Wzorcowanie komórek na zdefiniowanych fotolitograficznie Parylene-C: Substraty SiO2
7 marca 2014
Ten protokół opisuje metodę tworzenia wzorów komórkowych na SiO2 kompatybilną z mikrofabrykacją. Predefiniowany wzór parylenu-C jest drukowany fotolitograficznie na płytkach SiO2. Po inkubacji z surowicą (lub innym roztworem aktywacyjnym) komórki przylegają specyficznie (i rosną zgodnie z zgodnością) leżącego poniżej parylenu-C, będąc jednocześnie odpychane przez regiony SiO2.
Ogólnym celem tej procedury jest modelowanie komórek na usługach dwutlenku krzemu zgodnie z predefiniowanym podstawowym projektem paraliny. Osiąga się to, najpierw tworząc maskę fotograficzną o pożądanym wzorze. Drugim krokiem jest utlenienie, a następnie pokrycie płytki krzemowej paraliną.
Następnie procesy fotolitograficzne wykonywane w pomieszczeniu czystym mikroelektroniki są wykorzystywane do selektywnego wytrawiania powłoki paraline w celu ujawnienia pożądanego wzoru. Ostatnim krokiem jest aktywacja chipów za pomocą najpierw kwasu piranii, a następnie inkubacja w surowicy cielęcej płodu przez trzy do 12 godzin, po czym można zastosować zawiesinę komórkową do hodowli. Ostatecznie wzorce komórkowe można ocenić za pomocą obrazowania żywych komórek za pomocą mikroskopu preparacyjnego lub po utrwaleniu za pomocą konfokalnej mikroskopii fluorescencyjnej.
Główną przewagą tej techniki nad kilkoma istniejącymi platformami do tworzenia wzorów komórkowych jest to, że nie ma potrzeby wprowadzania czynników biologicznych do pomieszczenia czystego. Ponadto chipy wzorcowe mogą być przechowywane w nieskończoność, dopóki nie zostaną aktywowane najpierw kwasem parowym, a następnie surowicą. Aby zaprojektować żądaną konfigurację paraline C, użyj pakietu oprogramowania do edycji układu, który jest w stanie odczytywać, zapisywać dwa pliki CIF lub GDS.
Zleć producenta maski fotograficznej odpowiedniemu zakładowi mikroelektronicznemu lub wyprodukuj we własnym zakresie. Jeśli istnieją urządzenia, należy utlenić płytkę krzemową w atmosferycznym piecu poziomym w temperaturze 950 stopni Celsjusza przez 40 minut, aby wytworzyć warstwę dwutlenku krzemu o grubości 200 nanometrów. Następnie potwierdź grubość małym miejscem.
Reflektometr spektroskopowy. Umieścić wafle w systemie osadzania próżniowego, nałożyć sinusoidalny promotor adhezji na wewnętrzną stronę pokrywy komory. Podczas cyklu pompowania w dół, sinusoidalny promotor adhezji powleka utleniony ładunek wafla paraline w piecu osadza paralinę C w temperaturze otoczenia z szybkością 1,3 nanometra na miligram dimeru przy użyciu systemu osadzania próżniowego.
Następnie nałóż promotor przyczepności HMDS na płytkę pokrytą paraline. Używając odpowiedniego systemu powlekania fotorezystywnego, wiruj wafel z prędkością 4 000 obr./min przez 30 sekund, nakładając dodatni fotorezyst, aby uzyskać grubość jednego mikrona za pomocą systemu powlekania fotorezystu, a następnie miękko piecz wafel przez 60 sekund w temperaturze 90 stopni Celsjusza. Teraz włóż zarówno wafel, jak i prefabrykowaną maskę fotograficzną do nakładki na maskę.
Naświetl płytkę pokrytą fotorezystem światłem UV, aby przenieść pożądany wzór do fotorezystu. Następnie piecz odsłonięty wafel przez 60 sekund w temperaturze 110 stopni Celsjusza. Następnie usuń cały odsłonięty fotorezyst z płytki, rozwijając go w odpowiednim roztworze wywoływacza w Hoff niezabezpieczonej paralinii, używając systemu wytrawiania plazmą tlenową w celu odsłonięcia znajdującego się pod spodem dwutlenku krzemu.
