Name: Tworzenie dwuwymiarowych wzorzystych substratów do uwięzienia białek i komórek (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-09-06T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 36 s
Description: Poznaj technikę mikrokontaktowego drukowania do tworzenia wzorzystych substratów złotych kontrolujących absorpcję białek i wzrost komórek. Ta metoda umożliwia badanie zachowań komórkowych w neurobiologii i inżynierii tkankowej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Pragniemy podziękować całej grupie badawczej Maurer z Washington University, której wspólna wiedza umożliwiła opracowanie tego protokołu. Finansowanie niniejszej pracy zapewnił National Institute of Mental Health (1R01MH085495).

1. Przygotowanie wzorowanego mastera (Rysunek 1)
<ol>
<li>Umieść podłoże krzemowe w centrum powlekarki rotacyjnej i wypłucz je acetonem podczas pierwszego etapu dwucyklowego programu wirowania zgodnie z Tabelą 1. Aceton wyparuje podczas drugiego etapu programu wirowania, pozostawiając czyste i suche podłoże.</li>
<li>Nanieś około 1 mL fotorezystu AZ9245 na podłoże i rozprowadź go metodą spin-coatingu, stosując warunki opisane w Tabeli 1.</li>
<li>Przeprowadź wstępne wygrzewanie (soft-bake) podłoża pokrytego fotorezystem w temperaturze 110°C przez 2 m, używając płyty grzejnej o wysokiej jednorodności temperatury.</li>
<li>Wykonaj naświetlanie wzoru na podłożu, korzystając z systemu bezpośredniej litografii lub maskownicy z odpowiednią maską. Maski można nabyć z wielu źródeł komercyjnych. Dodatkowo, do tworzenia wzorów o dużych elementach można wykorzystać folie przeźroczyste wydrukowane tuszem absorbującym UV, przyklejone do płaskiego szkła optycznego.</li>
<li>Wywoływaj wzór na podłożu w roztworze wywoływacza 400K i wody dejonizowanej klasy półprzewodnikowej w stosunku 1:2 przez 1 m 45 s przy delikatnym mieszaniu. Dokładnie wypłucz wodą dejonizowaną klasy półprzewodnikowej i osusz strumieniem gazowego azotu (N2). Poprawność wywołania wzoru można sprawdzić pod mikroskopem z filtrem UV. Jeśli wzór nie został w pełni wywołany, podłoże można ponownie umieścić w roztworze wywołującym na dodatkowy czas.</li>
</ol>
Uwaga: Aby uzyskać najlepsze wyniki, fotolitografię należy przeprowadzać w warunkach pomieszczenia czystego.
2. Przygotowanie stempla z PDMS (Rysunek 2)
<ol>
<li>Przygotować mieszaninę żywicy i utwardzacza Sylgard 182 (PDMS) w stosunku wagowym 10:1 i całkowicie pokryć nią matrycę (wafle z fotolitograficznym wzorem) w jednorazowej szalce Petriego.</li>
<li>Odgazować matrycę pokrytą PDMS w eksyكاتهrze próżniowym do momentu, aż pęcherzyki powietrza przestaną być widoczne, a następnie utwardzić stempel w piecu w temperaturze 65°C przez 1,5 h. Przed utwardzaniem należy upewnić się, że matryca znajduje się na dnie szalki, ponieważ podczas etapu odgazowywania może ona wypłynąć na powierzchnię.</li>
<li>Wyciąć stempel z PDMS z matrycy i przyciąć go do odpowiedniego rozmiaru. Przechowywać stempel w zamkniętym pojemniku (stroną z wzorem do góry), aby chronić go przed kurzem i zanieczyszczeniami.</li>
</ol>
3. Przygotowanie wzorowanego podłoża złota (Rysunek 3)
<ol>
<li>Przygotować okrągłe szklane laminki nr 1 o średnicy 25 mm do osadzania metalu, poddając je działaniu plazmy tlenowej przez 10 m. Płukać dwukrotnie wodą dejonizowaną o rezystywności 18,2 MΩ, a następnie dwukrotnie etanolem, osuszając strumieniem gazu N2 pomiędzy każdym etapem.</li>
