Name: Wzorcowanie komórek na zdefiniowanych fotolitograficznie Parylene-C: Substraty SiO2 (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-03-07T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 19 s
Description: Poznaj metodę wzorcowania komórek na SiO₂ z wykorzystaniem fotolitografii i parylene-C. Technika umożliwia kontrolowane wzorce adhezji bez biologicznych czynników w pomieszczeniu czystym.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez stypendium Wellcome Trust Clinical PhD fellowship (ECAT).

1. Wytwarzanie wzorów parylenu na SiO2: Przebieg procesu (patrz rysunek 1)
<ol>
	<li>Zaprojektuj żądaną konfigurację parylene-C za pomocą pakietu oprogramowania do edycji układu, zdolnego do odczytu/zapisu plików CIF (Caltech Intermediate Form) lub GDS-II (Graphic Database System-II). CIF i GDS-II to standardowe formaty plików do układów scalonych.</li>
	<li>Zleć produkcję masek fotograficznych odpowiedniemu zakładowi mikroelektronicznemu lub wyprodukuj we własnym zakresie, jeśli takie istnieją.</li>
	<li>Tlenić płytkę krzemową w atmosferycznym piecu poziomym (H2 1,88 SLM i O2 1,25 SLM) w temperaturze 950 °C przez 40 minut, aby uzyskać warstwę SiO2 o długości 200 nm (potwierdzić grubość za pomocą reflektometru spektroskopowego o małej plamce).</li>
	<li>Zagruntować utlenioną płytkę promotorem przyczepności silanów. Teraz nanieść parylen-C w temperaturze 22 °C z szybkością 1,298 nm/mg dimeru za pomocą systemu osadzania próżniowego specjalnie zaprojektowanego do osadzania parylenu. Powłoka parylenu-C o grubości 100 nm została użyta do wszystkich pokazanych poniżej przykładów.</li>
	<li>Promotor adhezji heksametyldisilazanu (HMDS) z następnym złożeniem na płytce pokrytej parylenem za pomocą odpowiedniego systemu powlekania fotorezystancyjnego.</li>
	<li>Teraz obracaj płytkę z prędkością 4 000 obr./min przez 30 sekund, nakładając dodatni fotorezystor (co daje teoretyczną grubość 1 μm), używając tego samego systemu powłok fotorezystowych, co powyżej.</li>
	<li>Wafelek pieczemy na miękko przez 60 sekund w temperaturze 90°C.</li>
	<li>Włóż zarówno wafel, jak i wstępnie wyprodukowaną maskę fotograficzną do nakładki maski.</li>
	<li>Naświetlić płytkę pokrytą fotorezystem z negatywem UV przedstawiającym pożądaną konfigurację parylenu-C.</li>
	<li>Piecz odsłonięty wafel przez 60 sekund w temperaturze 110 °C.</li>
	<li>Usuń cały odsłonięty fotorezystor z płytki, opracowując odpowiednie rozwiązanie wywoływacza.</li>
	<li>Wytrawić niezabezpieczony parylen. Użyj systemu wytrawiania plazmą tlenową (przy ciśnieniu w komorze 50 mTorr, 49 sccm O2, mocy RF 100 W przy 13,56 MHz i szybkości wytrawiania 100 nm / min), aby ujawnić leżący pod spodem SiO2.</li>
	<li>Wafel pokroić w kostkę za pomocą odpowiedniej piły do krojenia w kostkę (prędkość obrotowa wrzeciona 30 000 obr/min, prędkość posuwu 7 mm/s).</li>
	<li>Opłucz wióry w dejonizowanymH2Oi wysusz suszarką azotem.</li>
	<li>Przechowuj chipsy (na czas nieokreślony) w pojemnikach wolnych od kurzu, aż będą potrzebne.</li>
</ol>
2. Czyszczenie i aktywacja chipów: Protokół
<ol>
	<li>Usuń resztki fotorezystu z wiórów, myjąc w acetonie przez 10 sekund.</li>
	<li>Płukać w dejonizowanym destylowanym H2O 3x.</li>
	<li>Uzupełnić świeży kwas piraniowy (proporcja 5:3 30% nadtlenku wodoru i 98% kwasu siarkowego). 
	UWAGA: Kwas piraniowy należy przygotowywać z dużą starannością. Jest niezwykle silnym utleniaczem, jest silnie kwaśny, a mieszanie nadtlenku wodoru z kwasem siarkowym jest reakcją egzotermiczną. Wykonaj ten etap w okapie oparowym z kwasem. Odczekaj 2 minuty po wymieszaniu kwasu piranii, ale zużyj w ciągu 20 minut.</li>
	<li>Oczyść i wytraw wióry przez zanurzenie w kwasie piraniowym na 10 minut.</li>
	<li>Opłucz wiórki 3x w dejonizowanymH2Oi przenieś do sterylnego naczynia hodowlanego.</li>
	<li>Teraz aktywuj żetony do tworzenia wzorów komórek. Na przykład dodaj dwa chipsy na studzienkę do płytki 6-dołkowej, a następnie dodaj 2 ml płodowej surowicy bydlęcej, aby całkowicie zanurzyć wszystkie wióry. Wykonaj ten i wszystkie kolejne etapy hodowli komórkowej w sterylnych warunkach w kapturze do hodowli tkankowej z przepływem laminarnym.</li>
	<li>Inkubować chipsy w surowicy przez 3-12 godzin w temperaturze 37 °C. 
	UWAGA: Kroki 2.4-2.7 należy wykonywać sekwencyjnie i bez opóźnień między krokami. Jeśli aktywacja surowicy jest opóźniona o ≥24 godziny po leczeniu piranią, wzorzec komórek jest upośledzony z powodu zmniejszonego odpychania komórek z regionów SiO2. 
	Alternatywne roztwory aktywacyjne zawierające specyficzne białka adhezyjne komórek mogą być stosowane zamiast płodowej surowicy bydlęcej. Takie roztwory zmieniają charakterystykę adhezji komórkowej dwóch kontrastujących substratów (patrz reprezentatywne wyniki dla przykładu).</li>
</ol>
3. Powlekanie linii komórkowych na chipie: Protokół
<ol>
	<li>Usuń wiórki z roztworu aktywacyjnego i umyj raz przez 10 sekund w zrównoważonym roztworze soli Hanka.</li>
	<li>Umieść chip w dołku hodowlanym i umieść wybrany typ komórki jako zawiesinę w zwykłym pożywce wzrostowej. Optymalna gęstość posiewu komórek zależy zarówno od typu ogniwa, jak i wzoru geometrycznego parylenu-C na chipie. Gęstość 5 x 104 komórek/ml jest rozsądnym punktem wyjścia.</li>
	<li>Obrazowanie jest dostosowane do podstawowej motywacji do tworzenia wzorców komórkowych, ale zachowanie żywych komórek można łatwo ocenić za pomocą mikroskopu preparacyjnego i kamery cyfrowej z odpowiednią soczewką przekaźnikową.</li>
</ol>

