Name: Badania strukturalne układów makromolekularnych w skali atomowej za pomocą spektroskopii magnetycznego rezonansu jądrowego w ciele stałym (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-09-17T13:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 55 s
Description: Poznaj metodę spektroskopii MAS SSNMR do badania struktur nierozpuszczalnych i niekrystalicznych zespołów białkowych w skali atomowej. Protokół obejmuje przygotowanie próbek izotopowo znakowanych oraz analizę danych strukturalnych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Ta praca jest finansowana przez ANR (13-PDOC-0017-01 do B.H. i ANR-14-CE09-0020-01 do A.L.), program "Inwestycje dla przyszłości" IdEx Bordeaux/CNRS (PEPS 2016 do B.H.) numer ANR-10-IDEX-03-02 do B.H., Fondation pour la Recherche Médicale (FRM-AJE20140630090 do A.L.), program FP7 (FP7-PEOPLE-2013-CIG do A.L.) oraz Europejską Radę ds. Badań Naukowych (ERBN) w ramach programu Unii Europejskiej Horyzont 2020 w zakresie badań naukowych i innowacji (ERC Starting Grant dla A.L., umowa nr 639020) oraz projekt "WEAKINTERACT".

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

NMR w stanie stałym (SSNMR) jest metodą z wyboru do charakteryzowania wielkocząsteczkowych zespołów białek na poziomie atomowym. Jednym z centralnych zagadnień w wyznaczaniu struktury w oparciu o SSNMR jest jakość spektralna badanego układu, która pozwala na tworzenie modeli strukturalnych 3D o różnej precyzji, zwykle od modeli o niskiej rozdzielczości (zawierających drugorzędowe elementy struktury i niewiele informacji 3D) do pseudoatomowych struktur 3D. Ilość i jakość informacji strukturalnych uzyskanych z wielowymiarowych eksperymentów SSNMR jest kluczem do obliczenia struktury NMR zespołu o wysokiej rozdzielczości.
Opisany protokół opiera się na wykryciu 13ograniczeń strukturalnych C-13C i 15 N-13C, wymagających rejestracji kilku widm 2D (a czasami 3D) o wysokim stosunku sygnału do szumu. Przy umiarkowanych częstotliwościach MAS (<25 kHz) próbka jest wprowadzana do wirników o średnicy 3,2-4 mm, co pozwala na uzyskanie ilości białka do ~50 mg, w zależności od uwodnienia próbki. Ilość próbki wewnątrz wirnika jest wprost proporcjonalna do stosunku sygnału do szumu w widmach SSNMR, co jest decydującym czynnikiem dla wykrywania ograniczeń odległości dalekiego zasięgu i ich jednoznacznego przypisania.
Rozdzielczość spektralna jest kluczowym parametrem podczas sekwencyjnego przypisywania rezonansu i zbierania uwięzi. Aby uzyskać optymalne wyniki, należy zoptymalizować parametry przygotowania próbki, szczególnie w zakresie oczyszczania podjednostki i warunków montażu (pH, bufor, wstrząsanie, temperatura itp.). W celu optymalizacji próbki zaleca się przygotowanie nieoznakowanych próbek dla kilku różnych warunków, dla których zaobserwowano składanie, oraz zarejestrowanie widma 1D 1 H-13C CP (opisanego w kroku 2.1) na każdej przygotowanej próbce. Widma służą do porównania rozdzielczości spektralnej i dyspersji między różnymi preparatami, na podstawie których można określić optymalne warunki.
Jakość danych SSNMR zależy w dużym stopniu od wyboru parametrów akwizycji NMR, zwłaszcza dla etapów transferu polaryzacji. Zastosowanie pola magnetycznego o wysokim natężeniu (częstotliwość ≥600 MHz 1H) jest niezbędne do uzyskania wysokiej czułości i rozdzielczości spektralnej, wymaganych w przypadku złożonych obiektów, takich jak wielkocząsteczkowe zespoły białek.
Czynnikiem ograniczającym w wielu przypadkach jest dostępność spektrometru. W związku z tym rozsądny wybór próbek, które mają być przygotowane, powinien poprzedzać sesję spektrometru. W każdym razie, jednolicie 13C, 15N próbka jest warunkiem wstępnym do wykonania sekwencyjnego i wewnątrzresztkowego przypisania rezonansu. Dla białek przypisywanych technikami NMR w stanie stałym patrz71. Oznaczanie struktury zespołów makromolekularnych przy umiarkowanych częstotliwościach MAS wymaga selektywnie 13próbek znakowanych C; do wykrywania kontaktów dalekiego zasięgu 13 C-13C i 13 C-15N powszechnie stosuje się próbki oparte na 1,3-13 C- i 2-13C-gylcerolu i/lub 1-13C i 2-13C-glukozie, jak opisano powyżej. Wybór między tymi dwoma schematami etykietowania opiera się na spektralnym stosunku sygnału do szumu i rozdzielczości. Aby rozróżnić wewnątrz- i międzycząsteczkowe kontakty dalekiego zasięgu, mieszane znakowane i rozcieńczone próbki okazały się skuteczne.
Krótko mówiąc, kluczowymi etapami atomowego badania strukturalnego SSNMR są: (i) przygotowanie podjednostek i montaż muszą być zoptymalizowane w celu uzyskania doskonałej ilości i jakości próbki, (ii) natężenie pola spektrometru i parametry akwizycji muszą być starannie dobrane; (iii) do określenia struktury 3D wymagane są strategie selektywnego etykietowania, a ilość wymaganych danych zależy od jakości danych i dostępności danych uzupełniających.
Pomimo możliwości zastosowania w szerokim zakresie układów supramolekularnych, od białek błonowych po homomultimeryczne nanoobiekty, SSNMR jest często ograniczony przez zapotrzebowanie na ilości mg materiału znakowanego izotopowo. Najnowsze osiągnięcia technologiczne w zakresie ultraszybkiego MAS (≥100 kHz) SSNMR otwierają drogę do NMR z detekcją 1H i przesuwają granicę minimalnej ilości próbki do poziomu poniżej 72,73,74. Niemniej jednak, dla szczegółowych badań strukturalnych niezbędne jest 13próbek znakowanych C, co ogranicza zastosowanie SSNMR do próbek złożonych in vitro lub do systemów ulegających ekspresji w organizmach, które przeżywają na minimalnej pożywce, gdzie SSNMR w komórce jest nową metodą (przeglądy patrz 75,76,77,78).
Ważnym czynnikiem w zastosowaniu SSNMR do uzyskiwania struktur 3D o wysokiej rozdzielczości jest rozdzielczość spektralna: wewnętrzna niejednorodność konformacyjna w zespole może ograniczać rozdzielczość spektralną i analizę widm. Oznaczanie 13C specyficznych dla pozostałości może w niektórych przypadkach stanowić alternatywę dla uzyskania szczegółowych informacji o odległości od pozostałości strategicznych w celu uzyskania modeli strukturalnych (najnowsze przykłady znajdują się w 79,80).
SSNMR do określania struktury 3D nadal wymaga zebrania kilku zestawów danych z często długim czasem zbierania danych na zaawansowanych instrumentach, w zależności od podejścia i systemu, od kilku dni do tygodni na spektrometrze 600-1000 MHz (częstotliwość 1H). W związku z tym dostęp do czasu spektrometru może być czynnikiem ograniczającym w dogłębnym badaniu SSNMR.
W przypadku homomultimerycznych zespołów białkowych, prowadzących do uzyskania danych SSNMR o wystarczającej jakości, aby zidentyfikować dużą liczbę ograniczeń strukturalnych, takich jak w 3,57,64,70, SSNMR nadal nie daje dostępu do mikroskopijnych wymiarów. W związku z tym, w przypadku wyznaczania de novo struktury SSNMR zespołu homomultimerycznego, dane EM lub masa na długość (MPL) idealnie uzupełniają dane SSNMR w celu wyprowadzenia parametrów symetrii. Same dane SSNMR dostarczają atomowych interfejsów wewnątrz- i międzycząsteczkowych
SSNMR jest wysoce komplementarny z technikami strukturalnymi, takimi jak pomiary EM lub MPL, ale dane można również doskonale łączyć ze strukturami atomowymi uzyskanymi za pomocą krystalografii rentgenowskiej lub roztworu NMR na zmutowanych lub skróconych podjednostkach. W literaturze można znaleźć coraz więcej badań, w których połączenie różnych danych strukturalnych pozwoliło na wyznaczenie atomowych modeli 3D zespołów makromolekularnych (patrz rysunek 6 dla reprezentatywnych przykładów).
W dziedzinie biologii strukturalnej SSNMR jawi się jako obiecująca technika badania nierozpuszczalnych i niekrystalicznych zespołów na poziomie atomowym, tj. dostarczania danych strukturalnych w skali atomowej. Pod tym względem SSNMR jest pendantem do roztworu NMR i krystalografii rentgenowskiej dla zespołów molekularnych, w tym białek błonowych w ich naturalnym środowisku i zespołów białkowych, takich jak otoczki wirusowe, włókna bakteryjne lub amyloidy, a także RNA i kompleksy RNA-białko (patrz na przykład81). Jego wysoce wszechstronne zastosowania in vitro i w kontekście komórkowym, takie jak śledzenie drugorzędowych, trzeciorzędowych i czwartorzędowych zmian strukturalnych, identyfikacja powierzchni interakcji z cząsteczkami partnerskimi w skali atomowej (na przykład 82) oraz mapowanie dynamiki molekularnej w kontekście złożonych kompleksów, wskazują na istotny potencjał SSNMR w przyszłych badaniach strukturalnych nad złożonymi zespołami biomolekularnymi.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Składnik</td>
			<td>M9 średni</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zawartość NaCl</td>
			<td>0,5 g/l</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>3 g/l</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4</td>
			<td>6,7 g/l</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4</td>
			<td>1 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZnCl2</td>
			<td>10 μM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FeCl3</td>
			<td>1 μM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>100 μM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mieszanka witamin MEM 100X</td>
			<td>10 ml/l</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>13C-glukoza</td>
			<td>2 g/l</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15NH4Cl</td>
			<td>1 g/L</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 1: Skład minimalnej pożywki ekspresyjnej do produkcji rekombinowanych białek w komórkach E. coli BL21.

