Tworzenie dwuwymiarowych wzorzystych substratów do uwięzienia białek i komórek

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest opracowanie dwuwymiarowego podłoża o wzorze do kontroli wchłaniania białek i wzrostu komórek. Osiąga się to dzięki wykorzystaniu fotolitografii do wytworzenia wzorzystego wzorca, który jest używany do produkcji stempla A-P-D-M-S do druku mikrokontaktowego. W drugim kroku przygotowywane jest wzorzyste złote podłoże, które obejmuje druk mikrokontaktowy w celu uzyskania wzoru z regionami, które wchłaniają i są odporne na białko

Następnie białko i komórki są dodawane do podłoża w celu wizualizacji wzoru i badania. Uzyskuje się wyniki wzrostu i zachowania komórek, które wykazują dobre uwięzienie białek i komórek na tych substratach wzorcowych w oparciu o fluorescencję i mikroskopię kontrastu twarzy. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z innymi istniejącymi metodami, takimi jak drukowanie białek za pomocą MicroCon, jest to, że monowarstwa zakończona glikolem jest odporna na niespecyficzną absorpcję białek i komórek w tle wzoru.

Ogólnie rzecz biorąc, osoby, które są nowe w tej metodzie, będą miały trudności, ponieważ właściwa technika stemplowania musi być zoptymalizowana dla każdego wydrukowanego wzoru. Aby rozpocząć przygotowanie wzorzystego centrum głównego, płytkę krzemową na koderze wirowym, a podczas początkowego etapu dwucyklowego programu wirowania, przepłucz wafel acetonem. Podczas drugiego kroku programu wirowania aceton odparuje, pozostawiając czystą, suchą płytkę na początku wirowania, nałóż fotorezystor na płytkę, a następnie odwiruj powłokę w warunkach opisanych wcześniej.

Miękkie pieczenie wafla pokrytego fotoodpornością w temperaturze 110 stopni Celsjusza przez dwie minuty na płycie grzejnej o wysokiej jednorodności. Następny wzór fotograficzny. Wafel powlekany fotorezystancem za pomocą systemu wyrównywania maski i odpowiedniej maski.

Najpierw umieść podłoże na wózku próżniowym nakładki do maski. Następnie włóż maskę do tacki uchwytu i włącz odkurzacz, aby utrzymać maskę na miejscu, aby potwierdzić dobry kontakt maski z podłożem. Podnieś podłoże, aż zetknie się z maską.

Użyj optyki nakładki, aby potwierdzić, że nawiązano dobry kontakt. Na koniec włącz lampę, aby naświetlić podłoże światłem UV przez maskę litograficzną. Rozwijaj wzorzystą płytkę w wywoływaczu przez minutę 45 sekund z delikatnym mieszaniem.

Dokładnie spłucz półprzewodnikową, dejonizowaną wodą i osusz strumieniem azotu gazowego, sprawdzając rozwój wzoru za pomocą mikroskopu z filtrem UV. Rozpocznij tę procedurę od przygotowania utwardzacza żywicznego w proporcji 10 do 1. Mieszanina cygara 180 2 całkowicie.

Przykryj wzorzysty wafel fotograficzny mieszaniną na jednorazowej szalce Petriego w próżniowym osuszaczu Degas, mistrz PDMS pokryty tak, aż nie będą widoczne żadne bąbelki. Po upewnieniu się, że mistrz znajduje się na dnie naczynia, pozwól stemplowi utwardzić się w piekarniku w temperaturze 65 stopni Celsjusza przez 1,5 godziny. Po utwardzeniu stempla PDMS wytnij stempel z wzorca i przytnij go do odpowiedniego rozmiaru.

Przechowuj stempel w zakrytym pojemniku stroną do góry, aby chronić go przed kurzem i zanieczyszczeniami. Aby przygotować podłoża do osadzania metalu, najpierw należy potraktować okrągłe szkiełka nakrywkowe plazmą tlenową przez 10 minut. Następnie dwukrotnie przepłukać szkiełka nakrywkowe wodą dejonizowaną, susząc strumieniem gazowego azotu pomiędzy płukaniami, po spłukaniu wodą, dwukrotnie spłukać etanolem, ponownie susząc strumieniem azotu gazowego między płukaniami.

Korzystając z systemu osadzania wiązką elektronów z wieloma kieszeniami, zdeponuj tytan o wartości 50 angstremów, a następnie złoto o wartości 150 angstremów. Nie należy umieszczać parownika między osadzaniem warstwy tytanu a warstwą złota. Wypłucz stempel PDMS etanolem i dokładnie wysusz.

Za pomocą gazowego azotu nałóż kroplami roztwór do tłoczenia na stempel, aż do całkowitego pokrycia. Dokładnie osusz stempel gazowym azotem. Druk mikrokontaktowy pliku HEXA Decane zależy od cech stempla PDMS i jest jednym z najtrudniejszych aspektów tej procedury.

