Generowanie wielokierunkowych mikrośrodowisk komórkowych za pomocą fotomodelingu UV trójwymiarowych substratów do hodowli komórkowych

Wpływ czynników mikrośrodowiskowych na zachowanie komórek jest często badany przy użyciu nadmiernie uproszczonych platform in vitro, które izolują pojedyncze sygnały. Nasze podejście tworzy substraty do hodowli komórkowych, które łączą wiele z tych wskazówek. Podejście to jest bardzo wszechstronne i umożliwia systematyczne badanie z wykorzystaniem szerokiej gamy materiałów do hodowli komórkowych, wzorców naprowadzania kontaktowego, odczytów komórkowych i białek.

Procedura zostanie zademonstrowana przez dwóch kandydatów PSE z naszego laboratorium. CAS VAN DER PUTTEN i MIRKO D'URSO Po pierwsze, stwórz szklaną formę negatywową za pomocą techniki lasera femtosekundowego bezpośrednio w prawo, zawierającą wszystkie interesujące Cię cechy. Następnie ostrożnie umieść szklaną formę negatywową na dnie szalki Petriego i wlej prepolimer polidimetylosiloksanu na wierzch formy ze szkła ujemnego, aby całkowicie ją przykryć.

Umieść tę szalkę Petriego w eksykatorze próżniowym i uruchom pompę próżniową. Po osiągnięciu próżni odczekaj 5 minut, aby usunąć wszystkie pęcherzyki obecne na granicy między powierzchnią formy a prepolimerem polidimetylosiloksanu. Utwardź prepolimer PDMS przez noc w piekarniku w temperaturze 65 stopni Celsjusza.

Po utwardzeniu użyj szpatułki, aby podnieść krawędzie PDMS. Wyjmij nowo utwardzony dodatni chip PDMS z ujemnej formy szklanej, a jeśli dodatni chip PDMS ma tendencję do przyklejania się do ujemnej szklanej formy, dodaj etanol lub wodę do krawędzi odcisku podczas podnoszenia. Następnie umieść dodatni chip polidimetylosiloksanu w eksykatorze obok małej fiolki z kroplą środka silanizacyjnego i pozostaw chip pod próżnią na noc.

Wlej prepolimer PDMS do ujemnej formy PDMS, aby wytworzyć wiele chipów hodowli komórkowych o grubości 5 milimetrów. Następnie usuń pęcherzyki za pomocą eksykatora i utwardź przez trzy godziny w temperaturze 65 stopni Celsjusza. Użyj żyletki, aby przyciąć wióry do ostatecznego rozmiaru i przechowywać je w temperaturze pokojowej Aby pasywować podłoże za pomocą pęsety, umieść wiór w koszu plazmowego Ashera.

Następnie użyj plazmy tlenowej, aby aktywować grupy hydroksylowe na powierzchni chipa i odpowietrzyć komorę popielnictwa za pomocą azotu. Wyjmij chips z kosza i umieść go w małym pojemniku z polidimetylosiloksanu. Teraz użyj pipety Pasteura, aby dodać 500 mikrolitrów poli-L-lizyny na wierzch chipa, aby całkowicie zanurzyć powierzchnię w roztworze i inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej.

Następnie usuń 450 mikrolitrów poli-L-lizyny z chipa hodowli komórkowej za pomocą pipety. Następnie przepłucz powierzchnię chipa 500 mikrolitrami 0,1-molowego buforu HEPES. Utrzymuj końcową jakość wzoru, pozostawiając niewielką objętość płynu na chipie polidimetylosiloksanu, aby zapobiec wysuszeniu próbki.

Tuż przed użyciem przygotuj 500 mikrolitrów 50 miligramów na mililitr roztworu walerianianu metoksypolietylenowo-glikozowego cyjanamidu w buforze 0,1 molowym na chip do hodowli komórkowej i inkubuj w nim próbkę przez 60 minut. Za pomocą mikropipety usuń 450 mikrolitrów roztworu walerianianu cyjanamidu z polietylenu etylenu. Umyj powierzchnię wióra pięciokrotnie za pomocą PBS, pipetując do wewnątrz i na zewnątrz.

Aby usunąć wszystkie niepowiązane mPEG-SVA. Umieść szklane szkiełko z fluorescencyjnym zakreślaczem w torze optycznym mikroskopu. Przełącz się w tryb fluorescencyjny w mikroskopie i ostrożnie ustaw ostrość obrazu primo, upewniając się, że zarówno logo, jak i tekst są ostre.

Kliknij dalej, aby wyświetlić dane kalibracji i wzór, aby zakończyć procedurę kalibracji. Zapisz położenie Z stolika podczas kalibracji i użyj tego położenia jako odniesienia w dalszej części protokołu. Po zdjęciu szkiełka kalibracyjnego ze stolika należy umieścić na stoliku szkiełko podstawowe zawierające kroplę fotoinicjatora i umieścić substrat do hodowli komórkowej PDMS do góry nogami, w kropli fotoinicjatora.