Postępy w spektroskopii stanu stałego magnetycznego rezonansu jądrowego (SSNMR) z wykorzystaniem wirowania pod kątem magicznym stanowią wydajne narzędzie do charakterystyki strukturalnej makromolekularnych kompleksów białkowych w rozdzielczości atomowej. Kompleksy białkowe te są powszechnymi systemami, które pełnią kluczowe role w wielu procesach biologicznych. Ich struktury molekularne, oddziaływania i dynamika są dostępne dzięki badaniom SSNMR, co wykazano w przypadku mechanizmów infekcji wirusowych (kapsydy1) i bakteryjnych (systemy wydzielnicze2,3, pili4), kompleksów białek błonowych5,6,7,8 oraz funkcjonalnych amyloidów 9,10,1. Ten typ organizacji molekularnej może również wywoływać patologie, na przykład w chorobach neurodegeneracyjnych, gdzie białka łączą się w błędnie sfałdowane stany amyloidowe, co prowadzi do aberrantnego zachowania komórek lub ich śmierci 12,13. Kompleksy białkowe są często tworzone poprzez symetryczną oligomeryzację wielu kopii podjednostek białkowych w duże obiekty supramolekularne o różnych kształtach, w tym włókna, filamenty, pory, rurki lub nanocząsteczki. Architektura czwartorzędowa jest definiowana przez słabe oddziaływania między podjednostkami białkowymi, które organizują składanie w czasie i przestrzeni oraz umożliwiają zaawansowane funkcje biologiczne. Badania strukturalne tych kompleksów w skali atomowej stanowią wyzwanie dla technik wysokiej rozdzielczości, ponieważ ich immanentna nierozpuszczalność, a bardzo często brak krystaliczności, ograniczają zastosowanie konwencjonalnej krystalografii rentgenowskiej lub metod NMR w roztworach. SSNMR z wirowaniem pod kątem magicznym (MAS) jest rozwijającą się techniką pozwalającą na uzyskanie danych o rozdzielczości atomowej dla nierozpuszczalnych kompleksów makromolekularnych i udowodniła swoją skuteczność w wyznaczaniu trójwymiarowych modeli atomowych dla coraz większej liczby złożonych systemów biomolekularnych, w tym bakteryjnych filamentów, kompleksów amyloidowych i cząstek wirusowych 14,15,16,17,18,19,20,21,2. Postępy techniczne w zakresie wysokich pól magnetycznych, rozwój metodologiczny oraz przygotowanie próbek uczyniły z MAS SSNMR solidną metodę badania nierozpuszczalnych białek w różnych środowiskach, zwłaszcza w ich biologicznie istotnym stanie zorganizowanym w makromolekuły lub w błonach komórkowych, co czyni tę technikę wysoce komplementarną względem krio-mikroskopii elektronowej. W wielu przypadkach kompleksy białkowe charakteryzują się bardzo wysokim stopniem symetrii. MAS SSNMR wykorzystuje tę cechę, ponieważ wszystkie podjednostki białkowe w kompleksie homomolekularnym mają taką samą strukturę lokalną, a zatem praktycznie identyczną sygnaturę SSNMR, co drastycznie zmniejsza złożoność analizy.
W niniejszym filmie przedstawiono wydajny protokół badań strukturalnych makcząsteczkowych kompleksów białkowych przy użyciu SSNMR z umiarkowanym MAS (&lt;25 kHz), który można podzielić na kilka etapów (Rycina 1). Zademonstrujemy krytyczne etapy procesu badawczego struktury SSNMR na przykładzie włóknistego kompleksu białkowego (patrz wyróżnione kroki na Rycynie 1), z wyłączeniem oczyszczania podjednostek białkowych, które różni się dla każdego kompleksu białkowego, lecz ma kluczowe znaczenie dla badań strukturalnych, oraz bez zagłębiania się w szczegóły techniczne i metodologiczne spektroskopii SSNMR i obliczeń strukturalnych, do których dostępne są w sieci specjalistyczne tutoriale. Choć obecny protokół będzie koncentrował się przede wszystkim na eksperymentach NMR w stanie stałym przeprowadzanych w warunkach MAS, zastosowanie uporządkowanych środowisk biologicznych 23,24,25,26,27, takich jak uporządkowane bicele, umożliwia badanie konformacji białek i dynamicznych oddziaływań białko-białko w mediach przypominających błony bez użycia technologii MAS. Przedstawimy etapy ekspresji i składania białek, a także rejestrację kluczowych widm SSNMR oraz ich analizę i interpretację. Naszym celem jest przybliżenie przebiegu analizy strukturalnej, umożliwiając czytelnikowi przeprowadzenie badania struktury kompleksu makcząsteczkowego w rozdzielczości atomowej przy użyciu technik SSNMR.
Protokół obejmuje 3 sekcje:
1. Przygotowanie próbek do NMR w stanie ciało
Jako warunek wstępny do analizy NMR w stanie stałym, komponenty białkowe kompleksu makromolekularnego muszą zostać wyekspresowane, znakowane izotopowo, oczyszczone i zmontowane in vitro w stan kompleksu zbliżony do natywnego (przykład przedstawiono na Rysunku 2). Aby zapewnić wysoką czułość NMR, wymagane jest wzbogacenie izotopowe w znakowaniu 13C i 15N poprzez zastosowanie minimalnych pożywek do ekspresji bakteryjnej uzupełnionych o źródła 13C i 15N, takie jak odpowiednio jednorodnie znakowana 13C glukoza/glicerol oraz 15NH4Cl. Na późniejszym etapie protokołu, w celu ułatwienia analizy NMR, stosowane są próbki selektywnie znakowane 13C, otrzymane z selektywnie znakowanych źródeł 13C, takich jak (1,3-13C)- i (2-13C)-glicerol (lub (1-13C)- i (2-13C)-glukoza). W celu opisania detekcji oddziaływań międzycząsteczkowych wprowadzono próbki o mieszanym znakowaniu, odpowiadające ekvimolarnym mieszaninom albo 50% znakowanej 15N i 50% znakowanej 13C, albo 50% (1,3-13C)- i 50% (2-13C)-glukozy. Wysoki stopień czystości białka oraz rygorystyczne warunki podczas etapu montażu są kluczowymi czynnikami zapewniającymi jednorodny uporządkowanie strukturalne końcowej próbki.
2. Wstępna charakterystyka strukturalna w oparciu o jednowymiarowy (1D) NMR w stanie ciało
Przedstawiamy kluczowe eksperymenty służące do analizy strukturalnej za pomocą SSNMR. Jednowymiarowe (1D) eksperymenty polaryzacji krzyżowej (CP) oraz INEPT / RINEPT28, z detekcją jąder 13C, są wykorzystywane odpowiednio do wykrywania sztywnych i elastycznych segmentów białek w kompleksie oraz do oszacowania stopnia homogeniczności strukturalnej i polimorfizmu lokalnego (przykład znajduje się na Rysunku 3).
3. Analiza konformacyjna i wyznaczanie struktury 3D
Podrozdziały 1 i 2 dotyczą analizy konformacyjnej, która opiera się na przypisaniu rezonansów SSNMR dla wszystkich sztywnych reszt kompleksu białkowego, ponieważ przesunięcia chemiczne są bardzo czułymi sondami środowiska lokalnego i mogą być wykorzystane do przewidywania kątów dihedralnych phi/psi, a tym samym do określenia struktury drugorzędowej. Rysunek 4 przedstawia przykład sekwencyjnego przypisania rezonansów w sztywnym rdzeniu kompleksu białkowego. Wyznaczenie struktury 3D opiera się na gromadzeniu danych strukturalnych, takich jak ograniczenia odległości kodujące bliskie sąsiedztwo (&lt;7 - 9 Å), zawierających informacje zarówno wewnątrzcząsteczkowe, jak i międzycząsteczkowe. Podrozdziały 3 i 4 opisują gromadzenie i interpretację dalekozasięgowych ograniczeń odległości. Kontakty dalekozasięgowe definiuje się jako wewnątrzcząsteczkowe sąsiedztwa 13C-13C powstające między resztą i a j, gdzie |i-j| ≥4, co definiuje trzeciorzędowe sfałdowanie białka podjednostki monomeru, lub jako międzycząsteczkowe sąsiedztwa 13C-13C, definiujące interfejsy międzycząsteczkowe pomiędzy podjednostkami białkowymi w kompleksie. Interfejsy wewnątrz- i międzycząsteczkowe przedstawiono na Rysunku 5. Ograniczenia SSNMR wykrywane w eksperymentach re-sprzęgania 13C-13C oraz 15N-13C zazwyczaj kodują odległości międzyjądrowe &lt; 1 nm. Podrozdział 4 wyjaśnia wykrywanie międzycząsteczkowych ograniczeń odległości. W symetrycznych kompleksach białkowych zastosowanie próbek homogenicznie znakowanych (tj. 10% jednolicie lub selektywnie znakowanych) do identyfikacji międzycząsteczkowych oddziaływań podjednostka-podjednostka jest ograniczone, ponieważ zarówno kontakty wewnątrz-, jak i międzycząsteczkowe prowadzą do wykrywalnych sygnałów. Jednoznaczne wykrywanie sąsiedztw międzycząsteczkowych osiąga się poprzez zastosowanie próbek mieszanych, zawierających ekvimolarną mieszaninę dwóch próbek różnie znakowanych, połączonych przed agregacją. Podrozdział 5 krótko wprowadza w zagadnienie modelowania struktury.
<img alt="Ekspresja białka znakowanego, montaż in vitro, NMR w stanie stałym; schemat analizy struktury białka." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55779/55779fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1: Przebieg badania strukturalnego o rozdzielczości atomowej z wykorzystaniem NMR w stanie stałym.13C, 15Przedstawiono produkcję białka znakowanego izotopem N, oczyszczanie podjednostek, składanie podjednostek, kontrolę formowania kompleksów, eksperymenty SSNMR, analizę eksperymentów SSNMR i wyznaczanie ograniczeń odległości oraz modelowanie struktury. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55779/55779fig1large.jpg" target="_blank">Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>

