Name: Generowanie wielokierunkowych mikrośrodowisk komórkowych za pomocą fotomodelingu UV trójwymiarowych substratów do hodowli komórkowych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-06-02T14:20:00.000+00:00
Duration: 9 min 30 s
Description: Poznaj metodę tworzenia wielokierunkowych mikrośrodowisk komórkowych przy użyciu fotomodelingu UV trójwymiarowych substratów PDMS. Technika ta umożliwia systematyczne badanie odpowiedzi komórek na sygnały zewnątrzkomórkowe.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy dr Nello Formisano (MERLN Institute for Technology-Inspired Regenerative Medicine) za dostarczenie ludzkich pierwotnych keratocytów. Prace te były wspierane przez Chemelot InSciTe (projekt BM3.02); Europejska Rada ds. Badań Naukowych (grant 851960); oraz Ministerstwu Edukacji, Kultury i Nauki za Program Grawitacji 024.003.013 "Regeneracja Sterowana Materiałami". Autorzy chcieliby podziękować firmie Alvéole za korespondencję, pomoc i rozwiązywanie problemów.

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

Obecnie zachowanie komórek jest często badane na płaskich podłożach hodowlanych, które nie są tak złożone jak natywne mikrośrodowisko komórki. Jako alternatywę stosuje się środowiska 3D, takie jak rusztowania i hydrożele. Chociaż te środowiska hodowli komórkowych poprawiają przydatność in vivo, zarówno systematyczne badania zachowania komórek, jak i wykonalność metod odczytu pozostają wyzwaniem. Aby systematycznie badać zachowanie komórek na reprezentatywnych podłożach hodowlanych, potrzebne są spójne substraty wielokierunkowe, które pozwalają na odczyt mikroskopowy. Dlatego w tym protokole opisujemy metodę tworzenia wielokierunkowych substratów do hodowli komórkowych o fizjologicznie istotnych geometriach i wzorzystych białkach ECM. Głównym wyzwaniem związanym z łączeniem sygnałów środowiskowych, takich jak geometria tkanek i wskazówki kontaktowe, na platformach in vitro, jest w dużej mierze charakter technologiczny. Konwencjonalne metody stosowania wskazówek kontaktowych (np. miękka litografia, wzory w głębokim UV i druk mikrokontaktowy35,36) do materiałów do hodowli komórkowych zostały zoptymalizowane pod kątem podłoży płaskich. Zapotrzebowanie na materiały do hodowli komórkowych 3D w połączeniu ze wskazówkami dotyczącymi kontaktu uwypukliło kilka wyzwań technologicznych, takich jak słabe wyrównanie wzoru, rozdzielczość i elastyczność. Aby sprostać tym wyzwaniom, można zastosować wysokoprzepustową, bezmaskową, opartą na świetle metodę modelowania45,49. W tym przypadku mikroskop optyczny umożliwia precyzyjne wyrównanie wzoru i rozdzielczość rzędu mikrometrów (patrz rysunek 6). Co więcej, zastosowanie maski cyfrowej umożliwia naukowcom badanie zachowania komórek w szerokim zakresie wzorców bez konieczności wytwarzania pracochłonnych masek fizycznych.
Podejście oparte na fotowzorcach UV może być stosowane w połączeniu z różnymi geometriami 3D (np. cylindrami, siodłami, kopułami, dołami) wykonanymi z różnych materiałów48. Substraty do hodowli komórkowych 3D użyte w tym badaniu są wykonane z PDMS; Można jednak użyć również innych materiałów. Może to wymagać różnych etapów w celu wytworzenia końcowego substratu do hodowli komórkowej zawierającego interesujące cechy. Ponieważ wykazano, że komórki są wrażliwe na chropowatość powierzchni materiałów do hodowli komórkowych, ważne jest, aby tworzyć chipy do hodowli komórkowych o gładkiej powierzchni, tak aby odpowiedź obserwowanych komórek można było w pełni przypisać geometrii 3D i wskazówkom naprowadzania kontaktowego50,51. Do pomiaru chropowatości powierzchni można wykorzystać metody pomiarowe, takie jak profilometria optyczna, skaningowa mikroskopia elektronowa lub mikroskopia sił atomowych. Po wytworzeniu materiału do hodowli komórkowej można wybrać metodę modelowania w oparciu o jedną lub wiele płaszczyzn ogniskowych w zależności od konkretnych wymiarów cechy będącej przedmiotem zainteresowania (patrz rysunek 3). Zazwyczaj pojedyncza płaszczyzna ogniskowej jest używana do modelowania obszaru w zakresie Z około 50 μm. Wykazano, że rozdzielczość wzorca jest spójna przy użyciu tej praktycznej reguły (patrz rysunek 6). Jednak wadą tej metody jest wydłużony czas tworzenia wzoru wraz z wprowadzeniem wielu płaszczyzn ogniskowych i wzorów. W naszej dłoni, przy użyciu wielu płaszczyzn ogniskowych, cechy geometryczne 3D do 16 mm x 16 mm x 0,17 mm (X x Y x Z) zostały z powodzeniem wymodelowane z wysoką jakością wzoru.