Upewnij się, że cechy 3D na powierzchni podłoża do hodowli komórkowej są skierowane w stronę szkiełka i są całkowicie zanurzone w inicjatorze fotograficznym, aby zapewnić prawidłowe wzory. Skoncentruj się odpowiednio na górze lub na dole wypukłych lub wklęsłych struktur i skup się na obszarze chipa we właściwym miejscu, zgodnie z opisem w manuskrypcie. Dostosuj ustawienia wzoru zgodnie z funkcją i wybierz dawkę 1000 milidżuli na mililitr.

Kliknij przycisk odtwarzania w prawym dolnym rogu ekranu, aby rozpocząć tworzenie wzoru. Po zakończeniu obserwuj wzór wyświetlany na zielono. Za pomocą mikropipety dodaj dwa mililitry PBS do fiolki zawierającej 20 mikrogramów fibronektyny znakowanej rodaminą, aby uzyskać stężenie 10 mikrogramów na mililitr.

Delikatnie odpipetować, aby uniknąć grudek białka i chronić przed światłem. Za pomocą mikropipety dodaj od 200 do 500 mikrolitrów roztworu białkowego do chipa do hodowli komórkowej. Dostosuj czas inkubacji i temperaturę w zależności od wybranego białka i upewnij się, że próbka jest pokryta.

Usuń roztwór białkowy i umyj chip pięć razy 500 mikrolitrami sterylnego PBS. Upewnij się, że pipetujesz PBS w górę i w dół wiele razy powyżej wszystkich istotnych cech chipa do hodowli komórkowej, aby usunąć wszelkie niezwiązane białka. Po przygotowaniu zawiesiny komórek usuń PBS i dodaj 1 mililitr zawiesiny komórek do chipa.

Następnie inkubuj go przez 60 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Sprawdź przyczepność komórek do chipa hodowli komórek wzorcowych pod mikroskopem jasnego pola. Szukaj wydłużonych morfologii komórek w przypadku wzorów linii.

A jeśli komórki zaczęły przylegać poza wzorzystym obszarem, usuń je, pipetując pożywkę w górę iw dół bezpośrednio nad komórkami na podłożu. Po zabarwieniu umieść wybarwioną próbkę do góry nogami w kropli PBS na szkiełku podstawowym na szkiełku podstawowym. Następnie, w zależności od wymaganego poziomu szczegółowości, wykonaj stosy Z z odpowiednim obiektywem i odstępami Z, aby zapewnić prawidłową akwizycję obrazu.

Utwórz render 3D stosu Z za pomocą oprogramowania do renderowania 3D. Wklęsły dół został ukształtowany przy użyciu indukowanej światłem absorpcji molekularnej białek, a projekcja maksymalnej intensywności i widok ortogonalny zostały zwizualizowane. Profil intensywności wykazywał wysoką rozdzielczość wzorca, ostre przejścia między obszarami wzorzystymi i niewzorzystymi oraz stałą intensywność białka.

Wzorowanie przy użyciu metody pojedynczej płaszczyzny ogniskowej oraz dwóch i trzech płaszczyzn ogniskowych wykazało idealne wyrównanie wzorów na wierzchu cech. Półcylindry wklęsłe, półcylindry wypukłe, powierzchnia siodła i PID zostały ukształtowane za pomocą linii lub koncentrycznych okręgów o różnych szerokościach. Afekt wewnątrz szkieletu ludzkich keratocytów jest barwiony za pomocą folidenu i wizualizowany.

Fibroblasty skóry wyhodowano na wzorzystym wklęsłym półcylindrze i uwidoczniono. Komórki wyczuwały i przylegały do substratu hodowli komórkowej z wieloma wskazówkami i pozostawały żywotne w czasie, jak uwidoczniono za pomocą F-aktyny, winkuliny i jąder. Ponadto komórki tworzyły zrosty ogniskowe głównie na liniach fibronektyny.

Ludzkie fibroblasty skórne hodowane na wzorzystym wklęsłym cylindrze w obecności fibronektyny rodaminy przylegały do podłoża multi cue i wykazywały reakcję wyrównania, zgodnie ze wzorcem prowadzenia kontaktu. Odpowiedź na wyrównanie i żywotność komórek są utrzymywane przez cały czas trwania hodowli. Najważniejszą rzeczą podczas wykonywania tego protokołu jest zapobieganie wysychaniu powierzchni chipa hodowli komórkowej.

Stosowanie różnych materiałów podłoża, powłok białkowych i typów komórek może wymagać dodatkowej optymalizacji. Dostarczanie wielu wskazówek środowiskowych w 3D może otworzyć nowe możliwości sterowania organizacją komórkową w złożonych tkankach inżynieryjnych.