<table><tbody><tr><td>Instruments</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NMR Spectrometer (> 11,7 Tesli)</td><td></td><td>Głowica</td> sondy MAS SSNMR z potrójnym rezonansem Brukera<td></td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Wirniki Bruker-SSNMR</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Wirówka Bruker</td><td></td><td>K1910</td><td></td>4mm</tr><tr><td>5804 R&nbsp;</td><td>Spektrometr Eppendorf</td><td>5805000629</td><td></td></tr><tr><td>GeneQuant 1300</td><td>Dutscher</td><td>28-9182-13</td><td></td></tr><tr><td>IGS60 INKUBATOR HERATHERM 75 L</td><td></td> Wytrząsarka orbitalna <td>Dutscher</td> 228001 <td></td></tr><tr><td>MaxQ 4450</td><td>Dutscher</td><td>78376</td><td></td></tr><tr><td>Mieszadło rewolwerowe rurkowe</td><td>Dutscher</td><td>79547</td><td></td></tr><tr><td>sonopuls HD 3100</td><td>Bandelin</td><td>3680</td><td></td></tr><tr><td>Elektroporator MicroPulser</td><td>Biorad</td><td>165-2100&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>system tetrakomórkowy mini-PROTEAN</td><td>Biorad</td><td>165-8000</td><td></td></tr><tr><td>AKTA pure system</td><td>GE Healthcare</td><td>29-0182-24</td><td></td></tr><tr><td>pipeta kapilarna microman M25</td><td>Gilson&nbsp;</td><td>F148502</td><td></td></tr><tr><td>Nazwa</td><td>Firma</td><td>Numer katalogowy</td><td>Komentarze</td></tr><tr><td>Materiały</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>amiconR ultra-15</td><td>sigma</td><td>Z740199-8EA</td><td></td></tr><tr><td>kapilary i tłoki</td><td>Gilson&nbsp;</td><td></td><td></td>F148112</tr><tr><td>szpatułka</td><td>Fisher</td><td>13263799</td><td></td></tr><tr><td>Nazwa</td><td>Firma</td><td>Numer katalogowy</td><td>Komentarze</td></tr><tr><td>Reodczynniki</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>D-glucose 13C6</td><td>Sigma</td><td>389374</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek amonu-15N</td><td>Sigma</td><td>299251</td><td></td></tr><tr><td>1,3 13C2 glicerol</td><td>Sigma</td><td>492639</td><td></td></tr><tr><td>2 13C glicerol</td><td>Sigma</td><td>489484</td><td></td></tr><tr><td>Kanamycyna</td><td>Sigma</td><td>K1876</td><td></td></tr><tr><td>Karbenicylina</td><td>Sigma</td><td>C3416</td><td></td></tr><tr><td>Fosforan sodu dwuzasadowy</td><td>Sigma</td><td>S7907</td><td></td></tr><tr><td>Fosforan potasu jednozasadowy</td><td>Sigma</td><td>P5655</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek sodu</td><td>Sigma</td><td>71380</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek wapnia</td><td>Sigma</td><td>C1016</td><td></td></tr><tr><td>Siarczan magnezu</td><td>Sigma</td><td>208094</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek żelaza</td><td>Sigma</td><td>157740</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek</td><td>Sigma</td><td>793523</td><td></td></tr><tr><td>MEM Roztwór witaminowy (100 razy;)</td><td>Sigma</td><td>M68954</td><td></td></tr><tr><td>IPTG</td><td>Fisher</td><td>BP1755</td><td></td></tr><tr><td>Podstawa Trizma&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>T1503</td><td></td></tr><tr><td>Tricine</td><td>Sigma</td><td>T0377</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>Sigma</td><td>436143</td><td></td></tr><tr><td>azydek sodu</td><td>Sigma</td><td>71289</td><td></td></tr><tr><td>Kwas 4,4-dimetylo-4-silapentano-1-sulfonowy&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>178837</td><td></td></tr><tr><td>Nazwa<</td><td>strong>Firma</td><td>Numer katalogowy</td><td>Komentarze</td></tr><tr><td>Softwares</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Unicorn 6.3</td><td>GE Healthcare</td><td></td><td>Akta systems</td></tr><tr><td>ccpNMR</td><td>CCPN&nbsp;</td><td></td><td>systemy spektrometryczne</td></tr></tbody></table>

