Wzorcowanie komórek na zdefiniowanych fotolitograficznie Parylene-C: Substraty SiO2

Ogólnym celem tej procedury jest modelowanie komórek na usługach dwutlenku krzemu zgodnie z predefiniowanym podstawowym projektem paraliny. Osiąga się to, najpierw tworząc maskę fotograficzną o pożądanym wzorze. Drugim krokiem jest utlenienie, a następnie pokrycie płytki krzemowej paraliną.

Następnie procesy fotolitograficzne wykonywane w pomieszczeniu czystym mikroelektroniki są wykorzystywane do selektywnego wytrawiania powłoki paraline w celu ujawnienia pożądanego wzoru. Ostatnim krokiem jest aktywacja chipów za pomocą najpierw kwasu piranii, a następnie inkubacja w surowicy cielęcej płodu przez trzy do 12 godzin, po czym można zastosować zawiesinę komórkową do hodowli. Ostatecznie wzorce komórkowe można ocenić za pomocą obrazowania żywych komórek za pomocą mikroskopu preparacyjnego lub po utrwaleniu za pomocą konfokalnej mikroskopii fluorescencyjnej.

Główną przewagą tej techniki nad kilkoma istniejącymi platformami do tworzenia wzorów komórkowych jest to, że nie ma potrzeby wprowadzania czynników biologicznych do pomieszczenia czystego. Ponadto chipy wzorcowe mogą być przechowywane w nieskończoność, dopóki nie zostaną aktywowane najpierw kwasem parowym, a następnie surowicą. Aby zaprojektować żądaną konfigurację paraline C, użyj pakietu oprogramowania do edycji układu, który jest w stanie odczytywać, zapisywać dwa pliki CIF lub GDS.

Zleć producenta maski fotograficznej odpowiedniemu zakładowi mikroelektronicznemu lub wyprodukuj we własnym zakresie. Jeśli istnieją urządzenia, należy utlenić płytkę krzemową w atmosferycznym piecu poziomym w temperaturze 950 stopni Celsjusza przez 40 minut, aby wytworzyć warstwę dwutlenku krzemu o grubości 200 nanometrów. Następnie potwierdź grubość małym miejscem.

Reflektometr spektroskopowy. Umieścić wafle w systemie osadzania próżniowego, nałożyć sinusoidalny promotor adhezji na wewnętrzną stronę pokrywy komory. Podczas cyklu pompowania w dół, sinusoidalny promotor adhezji powleka utleniony ładunek wafla paraline w piecu osadza paralinę C w temperaturze otoczenia z szybkością 1,3 nanometra na miligram dimeru przy użyciu systemu osadzania próżniowego.

Następnie nałóż promotor przyczepności HMDS na płytkę pokrytą paraline. Używając odpowiedniego systemu powlekania fotorezystywnego, wiruj wafel z prędkością 4 000 obr./min przez 30 sekund, nakładając dodatni fotorezyst, aby uzyskać grubość jednego mikrona za pomocą systemu powlekania fotorezystu, a następnie miękko piecz wafel przez 60 sekund w temperaturze 90 stopni Celsjusza. Teraz włóż zarówno wafel, jak i prefabrykowaną maskę fotograficzną do nakładki na maskę.

Naświetl płytkę pokrytą fotorezystem światłem UV, aby przenieść pożądany wzór do fotorezystu. Następnie piecz odsłonięty wafel przez 60 sekund w temperaturze 110 stopni Celsjusza. Następnie usuń cały odsłonięty fotorezyst z płytki, rozwijając go w odpowiednim roztworze wywoływacza w Hoff niezabezpieczonej paralinii, używając systemu wytrawiania plazmą tlenową w celu odsłonięcia znajdującego się pod spodem dwutlenku krzemu.

Następnie przechowuj frytki po pokrojeniu w kostkę w bezpyłowych pudełkach, aż będą potrzebne. W tej procedurze usuń resztki fotorezystu z wiórów, myjąc aceton przez 10 sekund. Następnie opłucz je trzykrotnie w dejonizowanym destylowanym H2O, a następnie przygotuj świeży kwas piraniowy w kwaśnym okapie, wyczyść i wytraw wióry przez zanurzenie w kwasie piana na 10 minut.

Następnie opłucz wióry trzykrotnie w dejonizowanym H2O i przenieś do sterylnego naczynia hodowlanego w kapturze do hodowli tkanek z przepływem laminarnym. Aktywuj chipy do modelowania komórek, umieszczając dwa wióry na dołek w płytce z sześcioma dołkami. Następnie dodaj dwa mililitry płodowej surowicy bydlęcej, aby całkowicie zanurzyć wszystkie chipsy.

Inkubuj chipsy w surowicy przez trzy do 12 godzin w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Teraz wyjmij chipy z ich roztworu aktywacyjnego. Umyj raz przez 10 sekund w zrównoważonym roztworze soli Hanka.

Następnie umieść chipsy w studzience hodowlanej i umieść wybrany typ komórek jako zawiesinę w zwykłej pożywce wzrostowej. Optymalna gęstość posiewu komórek zależy zarówno od typu ogniwa, jak i wzoru geometrycznego paraliny C na chipie. Gęstość pięć razy 10 do czwartej komórki na mililitr jest rozsądnym punktem wyjścia.

Obrazowanie jest dostosowane do podstawowej motywacji do tworzenia wzorców komórkowych, ale zachowanie żywych komórek można łatwo ocenić za pomocą mikroskopu preparacyjnego i kamery cyfrowej z odpowiednią soczewką przekaźnikową. Oto obrazowanie żywych komórek HEC 2 93 hodowanych na dwutlenku krzemu paraliny C po trzech dniach. In vitro statki inkubowano przez trzy godziny w płodowej surowicy bydlęcej, a komórki posiewano w zawiesinie w stężeniu pięć razy 10 do czwartej komórki na mililitr.

Paralina C wspomaga adhezję komórek, podczas gdy goły dwutlenek krzemu odpycha komórki. Rysunek ten przedstawia obrazy immunofluorescencyjne pierwotnych ludzkich komórek macierzystych pochodzących z glejaka, hodowanych na różnych wzorach paraliny C na dwutlenku krzemu. Tutaj schemat ilustruje siatkowatą konstrukcję paraliny, mikrografię fluorescencyjną utrwalonych komórek barwionych na obecność kwaśnego białka fibrylarnego gleju oraz mikrofotografię świetlną żywych komórek na tym samym chipie.

Oto obraz fluorescencyjny ilustrujący komórki barwione GFAP na innym projekcie paraline oraz obraz odbicia węzła w projekcie paraline szprychowego. Rysunek ten pokazuje obrazowanie żywych komórek trzech komórek T trzy L one hodowanych na dwutlenku krzemu paralinii C. Po czterech dniach in vitro chipy były aktywowane przez trzy godziny w płodowej surowicy bydlęcej, a komórki zostały posiane w zawiesinie w stężeniu pięć razy 10 czwartych komórek na mililitr.

W tym przypadku platforma nie umożliwia tworzenia wzorców, w których komórki stają się jednakowo zlewające się z regionami Lene C i dwutlenku krzemu. Podczas wykonywania tego protokołu należy pamiętać, że aktywacja surowicy musi nastąpić natychmiast po leczeniu piranią. Niezastosowanie się do tego skutkuje podważeniem procesu tworzenia wzorców.

Nie zapominaj, że praca z kwasem pirania może być bardzo niebezpieczna. Przygotuj i użyj kwasu piraniowego w chemicznym okapie i upewnij się, że nosisz odpowiednie okulary, fartuchy laboratoryjne i rękawice.