Następnie przechowuj frytki po pokrojeniu w kostkę w bezpyłowych pudełkach, aż będą potrzebne. W tej procedurze usuń resztki fotorezystu z wiórów, myjąc aceton przez 10 sekund. Następnie opłucz je trzykrotnie w dejonizowanym destylowanym H2O, a następnie przygotuj świeży kwas piraniowy w kwaśnym okapie, wyczyść i wytraw wióry przez zanurzenie w kwasie piana na 10 minut.
Następnie opłucz wióry trzykrotnie w dejonizowanym H2O i przenieś do sterylnego naczynia hodowlanego w kapturze do hodowli tkanek z przepływem laminarnym. Aktywuj chipy do modelowania komórek, umieszczając dwa wióry na dołek w płytce z sześcioma dołkami. Następnie dodaj dwa mililitry płodowej surowicy bydlęcej, aby całkowicie zanurzyć wszystkie chipsy.
Inkubuj chipsy w surowicy przez trzy do 12 godzin w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Teraz wyjmij chipy z ich roztworu aktywacyjnego. Umyj raz przez 10 sekund w zrównoważonym roztworze soli Hanka.
Następnie umieść chipsy w studzience hodowlanej i umieść wybrany typ komórek jako zawiesinę w zwykłej pożywce wzrostowej. Optymalna gęstość posiewu komórek zależy zarówno od typu ogniwa, jak i wzoru geometrycznego paraliny C na chipie. Gęstość pięć razy 10 do czwartej komórki na mililitr jest rozsądnym punktem wyjścia.
Obrazowanie jest dostosowane do podstawowej motywacji do tworzenia wzorców komórkowych, ale zachowanie żywych komórek można łatwo ocenić za pomocą mikroskopu preparacyjnego i kamery cyfrowej z odpowiednią soczewką przekaźnikową. Oto obrazowanie żywych komórek HEC 2 93 hodowanych na dwutlenku krzemu paraliny C po trzech dniach. In vitro statki inkubowano przez trzy godziny w płodowej surowicy bydlęcej, a komórki posiewano w zawiesinie w stężeniu pięć razy 10 do czwartej komórki na mililitr.
Paralina C wspomaga adhezję komórek, podczas gdy goły dwutlenek krzemu odpycha komórki. Rysunek ten przedstawia obrazy immunofluorescencyjne pierwotnych ludzkich komórek macierzystych pochodzących z glejaka, hodowanych na różnych wzorach paraliny C na dwutlenku krzemu. Tutaj schemat ilustruje siatkowatą konstrukcję paraliny, mikrografię fluorescencyjną utrwalonych komórek barwionych na obecność kwaśnego białka fibrylarnego gleju oraz mikrofotografię świetlną żywych komórek na tym samym chipie.
Oto obraz fluorescencyjny ilustrujący komórki barwione GFAP na innym projekcie paraline oraz obraz odbicia węzła w projekcie paraline szprychowego. Rysunek ten pokazuje obrazowanie żywych komórek trzech komórek T trzy L one hodowanych na dwutlenku krzemu paralinii C. Po czterech dniach in vitro chipy były aktywowane przez trzy godziny w płodowej surowicy bydlęcej, a komórki zostały posiane w zawiesinie w stężeniu pięć razy 10 czwartych komórek na mililitr.
W tym przypadku platforma nie umożliwia tworzenia wzorców, w których komórki stają się jednakowo zlewające się z regionami Lene C i dwutlenku krzemu. Podczas wykonywania tego protokołu należy pamiętać, że aktywacja surowicy musi nastąpić natychmiast po leczeniu piranią. Niezastosowanie się do tego skutkuje podważeniem procesu tworzenia wzorców.
Nie zapominaj, że praca z kwasem pirania może być bardzo niebezpieczna. Przygotuj i użyj kwasu piraniowego w chemicznym okapie i upewnij się, że nosisz odpowiednie okulary, fartuchy laboratoryjne i rękawice.