<ol><li>Zhi, Z. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Versatile+Gold+Surface+Approach+for+Fabrication+and+Interrogation+of+Glycoarrays%5BTitle%5D)+AND+%22ChemBioChem%22%5BJournal%5D)">A Versatile Gold Surface Approach for Fabrication and Interrogation of Glycoarrays.</a> ChemBioChem. 9, 1568-1575 (2009).</li>
<li>Michelini, E., Roda, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Staying+alive%3A+new+perspectives+on+cell+immobilization+for+biosensing+purposes%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Bioanal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Staying alive: new perspectives on cell immobilization for biosensing purposes.</a> Anal. Bioanal. Chem. 402 (5), 1785-1797 (2012).</li>
<li>Franks, W., Tosatti, S., Heer, F., Seif, P., Textor, M., Hierlemann, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patterned+cell+adhesion+by+self-assembled+structures+for+use+with+a+CMOS+cell-based+biosensor%5BTitle%5D)+AND+%22Biosens.+Bioelectron%22%5BJournal%5D)">Patterned cell adhesion by self-assembled structures for use with a CMOS cell-based biosensor.</a> Biosens. Bioelectron. 22 (7), 1426-1433 (2007).</li>
<li>Bacakova, L., Filova, E., Parizek, M., Ruml, T., Svorcik, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+cell+adhesion%2C+proliferation+and+differentiation+on+materials+designed+for+body+implants%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol.+Adv%22%5BJournal%5D)">Modulation of cell adhesion, proliferation and differentiation on materials designed for body implants.</a> Biotechnol. Adv. 29 (6), 739-767 (2011).</li>
<li>Bacakova, L., Svorcik, V. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBacakova%2C+L+%22Cell+colonization+control+by+physical+and+chemical+modification+of+materials.+In%3A+Cell+growth+process%3A+new+research%22">Cell colonization control by physical and chemical modification of materials. In: Cell growth process: new research</a>. Kimura, D. , Nova Science Publishers Inc. New York. 5-56 (2008).</li>
<li>Sanjana, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+fast+flexible+ink-jet+printing+method+for+patterning+dissociated+neurons+in+culture%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Methods%22%5BJournal%5D)">A fast flexible ink-jet printing method for patterning dissociated neurons in culture.</a> J. Neurosci. Methods. 136, 151-163 (2004).</li>
<li>Brittain, S., Paul, K., Zhao, X. -M., Whitesides, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Soft+lithography+and+micro-+fabrication%5BTitle%5D)+AND+%22Phys.+World%22%5BJournal%5D)">Soft lithography and micro- fabrication.</a> Phys. World. 11, 31-36 (1998).</li>
<li>Maher, M., Pine, J., Wright, J., Tai, Y. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+neurochip%3A+a+new+multielectrode+device+for+stimulating+and+recording+from+cultured+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Methods%22%5BJournal%5D)">The neurochip: a new multielectrode device for stimulating and recording from cultured neurons.</a> J. Neurosci. Methods. 87 (1), 45-56 (1999).</li>
<li>Martinoia, S., Bove, M., Tedesco, M., Margesin, B., Grattarola, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+micro-+fluidic+system+for+patterning+populations+of+neurons+on+silicon+micro-+machined+substrates%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Methods%22%5BJournal%5D)">A simple micro- fluidic system for patterning populations of neurons on silicon micro- machined substrates.</a> J. Neurosci. Methods. 87 (1), 35-44 (1999).</li>
<li>Zeck, G., Fromherz, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noninvasive+neuroelectronic+interfacing+with+synaptically+connected+snail+neurons+immobilized+on+a+semiconductor+chip%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Noninvasive neuroelectronic interfacing with synaptically connected snail neurons immobilized on a semiconductor chip.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98 (18), 10457-10462 (2001).</li>
<li>Michel, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+molecular+assembly+patterning%3A+a+new+approach+to+micro-+and+nanochemical+patterning+of+surfaces+for+biological+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Selective molecular assembly patterning: a new approach to micro- and nanochemical patterning of surfaces for biological applications.</a> Langmuir. 18 (8), 3281-3287 (2002).</li>
<li>Rajalingam, B., Selvarasah, S., Dokmeci, M., Khademhosseini, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+static+and+dynamic+patterned+cocultures+using+microfabricated+parylene-C+stencils%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Generation of static and dynamic patterned cocultures using microfabricated parylene-C stencils.</a> Lab Chip. 7, 1272-1279 (2007).</li>
<li>Reusable, reversibly sealable parylene membranes for cell and protein patterning. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22J.+Biomed.+Mater.+Res.+A%22">J. Biomed. Mater. Res. A</a>. Wright, D., Rajalingam, B., Karp, J., Selvarah, S., Ling, Y., Yeh, J., Langer, R., Dokmeci, M., Khademhosseini, A. 85 (2), 530-538 (2008).</li>
<li>Delivopoulos, E., Murray, A. F., MacLeod, N. K., Curtis, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Guided+growth+of+neurons+and+glia+using+microfabricated+patterns+of+parylene-C+on+a+SiO2+background%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Guided growth of neurons and glia using microfabricated patterns of parylene-C on a SiO2 background.</a> Biomaterials. 30, 2048-2058 (2009).</li>
<li>Delivopoulos, E., Murray, A. F., Curtis, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+parylene-C+photooxidation+on+serum-assisted+glial+and+neuronal+patterning%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomed.+Mater.+Res.+A%22%5BJournal%5D)">Effects of parylene-C photooxidation on serum-assisted glial and neuronal patterning.</a> J. Biomed. Mater. Res. A. 94, 47-58 (2010).</li>
<li>Delivopoulos, E., Murray, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controlled+adhesion+and+growth+of+long+term+glial+and+neuronal+cultures+on+parylene-C%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Controlled adhesion and growth of long term glial and neuronal cultures on parylene-C.</a> PLoS One. 6 (9), (2011).</li>
<li>Hughes, M. A., Bunting, A., Cameron, K., Murray, A. F., Shipston, M. J. Modulating patterned adhesion and repulsion of HEK 293 cells on micro-engineered parylene-C/SiO2 substrates. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHughes%2C+MA+%22J.+Biomed.+Mat.+Res.+Mater.+A%22">J. Biomed. Mat. Res. Mater. A</a>. 101 (2), 349-357 (2013).</li>
<li>Unsworth, C. P., Graham, E. S., Delivopoulos, E., Dragunow, M., Murray, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((First+human+hNT+neurons+patterned+on+parylene-C%2Fsilicon+dioxide+substrates%3A+Combining+an+accessible+cell+line+and+robust+patterning+technology+for+the+study+of+the+pathological+adult+human+brain%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Methods%22%5BJournal%5D)">First human hNT neurons patterned on parylene-C/silicon dioxide substrates: Combining an accessible cell line and robust patterning technology for the study of the pathological adult human brain.</a> J. Neurosci. Methods. 194, 154-157 (2010).</li>
</ol>

Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów finansowych.

Zanurzenie wiórów w kwasie piraniowym służy nie tylko do usunięcia resztek materiału organicznego, ale także do wytrawienia powierzchni podłoża. Jest to klucz do umożliwienia skutecznej aktywacji płodową surowicą bydlęcą. Niezastosowanie się do tego zapobiega tworzeniu się wzorców komórkowych i głęboko zmienia zachowanie komórek w układzie scalonym. Nie ma potrzeby sterylizacji frytek po oczyszczeniu kwasem piranii. Rzeczywiście, wykazano, że sterylizacja przez ekspozycję na promieniowanie UV podważa wzorce komórek w sposób zależny od dawki13. Należy zadbać o to, aby zmyć wszystkie pozostałości fotorezystu po procesie fotolitograficznym. Utrzymujący się fotorezystu może działać jak niepożądana warstwa cytoadhezyjna, która zastępuje wzór podyktowany geometrią parylenu-C/SiO2 . Aceton jest skuteczny przy zastosowaniu opisanego powyżej procesu fotolitograficznego i przy użyciu określonych odczynników. Jednak inne rodzaje fotorezystu mogą wymagać innego rozpuszczalnika.
Aby ocenić wpływ i powodzenie różnych etapów produkcji, można zmierzyć kąt zwilżania dwóch kontrastujących ze sobą podłoży. Rysunek 2 ilustruje zmiany, które zachodzą podczas procesu aktywacji chipa. Jest jednak prawdopodobne, że specyficzne adhezyjne i odpychające składniki białkowe w surowicy ostatecznie umożliwiają chipowi o wzorze parylenu wywieranie odpowiednich cech cytoadhezyjnych lub cyto-odpychających.
We wszystkich reprezentatywnych wynikach użyto wiórów o grubości parylenu 100 nm, chociaż z powodzeniem wykonaliśmy wzór przy użyciu zarówno grubszych, jak i cieńszych warstw parylenu. Co ważne, ta technika trawienia fotolitograficznego pozwala na znacznie większą trójwymiarową kontrolę konfiguracji parylenu niż ta zilustrowana tutaj. Na przykład, używając kombinacji fotomasek, można tworzyć regiony parylenu o mieszanej grubości. Otwiera to drogę do tworzenia kultur komórkowych o zdefiniowanej trójwymiarowej topografii, wykraczającej poza zwykłe dyktowanie obszarów adhezji/odpychania komórek, potencjalnie oferując sposób integracji kanałów mikroprzepływowych z konstruktem.
Jak jednak pokazano, ta platforma wzorców nie jest uniwersalnie skuteczna w różnych typach komórek. Nic dziwnego, że różne linie komórkowe, z różnymi profilami cząsteczek adhezyjnych komórek, zachowują się inaczej, gdy są hodowane na tej platformie. Nie zidentyfikowaliśmy jeszcze kluczowych składników surowicy ani uzupełniających się receptorów błony komórkowej, które leżą u podstaw tej platformy wzorców komórkowych. Takie postępowanie w przyszłości obiecuje poszerzenie jego użyteczności i specyfiki. Na przykład, "niewzorcowa" linia komórkowa może być genetycznie modyfikowana w celu ekspresji wymaganej cząsteczki adhezyjnej, a tym samym promowania wzorcowania.