<li>Za pomocą wielokomorowego systemu naparowania wiązką elektronową osadzić 50 Å tytanu, a następnie 150 Å złota. Nie wypuszczać powietrza do parownika pomiędzy osadzaniem warstwy tytanu a warstwy złota. Alternatywnie można zakupić laminki pokryte złotem od różnych dostawców, jednak istotne jest, aby warstwy metalu zostały przygotowane metodą naparowania wiązką elektronową, a nie naparowaniem termicznym. W przypadku zakupu z zewnętrznego źródła, podłoża złote można oczyścić przed użyciem poprzez utlenianie plazmowe lub za pomocą roztworu „piranha” (7:3 stężony H2SO4:30% H2O2)11.</li>
</ol>
Uwaga: roztwór „Piranha” jest wybuchowy w obecności związków organicznych.
<ol start="3">
<li>Przygotować roztwór do stemplowania (10 mM heksadekanotiolu w etanolu absolutnym) oraz roztwór do wypełniania tła (1 mM tiolu zakończonego grupą glikolu w etanolu absolutnym).</li>
<li>Opłukać stempel etanolem i dokładnie wysuszyć gazem N2. Nanosić roztwór do stemplowania na stempel PDMS kroplami, aż zostanie on całkowicie pokryty. Dokładnie wysuszyć stempel gazem N2. Przejść do punktu 5a lub 5b, w zależności od cech stempla PDMS.</li>
<li>
<ol class="lalpha">
<li>Delikatnie docisnąć stempel do złotej podłoża i pozostawić na 15 s w celu utworzenia monowarstwy.</li>
<li>Umieścić złote podłoże w czałce Petri zawierającej wodę dejonizowaną o rezystywności 18,2 MΩ, dbając o to, aby podłoże było zanurzone. Delikatnie docisnąć stempel do złotej powierzchni i pozostawić na 15 s w celu utworzenia monowarstwy.</li>
</ol></li>
<li>Opłukać ostemplowane podłoże dwukrotnie etanolem, susząc gazem N2 po każdym płukaniu, a następnie umieścić podłoże w czałce Petri.</li>
<li>Przykryć podłoże roztworem do wypełniania tła i szczelnie zamknąć czałkę parafilmem, aby zapobiec odparowaniu.</li>
<li>Pozostawić w ciemności na 12-14 h w celu utworzenia monowarstwy w tle.</li>
<li>Wyjąć wzorowane szkiełko nakrywowe z roztworu do wypełniania tła i opłukać dwukrotnie etanolem, susząc gazem N2 po każdym płukaniu.</li>
</ol>
4. Nakładanie białek i komórek na wzorowane podłoże
<ol>
<li>Umieść wzorcowane szkiełko zakrywe w małej szalce Petriego lub komorze do hodowli komórek i przykryj 500 μL do 1 mL fosforanu soli buforowej Dulbecco (DPBS). DPBS musi całkowicie pokrywać podłoże podczas inkubacji białka, aby zapewnić jego równomierną warstwę.</li>
<li>Dodaj stężony roztwór białka do DPBS i wymieszaj go, pipetując kilka razy. Inkubuj mieszaninę białka z podłożem w temperaturze 37°C przez 1 h. Końcowe stężenia lamininy i fibronektyny wynoszą zazwyczaj odpowiednio 12 μg/mL i 20 μg/mL. Białko można znakować fluorescencyjnym barwnikiem reaktywnym wobec grup aminowych, aby umożliwić łatwą wizualizację wzoru. Jednak znakowane białko należy mieszać w stosunku 1:1 z białkiem nieznakowanym, ponieważ znakowanie może wpływać na aktywność biologiczną.</li>
<li>Po inkubacji dokładnie wypłucz podłoże DPBS (4-5x), aby usunąć niezwiązane białko, dbając o to, by nie doprowadzić do wyschnięcia podłoża ani do jego kontaktu z granicą faz powietrze-woda. Po pierwszych trzech płukaniach dodaj około 500 μL pełnej pożywki do wzrostu komórek, aby utrzymać podłoże w stanie wilgotnym.</li>
<li>Zastąp pożywkę używaną do płukania podłoża świeżą pożywką.</li>
<li>Dysocjuj i policz komórki do wysiania na podłoże. Można wykorzystać dysocjowane komórki pierwotne, takie jak neurony hipokampa, lub unieśmiertelnione linie komórkowe, np. komórki CHO-K1.</li>
<li>Wysiej dysocjowane komórki na podłoże. Zazwyczaj stosuje się od 30 do 200 komórek/mm2.</li>
</ol>
5. Reprezentatywne wyniki:
<img src="/files/ftp_upload/3164/3164fig1.jpg" alt="Schemat procesu fotolitografii płytki krzemowej; szczegółowe kroki nakładania fotorezystu, naświetlania i wywoływania." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 1"> Rysunek 1.Ogólny schemat fotolitograficznego przygotowania wzorowanej matrycy. W tym procesie płytka krzemowa jest czyszczona acetonem, powlekana fotorezystem, naświetlana w celu uzyskania pożądanego wzoru, a następnie wzór jest wywoływany.