Dodatkowo należy wspomnieć, że wysokość (oś Z) elementów geometrycznych, które można wykorzystać w połączeniu z tym protokołem, jest ograniczona. Ponieważ zarówno fotowzorzec UV, jak i wiele odczytów komórkowych opiera się na konfiguracji mikroskopowej, odległość robocza obiektywów określa maksymalną wysokość obiektu. W naszej dłoni geometrie przekraczające wysokość 300 μm mogą być nadal fotowzorcowane promieniami UV, a odczyty zostały wykonane za pomocą mikroskopu konfokalnego z obiektywami 40x. Dzięki temu możliwe są badania mechanobiologiczne w skali od wewnątrzkomórkowej po komórkową i tkankową przy użyciu opisanego protokołu. 
Innym czynnikiem, który należy wziąć pod uwagę, jest ryzyko wyschnięcia próbek w trakcie lub po fotowzorcowaniu UV49. Jest to szczególnie istotne w przypadku stosowania geometrii 3D, ponieważ wypukłości są często eksponowane poza materiałami do hodowli komórkowych. Jak pokazano na rysunku 4, może to skutkować nierównymi wzorcami z agregatami białkowymi tworzącymi się na szczycie interesującej cechy. Mycie chipów hodowli komórkowej po inkubacji białek i podczas hodowli komórkowej ma kluczowe znaczenie dla prawidłowego powlekania geometrii 3D. Dlatego zaleca się, aby zawsze pozostawiać małe objętości roztworu roboczego (PBS, PLPP, roztwór białkowy, pożywka do hodowli komórkowych) na wierzchu chipa do hodowli komórkowej.
Do tej pory zastosowano kilka powłok białkowych (fibronektyna, kolagen typu I i IV, żelatyna, FNC) i typów komórek (ludzkie komórki zrębu szpiku kostnego, ludzkie miofibroblasty, ludzkie komórki śródbłonka, ludzkie keratocyty i fibroblasty skóry) w połączeniu z opisanym podejściem do fotowzorcowania na ustrukturyzowanych materiałach do hodowli komórkowych. Jak wykazano w poprzednim badaniu48, optymalizacja parametrów inkubacji białek ma kluczowe znaczenie dla systematycznych badań nad nowymi typami komórek. Dlatego przed wykonaniem nowego eksperymentu z nowymi białkami lub komórkami zaleca się przetestowanie zakresu stężeń białek, temperatur inkubacji i czasów inkubacji. Porównując morfologię komórek po początkowej adhezji na jednorodnych, płaskich obszarach o wzorzystych wzorcach z morfologią komórek w "normalnych" warunkach hodowli komórek, można uzyskać zoptymalizowany zestaw parametrów eksperymentalnych. Dodatkowo, każdy typ komórki może wymagać innej ilości czasu po wysiewie, aby pokazać rozpoznawalną morfologię adhezji w określonym środowisku wielokierunkowym (patrz Rysunek 5). W tym celu kluczowe znaczenie ma optymalizacja czasu wymaganego dla każdego typu ogniwa do przedstawienia zdarzeń kontaktowych na obszarze wzoru podczas prania w kroku 8.4. Na przykład zaobserwowaliśmy, że we wzorcach liniowych ludzkie keratocyty wykazują wydłużone morfologie w ciągu pierwszych 30 minut po wysiewie, podczas gdy komórki śródbłonka i fibroblasty skóry potrzebują wielu godzin, zanim wykażą zmianę morfologii adhezji. Parametry doświadczalne wymagane do inkubacji białek (etap 7) i wysiewu komórek (etap 8) mogą być zatem zależne od wybranego typu białka i komórki. 
Przedstawione podejście do stosowania wskazówek dotyczących kontaktu z komputerem w geometriach 3D może pomóc w lepszym zrozumieniu zachowania komórek w złożonych środowiskach wielokierunkowych. Może to obejmować badania składników wewnątrzkomórkowych, takich jak zrosty ogniskowe i jądra, a także może obejmować eksperymenty przeprowadzane na większej, komórkowej lub tkankowej skali przy użyciu proponowanej metody. Ostatecznie oczekuje się, że zdobyta wiedza będzie mogła zostać wykorzystana w projektowaniu zastosowań inżynierii tkankowej, w których złożone środowiska komórkowe są projektowane tak, aby kierować zachowaniem komórek w kierunku pożądanego wyniku.