badania strukturalne układów makromolekularnych w skali atomowej za pomocą spektroskopii magnetycznego rezonansu jądrowego w ciele stałym

Atomic Scale Structural Studies of Macromolecular Assemblies by Solid-state Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy

Zespoły białek supramolekularnych odgrywają fundamentalne role w procesach biologicznych, począwszy od interakcji gospodarz-patogen, poprzez infekcję wirusową, aż po rozprzestrzenianie się chorób neurodegeneracyjnych. Takie zespoły składają się z wielu podjednostek białkowych zorganizowanych w sposób niekowalencyjny, tworząc duże obiekty makromolekularne, które mogą wykonywać różne funkcje komórkowe lub powodować szkodliwe konsekwencje. Wgląd atomowy w mechanizmy składania i funkcjonowanie tych zespołów makromolekularnych pozostaje często rzadki, ponieważ ich nieodłączna nierozpuszczalność i niekrystaliczność często drastycznie obniżają jakość danych uzyskanych z większości technik stosowanych w biologii strukturalnej, takich jak krystalografia rentgenowska i roztwór magnetycznego rezonansu jądrowego (NMR). Przedstawiamy tutaj spektroskopię NMR w ciele stałym z wirowaniem pod magicznym kątem (SSNMR) jako potężną metodę badania struktur zespołów makromolekularnych w rozdzielczości atomowej. SSNMR może ujawnić szczegóły atomowe na złożonym kompleksie bez ograniczeń rozmiaru i rozpuszczalności. Przedstawiony tutaj protokół opisuje podstawowe etapy od produkcji wielkocząsteczkowych zespołów białek znakowanych izotopem 13C/15N do uzyskania standardowych widm SSNMR oraz ich analizy i interpretacji. Jako przykład pokazujemy przebieg analizy strukturalnej SSNMR zespołu białek nitkowatych.