<img src="/files/ftp_upload/3164/3164fig2.jpg" alt="Proces mikrowytwarzania: miękka litografia z użyciem PDMS, schemat przedstawiający etapy formowania i utwardzania PDMS." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 2"> Rysunek 2. Ogólny schemat przygotowania stempla z PDMS. W tym procesie wzorzec struktury zostaje pokryty preparatem Sylgard (żywica:utwardzacz w stosunku 10:1), odgazowany w eksykatorze próżniowym, utwardzony w piecu w temperaturze 60°C i docięty do odpowiedniego rozmiaru.
<img src="/files/ftp_upload/3164/3164fig3.jpg" alt="Proces mikrowzorowania z użyciem stemplowania PDMS; schemat adsorpcji białka dla zastosowań w biosensorach." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 3"> Rycina 3. Ogólny schemat wzorowania podłoża. W tym procesie podłoża szklane są powlekane tytanem (50Å) i złotem (150Å) przy użyciu odparowacza wiązką elektronową, wzorowane metodą mikrokrzykowania heksadekanotiolu za pomocą stempla PDMS, wypełniane w pozostałych miejscach tiolami alkanowymi z grupą glikolu, a następnie powlekane białkiem znakowanym fluorescencyjnie.
<img src="/files/ftp_upload/3164/3164fig4.jpg" alt="Równowaga statyczna; kształty; schemat; edukacyjny; koncepcja fizyczna; powiązana analiza; zrównoważone siły." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 4"> Rysunek 4. Wzorzec strukturalny (A) oraz stempel PDMS (B) przygotowane zgodnie z opisanymi metodami. Paski skali wynoszą 100μm.
<img src="/files/ftp_upload/3164/3164fig5.jpg" alt="Kształty geometryczne na biochipie; mikroskopia fluorescencyjna, analiza wzorców, oddziaływania komórkowe." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 5"> Rycina 5. Wzorzyste SAM-y zwizualizowane za pomocą fibonektyny znakowanej AlexaFluor 647 (A) oraz ograniczenie przestrzenne komórek CHO-K1 (B). Paski skali odpowiadają 100 μm.
<img src="/files/ftp_upload/3164/3164fig6.jpg" alt="Mikroskopia fluorescencyjna: analiza wyrównania DNA, kanały niebieski/czerwony, eksperyment mikroskopowy." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 6"> Rycina 6. Wzorcowana laminina z wysianymi neuronami hipokampa myszy E18 po 4 dniach in vitro. Do wizualizacji wzoru użyto przeciwciała antylamininowego sprzężonego z AlexaFluor 350 (A), a neurony hipokampa myszy E18 zabarwiono MitoTracker Red 580 (B). Paski skali oznaczają 100 μm.
<img src="/files/ftp_upload/3164/3164fig7.jpg" alt="Obraz mikroskopowy przedstawiający wzory czerwonej fluorescencji, porównujący różne powierzchnie materiałów do analizy." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 7"> Rysunek 7. Potencjalne problemy podczas przygotowywania wzorowanego podłoża, zwizualizowane poprzez adsorpcję fibronektyny sprzężonej z AlexaFluor 647. (A) Niewystarczające mieszanie prowadzi do nierównomiernej adsorpcji białka. (B) Nierównomierne przyłożenie nacisku podczas stemplowania prowadzi do częściowego przeniesienia wzoru. (C) Nadmierny nacisk podczas stemplowania może prowadzić do zapadnięcia się stempla. (D) Wystawienie wzorowanej powierzchni na granicę faz powietrze-woda podczas płukania może skutkować tła adsorpcją białka. Paski skali wynoszą 100 μm.
