Badania strukturalne układów makromolekularnych w skali atomowej za pomocą spektroskopii magnetycznego rezonansu jądrowego w ciele stałym

Ogólnym celem tego protokołu jest badanie struktur nierozpuszczalnych i niekrystalicznych zespołów białek supermolekularnych w rozdzielczości atomowej za pomocą spektroskopii NMR w stanie stałym z wirowaniem pod magicznym kątem. Przedstawimy podstawowe kroki metodologiczne w badaniu struktur atomowych biomolekularnych zespołów białkowych za pomocą NMR w stanie stałym. Badanie struktur atomowych tych zespołów jest niezwykle trudne, ponieważ są one z natury nierozpuszczalne i niekrystaliczne.

NMR w stanie stałym to nowa technika zdolna do badania struktury molekularnej i dynamiki w rozdzielczości atomowej bez ograniczeń związanych z rozmiarem zmontowanego obiektu lub jego rozpuszczalnością. Ilustrujemy tutaj kluczowe kroki do wizualizacji struktur atomowych biomolekularnych zespołów białkowych według sprzedanego NMR, w tym przygotowanie próbek znakowanych izotopowo, zbieranie i analizę danych strukturalnych z NMR w stanie stałym. Pierwszym krokiem w przebiegu pracy NMR w stanie stałym jest produkcja podjednostek białkowych znakowanych C13 N15 i ich złożenie in vitro.

Zaszczepić 15-milimetrową hodowlę wstępną wstępnie podgrzanego podłoża LB jedną kolonią przekształconych komórek E. coli. Inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza z prędkością 200 obr./min, wstrząsając przez noc. Aby zaszczepić główną kulturę, przenieś całą kulturę wstępną do jednego litra wstępnie podgrzanej pożywki N9 zawierającej niezbędne izotopowo znakowane źródła węgla i azotu.

Mogą to być chlorek amonu znakowany N15, jednolicie znakowana glukoza C13, selektywnie znakowana glukoza C13 lub selektywnie inkubowana glicerolu znakowana C13 w temperaturze 37 stopni i mierzona gęstością optyczną przy 600 nanometrach, gdy tylko kultura stanie się mętna. Gdy OD osiągnie wartość 0,8, indukuj ekspresję białka za pomocą 0,75 mini molowego IPTG przez cztery godziny. Należy pamiętać, że optymalne warunki indukcji mogą się różnić w zależności od białka.

Odzyskać komórki przez wirowanie przez 30 minut w temperaturze 6 000 G i czterech stopniach. Po oczyszczeniu podjednostek białkowych są one składane in vitro. Skoncentrować białko do około jednego minimolowca w odśrodkowym zespole filtrującym.

W tym celu należy wprowadzić próbkę do jednostki filtrującej i odwirować przy 4 000 G przez 30 minut. Pomiędzy etapami wirowania delikatnie wymieszaj roztwór w jednostce filtrującej za pomocą pipety, aby uniknąć osadzania się białka na membranie filtracyjnej. Powtarzaj procedurę, aż do osiągnięcia pożądanego stężenia.

Przenieść próbkę do probówki sokoła i inkubować pod mieszaniem przez tydzień w temperaturze pokojowej. Zwykle polimeryzacji podjednostek w włókna towarzyszy zmętnienie roztworu. Dodaj 0,02% wagowo na objętość azydku sodu, aby uniknąć zanieczyszczenia bakteryjnego.

Aby zebrać zespół białkowy, odwirować próbkę przez jedną godzinę w temperaturze 20 000 G i czterech stopniach. Odessać większość supernatantu, pozostawiając tylko tyle cieczy, aby pokryć powierzchnię, aby uniknąć wysuszenia próbki, i przechowywać próbkę w temperaturze czterech stopni do czasu pomiaru. Przedstawimy niezbędne eksperymenty do analizy strukturalnej za pomocą NMR w stanie stałym.

Jednowymiarowa polaryzacja krzyżowa (CP) i nieudolne eksperymenty wykryte na jądrach C13 są wykorzystywane do wykrywania odpowiednio sztywnych i elastycznych segmentów białka w złożeniu. A także oszacowanie stopnia jednorodności strukturalnej i lokalnego polimorfizmu. W tym przypadku używamy standardowych wartości eksperymentalnych.

Typowe zakresy parametrów są wskazane w protokole. Włóż rotę do magnesu NMR i rozpocznij obracanie magicznego kąta zgodnie z opisem w protokole. Ustaw żądaną częstotliwość wirowania i zapewnij stabilizację z dokładnością do plus minus 10 Hz.

Nagraj pojedyncze, pulsacyjne, jednowymiarowe widmo protonów za pomocą 16 skanów. Ustaw CP z węgla protonowego 1D. Eksperymenty CP pokazują sygnały, które powstają z reszt w sztywnej konformacji. Początkowe parametry eksperymentu są pobierane ze standardowej procedury optymalizacyjnej na związku referencyjnym.