In vivo, komórki są poddawane różnorodnym sygnałom środowiskowym, które mogą mieć charakter mechaniczny, fizyczny i biochemiczny, a które pochodzą z macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM). Zidentyfikowano liczne sygnały środowiskowe, które odgrywają istotną rolę w regulacji zachowania komórek, takich jak proliferacja, różnicowanie i migracja1,2,3,4,5. Jednym z najszerzej badanych zjawisk jest naprowadzanie kontaktowe, opisujące ułożenie komórek za pośrednictwem adhezji wzdłuż anizotropowych wzorców biochemicznych lub topograficznych obecnych na podłożu zewnątrzkomórkowym6,7,8,9,10,11. Wykazano, że poza kierowaniem ułożeniem komórek, wskazówki dotyczące kontaktu wpływają również na inne właściwości komórek, takie jak migracja komórek, organizacja białek wewnątrzkomórkowych, kształt komórki i los komórki12,13,14,15. Dodatkowo, geometryczna architektura środowiska komórkowego 3D została również uznana za jej regulacyjny wpływ na zachowanie komórek16,17. W ludzkim ciele komórki są wystawione na działanie szeregu zakrzywionych geometrii, począwszy od mikroskalowych włókien kolagenowych, naczyń włosowatych i kłębuszków nerkowych, aż po mezoskalowe pęcherzyki płucne i tętnice18,19. Co ciekawe, ostatnie badania in vitro wykazały, że komórki mogą wyczuwać i reagować na takie sygnały fizyczne, od nano- do mezoscale20,21,22,23.
Do tej pory, większość badań nad reakcją komórek na sygnały środowiskowe była w dużej mierze przeprowadzana przy użyciu eksperymentalnych konfiguracji, które izolują pojedyncze sygnały. Chociaż podejście to pozwoliło na ogromny postęp w zrozumieniu podstawowych mechanizmów stojących za komórkowym wykrywaniem sygnałów środowiskowych, słabo podsumowuje środowisko in vivo, które jednocześnie przedstawia wiele wskazówek. Aby wypełnić tę lukę, przydatne jest opracowanie platform kulturowych, za pomocą których wiele sygnałów środowiskowych może być niezależnie i jednocześnie kontrolowanych. Koncepcja ta zyskuje ostatnio coraz większą popularność24,25, z badaniami łączącymi sztywność matrycy i gęstość liganda26,27,28,29, sztywność i porowatość podłoża30, sztywność podłoża i objętość mikroniszy 3D31, topografia powierzchni i wskazówki dotyczące kontaktu32,33,34, oraz nanoskalowe wskazówki dotyczące naprowadzania na kontakt z mezoskalowymi wskazówkami dotyczącymi krzywizny23. Wyzwaniem pozostaje jednak połączenie wskazówek naprowadzania kontaktowego z różnymi geometriami 3D w kontrolowany i wysokowydajny sposób.
Ten protokół badawczy rozwiązuje to wyzwanie i wprowadza metodę tworzenia substratów do hodowli komórkowych z kontrolowaną kombinacją wzorzystych obszarów adhezyjnych białek ECM (wskazówki kontaktowe) i krzywizny substratu (wskazówki geometryczne). Takie podejście pozwala na analizę odpowiedzi komórek w biomimetycznym środowisku wielokierunkowym w sposób systematyczny i wysokoprzepustowy. Zdobyta wiedza może pomóc w lepszym zrozumieniu zachowania komórek w złożonych środowiskach i może być wykorzystana do projektowania materiałów instruktażowych o właściwościach, które kierują odpowiedziami komórek w kierunku pożądanego rezultatu.