<img src="/files/ftp_upload/3164/3164fig8.jpg" alt="Obrazy mikroskopowe przedstawiające wzory wzbudzenia optycznego w badaniu fotonicznym, widoczny wzór siatki." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 8"> Rycina 8. Wzorowanie w zanurzeniu pozwala na tworzenie wzorów z małymi elementami, które są trudne do naniesienia metodą konwencjonalnego mikrostemplowania w powietrzu. Obrazy (A) i (B) przedstawiają różne obszary tego samego wzoru, naniesionego za pomocą tego samego stempla z PDMS w powietrzu (A) lub w wodzie dejonizowanej (B). Na obrazie (A) widoczne są linie wspierające o szerokości 10 μm otaczające wzór (dodane w celu zapobiegania zapadaniu się stempla), jednak mniejsze elementy w formie kropek, widoczne na obrazie (B), nie są obecne. Dowodzi to, że stemplowanie w powietrzu sprawdza się w przypadku większych elementów, natomiast w przypadku wzorów z mniejszymi elementami konieczne może być stemplowanie w wodzie. Paski skali wynoszą 20 μm.
<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Cykl</td>
 <td>Szybkość przyspieszania (rpm/s)</td>
 <td>Prędkość końcowa (rpm)</td>
 <td>Czas (s)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>1</td>
 <td>500</td>
 <td>1000</td>
 <td>5</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>2</td>
 <td>3800</td>
 <td>3800</td>
 <td>30</td>
 </tr>
 </tbody>
</table>
Tabela 1. Dwucyklowy program wirowania użyty do stworzenia powłoki z AZ9245 o grubości 4.5 μm na waflu krzemowym.
Aby przygotować stempla PDMS do tworzenia strukturalnych podłoży, w pierwszej kolejności wykonuje się matrycę z fotorezystu (ryciny 1 i 4A). Matryca jest odwrotnością stempla i jest tworzona przy użyciu systemu litografii bezpośredniej lub urządzenia do wyrównywania masek (mask aligner). W przypadku zastosowania fotorezystu pozytywowego, takiego jak AZ9245, do produkcji matrycy, pokryty rezystem wafelek jest naświetlany wzorem, który ma pojawić się na końcowym podłożu. Choć nie zawsze jest to możliwe, zgłaszano, że idealny stosunek kształtu (rozmiar elementu do grubości rezystu) dla matryc stempli PDMS wynosi 1:2.13 Ustaliliśmy, że w zależności od charakteru wzoru możliwe są stosunki kształtu rzędu 1:40. Wafelki krzemowe pokryte AZ9245 w warunkach opisanych w niniejszym protokole dają fotorezyst o nominalnej grubości 4,5 μm. Stwierdziliśmy, że taka grubość AZ9245 może być wykorzystana do produkcji matryc PDMS z elementami o rozmiarach od &gt;100 μm do 2 μm.
Stemple z PDMS są odlewane z Sylgard 182 (lub Sylgard 184) przy użyciu matrycy wykonanej z fotorezystu (Rysunek 2). Matryce z fotorezystu mogą być używane wielokrotnie do tworzenia wielu kopii tego samego stempla. Po utwardzeniu PDMS stemple są oddzielane od matrycy za pomocą żyletki, a otrzymany stempel można obejrzeć pod mikroskopem, kładąc go stroną z wytłoczeniami na szkiełku nakrywkowym (Rysunek 4B)
Prawidłowe stemplowanie pozwala uzyskać ostry i wyraźny wzór białkowy, który można zwizualizować poprzez zastosowanie białka znakowanego fluorescencyjnie (Rysunki 3 i 5). Alternatywnie, do wizualizacji wzoru białkowego po utrwaleniu komórek można zastosować immunohistochemię (Rysunek 6). Wzrost komórek jest dobrze ograniczony do obszaru wzoru białkowego zarówno w przypadku unieśmiertelnionych linii komórkowych, jak i komórek pierwotnych (Rysunki 5 i 6).
Choć technika ta jest łatwa do opanowania, mogą wystąpić kilka powszechnych problemów. Aplikacja białka bez odpowiedniego wymieszania stężonego roztworu białka w DPBS może prowadzić do powstania nierównomiernych wzorów białkowych (Rysunek 7A). Nieprawidłowe stemplowanie może skutkować częściowym przeniesieniem wzoru lub zapadnięciem się stempla (Rysunek 7B-C). Ponadto wystawienie podłoża z naniesionym wzorem zawierającym zaadsorbowane białko na działanie powietrza może zakłócić monowarstwę, co powoduje spadek rezystancji tła (Rysunek 7D). Wzory składające się z bardzo małych elementów (&lt; 5 μm) i wysokich współczynników kształtu często wymagają zastosowania zanurzonego mikrokontaktowego drukowania. W tej procedurze (3.5b) woda służy jako bariera zapobiegająca osadzaniu się heksadekanotiolu na podłożu poza obszarem wzoru (Rysunek 8).14