Zrozumienie mechanizmów, które decydują o adhezji komórek i tworzeniu wzorów na syntetycznych materiałach, jest ważne dla zastosowań takich jak inżynieria tkankowa, odkrywanie leków i produkcja biosensorów1-3. Dostępnych i rozwijających się technik jest wiele technik, z których każda wykorzystuje niezliczone czynniki biologiczne, chemiczne i fizyczne, które wpływają na adhezję komórek.
Tutaj opisujemy technikę tworzenia wzorów komórkowych, która wykorzystuje procesy początkowo opracowane do celów produkcji mikroelektroniki. W związku z tym platforma jest dobrze przygotowana do umożliwienia dalszej integracji technologii mikroelektronicznych, takich jak MEA, z platformą modelowania.
Interfejs między błoną komórkową a sąsiednim materiałem jest dwukierunkowy i złożony. In vivo białka macierzy zewnątrzkomórkowej zapewniają strukturę i siłę oraz wpływają na zachowanie komórek poprzez interakcje z receptorami adhezyjnymi komórek. Podobnie, komórki in vitro oddziałują z syntetycznymi substratami poprzez wchłonięte warstwy białek4, podczas gdy wpływy fizykochemiczne również modulują adhezję. Na przykład powierzchnia polimeru może być bardziej "zwilżalna" (hydrofilowa) przez naświetlanie jonami lub światłem ultrafioletowym lub trawienie przez traktowanie kwasem lub wodorotlenkiem5. Uznane metody tworzenia wzorców komórkowych wykorzystują te i inne mediatory adhezji komórek. Przykłady obejmują druk atramentowy6, tłoczenie mikrokontaktowe7, unieruchomienie fizyczne8, mikrofluidykę9, manipulację w czasie rzeczywistym10 i selektywne wzorcowanie składania molekularnego (SMAP)11. Każdy z nich ma określone zalety i ograniczenia. Kluczowym czynnikiem napędzającym naszą pracę jest jednak integracja modelowania komórek z systemami mikroelektromechanicznymi (MEMS).
MEMS odnoszą się do ekstremalnie małych urządzeń mechanicznych napędzanych elektrycznością. Pokrywa się to z odpowiednikami systemów nanoelektromechanicznych w skali nano. Koncepcja ta stała się praktyczna dopiero wtedy, gdy strategie półprzewodnikowe umożliwiły produkcję w mikroskali. Techniki mikrowytwarzania opracowane pierwotnie dla elektroniki półprzewodnikowej zostały przypadkowo uznane za przydatne w innych zastosowaniach, takich jak na przykład elektrofizjologia komórkowa. Kluczowym celem dalszych etapów jest połączenie takich technologii mikroelektronicznych z procesem modelowania komórek o wysokiej wierności (tworząc urządzenie bioMEMS). Kilka istniejących, skądinąd niezawodnych i praktycznych technik tworzenia wzorów komórkowych jest niekompatybilnych z tą ideą. Na przykład dokładne wyrównanie wbudowanych mikroelektroniki lub bioczujników ma zasadnicze znaczenie dla ich skuteczności, ale jest niezwykle trudne do osiągnięcia przy użyciu techniki takiej jak tłoczenie mikrokontaktowe.
Aby obejść ten problem, pracujemy nad platformą do tworzenia wzorów opartą na SiO2, która wykorzystuje fotolitograficznie drukowany parylen-C. Fotolitografia polega na przeniesieniu cech geometrycznych z maski na podłoże za pomocą oświetlenia UV. Maska jest projektowana przy użyciu odpowiedniego programu do projektowania wspomaganego komputerowo. Na szklanej płytce cienka warstwa nieprzezroczystego chromu reprezentuje pożądany wzór geometryczny (możliwa jest rozdzielczość elementu 1-2 mm). Podłoże, które ma być wzorzyste, jest pokryte cienką warstwą fotorezystu (polimeru wrażliwego na promieniowanie UV). Powlekany polimer jest następnie wyrównywany i doprowadzany do bliskiego kontaktu z maską. Źródło promieniowania UV jest stosowane w taki sposób, że niezabezpieczone obszary są napromieniowywane, a zatem stają się rozpuszczalne i usuwalne w następnym etapie rozwoju, pozostawiając reprezentację parylenu-C wzoru maski. Proces ten rozpoczął się podczas opracowywania urządzeń półprzewodnikowych. W związku z tym wafle krzemowe są często używane jako podłoże. Fotolitograficzne osadzanie parylenu-C na SiO2 jest zatem prostym i niezawodnym procesem, który rutynowo odbywa się w mikroelektronicznych pomieszczeniach czystych.
Podczas gdy parylen ma kilka pożądanych cech bioinżynieryjnych (chemicznie obojętny, niebiodegradowalny), czynnikiem ograniczającym jego bezpośrednie zastosowanie w modelowaniu komórek jest jego wrodzona słaba adhezja, przypisywana częściowo jego ekstremalnej hydrofobowości. Niemniej jednak parylen-C był wcześniej używany pośrednio do modelowania komórek, na przykład jako odklejana matryca komórkowa12,13. Takie podejście jest ograniczone przez słabą rozdzielczość i wymaga wielu kroków. Opisany tutaj proces wykorzystuje etap trawienia kwasem, po którym następuje inkubacja surowicy, aby zapewnić, że regiony parylenu-C stają się adhezyjne komórkowo, poprzez połączenie zmniejszenia hydrofobowości i wiązania białek surowicy.
Końcowym rezultatem jest konstrukt złożony z dwóch różnych substratów, które po aktywacji biologicznej wykazują odpowiednie cechy cytoadhezyjne lub cyto-odpychające i w ten sposób stanowią efektywną platformę do modelowania komórek. Co ważne, nie ma potrzeby wprowadzania czynników biologicznych do pomieszczenia czystego, ponieważ wzorzyste podłoża mogą być przechowywane w nieskończoność przed użyciem (po czym są aktywowane za pomocą płodowej surowicy bydlęcej lub innego roztworu aktywacyjnego).
Ta platforma wzorcowa parylene-C/SiO2 jest zatem dobrym kandydatem do koalicji z komponentami MEMS, ponieważ procesy produkcyjne tak bardzo przypominają te używane do produkcji mikroelektroniki.