Parametry kalibracji impulsów i odsprzęgania można zoptymalizować w próbce, gdy czułość jest wystarczająco wysoka. Tutaj rejestrujemy CP z 16 skanami. Czas kontaktu CP i poziomy mocy są wybierane na podstawie maksymalnego natężenia sygnału, jak pokazano tutaj w celu optymalizacji czasu kontaktu CP.

Maksymalna intensywność w tym przykładzie jest osiągana przy 800 milisekundach. Parametry odsprzęgania należy również skorygować w stosunku do parametrów pierwotnie ustalonych w kalibracji związku odniesienia. Na koniec uważnie obserwuj lokalizację wirujących pasm bocznych przy podanej częstotliwości wirowania pod magicznym kątem, pokazanej tutaj na 18 kilohercach, aby uniknąć nakładania się sygnału.

Zapisz referencyjne widmo CP węgla protonowego 1D, które służy jako jednowymiarowy spektralny odcisk palca. Tutaj gromadzimy 128 skanów z czasem kontaktu CP 800 milisekund, siłą odsprzęgania 100 kiloherców, opóźnieniem recyklingu wynoszącym trzy sekundy i czasem akwizycji wynoszącym 20 milisekund. Przeprowadź eksperyment CP bez apatii.

Wybierz i wyizolowany pik, aby oszacować C39 w próbce, wskazując na porządek strukturalny i jednorodność. W tym przypadku szerokość linii, mierzona jako pełna szerokość w połowie wysokości, wynosi około 60 do 70 herców, co wskazuje na dobrze uporządkowaną strukturę białka w zespole. Zorganizuj jednowymiarowy eksperyment z węglem protonowym, aby zbadać wysoce mobilne części zespołu białkowego.

Nagraj referencyjny nieudolny eksperyment, który posłuży jako odcisk palca dla ruchomych segmentów białka. Typowe parametry to 128 skanów i czas akwizycji wynoszący 25 milisekund. Przetwórz eksperyment z nieudolnym węglem protonowym.

Liczba sygnałów i ich położenie wskazują odpowiednio na zakres ruchliwości reszt i skład aminokwasów. W tym przypadku obserwuje się tylko sygnał z bufora skrętnego CH2 merit-y, ponieważ całe białko znajduje się w sztywnym reżimie w strukturze składania. Analiza konformacyjna struktury białka opiera się na przypisaniach rezonansu NMR w stanie stałym dla wszystkich sztywnych reszt zespołu.

Jest to możliwe, ponieważ przesunięcia chemiczne są bardzo czułymi sondami dla lokalnego środowiska chemicznego i mogą być wykorzystywane do przewidywania drugorzędowej struktury białka. Pełne określenie struktury 3D opiera się następnie na gromadzeniu danych strukturalnych, takich jak ograniczenia odległości, które kodują zarówno wewnątrzcząsteczkowe, jak i międzycząsteczkowe zbliżenia atomów do dziewięciu angstremów. Tutaj pokażemy, w jaki sposób rejestrowane są podstawowe eksperymenty dwuwymiarowe i podamy przykład przypisania sekwencyjnego.

Następnie przedstawimy krótką demonstrację, w jaki sposób zbierać ograniczenia odległości z eksperymentów zarejestrowanych na próbkach selektywnie znakowanych C13. Ustaw krótki czas mieszania dwuwymiarowego eksperymentu PDSD z węglem węglowym, aby wykryć korelację węgla w środku pozostałości. Skopiuj wartości początkowego kroku polaryzacji krzyżowej węgla protonowego z jednowymiarowego eksperymentu CP.

Mieszanie można ustawić na 50 milisekund dla próbek jednorodnie oznakowanych C13. W tym przypadku wybraliśmy czas akwizycji 15 i 20 milisekund odpowiednio w wymiarze pośrednim i bezpośrednim. Do przetwarzania widma PDSD używamy funkcji okna QSINE z przesunięciem dzwonka sinusoidalnym wynoszącym 3,5.

Aby umożliwić przypisanie specyficznych pozostałości, należy użyć ustawień krótkiego czasu mieszania PDSD, aby zarejestrować pośredni czas mieszania PDSD z czasem mieszania od 100 do 200 milisekund. Należy zauważyć, że dodatkowe widma, w tym eksperymenty z wykrytym azotem, są często wymagane do pełnego przypisania rezonansu i są szczegółowo opisane w protokole. Wybierz program do analizy NMR, taki jak Analiza CCPNMR.

Załaduj widma 2D do oprogramowania i utwórz obiekt molekularny z pierwotną sekwencją białka. Zacznij od identyfikacji typów aminokwasów, które są widoczne w widmie PDSD o krótkim czasie mieszania. Połączenie atomów węgla w układach wirowych pozwala na przypisanie specyficznego typu pozostałości.