Przegląd
Niniejszy protokół szczegółowo opisuje metodę wzorowania komórek na dwutlenku krzemu (SiO2) z wykorzystaniem parylenu-C. Komórki przylegają do obszarów pokrytych parylenem-C, podczas gdy SiO2 działa odpychająco, co umożliwia kontrolowane tworzenie wzorów wzrostu.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Wzorowanie komórek
- Mikrofabrykacja
- Zastosowania w neuronauce
Wprowadzenie
- Wzorowanie komórek jest kluczowe dla badania zachowań komórkowych.
- Parylene-C służy jako podłoże do adhezji komórek.
- Dwutlenek krzemu jest wykorzystywany ze względu na jego właściwości odpychające komórki.
- Metoda ta pozwala uniknąć zanieczyszczeń czynnikami biologicznymi w pomieszczeniach typu clean room.
Cel badania
- Opracowanie wiarygodnej metody wzorowania komórek na SiO2.
- Pogłębienie zrozumienia zachowania komórek w środowiskach wzorowanych.
- Dostarczenie protokołu minimalizującego ryzyko kontaminacji.
Zastosowane Metody
- Przygotowanie maski fotograficznej dla pożądanego wzoru z parylenu-C.
- Utlenianie i powlekanie wafli krzemowych parylenem-C.
- Trawienie fotolitograficzne w celu odsłonięcia wzoru.
- Aktywacja chipów przy użyciu kwasu piranha oraz płodowego surowicy cielęcej.
Główne wyniki
- Komórki zostały pomyślnie ukształtowane zgodnie z projektem z parylenu-C.
- Obrazowanie żywych komórek wykazało zachowanie komórek na wzorowanych powierzchniach.
- Immunofluorescencja potwierdziła wzorce adhezji i wzrostu komórek.
- Metoda ta umożliwia nieograniczone przechowywanie chipów z wzorami przed ich aktywacją.
Wnioski
- Technika ta oferuje solidne podejście do wzorowania komórek.
- Upraszcza ona ten proces poprzez wyeliminowanie konieczności stosowania czynników biologicznych w pomieszczeniach typu clean room.
- Przyszłe zastosowania mogą obejmować różne typy komórek i wzory do celów badawczych.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Ta kompatybilna z mikrofabrykacją metoda wzorowania komórek umożliwia precyzyjną przestrzenną kontrolę adhezji komórek na podłożach krzemowych, wspierając rozwój powtarzalnych modeli in vitro dla neuronauki i badań nad chorobami. Dzięki integracji ze standardowymi procesami półprzewodnikowymi ułatwia ona tworzenie skalowalnych platform kompatybilnych z matrycami wieloelektrodowymi oraz systemami lab-on-a-chip. Podejście to zmniejsza ryzyko kontaminacji w środowiskach cleanroom i pozwala na nieograniczone przechowywanie wzorowanych chipów przed aktywacją, co zwiększa elastyczność przepływu pracy w badaniach odkrywczych.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia weryfikację hipotez terapeutycznych poprzez precyzyjną organizację przestrzenną sieci neuronalnych lub glejowych w celu badania interakcji specyficznych dla danych szlaków.
- Wartość operacyjna: Wspiera walidację funkcjonalną celów poprzez izolację odpowiedzi komórkowych w określonych mikrośrodowiskach, co redukuje liczbę zmiennych zakłócających w screeningu fenotypowym.
- Wartość prognostyczna: Zwiększa pewność danych dotyczących zaangażowania celu poprzez umożliwienie kontrolowanych testów ko-kultury lub testów granic odpychających, które naśladują architekturę tkanki.
Przesiewanie i opracowywanie testów
- Gotowość analizy: Pozwala na wytwarzanie standaryzowanych, kompatybilnych z mikrowytwarzaniem podłoży, odpowiednich do obrazowania wysokotreściowego oraz odczytów elektrofizjologicznych w przepływach pracy zintegrowanych z MEA.
- Powtarzalność: Zapewnia wierność wzoru na poziomie mikronów dzięki fotolitografii, co gwarantuje spójne rozmieszczenie komórek w powtórzeniach, umożliwiając niezawodny screening związków.
