnych na poziomie atomowym, bez ograniczeń dotyczących rozmiaru obiektów, uporządkowania dalekozasięgowego czy krystaliczności.

Metoda ta pozwala na badanie struktury atomowej kompleksów biomolekularnych. Bardzo ważne jest staranne przygotowanie próbki w celu optymalizacji warunków NMR, aby uzyskać dane o wysokiej rozdzielczości. Dzięki temu protokołowi możemy uzyskać rozdzielczość atomową, która dostarcza informacji o kompleksach białkowych.

Technikę tę można łączyć z innymi metodami biologii strukturalnej w celu uzyskania modeli trójwymiarowych.