<table><tbody><tr><td>Pakiet oprogramowania do edycji układu</td><td>CleWin 5.0 firmy WieWeb</td><td></td><td>Zdolny do odczytu/zapisu plików CIF lub GDS-II. Służy do tworzenia projektu parylenu do produkcji masek fotograficznych. http://www.wieweb.com/ns6/index.html</td></tr><tr><td>Maska fotograficzna na zamówienie</td><td>Compugraphics International Ltd, Glenrothes, Szkocja</td><td></td><td>Albo produkuj we własnym zakresie obiekty, albo zlecasz. www.compugraphics-photomasks.com</td></tr><tr><td>3 w płytkach krzemowych</td><td>Siltronix, Archamps, Francja</td><td></td><td>http://www.siltronix.com</td></tr><tr><td>Atmosferyczny piec poziomy</td><td>Sandvik</td><td></td><td>Do utleniania wafli krzemowej. http://www.mrlind.com</td></tr><tr><td>Reflektometr spektroskopowy małych plamek</td><td>Nanometria</td><td></td><td>Do pomiaru głębokości warstwy dwutlenku krzemu. www.nanometrics.com/</td></tr> <tr><td>Promotor adhezji silanu</td><td>Merck</td><td>Chemicals 1076730050</td><td>Wstępnie nałożony na płytkę, aby zachęcić do osadzania parylenu. www.merck-chemicals.de/</td></tr> <tr><td>Parylene-C</td><td>Ultra Electronics</td><td></td><td>www.ultra-cems.com</td></tr><tr><td>SCS Labcoter 2 jednostka osadzania, model PDS2010</td><td>SCS Equipment, Surrye, Wielka Brytania</td><td>Model PDS2010</td><td></td></tr> <tr><td>Promotor adhezji www.scscoatings.com/ heksametyldisilazanu (HMDS)</td><td>SpiChem</td><td></td><td>www.2spi.com</td></tr><tr><td>Zautomatyzowany system torowy do dozowania fotorezystu na płytki; 3-calowa szyna fotorezystyczna</td><td>SVG (silicon Valley Group)</td><td></td><td>Zautomatyzowany system szynowy do dozowania fotorezystu na płytki. Główny piekarnik piecze wafel i dozuje promotor przyczepności, HMDS. Kombinowany błystka dozuje fotorezystor. Piekarnik do pieczenia utwardza opór.</td></tr><tr><td>Fotorezystor</td><td>Rohm & Haas</td><td>SPR350-1.2 dodatni fotorezystu</td><td>www.rohmhaas.com/</td></tr> <tr><td>MA/BA8 wyrównywacz maski fotograficznej</td><td>Suss Microtech</td><td></td><td>www.suss.com</td></tr><tr><td>Microchem MF-26A deweloper</td><td>Microchem</td><td></td><td>Usuwa odsłonięte obszary fotorezystu.</td></tr><tr><td>www.microchem.com System wytrawiania plazmowego JLS RIE80</td><td>JLS Designs</td><td></td><td>Usuwa odsłonięte obszary parylenu. www.jlsdesigns.co.uk</td></tr><tr><td colspan="4">[nagłówek]</td></tr><tr><td>DISCO DAD 680 Piła do krojenia wafli w kostkę</td><td>DISCO Corporation, Japonia</td><td></td><td>www.disco.co.jp</td></tr><tr><td>Aceton</td><td>Fisher Scientific</td><td>A929-4</td><td>Do zmywania resztek fotorezystu.</td></tr><tr><td>30% Nadtlenek wodoru</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H1009</td><td>www.sigmaaldrich.com</td></tr><tr><td>98% Kwas siarkowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>435589</td><td>www.sigmaaldrich.com</td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca</td><td>Gibco-Invitrogen</td><td>10437</td><td>Standardowa aktywacja chipa.&nbsp; www.invitrogen.com</td></tr><tr><td>Zbilansowany roztwór soli Hanka</td><td>Gibco-Invitrogen</td><td>14170</td><td>www.invitrogen.com</td></tr></tbody></table>

wzorcowanie komórek na zdefiniowanych fotolitograficznie 
parylene-c: substraty sio2

Cell Patterning on Photolithographically Defined 
Parylene-C: SiO2 Substrates

Platformy do tworzenia wzorców komórkowych wspierają szerokie cele badawcze, takie jak budowa predefiniowanych sieci neuronalnych in vitro i eksploracja pewnych centralnych aspektów fizjologii komórek. Aby łatwo połączyć modelowanie komórek z matrycami wieloelektrodowymi (MEA) i technologiami "lab on a chip" opartymi na krzemie, wymagany jest protokół kompatybilny z mikrofabrykacją. Opisujemy metodę wykorzystującą osadzanie polimeru parylenu-C na płytkach SiO2. Fotolitografia umożliwia dokładne i niezawodne modelowanie parylenu-C w rozdzielczości na poziomie mikronów. Późniejsza aktywacja przez zanurzenie w płodowej surowicy bydlęcej (lub innym specyficznym roztworze aktywacyjnym) powoduje powstanie substratu, w którym hodowane komórki przylegają lub są odpychane odpowiednio przez regiony parylenu lub SiO2. Technika ta pozwoliła na modelowanie szerokiego zakresu typów komórek (w tym pierwotnych mysich komórek hipokampa, linii komórkowej HEK 293, ludzkiej linii komórkowej teratoraka podobnej do neuronów, pierwotnych mysich komórek ziarnistych móżdżku i pierwotnych ludzkich komórek macierzystych pochodzących z glejaka). Co jednak ciekawe, platforma nie jest uniwersalna; odzwierciedlające znaczenie specyficznych dla komórek cząsteczek adhezyjnych. Ten proces modelowania komórek jest opłacalny, niezawodny i, co ważne, może być włączony do standardowych protokołów mikrofabrykacji (produkcji chipów), torując drogę do integracji technologii mikroelektronicznej.