<ol><li>Wilbur, J., Kumar, A., Biebuyck, H., Kim, E., Whitesides, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microcontact+printing+of+self-assembled+monolayers%3A+Applications+in+microfabrication%5BTitle%5D)+AND+%22Nanotechnology%22%5BJournal%5D)">Microcontact printing of self-assembled monolayers: Applications in microfabrication.</a> Nanotechnology. 7, 452-457 (1996).</li>
<li>Chang, J., Brewer, G., Wheeler, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+modified+microstamping+technique+enhances+polylysine+transfer+and+neuronal+cell+patterning%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">A modified microstamping technique enhances polylysine transfer and neuronal cell patterning.</a> Biomaterials. 24, 2863-2870 (2003).</li>
<li>Lange, S., Benes, V., Kern, D., Horber, J., Bernard, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microcontact+printing+of+DNA+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Microcontact printing of DNA molecules.</a> Analytical Chemistry. , 1641-1647 (2004).</li>
<li>Xia, Y., Mrksich, M., Kim, E., Whitesides, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microcontact+printing+of+octadecylsiloxane+on+the+surface+of+silicon+dioxide+and+its+application+in+microfabrication%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Microcontact printing of octadecylsiloxane on the surface of silicon dioxide and its application in microfabrication.</a> J. Am. Chem. Soc. , 9576-9577 (1995).</li>
<li>Mrksich, M., Dike, L., Tien, J., Ingber, D., Whitesides, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+microcontact+printing+to+pattern+the+attachment+of+mammalian+cells+to+self-assembled+monolayers+of+alkanethiolates+on+transparent+films+of+gold+and+silver%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Using microcontact printing to pattern the attachment of mammalian cells to self-assembled monolayers of alkanethiolates on transparent films of gold and silver.</a> Experimental Cell Research. , 305-313 (1997).</li>
<li>Prime, K. L., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adsorption+of+proteins+onto+surfaces+containing+end-attached+oligo%28ethylene+oxide%29+-+a+model+system+using+self-assembled+monolayers%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Adsorption of proteins onto surfaces containing end-attached oligo(ethylene oxide) - a model system using self-assembled monolayers.</a> J. Am. Chem. Soc. 115, 10714-10721 (1993).</li>
<li>Raghavan, S., Desai, R., Kwon, Y., Mrksich, M., Chen, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micropatterned+Dynamically+Adhesive+Substrates+for+Cell+Migration%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Micropatterned Dynamically Adhesive Substrates for Cell Migration.</a> Langmuir. , 17733-17738 (2010).</li>
<li>Rogers, J., Bao, Z., Baldwin, K., Dodabalapur, A., Crone, B., Raju, V. R., Kuck, V., Katz, H., Amundson, K., Ewing, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Paper-like+electronic+displays%3A+Large-area+rubber-stamped+plastic+sheets+of+electronics+and+microencapsulated+electrophoretic+inks%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Paper-like electronic displays: Large-area rubber-stamped plastic sheets of electronics and microencapsulated electrophoretic inks.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 98, 4835-4840 (2001).</li>
<li>Yanker, D., Maurer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+printing+of+trichlorosilanes+on+glass+for+selective+protein+adsorption+and+cell+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biosystems%22%5BJournal%5D)">Direct printing of trichlorosilanes on glass for selective protein adsorption and cell growth.</a> Molecular Biosystems. 4, 502-504 (2008).</li>
<li>Johnson, D., Maurer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recycling+and+reusing+patterned+self-assembled+monolayers+for+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Communications%22%5BJournal%5D)">Recycling and reusing patterned self-assembled monolayers for cell culture.</a> Chemical Communications. , 520-522 (2011).</li>
<li>Herne, T., Tarlov, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+DNA+probes+immobilized+on+gold+surfaces%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Characterization of DNA probes immobilized on gold surfaces.</a> J. Am. Chem. Soc. , 8916-8920 (1997).</li>
<li>Hanson, E., Schwartz, J., Nickel, B., Koch, N., Danisman, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bonding+self-assembled%2C+compact+organophosphonate+monolayers+to+the+native+oxide+surface+of+silicon%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Bonding self-assembled, compact organophosphonate monolayers to the native oxide surface of silicon.</a> J. Am. Chem. Soc. , 16074-16080 (2003).</li>
<li>Johannes, M., Cole, D., Clark, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atomic+force+microscope+based+nanofabrication+of+master+pattern+molds+for+use+in+soft+lithography%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+Physics+Letters%22%5BJournal%5D)">Atomic force microscope based nanofabrication of master pattern molds for use in soft lithography.</a> Applied Physics Letters. , (2007).</li>
<li>Bessueille, F., Pla-Roca, M., Mills, C. A., Martinez, E., Samitier, J., Errachid, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Submerged+microcontact+printing+%28S%CE%BCCP%29%3A+An+unconventional+printing+technique+of+thiols+using+high+aspect+ratio%2C+elastomeric+stamps%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Submerged microcontact printing (SμCP): An unconventional printing technique of thiols using high aspect ratio, elastomeric stamps.</a> Langmuir. , 12060-12063 (2005).</li>
<li>Xia, Y., Whitesides, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extending+microcontact+printing+as+a+microlithographic+technique%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Extending microcontact printing as a microlithographic technique.</a> Langmuir. , 2059-2067 (1997).</li>
<li>Biasco, A., Pisignano, D., Krebs, B., Pompa, P. P., Persano, L., Cingolani, R., Rinaldi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conformation+of+microcontact-printed+proteins+by+atomic+force+miroscopy+molecular+sizing%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Conformation of microcontact-printed proteins by atomic force miroscopy molecular sizing.</a> Langmuir. , 5154-5158 (2005).</li>
<li>Shen, K., Qi, J., Kam, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microcontact+printing+of+proteins+for+cell+biology%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Microcontact printing of proteins for cell biology.</a> J Vis Exp. (22), e1065-e1065 (2008).</li>
<li>Piner, R., Zhu, J., Xu, F., Hong, S., Mirkin, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%22Dip-pen%22+nanolithography%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">"Dip-pen" nanolithography.</a> Science. 283, 661-663 (1999).</li>
<li>Ryan, D., Parviz, B. A., Linder, V., Semetey, V., Sia, S. K., Su, J., Mrksich, M., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patterning+multiple+aligned+self-assembled+monolayers+using+light%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Patterning multiple aligned self-assembled monolayers using light.</a> Langmuir. , 9080-9088 (2004).</li>
</ol>