Typowy schemat pracy SSNMR obejmuje kilka etapów przedstawionych na Rysunku 1. Zazwyczaj podjednostki białkowe są otrzymywane poprzez heterologiczną ekspresję in vitro w E. coli, oczyszczane i składane w warunkach wstrząsania, choć czasami również w warunkach statycznych. Po ekspresji i oczyszczaniu podjednostki białkowej wykonuje się chromatografię żelową SDS (Rysunek 2A). Powstanie kompleksów makromolekularnych można następnie potwierdzić za pomocą analizy z wykorzystaniem mikroskopii elektronowej (EM) (przykład kompleksu włóknistego przedstawiono na Rysunku 2B).
Po wprowadzeniu kompleksu białkowego do rotora SSNMR, rotor jest umieszczany w spektrometrze, regulowane są częstotliwość MAS oraz temperatura, a następnie rejestrowane są widma. Pierwsze informacje można uzyskać za pomocą technik 1D SSNMR. Rysunek 3 przedstawia typowy sygnał FID SSNMR wykryty na kanale 13C dla strukturalnie homogennej próbki białka, widmo 1H-13C CP, ujawniające rezonanse 13C obecne w sztywnym rdzeniu podjednostki białkowej w kompleksie, oraz widmo 2D 1H-13C INEPT, reprezentujące mobilne reszty. Aby uzyskać szczegółowe informacje o strukturze atomowej sztywnego rdzenia kompleksu, należy zarejestrować wielowymiarowe eksperymenty SSNMR na próbkach znakowanych jednorodnie i selektywnie, aby najpierw przypisać rezonanse SSNMR, a następnie wykryć dalekozasięgowe zbliżenia (patrz Rysunek 4).
Wszystkie widma są przetwarzane i analizowane za pomocą odpowiedniego oprogramowania w celu przypisania rezonansów SSNMR oraz wyłonienia międzycząsteczkowych i wewnątrz-cząsteczkowych ograniczeń odległości (Rysunek 5). Ograniczenia odległości SSNMR są wykorzystywane samodzielnie lub w połączeniu z danymi z technik komplementarnych, które mogą zostać zintegrowane z programem do modelowania.
Przedstawiając reprezentatywne struktury atomowe kompleksów makromolekularnych rozwiązanych za pomocą technik SSNMR, Rysunek 6 ilustruje kilka kompleksów filamentowych z bakteryjnych wyrostków oraz włókien amyloidowych.
<img alt="Trójwymiarowe struktury białek, modele wstążkowe, diagram, biologia strukturalna, analiza konformacji molekularnej." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55779/55779fig6v2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 6"> 
Rysunek 6:Włókniste struktury makromolekularne wyznaczone metodą NMR w stanie stałym: filamenty bakteryjne i włókna białek amyloidowych.A) Pilus typu 1 bakterii uropatogennych E. coli, kod PDB 2N7H 4; B) filament ASC, kod PDB 2N1F 63; C) igły systemu wydzielniczego typu III, kody PDB 2MME, 2LPZ i 2MEX 2,3,64; D) Włókna amyloidu-beta AB42, kody PDB 2NAO, 5KK3, 2MXU 65,66,67 or mutant Osaka, kod PDB 2MVX 57mutant z Iowa, kod PDB 2MPZ 58; EWłókna alfa-synukleiny, kod PDB 2N0A 68; F) domena prionowa HET-s, kod PDB 2RNM, 2KJ3 69,70. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55779/55779fig6v2large.jpg" target="_blank">Aby wyświetlić tę figurę w powiększeniu, kliknij tutaj.</a>

Struktury supramolekularnych zespołów białkowych w rozdzielczości atomowej mają duże znaczenie ze względu na ich kluczowe role w różnych zjawiskach biologicznych. W niniejszym artykule przedstawiamy protokół do wykonywania wysokorozdzielczych badań strukturalnych nierozpuszczalnych i niekrystalicznych zespołów białek wielkocząsteczkowych za pomocą spektroskopii magnetycznego rezonansu jądrowego w stanie stałym z wirowaniem pod magicznym kątem (MAS SSNMR).

Badania strukturalne układów makromolekularnych w skali atomowej za pomocą spektroskopii magnetycznego rezonansu jądrowego w ciele stałym

Supramolecular protein assemblies play fundamental roles in biological processes ranging from host-pathogen interaction, viral infection to the ...