- Skalowalność: Umożliwia seryjną produkcję i nieograniczone przechowywanie chipów, co pozwala na wdrażanie analiz na żądanie bez konieczności powtarzania procesów w pomieszczeniu czystym.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Modelowanie chorób: Wspiera badanie fizjologii komórkowej w systemach istotnych neurologicznie, w tym w pierwotnych ludzkich komórkach macierzystych pochodzących z glejaka oraz w neuronach hipokampa myszy.
- Ciągłość translacyjna: Umożliwia przejście z fazy odkrywania w badaniach przesiewowych fenotypowych do walidacji przedklinicznej przy użyciu spójnych platform substratowych.
- Minimalizacja ryzyka mechanistycznego: Wyjaśnia rolę specyficznych dla komórek cząsteczek adhezyjnych w wynikach wzorowania, co pozwala na wybór celów terapeutycznych w oparciu o istotność biologiczną.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda ta wpisuje się w kontinuum procesu odkrywania, od wczesnej walidacji celu, poprzez opracowywanie testów, aż po modelowanie przedkliniczne, szczególnie w odniesieniu do celów neuroterapeutycznych i onkologicznych, w których przestrzenna organizacja komórek determinuje ich funkcję.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez poprzez umożliwienie kontrolowanych współkultur lub projektowanie granic odpychających, co pozwala na wyjaśnienie komunikacji komórkowej i modulacji szlaków.
- Przesiewanie: Dostarcza podłoży gotowych do analizy z wynikami ilościowymi uzyskanymi za pomocą obrazowania żywych komórek lub immunofluorescencji, co ułatwia porównywanie efektów związków w zróżnicowanych warunkach wzorców.
- Analityka: Generuje odczyty o rozdzielczości przestrzennej (np. barwienie GFAP, wskaźniki konfluencji), które umożliwiają statystyczne porównanie zachowania komórek w zdefiniowanych mikrośrodowiskach.
- Badania translacyjne: Łączy się z pracami przedklinicznymi poprzez wykorzystanie typów komórek istotnych dla danej choroby (np. ludzkich komórek macierzystych glejaka) oraz wzorców naśladujących architekturę tkanki.
- Zastosowania w skali przedsiębiorstwa: Stanowi wielokrotnie wykorzystywalną możliwość mikrowytwarzania, a nie jednorazowy protokół, i jest kompatybilna ze standardowym przetwarzaniem wafli oraz infrastrukturą cleanroom.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną poprzez redukcję niejednoznaczności mechanistycznej w odpowiedziach komórkowych dzięki zastosowaniu systemów hodowli o zdefiniowanej przestrzennie strukturze.
- Wartość operacyjna: Poprawia standaryzację i powtarzalność dzięki precyzji fotolitograficznej oraz aktywacji opartej na surowicy, niezależnej od wprowadzania materiału biologicznego do pomieszczeń czystych.
- Wartość strategiczna: Usprawnia podejmowanie decyzji go/no-go, umożliwiając wczesną redukcję ryzyka dla celów terapeutycznych w oparciu o ich zachowanie w fizjologicznie istotnych kontekstach przestrzennych.
- Wpływ na portfolio: Wspiera optymalizację postępów prac z uwzględnieniem ryzyka, dostarczając danych z modeli lepiej odzwierciedlających organizację na poziomie tkankowym oraz heterogeniczność komórkową.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymaga wiedzy specjalistycznej w zakresie mikrowytwarzania, fotolitografii oraz systemów osadzania w próżni w celu powlekania i wzorowania parylenem-C.
- Zależne od dostępu do pomieszczeń czystych (cleanroom), maskowników, trawaczy plazmowych tlenowych oraz reflektometrów spektroskopowych do kontroli procesu.
- Wymaga standaryzowanych protokołów aktywacji (roztwór piranha, a następnie inkubacja w surowicy), aby zapewnić spójne wyniki wzorowania w różnych partiach.
- Wymaga dostosowania gęstości wysiewu komórek i czasu inkubacji w zależności od właściwości adhezyjnych specyficznych dla typu komórek oraz geometrii wzoru.
- Ograniczona uniwersalność w odniesieniu do różnych typów komórek ze względu na zależność od endogennych cząsteczek adhezyjnych, co wymaga walidacji empirycznej dla nowych modeli.