Proces fotolitograficznego wzorowania SiO2 za pomocą parylenu-C przedstawiono na Rysunku 1. Po przygotowaniu, aktywacja chipów w płodowej surowicy bydlęcej umożliwia wzorowanie w kulturze szerokiego zakresu typów komórek. Nasza grupa z sukcesem przeprowadziła wzorowanie pierwotnych komórek hipokampa myszy14-16, linii komórkowej HEK 29317, linii komórkowej ludzkiego teratokarcinomy neuronopodobnej (hNT)18, pierwotnych ziarnistych komórek móżdżku myszy oraz pierwotnych ludzkich komórek macierzystych pochodzących z glejaka.
Rysunek 3 ilustruje skuteczne wzorowanie komórek HEK 293 na wzorze z parylenu składającym się z okrągłych węzłów z rozszerzeniami w kształcie „celownika”. Aktywacja chipa w tym przykładzie została przeprowadzona z użyciem płodowej surowicy bydlęcej. W przeciwieństwie do tego, Rysunek 4 ilustruje możliwość rozszerzenia platformy wzorowania poprzez zastosowanie alternatywnych roztworów aktywujących. Dzięki zastosowaniu roztworu albuminy surowicy bydlęcej (3 mg/ml) i fibronektyny (1 μg/ml) w HBSS, poprzednia zasada wzorowania została odwrócona.
Rycina 5 przedstawia inny typ komórek (pierwotną ludzką linię komórek macierzystych pochodzącą z glejaka wysokiego stopnia). W tym przypadku geometria zastosowanego wzoru wpływa na zachowanie komórek, przy czym wzór pokazany na Rycini 4A sprzyja wzrostowi wypustek komórkowych wzdłuż cienkich ścieżek z parylenu-C, co przedstawiono na Rycini 4B oraz Rycini 4C.
Niektóre typy komórek nie wykazują wzorca przy zastosowaniu ugruntowanego protokołu aktywacji płodowej surowicy bydlęcej. Rysunek 6 przedstawia komórki 3T3 L1 rosnące do konfluencji, bez zauważalnych różnic w cyto-repulsji lub cyto-adhezji pomiędzy regionami z parylenu-C a SiO2.
<img alt="Schemat procesu wytwarzania wafla krzemowego z fotolitografią i trawieniem dla mikroelektroniki." fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50929/50929fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50929/50929fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1. Schemat blokowy ilustrujący proces wytwarzania wzorów z parylenu-C na SiO2.
<img alt="Schemat procesu trawienia Parylenu-C przedstawiający etapy trawienia plazmą tlenową, traktowania kwasem piranha oraz inkubacji w surowicy." fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50929/50929fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50929/50929fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2. Schemat blokowy ilustrujący zmiany kąta zwilżania dla obszarów z wzorowanego parylenu-C i SiO2 podczas etapów aktywacji chipa.
<img alt="Obraz mikroskopowy sferoidów komórkowych zamkniętych w hydrożelu, ułożonych w siatkę do analizy wzrostu komórek." fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50929/50929fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50929/50929fig3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3. Obrazowanie żywych komórek HEK 293 hodowanych na parylenie-C/SiO2 po trzech dniach in vitro. Chip inkubowany przez 3 hr w płodowej surowicy bydlęcej, po czym komórki wysiano w zawiesinie w stężeniu 5 x 104 cells/ml. Parylen-C sprzyja adhezji komórek, podczas gdy czyste SiO2 odpycha komórki. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50929/50929fig3highres.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Etapy wzrostu komórek na podłożu; obraz mikroskopowy; badanie kultur tkankowych." fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50929/50929fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50929/50929fig4.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 4"> 
Rycina 4. Obrazowanie żywych komórek HEK 293 hodowanych na parylenie-C/SiO2 po trzech dniach in vitro. Chipy aktywowane przez 3 hr w różnych zracjonalizowanych roztworach aktywujących: A: płodowa surowica bydlęca, B: witronektyna (1 μg/ml) w HBSS, C: albuminy surowicze bydlęce (3 mg/ml) + witronektyna (1 μg/ml) w HBSS, D: albuminy surowicze bydlęce (3 mg/ml) + fibronektyna (1 μg/ml) w HBSS. Wysiane komórki znajdowały się w zawiesinie o gęstości 5 x 104 komórek/ml. Zwróć uwagę, jak różne traktowanie chipa doprowadziło do odwrócenia poprzedniego dogmatu dotyczącego wzorowania, gdzie SiO2 stało się obecnie adhezyjne, a parylen-C repulsywny. Średnica węzła parylenu-C 250 μm, zaadaptowano z Hughes et al.17 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50929/50929fig4highres.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Schemat mikroprzepływowej hodowli komórkowej z obrazowaniem fluorescencyjnym, w świetle przechodzącym i w kontraście fazowym, skala 100-300µm." fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50929/50929fig5highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50929/50929fig5.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 5"> 
Rycina 5. Obrazy immunofluorescencyjne pierwotnych ludzkich komórek macierzystych pochodzących z glejaka, hodowanych na różnych wzorach parylenu-C na SiO2. A: schemat ilustrujący siatkową strukturę parylenu pokazaną na zdjęciach B i C. B: mikrofotografia fluorescencyjna utrwalonych komórek (po 4 dniach in vitro) barwionych pod kątem obecności kwaśnego białka włókienstego gleju (GFAP). C: mikrofotografia świetlna żywych komórek na tym samym chipie. D: obraz fluorescencyjny ilustrujący komórki barwione na GFAP na innym wzorze parylenu. E: obraz refleksyjny wzoru parylenu typu „węzeł i szprychy” pokazanego na zdjęciu D. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50929/50929fig5highres.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Wzór hodowli komórkowej z czerwonymi okrągłymi koloniami; obraz mikroskopowy; skala 200µm; badanie wzrostu komórkowego." fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50929/50929fig6highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50929/50929fig6.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 6"> 
Rysunek 6. Obrazowanie żywych komórek 3T3 L1 hodowanych na parylenie-C/SiO2 po czterech dniach in vitro. Chip aktywowany przez 3 hr w płodowej surowicy bydlęcej, po czym komórki wysiano w zawiesinie (3 x 104 komórek/ml). W tym przypadku platforma nie umożliwia tworzenia wzorów, a komórki osiągają taką samą konfluencję w obszarach parylenu-C i SiO2. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50929/50929fig6highres.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>

Ten protokół opisuje metodę tworzenia wzorów komórkowych na SiO2 kompatybilną z mikrofabrykacją. Predefiniowany wzór parylenu-C jest drukowany fotolitograficznie na płytkach SiO2. Po inkubacji z surowicą (lub innym roztworem aktywacyjnym) komórki przylegają specyficznie (i rosną zgodnie z zgodnością) leżącego poniżej parylenu-C, będąc jednocześnie odpychane przez regiony SiO2.

Wzorcowanie komórek na zdefiniowanych fotolitograficznie 
Parylene-C: Substraty SiO2

Cell patterning platforms support broad research goals, such as construction of predefined in vitro neuronal networks and the exploration of certain ...