Ogólnym celem niniejszego protokołu jest badanie struktur nierozpuszczalnych i niekrystalicznych supermolekularnych kompleksów białkowych w rozdzielczości atomowej za pomocą spektroskopii NMR w stanie ciało z rotacją w kącie magicznym (MAS). Przedstawimy kluczowe kroki metodologiczne służące do badania struktur atomowych biomolekularnych kompleksów białkowych metodą NMR w stanie ciało. Badanie struktur atomowych tych kompleksów jest niezwykle trudne, ponieważ są one z natury nierozpuszczalne i niekrystaliczne.NMR w stanie stałym to rozwijająca się technika pozwalająca na badanie struktury i dynamiki cząsteczkowej z rozdzielczością atomową, bez ograniczeń wynikających z rozmiaru złożonego obiektu lub jego rozpuszczalności. Przedstawiamy tutaj kluczowe etapy wizualizacji struktur atomowych biomolekularnych kompleksów białkowych za pomocą NMR w stanie stałym, w tym przygotowanie próbek znakowanych izotopowo, gromadzenie oraz analizę danych strukturalnych z NMR w stanie stałym. Pierwszym krokiem w procesie NMR w stanie stałym jest produkcja podjednostek białkowych znakowanych C13 N15 oraz ich montaż in vitro.Zaszczep 15 ml prekultury w uprzednio ogrzanym medium LB, używając jednej kolonii transformowanych komórek E.coli. Inkubuj przez noc w temperaturze 37°C przy wytrząsaniu z prędkością 200 RPM. Aby zaszczepić kulturę główną, przenieś całą prekulturę do jednego litra uprzednio ogrzanego medium N9 zawierającego niezbędne izotopowo znakowane źródła węgla i azotu.Mogą to być: chlorek amonu znakowany $^{15}\text{N}$, glukoza jednolicie znakowana $^{13}\text{C}$, glukoza selektywnie znakowana $^{13}\text{C}$ lub glicerol selektywnie znakowany $^{13}\text{C}$. Inkubować w temperaturze 37 °C i pomierzyć gęstość optyczną przy 600 nm, gdy tylko hodowla stanie się mętna. Po osiągnięciu wartości OD wynoszącej 0,8, indukować ekspresję białka za pomocą 0,75 mM IPTG przez cztery godziny. Należy pamiętać, że optymalne warunki indukcji mogą różnić się w zależności od białka.Odzyskać komórki poprzez wirowanie przez 30 minut przy 6 000 G i temperaturze czterech stopni. Po oczyszczeniu podjednostek białkowych są one składane in vitro. Skoncentrować białko do stężenia około jednego mili mola w jednostce filtra wirowarkowego.Aby to osiągnąć, należy wprowadzić próbkę do jednostki filtrującej i wirować przy 4 000 G przez 30 minut. Między etapami wirowania należy delikatnie wymieszać roztwór w jednostce filtrującej za pomocą pipety, aby uniknąć osadzania się białek na membranie filtra. Powtarzać procedurę aż do uzyskania pożądanego stężenia.Przenieś próbkę do probówki typu Falcon i inkubuj pod wpływem mieszania przez tydzień w temperaturze pokojowej. Zazwyczaj polimeryzacji podjednostek w filamenty towarzyszy zmętnienie roztworu. Dodaj 0,02% w/v azotku sodu, aby zapobiec kontaminacji bakteryjnej.Aby zebrać kompleks białkowy, odwiruj próbkę przez jedną godzinę przy 20 000 G i temperaturze czterech stopni. Odessaj większość supernatantu, pozostawiając jedynie ilość płynu wystarczającą do pokrycia powierzchni, aby zapobiec wyschnięciu próbki, a następnie przechowuj ją w temperaturze czterech stopni do momentu pomiaru. Przedstawimy kluczowe eksperymenty niezbędne do analizy strukturalnej metodą NMR w stanie stałym.Jednowymiarowe eksperymenty polaryzacji krzyżowej (cross polarization, CP) oraz INEPT, przeprowadzane na jądrach C13, są wykorzystywane odpowiednio do wykrywania sztywnych i elastycznych segmentów białek w kompleksie, a także do oceny stopnia homogeniczności strukturalnej i polimorfizmu lokalnego. W niniejszej pracy stosujemy standardowe wartości eksperymentalne.Typowe zakresy parametrów są wskazane w protokole. Wsuń rotor do magnesu NMR i uruchom wirowanie pod kątem magicznym zgodnie z opisem w protokole. Ustaw pożądaną częstotliwość wirowania i upewnij się, że stabilizacja mieści się w granicach plus lub minus 10 hertz.Nagraj pojedyncze jednowymiarowe widmo protonowe z impulsem, wykorzystując 16 skanów. Przygotuj eksperyment CP 1D proton-węgiel. Eksperymenty CP wykazują sygnały pochodzące z reszt o sztywnej konformacji. Początkowe parametry eksperymentu zostały przyjęte ze standardowej procedury optymalizacji na związku referencyjnym.Parametry kalibracji i rozsprzęgania impulsów można zoptymalizować na próbce, gdy czułość jest wystarczająco wysoka. W tym przypadku rejestrujemy sygnał CP z 16 skanami. Czas kontaktu CP oraz poziomy mocy są dobierane na podstawie maksymalnej intensywności sygnału, co zaprezentowano tutaj w przypadku optymalizacji czasu kontaktu CP.Maksymalna intensywność w tym przykładzie zostaje osiągnięta w 800 milisekundach. Parametry rozsprzęgania powinny zostać ponownie dostrojone względem wartości pierwotnie ustalonych podczas kalibracji związku referencyjnego. Na koniec należy uważnie monitorować położenie bocznych pasm wirowania przy danej częstotliwości magicznego kąta wirowania, przedstawionej tutaj jako 18 kilohertz, aby uniknąć nakładania się na sygnał.Należy zarejestrować referencyjne jednowymiarowe widmo CP proton-węgiel, które posłuży jako jednowymiarowy odcisk widmowy. W tym celu gromadzimy 128 skanów przy czasie kontaktu CP wynoszącym 800 ms, sile rozsprzęgania 100 kHz, czasie recyklingu trzech sekund oraz czasie akwizycji 20 ms. Eksperyment CP należy przetworzyć bez apatyzacji.Wybierz i wyizoluj pik, aby oszacować C39 w próbce, co jest wskaźnikiem uporządkowania strukturalnego i jednorodności. W tym przypadku szerokość linii, mierzona jako pełna szerokość po połowie maksymalnej wysokości (FWHM), wynosi około 60 do 70 hertz, co wskazuje na dobrze uporządkowaną strukturę białka w kompleksie. Konfiguruj jednowymiarowy eksperyment INEPT dla protonów i węgla, aby zbadać wysoce mobilne części kompleksu białkowego.Należy zarejestrować referencyjny eksperyment INEPT, który będzie służył jako wzorzec dla ruchomych segmentów białek. Typowe parametry to 128 skanów oraz czas akwizycji wynoszący 25 milisekund. Następnie należy przetworzyć dane z eksperymentu INEPT dla protonów i węgla.Liczba sygnałów oraz ich położenie świadczą odpowiednio o stopniu mobilności reszt oraz o składzie aminokwasowym. W tym przypadku obserwuje się jedynie sygnał z grupy CH2 w buforze skrętnym (twist buffer), ponieważ całe białko w strukturze kompleksu znajduje się w reżimie