Nie zadeklarowano żadnych konfliktów interesów.

Podczas litograficznego wytwarzania matrycy wykorzystywanej do tworzenia stempli z PDMS może wystąpić szereg problemów. Niedoświetlenie wafla pokrytego rezystem prowadzi do powstania zamglonych i niewyraźnych wzorów, natomiast prześwietlenie wafla pokrytego rezystem skutkuje powiększeniem lub brakiem określonych elementów. Generalnie matryce z dużymi elementami (&gt;10 μm) są stosunkowo łatwe do uformowania i wywołania, podczas gdy matryce z mniejszymi elementami mogą wymagać rozległej optymalizacji parametrów naświetlan...

<table><tbody><tr><td>Wafle krzemowe</td><td>Wafer Reclaim Services</td><td></td><td>2 cale</td></tr><tr><td>Powlekarka rotacyjna/płyta grzewcza</td><td>Brewer Science, Inc.</td><td>Cee 200CB Spin-Bake System</td><td></td></tr><tr><td>Fotorezyst AZ9245</td><td>Mays Chemical Company</td><td>105880034-1160</td><td></td></tr><tr><td>System bezpośredniej litografii laserowej</td><td>Microtech s.r.l.</td><td>LW325 LaserWriter System</td><td></td></tr><tr><td>Mask Aligner (ustawiacz masek)</td><td>HTG</td><td>3HR</td><td></td></tr><tr><td>Wywoływacz AZ 400K</td><td>Mays Chemical Company</td><td>105880018-1160</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do elastomeru silikonowego Sylgard 182</td><td>Dow Corning</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Okrągłe szkiełka nakrywkowe nr 1, 25 mm</td><td>VWR international</td><td>16004-310</td><td></td></tr><tr><td>Utleniacz plazmowy</td><td>Diener</td><td>Femto</td><td></td></tr><tr><td>Kawałki tytanu</td><td>Kamis Incorporated</td><td></td><td>czystość 99.95%</td></tr><tr><td>Granulki złota</td><td>Kamis Incorporated</td><td></td><td>czystość 99.999%</td></tr><tr><td>Parownik wiązką elektronów</td><td>Kurt J. Lesker</td><td>PVD 75 Thin Film Deposition System</td><td>z akcesorium do wiązki elektronów</td></tr><tr><td>Heksadekanotiol</td><td>Alfa Aesar</td><td>A11362</td><td></td></tr><tr><td>1-merkapto-undec-11-yl)tetra(glikol etylenowy)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>674508</td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Pharmco-AAPER</td><td>111000200</td><td>200 proof, bezwodny</td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>VWR international</td><td>52858-000</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>VWR international</td><td>4500-434</td><td>Bez wapnia i magnezu</td></tr><tr><td>Laminina I z myszy</td><td>VWR international</td><td>95036-762</td><td></td></tr><tr><td>Fibronektyna z ludzkiej osocza</td><td>Invitrogen</td><td>33016-015</td><td></td></tr><tr><td>AlexaFluor&amp;#174; 647 kwas karboksylowy, ester succinimidylowy</td><td>Invitrogen</td><td>A-20006</td><td></td></tr><tr><td>MitoTracker Red 580</td><td>Invitrogen</td><td>M22425</td><td></td></tr><tr><td>AlexaFluor&amp;#174; 350 kwas karboksylowy, ester succinimidylowy</td><td>Invitrogen</td><td>A-10168</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało przeciwko lamininie</td><td>Fisher Scientific</td><td>AB2034MI</td><td></td></tr></tbody></table>

tworzenie dwuwymiarowych wzorowanych podłoży do ograniczania przestrzeni białek i komórek