Tutaj przypisujemy układ spinowy reszty tenu. Transfery polaryzacji między jądrami C-alfa, C-beta i C-gamma prowadzą do fizycznych pików krzyżowych w widmie PDSD. Za pomocą tej procedury spróbuj zidentyfikować jak najwięcej pozostałości.

Nałóż na siebie widmo PDSD o krótkim, jak i pośrednim czasie mieszania. Dodatkowe piki widoczne w pośrednim czasie mieszania PDSD zwykle powstają w wyniku kontaktu między sekwencyjnymi pozostałościami. Zaznacz piki rezonansowe układu spinowego i znajdź korelacje w pośrednim czasie mieszania PDSD z częstotliwościami rezonansowymi innych układów spinowych.

Pokazujemy sekwencyjne przypisanie tenu 33 do izolutanu 32 w naszym zespole białek nitkowatych. Częstotliwości rezonansowe układu spinowego tenu są widoczne na częstotliwości węgla izolutowanych w 32 i odwrotnie. Procedury przypisywania widm wykrytych azotu oraz uzyskiwania struktury drugorzędowej białka z przypisań są opisane w protokole.

Po dokładnym przypisaniu rezonansu możemy przystąpić do identyfikacji ograniczeń dalekiego zasięgu. Ograniczenia dalekiego zasięgu to wewnątrz- lub międzycząsteczkowe zbliżenia węgla węglowego między odległymi pozostałościami, które definiują zarówno trzeciorzędowe fałd podjednostek monomerycznych, jak i układ podjednostek w zespole. W tym przypadku szczególne znaczenie mają selektywnie znakowane próbki C13.

Na próbkę selektywnie znakowaną C13 nałóż PDSD o pośrednim czasie mieszania na PDSD z węglem o długim czasie mieszania, zarejestrowaną w czasie mieszania od 400 milisekund do jednej sekundy. Jeśli to możliwe, oba PDSD powinny być zarejestrowane na tej samej selektywnie oznakowanej próbce. Dodatkowe piki powstają w wyniku korelacji między bardziej odległymi atomami C13.

Podczas przypisywania rezonansu należy wziąć pod uwagę schemat selektywnego etykietowania. W tym przypadku 1-3-glicerol. W tym miejscu zwróciliśmy uwagę na przykład piku kontaktowego dalekiego zasięgu z jednoznacznym przypisaniem do obu wymiarów.

Thenium 33 C-beta z białkiem 45 C-alfa. Po zakończeniu identyfikacji na duże odległości, ograniczenia są klasyfikowane jako jednoznaczne lub niejednoznaczne, a także wewnątrz- lub międzycząsteczkowe. Listy ograniczeń, które należy przygotować do modelowania konstrukcyjnego, są wymienione w protokole.

Samouczki dotyczące modelowania konstrukcji przy użyciu różnych programów można znaleźć w Internecie. Dane NMR w stanie stałym, same w sobie lub w połączeniu z danymi uzupełniającymi, mogą pozwolić na określenie struktury zespołów supermolekularnych na poziomie atomowym. Zaletami NMR w stanie stałym są z jednej strony możliwość dostarczania zarówno informacji o strukturze drugorzędowej, jak i ograniczeń odległości atomowej z interfejsów wewnątrzcząsteczkowych, które można zintegrować z procesem modelowania.

Z drugiej jednak strony, unikalna cecha spektroskopii NMR w stanie stałym polega na jej zdolności do zbierania ograniczeń odległości atomowej na międzycząsteczkowych granicy faz nienaruszonego złożenia supermolekularnego. Wykrywanie i rozróżnianie przyporządkowań wewnątrz- i międzymolekularnych może być jednak żmudnym procesem i zazwyczaj wymaga przygotowania selektywnie znakowanych próbek C13. Jednak dzięki nowym osiągnięciom w zakresie strategii selektywnego znakowania, konstrukcji sprzętu spektrometru i metodologii NMR w stanie stałym, technika ta w coraz większym stopniu wykorzystuje swój teoretyczny potencjał dostarczania informacji molekularnych na poziomie atomowym bez ograniczeń dotyczących wielkości obiektu, kolejności dalekiego zasięgu lub krystaliczności.

Metoda ta pozwala nam badać strukturę atomową zespołów biomolekularnych. Bardzo ważne jest, aby starannie przygotować próbkę, aby zoptymalizować stan NMR, aby uzyskać dane o wysokiej rozdzielczości. Dzięki temu protokołowi możemy uzyskać rozdzielczości atomowe, które są informacją o zespołach białek.

Technikę tę można łączyć z innymi technikami biologii strukturalnej w celu uzyskania modeli trójwymiarowych.