sztywnym. Analiza konformacyjna struktury białka opiera się na przypisaniach rezonansów NMR w stanie stałym dla wszystkich sztywnych reszt w kompleksie.Jest to możliwe, ponieważ przesunięcia chemiczne są bardzo czułymi wskaźnikami lokalnego środowiska chemicznego i mogą być wykorzystane do przewidywania struktury drugorzędowej białka. Pełne wyznaczenie struktury 3D opiera się następnie na zbiorze danych strukturalnych, takich jak ograniczenia dystansu, które kodują bliskość atomów wewnątrz- i międzycząsteczkowych do dziewięciu angstromów. W tej części pokażemy, w jaki sposób rejestruje się podstawowe eksperymenty dwuwymiarowe oraz przedstawimy przykład przypisania sekwencyjnego.Następnie przeprowadzimy krótką demonstrację sposobu zbierania ograniczeń odległości z eksperymentów zarejestrowanych na próbkach selektywnie znakowanych C13. Skonfiguruj dwuwymiarowy eksperyment carbon carbon PDSD z krótkim czasem mieszania, aby wykryć korelacje carbon carbon w obrębie jednego reszty. Skopiuj wartości dla początkowego etapu polaryzacji krzyżowej proton carbon z jednowymiarowego eksperymentu CP.W przypadku próbek jednorodnie znakowanych C13 czas mieszania można ustawić na 50 milisekund. W tym przypadku wybrano czas akwizycji wynoszący odpowiednio 15 i 20 milisekund w wymiarze pośrednim i bezpośrednim. Do przetwarzania widma PDSD zastosowano funkcję okna QSINE z przesunięciem sine-bell wynoszącym 3,5.Aby umożliwić przypisanie sygnałów do konkretnych reszt, należy zastosować ustawienia PDSD z krótkim czasem mieszania, aby zarejestrować PDSD z pośrednim czasem mieszania wynoszącym od 100 do 200 milisekund. Należy pamiętać, że do pełnego przypisania rezonansów często wymagane są dodatkowe widma, w tym eksperymenty z detekcją azotu, co zostało szczegółowo opisane w protokole. Należy wybrać program do analizy NMR, taki jak CCPNMR Analysis.Wczytaj widma 2D do oprogramowania i utwórz obiekt cząsteczki z główną sekwencją białka. Rozpocznij od identyfikacji typów aminokwasów widocznych w widmie PDSD przy krótkim czasie mieszania. Połączenie atomów węgla systemów spinowych umożliwia przypisanie specyficzne dla typu reszty.W tej części przypisujemy system spinowy reszty treoniany. Transfer polaryzacji między jądrami C-alfa, C-beta i C-gamma prowadzi do powstania fizycznych pików korelacyjnych w spektrum PDSD. Spróbuj zidentyfikować tak wiele reszt, jak to możliwe, stosując tę procedurę.Nałóż na siebie widma PDSD dla krótkiego i średniego czasu mieszania. Dodatkowe piki widoczne w PDSD dla średniego czasu mieszania zazwyczaj wynikają z kontaktu między następującymi po sobie resztami. Zaznacz piki rezonansowe danego układu spinowego i znajdź w PDSD dla średniego czasu mieszania korelacje z częstotliwościami rezonansowymi innych układów spinowych.Przedstawiamy sekwencyjną przypisanie od thenium 33 do isolutane 32 w naszej strukturze białka włóknistego. Częstotliwości rezonansowe systemu spinowego thenium są widoczne przy częstotliwości węgla isolutów w 32, i na odwrót. Procedury przypisywania z wykorzystaniem widm z detekcją azotu oraz metody wyznaczania struktury drugorzędowej białka na podstawie przypisań zostały opisane w protokole.Po dokładnym przyporządkowaniu rezonansów można przejść do identyfikacji więzów dalekozasięgowych. Więzy dalekozasięgowe to wewnątrzcząsteczkowe lub międzycząsteczkowe zbliżenia węgiel-węgiel pomiędzy oddalonymi od siebie resztami, które definiują zarówno trzeciorzędową strukturę podjednostek monomerów, jak i ułożenie podjednostek w obrębie kompleksu. W tym przypadku szczególne znaczenie mają próbki selektywnie znakowane izotopem C13.Nałóż na siebie widmo PDSD z pośrednim czasem mieszania oraz widmo PDSD węgiel-węgiel z długim czasem mieszania, zarejestrowane przy czasie mieszania od 400 milisekund do jednej sekundy na próbce selektywnie znakowanej C13. Jeśli to możliwe, oba widma PDSD powinny zostać zarejestrowane na tej samej selektywnie znakowanej próbce. Piki dodatkowe wynikają z korelacji między bardziej oddalonymi atomami C13.Podczas przypisywania rezonansów należy wziąć pod uwagę schemat znakowania selektywnego. W tym przypadku jest to 1-3-glicerol. Tutaj wyróżniliśmy przykład piku kontaktu dalekiego zasięgu z jednoznacznym przypisaniem w obu wymiarach.Threonina 33 C-beta z białkiem 45 C-alpha. Po zakończeniu identyfikacji odległości dalekiego zasięgu, więzy są klasyfikowane jako jednoznaczne lub niejednoznaczne, a także jako wewnątrz- lub międzycząsteczkowe. Listy więzów, które należy przygotować do modelowania strukturalnego, są wymienione w protokole.W sieci dostępne są samouczki dotyczące modelowania strukturalnego z wykorzystaniem różnych programów. Dane NMR stanu stałego, zarówno samodzielnie, jak i w połączeniu z danymi komplementarnymi, mogą pozwolić na wyznaczenie struktury zgromadzeń supramolekularnych na poziomie atomowym. Zaletą NMR stanu stałego jest z jednej strony możliwość dostarczenia informacji o strukturze drugorzędowej oraz ograniczeń dystansów atomowych z interfejsów wewnątrzmolekularnych, które mogą zostać zintegrowane w procesie modelowania.Z drugiej strony unikalną cechą spektroskopii NMR w fazie stałej jest możliwość wyznaczania ograniczeń odległości atomowych na interfejsach międzycząsteczkowych w nienaruszonych kompleksach supermolekularnych. Wykrywanie i rozróżnianie między przypisaniami ograniczeń wewnątrz- i międzycząsteczkowych może być jednak żmudnym procesem i zazwyczaj wymaga przygotowania próbek selektywnie znakowanych izotopem C13. Dzięki nowym osiągnięciom w strategiach selektywnego znakowania, konstrukcji sprzętowej spektrometrów oraz metodologii NMR w fazie stałej, technika ta coraz lepiej realizuje swój teoretyczny potencjał dostarczania informacji molekularnych na poziomie atomowym, bez ograniczeń dotyczących rozmiaru obiektów, uporządkowania dalekozasięgowego czy krystaliczności.Metoda ta pozwala na badanie struktury atomowej kompleksów biomolekularnych. Bardzo ważne jest staranne przygotowanie próbki w celu optymalizacji warunków NMR, aby uzyskać dane o wysokiej rozdzielczości. Dzięki temu protokołowi możemy uzyskać rozdzielczość atomową, która dostarcza informacji o kompleksach białkowych.Technikę tę można łączyć z innymi metodami biologii strukturalnej w celu uzyskania modeli trójwymiarowych.