Creating Two-Dimensional Patterned Substrates for Protein and Cell Confinement

Drukowanie mikrokontaktowe zapewnia szybką i wysoce powtarzalną metodę tworzenia precyzyjnie wzorowanych podłoży.1 Choć drukowanie mikrokontaktowe można wykorzystać do bezpośredniego nanoszenia dużej liczby cząsteczek, w tym białek,2 DNA,3 oraz silanów,4 tworzenie samoorganizujących się monowarstw (SAMs) z długołańcuchowych alkanotioli na złocie stanowi prosty sposób na ograniczenie białek i komórek do określonych wzorów zawierających obszary adhezyjne i odporne. Takie ograniczenie może być wykorzystane do kontrolowania morfologii komórek i jest przydatne przy badaniu różnych zagadnień z zakresu biologii białek i komórek. W niniejszej pracy opisujemy ogólną metodę tworzenia precyzyjnych wzorów białkowych do badań komórkowych.5 Proces ten obejmuje trzy etapy: wykonanie wzorowanego matryca za pomocą fotolitografii, stworzenie stempla z PDMS oraz drukowanie mikrokontaktowe na podłożu pokrytym złotem. Po wzorowaniu podłoża do hodowli komórkowej te są w stanie ograniczyć białka i/lub komórki (komórki pierwotne lub linie komórkowe) do naniesionego wzoru.
Zastosowanie chemii samoorganizujących się monowarstw pozwala na precyzyjną kontrolę nad wzorcowanymi obszarami adhezyjnymi dla białek/komórek oraz obszarami nieadhezyjnymi; nie można tego osiągnąć za pomocą bezpośredniego stemplowania białek. Heksadekanotiol, długołańcuchowy alkanotiol używany w etapie mikro druku kontaktowego, tworzy powierzchnię hydrofobową, która łatwo adsorbuje białka z roztworu. Thiol zakończony grupą glikolową, stosowany do wypełniania nienadrukowanych obszarów podłoża, tworzy monowarstwę odporną na adsorpcję białek, a w konsekwencji na wzrost komórek.6 Monomery tioli tych tworzą wysoko ustrukturyzowane monowarstwy, które precyzyjnie definiują obszary podłoża mogące wspierać adsorpcję białek i wzrost komórek. W rezultacie podłoża te są użyteczne w szerokim zakresie zastosowań, od badań nad zachowaniem międzykomórkowym7 po tworzenie mikroelektroniki.8
Choć w badaniach nad hodowlami komórkowymi stosowano inne rodzaje chemii monowarstw, w tym prace naszej grupy wykorzystujące trichlorosilany do tworzenia wzorów bezpośrednio na podłożach szklanych,9 wzorzyste monowarstwy tworzone z alkanotioli na złocie są łatwe w przygotowaniu. Co więcej, monomery stosowane do przygotowania monowarstw są dostępne komercyjnie, stabilne i nie wymagają przechowywania ani obchodzenia się z nimi w atmosferze obojętnej. Wzorzyste podłoża przygotowane z alkanotioli mogą być również regenerowane i używane wielokrotnie, zachowując zdolność do ograniczania rozmieszczenia komórek.10

Samoorganizujące się monowarstwy (SAMs) utworzone z długołańcuchowych alkanotioli na złocie stanowią precyzyjnie zdefiniowane podłoża do tworzenia wzorów białkowych oraz ograniczania przestrzeni wzrostu komórek. Mikro kontaktowy druk heksadekanotiolu przy użyciu stempla z polidimetylosiloksanu (PDMS), a następnie wypełnienie wolnych przestrzeni monomerem alkanotiolu zakończonym grupą glikolową, pozwala na uzyskanie wzoru, w którym białka i komórki adsorbują wyłącznie do obszaru z nadrukowanym heksadekanotiolem.

Tworzenie dwuwymiarowych wzorowanych podłoży do ograniczania przestrzeni białek i komórek

Drukowanie mikrokontaktowe zapewnia szybką i wysoce powtarzalną metodę tworzenia dobrze zdefiniowanych podłoży wzorowanych.1 Podczas gdy drukowanie mikrokontaktowe ...

Ogólnym celem następnego eksperymentu jest opracowanie dwuwymiarowo wzorowanego podłoża służącego do kontroli absorpcji białek oraz wzrostu komórek. Osiąga się to poprzez zastosowanie fotolitografii do wykonania wzorowanego matrycy, która służy do wytworzenia stempla A-P-D-M-S do mikrostemplowania. W drugim kroku przygotowywane jest wzorowane podłoże złote, co obejmuje mikrostemplowanie w celu stworzenia wzoru z obszarami absorbującymi oraz odpornymi na białka.Następnie do podłoża dodaje się białka i komórki w celu wizualizacji wzoru i przeprowadzenia badań. Wyniki dotyczące wzrostu i zachowania komórek, uzyskane za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej oraz kontrastowej, wykazują dobre ograniczenie białek i komórek do obszarów wzoru na tych podłożach. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z innymi istniejącymi metodami, takimi jak druk białek MicroCon, jest to, że monowarstwa zakończona grupami glikolowymi zapobiega nieswoistej adsorpcji białek i komórek w obszarach tła wzoru.Zazwyczaj osoby rozpoczynające pracę z tą metodą napotykają trudności, ponieważ właściwa technika stemplowania musi zostać zoptymalizowana dla każdego drukowanego wzoru. Aby rozpocząć przygotowanie wzorcowego

creating-two-dimensional-patterned-substrates-for-protein-cell

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Two-Dimensional Patterned Substrates for Protein and Cell Confinement

Drukowanie mikrokontaktowe jest szeroko stosowane do wzorowania białek i innych cząsteczek na powierzchniach materiałów. Demonstrujemy podstawowe kroki tego procesu, polegające na stemplowaniu wzorów fibronektyny na szkle.