Ogólnym celem tej procedury jest rozmieszczenie komórek na powierzchniach dwutlenku krzemu zgodnie z wcześniej zdefiniowanym wzorem z parylenu. Osiąga się to najpierw poprzez utworzenie fotomaski pożądanego wzoru. Drugim krokiem jest utlenienie, a następnie pokrycie płytki krzemowej parylenem.Następnie, w celu odsłonięcia pożądanego wzoru, przeprowadza się procesy fotolitograficzne w specjalistycznym pomieszczeniu typu clean room dla mikroelektroniki, aby selektywnie wytrawić powłokę z parylenu. Końcowym etapem jest aktywacja chipów, najpierw przy użyciu roztworu piranha, a następnie inkubacja w płodowej surowicy cielęcej przez okres od 3 do 12 godzin, po czym można nanieść zawiesinę komórek do hodowli. Ostatecznie rozmieszczenie komórek można ocenić albo poprzez obrazowanie żywych komórek przy użyciu mikroskopu stereoskopowego, albo po utrwaleniu przy użyciu konfokalnej mikroskopii fluorescencyjnej.Główną zaletą tej techniki w porównaniu z wieloma istniejącymi platformami do wzorowania komórek jest brak konieczności wprowadzania czynników biologicznych do pomieszczenia czystego. Ponadto chipy z wzorami mogą być przechowywane w nieskończoność, dopóki nie zostaną aktywowane najpierw kwasem par, a następnie surowicą. Aby zaprojektować pożądana konfigurację paraline C, należy użyć pakietu oprogramowania do edycji układów, który umożliwia odczyt i zapis plików CIF lub GDS two.Zamów maski fotograficzne u odpowiedniego producenta mikroelektroniki lub wykonaj je we własnym zakresie. Jeśli dysponujesz odpowiednim zapleczem, utlenij płytkę krzemową w poziomowym piecu atmosferycznym w temperaturze 950 °C przez 40 minut, aby wytworzyć warstwę dwutlenku krzemu o grubości 200 nm. Następnie potwierdź grubość warstwy, wykonując pomiar punktowy.Spektroskopowy reflektometr. Umieść wafle w systemie do osadzania próżniowego i nałóż promotor adhezji sine na wewnętrzną stronę pokrywy komory. Podczas cyklu pompowania promotor adhezji sine pokrywa utleniony wafel; załaduj paraline do pieca i osadź paraline C w temperaturze otoczenia z szybkością 1,3 nanometra na miligram dimeru, korzystając z systemu do osadzania próżniowego.Następnie nanieś promotor adhezji HMDS na podłoże krzemowe pokryte parylenem. Używając odpowiedniego systemu do nakładania fotorezystu, zakręć podłożem z prędkością 4 000 RPM przez 30 sekund podczas aplikacji pozytywnego fotorezystu, aby uzyskać grubość jednej mikrona, a następnie przeprowadź wstępne wygrzewanie (soft bake) podłoża przez 60 sekund w temperaturze 90 °C. Teraz umieść podłoże oraz przygotowaną wcześniej maskę fotolitograficzną w urządzeniu do wyrównywania masek.Naświetl płytkę pokrytą fotorezystem światłem UV, aby przenieść pożądany wzór na fotorezyst. Następnie wypiecz naświetloną płytkę przez 60 s w temperaturze 110 °C. Po tym usuń cały naświetlony fotorezyst z płytki, wywołując ją w odpowiednim roztworze wywoływacza, a następnie usuń niechronioną warstwę parylenu za pomocą systemu trawienia w plazmie tlenowej, aby odsłonić znajdujący się pod nią dwutlenek krzemu.Następnie po dicingu przechowywać chipy w bezpyłowych pudełkach do czasu użycia. W tej procedurze usunąć pozostałości fotorezystu z chipów, myjąc je w acetonie przez 10 seconds. Następnie wypłukać je trzykrotnie w dejonizowanej destylowanej H2O, po czym przygotować świeży roztwór piranha acid w dygestorium do kwasów, a następnie oczyścić i wytrawić chipy poprzez zanurzenie w piranha acid na 10 minutes.Następnie opłukać płytki trzykrotnie w dejonizowanej H2O i przenieść do sterylnej szalki hodowlanej w laminarnym dygestorium do hodowli tkankowej. Aktywować płytki do wzorowania komórek, umieszczając po dwie płytki w każdym dołku płytki sześciodołkowej. Następnie dodać dwa mililitry płodowej surowicy bydlęcej, aby całkowicie zanurzyć wszystkie płytki.Inkubować chipy w surowicy od 3 do 12 godzin w temperaturze 37 °C. Następnie wyjąć chipy z roztworu aktywującego. Przemyć jednokrotnie przez 10 sekund w zrównoważonym roztworze soli Hanksa.Następnie należy umieścić chipy w dołku hodowlanym i wysiać wybrany typ komórek w formie zawiesiny w standardowej pożywce wzrostowej. Optymalna gęstość wysiewu komórek zależy zarówno od typu komórek, jak i wzoru geometrycznego linii paraline C na chipie. Gęstość 5 × 10⁴ komórek na ml stanowi rozsądny punkt wyjścia.Obrazowanie jest dostosowane do podstawowej motywacji związanej z wzorcowaniem komórek, jednak zachowanie żywych komórek można łatwo ocenić za pomocą mikroskopu stereoskopowego i kamery cyfrowej z odpowiednim obiektywem przekaźnikowym. Przedstawiono tutaj obrazowanie żywych komórek HEC 2 93 hodowanych na dwutlenku krzemu z paraliną C po trzech dniach. In vitro płytki inkubowano przez trzy godziny w płodowej surowicy bydlęcej, a komórki wysiano w zawiesinie w stężeniu 5×10⁴ komórek/ml.Paralen C sprzyja adhezji komórek, podczas gdy czysty dwutlenek krzemu odpycha komórki. Rysunek ten przedstawia obrazy immunofluorescencyjne pierwotnych ludzkich komórek macierzystych pochodzących z glejaka, hodowanych na różnych wzorach paralenu C na dwutlenku krzemu. Tutaj schemat ilustruje siateczkowy wzór paralenu, mikrografia fluorescencyjna przedstawia utrwalone komórki barwione na białko kwaśne włókienkowe gleju, a mikrografia świetlna pokazuje żywe komórki na tym samym chipie.Oto obraz fluorescencyjny przedstawiający komórki barwione na GFAP w innym projekcie paraline oraz obraz odbiciowy węzła w projekcie paraline typu „szprycha”. Natomiast ta rycina przedstawia obrazowanie żywych komórek linii T3L1 hodowanych na paraline C z dwutlenkiem krzemu. Po czterech dniach in vitro chipy były aktywowane przez trzy godziny w płodowej surowicy bydlęcej, a komórki wysiano w zawiesinie w stężeniu 5 × 10⁴ komórek/mL.W tym przypadku platforma nie umożliwia tworzenia wzorów, w których komórki osiągałyby taką samą konfluencję na obszarach Lene C oraz dwutlenku krzemu. Podczas wykonywania tego protokołu należy pamiętać, że aktywacja surowicą musi nastąpić niezwłocznie po traktowaniu roztworem piranha. Zaniedbanie tego kroku prowadzi do pogorszenia procesu tworzenia wzorów.Należy pamiętać, że praca z kwasem piranha może być niezwykle niebezpieczna. Kwas piranha należy przygotowywać i stosować w dygestorium, dbając o założenie odpowiednich gogli, fartuchów laboratoryjnych i rękawic.

cell-patterning-on-photolithographically-defined-parylene-c-sio2

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Układanie komórek na światłoczułym 
Parylene-C: podłoża SiO2

Niebędąca podatna na fouling monowarstwa silanu PEG została desorbowana z indywidualnie adresowalnych elektrod ITO na szkle poprzez przyłożenie potencjału redukcyjnego. Elektrochemiczne usuwanie warstwy silanu PEG z mikroelektrod ITO umożliwiło adhezję komórek w sposób przestrzennie zdefiniowany, przy czym wzory komórkowe ściśle odpowiadały rozmieszczeniu elektrod.