atomic-scale-structural-studies-macromolecular-assemblies-solid-state

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

Ten film opisuje technikę spektroskopii magnetycznego rezonansu jądrowego do badania interakcji białko-białko pomiędzy 15znakowanymi N dzikimi i zmutowanymi białkami envoplakiny a nieznakowanym białkiem wimentyny. Udana interakcja między envoplakiną typu dzikiego a wimentyną prowadzi do rozległego poszerzenia linii i zaniku pików w widmach NMR, podczas gdy brak interakcji między zmutowaną envoplakiną a wimentyną skutkuje dobrze rozdzielonymi pikami w widmach NMR.

Magnetyczny rezonans jądrowy do badania oddziaływań białko-białko na poziomie atomowym

Struktura roztworu NMR peptydu modelowego metalochaperonu z Cu (I) została określona, a szczegółowy protokół od przygotowania próbki i zbierania danych 1D i 2D do struktury trójwymiarowej jest opisany.

Oznaczanie struktury i koordynacji kompleksów peptyd-metal metodą 1D i 2D 1H NMR

Tutaj prezentujemy protokół opisujący badania ex situ i in situ przemian strukturalnych w szkłach metalowych. Zastosowaliśmy metody analityczne oparte na jądrze, które badają oddziaływania nadsubtelne. Wykazujemy możliwość zastosowania spektrometrii Mössbauera i jądrowego rozpraszania promieniowania synchrotronowego do przodu podczas eksperymentów opartych na temperaturze.

Metody badań przemian strukturalnych ex situ i in situ: przypadek krystalizacji szkieł metalicznych

Tutaj prezentujemy, jak można wykorzystać rozpraszanie promieniowania rentgenowskiego pod małym kątem (SAXS) do uzyskania informacji o obwiedniach o niskiej rozdzielczości reprezentujących struktury makromolekularne. W połączeniu z technikami strukturalnymi o wysokiej rozdzielczości, takimi jak krystalografia rentgenowska i magnetyczny rezonans jądrowy, SAXS może dostarczyć szczegółowych informacji na temat wielodomenowych białek i kompleksów makromolekularnych w roztworze.

Badania strukturalne makrocząsteczek w roztworze z wykorzystaniem rozpraszania promieniowania rentgenowskiego pod małym kątem

Przedstawiono protokół przygotowania 13 C,15znakowanych N próbek grzybów i roślin do wielowymiarowej spektroskopii NMR w ciele stałym i badań dynamicznej polaryzacji jądrowej (DNP).

Przygotowanie materiałów grzybowych i roślinnych do wyjaśnienia strukturalnego za pomocą dynamicznej polaryzacji jądrowej w stanie stałym NMR

Struktury molekularne i dynamika ciał stałych, cieczy, gazów i mieszanin są niezwykle interesujące dla różnych dziedzin nauki. Wysokotemperaturowy, wysokociśnieniowy MAS NMR in situ umożliwia detekcję środowiska chemicznego składników w układach fazy mieszanej w ściśle kontrolowanym środowisku chemicznym.

Spektroskopia magnetycznego rezonansu jądrowego in situ z magicznym kątem wirowania

Przedstawiono protokół zastosowania spektroskopii NMR wzmacniającej relaksację paramagnetyczną do wykrywania słabych i przejściowych interakcji między- i wewnątrzcząsteczkowych w białkach wewnętrznie nieuporządkowanych.

Wzmocnienie relaksacji paramagnetycznej do wykrywania i charakteryzowania samoasocjacji wewnętrznie nieuporządkowanych białek

Spektroskopia wstecznego rozpraszania neutronów oferuje nieniszczący i wolny od znaczników dostęp do dynamiki ps-ns białek i wody do ich hydratacji. Przebieg pracy przedstawiono w dwóch badaniach nad białkami amyloidowymi: nad czasowo-rozdzielczą dynamiką lizozymu podczas agregacji oraz nad dynamiką wody hydratacyjnej tau po tworzeniu włókien.

Spektroskopia neutronów o wysokiej rozdzielczości do badania dynamiki pikosekund-nanosekund białek i wody hydratacyjnej

Spektroskopia magnetycznego rezonansu jądrowego (NMR) może scharakteryzować dynamikę strukturalną białka w sposób specyficzny dla reszt. Udostępniamy praktyczny protokół do rejestrowania eksperymentów z relaksacją NMR 15N R1 i R2 oraz eksperymentów z heterojądrowym efektem Overhausera (hetNOE) {1H}-15N, wrażliwych na skalę czasową od pikosekund do nanosekund.

NMR 15N Eksperymenty relaksacyjne do badania dynamiki strukturalnej białek z pikosekundy na nanosekundy

Opisujemy tutaj metodę identyfikacji wielokrotnych fosforylacji wewnętrznie nieuporządkowanego białka za pomocą spektroskopii magnetycznego rezonansu jądrowego (NMR), używając białka Tau jako studium przypadku. Rekombinowany Tau jest izotopowo wzbogacany i modyfikowany in vitro przez kinazę przed pozyskaniem i analizą danych.

Spektroskopia magnetycznego rezonansu jądrowego do identyfikacji wielokrotnych fosforylacji białek wewnętrznie nieuporządkowanych

Poznaj metodę spektroskopii MAS SSNMR do badania struktur nierozpuszczalnych i niekrystalicznych zespołów białkowych w skali atomowej. Protokół obejmuje przygotowanie próbek izotopowo znakowanych oraz analizę danych strukturalnych.

Badania strukturalne układów makromolekularnych w skali atomowej za pomocą spektroskopii magnetycznego rezonansu jądrowego w ciele stałym (Wideo) | JoVE Journal

Badania strukturalne układów makromolekularnych w skali atomowej za pomocą spektroskopii magnetycznego rezonansu jądrowego w ciele stałym

Przeglądaj więcej filmów