Mikrodruk białek w biologii komórki

Opracowano wszechstronną technikę litografii plazmowej do tworzenia stabilnych wzorów powierzchniowych służących do kierowania adhezją komórkową. Technika ta może być stosowana do tworzenia sieci komórkowych, w tym takich, które naśladują naturalne tkanki, i była wykorzystywana do badania kilku odrębnych typów komórek.

Wzornictwo powierzchni metodą litografii plazmowej do tworzenia sieci komórkowych

Wodne systemy dwufazowe były używane do jednoczesnego modelowania wielu populacji komórek. Ta szybka i łatwa metoda modelowania komórek wykorzystuje separację faz wodnych roztworów dekstranu i glikolu polietylenowego oraz napięcie międzyfazowe, które istnieje między tymi dwoma roztworami polimerów.

Modelowanie kohodowli komórkowych przy użyciu wodnych systemów dwufazowych

Ten protokół opisuje metodę tworzenia wzorów komórkowych na SiO2 kompatybilną z mikrofabrykacją. Predefiniowany wzór parylenu-C jest drukowany fotolitograficznie na płytkach SiO2. Po inkubacji z surowicą (lub innym roztworem aktywacyjnym) komórki przylegają specyficznie (i rosną zgodnie z zgodnością) leżącego poniżej parylenu-C, będąc jednocześnie odpychane przez regiony SiO2.

Wzorcowanie komórek na zdefiniowanych fotolitograficznie 
Parylene-C: Substraty SiO2

Przedstawiono protokół wytwarzania dużego obszaru nanowzorzystego podłoża z małych form o nanowzorze do badania nanotopograficznej modulacji zachowania komórek.

Ekspandowanie nanowzorzystych substratów przy użyciu techniki ściegu do nanotopograficznej modulacji zachowania komórek

Przedstawiamy protokół funkcjonalizacji szkła za pomocą nanometrycznych plastrów białkowych otoczonych płynną dwuwarstwą lipidową. Substraty te są kompatybilne z zaawansowaną mikroskopią optyczną i oczekuje się, że posłużą jako platforma do badań adhezji i migracji komórek.

Macierze nanoklastrów ligandów w podpartej dwuwarstwie lipidowej

Ten raport opisuje prostą, łatwą do wykonania technikę, wykorzystującą próżnię niskociśnieniową, do wypełniania kanałów mikroprzepływowych komórkami i substratami do badań biologicznych.

Wszechstronna metoda modelowania białek i komórek

Ta metodologia ma na celu zilustrowanie mechanizmów, za pomocą których sygnały macierzy zewnątrzkomórkowej, takie jak sztywność substratu, skład białka i morfologia komórki, regulują fenotyp komórek Schwanna (SC).

Przygotowanie przestrajalnych mikrośrodowisk macierzy zewnątrzkomórkowej w celu oceny specyfikacji fenotypu komórek Schwanna

Tutaj prezentujemy protokół do mikrowzorcowania komórek w rozdzielczości pojedynczej komórki za pomocą adhezji programowanej przez DNA. Protokół ten wykorzystuje laboratoryjną platformę fotolitograficzną do tworzenia wzorów oligonukleotydów DNA na szkiełku szkiełkowym, a następnie znakuje błony komórkowe dostępnymi na rynku komplementarnymi oligonukleotydami. Hybrydyzacja oligonukleotydów powoduje zaprogramowaną adhezję komórek.

Proste, niedrogie i modułowe modelowanie komórek za pomocą DNA

Litografia w bliskim UV i mikroskopia siły trakcyjnej są połączone w celu pomiaru sił komórkowych na mikrowzorzystych hydrożelach. Ukierunkowane uwalnianie pojedynczych komórek pod wpływem światła umożliwia dużą liczbę pomiarów na tej samej próbce.

Kontrola adhezji komórek za pomocą technik modelowania hydrożelu do zastosowań w mikroskopii sił trakcyjnych

Tradycyjnie, hodowla komórkowa jest przeprowadzana na płaskich podłożach, które słabo naśladują naturalne środowisko komórek in vivo. W tym miejscu opisujemy metodę wytwarzania substratów do hodowli komórkowych o fizjologicznie istotnych zakrzywionych geometriach i mikrowzorach białek zewnątrzkomórkowych, co pozwala na systematyczne badania nad komórkowym wykrywaniem tych zewnątrzkomórkowych sygnałów.

Generowanie wielokierunkowych mikrośrodowisk komórkowych za pomocą fotomodelingu UV trójwymiarowych substratów do hodowli komórkowych

Poznaj technikę mikrokontaktowego drukowania do tworzenia wzorzystych substratów złotych kontrolujących absorpcję białek i wzrost komórek. Ta metoda umożliwia badanie zachowań komórkowych w neurobiologii i inżynierii tkankowej.

Tworzenie dwuwymiarowych wzorowanych podłoży do ograniczania przestrzeni białek i komórek

Przeglądaj więcej filmów