Wzorcowanie komórek na optycznie przezroczystych elektrodach z tlenku indu i cyny

Samoorganizujące się monowarstwy (SAMs) utworzone z długołańcuchowych alkanotioli na złocie stanowią precyzyjnie zdefiniowane podłoża do tworzenia wzorów białkowych oraz ograniczania przestrzeni wzrostu komórek. Mikro kontaktowy druk heksadekanotiolu przy użyciu stempla z polidimetylosiloksanu (PDMS), a następnie wypełnienie wolnych przestrzeni monomerem alkanotiolu zakończonym grupą glikolową, pozwala na uzyskanie wzoru, w którym białka i komórki adsorbują wyłącznie do obszaru z nadrukowanym...

Tworzenie dwuwymiarowych wzorowanych podłoży do ograniczania przestrzeni białek i komórek

W niniejszej pracy opisujemy prostą metodę wzorowania wolnego od tlenków krzemu i germanu za pomocą reaktywnych monowarstw organicznych oraz demonstrujemy funkcjonalizację wzorowanych podłoży małymi cząsteczkami i białkami. Podejście to zapewnia całkowitą ochronę powierzchni przed utlenianiem chemicznym, umożliwia precyzyjną kontrolę nad morfologią struktur oraz zapewnia łatwy dostęp do wzorów rozróżnialnych chemicznie.

Funkcjonalizacja i wzorowanie krzemu oraz germanu beztlenkowego metodą miękkiej litografii

Opracowano metodę litografii mikroperforacyjnej w celu wytwarzania wzorów mikro- i submikronowych na powierzchniach górnych, bocznych i dolnych podłoży polimerowych. Pozwala ona pokonać trudności związane z nanoszeniem wzorów na polimery przewodzące oraz tworzeniem wzorów na ściankach bocznych. Metoda ta umożliwia szybkie wytwarzanie wielu elementów i nie wymaga zastosowania agresywnych odczynników chemicznych.

Litografia mikropunczowania w celu generowania wzorów mikro- i submikronowych na podłożach polimerowych

Wodne systemy dwufazowe były używane do jednoczesnego modelowania wielu populacji komórek. Ta szybka i łatwa metoda modelowania komórek wykorzystuje separację faz wodnych roztworów dekstranu i glikolu polietylenowego oraz napięcie międzyfazowe, które istnieje między tymi dwoma roztworami polimerów.

Modelowanie kohodowli komórkowych przy użyciu wodnych systemów dwufazowych

Ten raport opisuje prostą, łatwą do wykonania technikę, wykorzystującą próżnię niskociśnieniową, do wypełniania kanałów mikroprzepływowych komórkami i substratami do badań biologicznych.

Wszechstronna metoda modelowania białek i komórek

Opisano metody wytwarzania powierzchni do wzorzystego osadzania pędzli o grubości nanometrów lub usieciowanych warstw o grubości mikronów kopolimeru blokowego azlactonu. Omówiono krytyczne etapy eksperymentalne, reprezentatywne wyniki i ograniczenia każdej metody. Metody te są przydatne do tworzenia funkcjonalnych interfejsów z dostosowanymi cechami fizycznymi i przestrajalną reaktywnością powierzchni.

Wytwarzanie powierzchni reaktywnych za pomocą pędzlowych i usieciowanych warstw kopolimerów blokowych funkcjonalizowanych azlaktonem

Tutaj prezentujemy protokół do mikrowzorcowania komórek w rozdzielczości pojedynczej komórki za pomocą adhezji programowanej przez DNA. Protokół ten wykorzystuje laboratoryjną platformę fotolitograficzną do tworzenia wzorów oligonukleotydów DNA na szkiełku szkiełkowym, a następnie znakuje błony komórkowe dostępnymi na rynku komplementarnymi oligonukleotydami. Hybrydyzacja oligonukleotydów powoduje zaprogramowaną adhezję komórek.

Proste, niedrogie i modułowe modelowanie komórek za pomocą DNA

Opisujemy ulepszenia standardowej metody pomiaru sił trakcyjnych komórek, opartej na drukowaniu mikrokontaktowym z pojedynczym krokiem subtraktywnego tworzenia wzorów układów punktowych białek macierzy zewnątrzkomórkowej na miękkich hydrożelach. Metoda ta pozwala na prostsze i bardziej spójne wytwarzanie wzorów wyspowych, niezbędnych do kontrolowania kształtu klastrów komórek.

Generowanie wzorców dla mikroskopii trakcyjnej mikrowzorców

Tradycyjnie, hodowla komórkowa jest przeprowadzana na płaskich podłożach, które słabo naśladują naturalne środowisko komórek in vivo. W tym miejscu opisujemy metodę wytwarzania substratów do hodowli komórkowych o fizjologicznie istotnych zakrzywionych geometriach i mikrowzorach białek zewnątrzkomórkowych, co pozwala na systematyczne badania nad komórkowym wykrywaniem tych zewnątrzkomórkowych sygnałów.

Generowanie wielokierunkowych mikrośrodowisk komórkowych za pomocą fotomodelingu UV trójwymiarowych substratów do hodowli komórkowych

Protokół ten przedstawia metodę indukowaną światłem do wytwarzania śliskich, trójwymiarowych struktur poprzez sekwencyjne cyfrowe wzorowanie i szczepienie na nanoporowatych powierzchniach pokrytych silanem. To podejście umożliwia kontrolowane przestrzennie tworzenie śliskich obszarów, umożliwiając wzorzystą odstraszaczność cieczy oraz ilościową analizę śliskości między warstwami, z zastosowaniami w manipulacji płynami i inżynierii powierzchni.

Wzorowanie i szczepienie światłem dla śliskich powierzchni na podstawie nanoporowatych struktur powlekanych silanem

Poznaj metodę wzorcowania komórek na SiO₂ z wykorzystaniem fotolitografii i parylene-C. Technika umożliwia kontrolowane wzorce adhezji bez biologicznych czynników w pomieszczeniu czystym.

Wzorcowanie komórek na zdefiniowanych fotolitograficznie Parylene-C: Substraty SiO₂

Przeglądaj więcej filmów