Udane tłoczenie wymaga opracowania dobrej techniki, która wywiera równomierny nacisk. Podczas tłoczenia. W przypadku konwencjonalnego druku mikrokontaktowego w powietrzu, delikatnie dociśnij stempel do złotego podłoża i pozwól monowarstwie uformować się przez 15 sekund.

Alternatywnie, w przypadku wzorów składających się z bardzo małych cech i wysokich proporcji, umieść złoty substrat na szalce Petriego zawierającej 18,2 mega om wody dejonizowanej, upewniając się, że podłoże jest zanurzone. Następnie delikatnie dociśnij stempel do złotego podłoża i pozwól warstwie mono przez 15 sekund się uformować. Następnie dwukrotnie spłukać stemplowane podłoże etanolem, susząc gazowym azotem.

Po każdym płukaniu umieścić podłoże na szalce Petriego i pokryć podłoże roztworem do wypełniania. Uszczelnij naczynie za pomocą param, aby zapobiec parowaniu. Pozwól monowarstwie tła uformować się w ciemności przez 12 do 14 godzin.

Na koniec usuń wzorzyste szkiełko nakrywkowe z roztworu do napełniania wstecznego i po każdym płukaniu dwukrotnie spłucz etanolem suszącym z gazowym azotem. Aby nałożyć białko na wzorzyste szkiełko nakrywkowe, umieść szkiełko nakrywkowe na małej szalce Petriego lub w komorze do hodowli komórkowych Przykryj 500 mikrolitrami na jeden mililitr buforowanej soli fizjologicznej delcos fosforan. DPBS musi całkowicie pokryć substrat podczas inkubacji białek.

Aby zapewnić równomierne pokrycie białkiem, dodaj skoncentrowany roztwór białka do DPBS i wymieszaj roztwór, pipetując kilka razy. Inkubować mieszaninę białek z substratem w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez godzinę. Po inkubacji dokładnie przepłukać podłoże DPBS w celu usunięcia niezwiązanego białka, uważając, aby nie wysuszyć substratu ani nie przepuścić go przez granicę powietrzno-wodną.

Po trzech płukaniach odessać DPBS. Następnie dodaj około 500 mikrolitrów kompletnej pożywki do wzrostu komórek, aby utrzymać mokre podłoże. Wymień podłoże wzrostowe używane do płukania podłoża.

Dzięki świeżej pożywce podłoże jest teraz gotowe do powlekania komórkami. Zazwyczaj na podłożu nakłada się od 30 do 200 komórek na milimetr kwadratowy. Ten obraz przedstawia stempel A-P-D-M-S uwidoczniony pod mikroskopem poprzez umieszczenie stempla stroną do dołu na szklanym szkiełku nakrywkowym, pasek skali ma 100 mikrometrów.

Prawidłowe tłoczenie skutkuje ostrym, wyraźnym wzorem białka, który można uwidocznić poprzez zastosowanie białka znakowanego fluorescencyjnie, takiego jak fibronektyna znakowana LOR 6 47. Ograniczenie komórek chk one do wzorca białkowego pokazano tutaj. Na tych obrazach paski skali mają wielkość 100 mikrometrów.

Alternatywnie, immunohistochemia może być wykorzystana do wizualizacji wzorca białka po utrwaleniu SU. W tym przypadku LOR trzy 50 sprzężone przeciwciało anty laminowane służy do wizualizacji wzorzystego laminatu wysianego mysimi neuronami hipokampa E 18 pokazanymi po czterech dniach in vitro E 18 mysich neuronów hipokampa wybarwionych monitorem MIT red five 80 pokazują, że wzrost komórek jest dobrze ograniczony do wzorca białkowego. Chociaż technika ta jest łatwa do opanowania, może pojawić się kilka typowych problemów, co ilustrują te preparaty substratów wzorcowych, które są wizualizowane przez sprzężoną absorpcję fibronektyny LOR 6 47.

Stosowanie białka bez wystarczającego wymieszania stężonego roztworu białkowego w DPBS może prowadzić do nierównych wzorów białek. Niewłaściwe tłoczenie może prowadzić do częściowego przeniesienia wzoru lub zapadnięcia się stempla. Ponadto wystawienie podłoża wzoru zawierającego wchłonięte białko na działanie powietrza może zakłócić działanie monowarstwy, powodując zmniejszenie oporu.

W tle, zanurzone wzory mogą tworzyć wzory o małych cechach, które są trudne do wydrukowania za pomocą konwencjonalnego druku mikrokontaktowego i powietrza. Te dwa obrazy pokazują różne obszary tego samego wzoru wydrukowane tym samym stemplem PDMS w powietrzu lub linie nośne wody dejonizowanej są pokazane na obrazie po lewej stronie, aby pokazać, że tylko małe cechy wzoru nie zostały pomyślnie wydrukowane. Podziałka ma 20 mikrometrów Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w ciągu 18 do 24 godzin, jeśli zostanie wykonana prawidłowo.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak wytworzyć podłoże do wzoru. Wyprodukuj pieczęć A-P-D-M-S. Wykorzystaj druk mikrokontaktowy, aby przygotować złote podłoże wzoru i zwizualizować ten wzór za pomocą białka i komórek.