3D fotowzorce białek 
Tworzenie obszarów adhezyjnych białek ECM (wskazówki kontaktowe) na materiałach do hodowli komórkowych można osiągnąć przy użyciu różnych technik, na przykład poprzez wzory w głębokim ultrafiolecie (głębokim UV) lub druk mikrokontaktowy35,36. Modelowanie w głębokim promieniowaniu UV wykorzystuje światło UV, które jest emitowane przez maskę na materiał polimerowy w celu degradacji polimerów pasywacyjnych w określonych miejscach na podłożu hodowli komórkowej. Wzorzysty substrat jest następnie inkubowany z interesującym ligandem, w wyniku czego powstają obszary adhezyjne, które wspierają przyczepianie się komórek i hodowlę w predefiniowanych lokalizacjach12,37,38. Alternatywnym sposobem wprowadzania wzorów białkowych jest druk mikrokontaktowy, w którym stemple elastomerowe zawierające pożądany kształt są powlekane wybranym białkiem i prasowane na podłożu do hodowli komórkowej, przenosząc w ten sposób powłokę białkową, do której komórki mogą przylegać35,37,39,40. Niestety, ponieważ obie techniki opierają się na przygotowaniu masek i metodach miękkiej litografii, eksperymenty są czasochłonne i pracochłonne, a także ograniczone pod względem elastyczności wzorów. Ponadto zarówno modelowanie w głębokim promieniowaniu UV, jak i druk mikrokontaktowy są najbardziej odpowiednie dla materiałów płaskich i są technicznie trudne, jeśli nie niemożliwe, do modelowania ligandów w środowisku 3D.
Aby ulepszyć te konwencjonalne metody, Waterkotte et al. połączyli litografię bez maski, chemiczne osadzanie z fazy gazowej i termoformowanie, aby wygenerować mikrowzorcowe podłoża polimerowe 3D41. Jednak technika ta opiera się na wykorzystaniu termoformowalnych folii polimerowych i oferuje niską rozdzielczość wzoru białka (7,5 μm), podczas gdy doniesiono, że komórki reagują na geometryczne wzorce białek tak małe jak 0,1 μm2,42. Sevcik i in. opisali inną obiecującą metodę nanomodelowania ligandów ECM na podłożach zawierających topografie nano- i mikrometrowe43. Za pomocą druku mikrokontaktowego białka ECM przeniesiono ze stempli polidimetylosiloksanu (PDMS) na termoczułe podłoże z poli(N-izopropylacrylamidu) (pNIPAM). Następnie właściwości termoczułe sieci pNIPAM pozwoliły im przenieść dwuwymiarowy (2D) wzór białka na topograficzne podłoże PDMS (rowki o głębokości 10-100 μm), kontrolując w ten sposób lokalizację miejsc adhezji na cechach topograficznych. Jednak nie wszystkie możliwe mikrotopografie mogą być modelowane, ponieważ problemy ze zmniejszoną zwilżalnością utrudniają modelowanie głębszych podłoży topograficznych. Zgłoszono, że rowy o proporcjach głębokości do szerokości wynoszącym 2,4 stanowią ostateczną granicę pomyślnego przeniesienia wzoru na podłoże topograficzne43. Dodatkowo, elastyczność różnych wzorów i rozdzielczość generowanych wzorów są słabe ze względu na wymóg druku mikrokontaktowego.
Ten artykuł opisuje metodę, która pokonuje wyżej wymienione wąskie gardła i oferuje elastyczną i wysokoprzepustową metodę tworzenia wielokierunkowych substratów, które mogą być użyte do hodowli komórkowej (zobacz <silna klasa="xfig">Rysunek 1). Fizjologicznie istotne geometrie (cylindry, kopuły, elipsy i powierzchnie siodeł) o krzywiznach w zakresie od ĸ = 1/2500 do ĸ = 1/125 μm-1 są wstępnie zaprojektowane i mikrofabrykowane w chipach PDMS. Następnie, na geometriach 3D tworzone są wskazówki kontaktowe przy użyciu różnych cyfrowych projektów wzorów, wykorzystując technikę fotowzorców o rozdzielczości tak małej jak 1,5 μm44. W tym celu chipy PDMS są początkowo pasywowane, aby zapobiec przyleganiu komórek i białek; ta warstwa pasywacyjna może być następnie usunięta przez połączenie chlorku 4-benzoilobenzylo-trimetyloamoniowego (PLPP) i ekspozycji na światło UV45. Maska cyfrowa ma za zadanie określić miejsca ekspozycji na promieniowanie UV, a tym samym obszar, z którego usuwana jest warstwa pasywacyjna. Białka mogą następnie przylegać do tych obszarów, umożliwiając przyłączanie się komórek. Ponieważ tworzenie wzorów odbywa się za pomocą maski cyfrowej (a nie fizycznej), można szybko tworzyć różnorodne wzory bez kłopotów i kosztów związanych z projektowaniem i wytwarzaniem dodatkowych fotomasek. Ponadto na podłożu można wzorować różnorodną gamę białek ECM (np. kolagen typu I, żelatynę i fibronektynę). Chociaż protokół ten jest wykonywany przy użyciu chipów do hodowli komórkowych wykonanych z PDMS, zasada ta może być zastosowana do każdego innego interesującego materiału46.

<table><tbody><tr><td>Przeciwciało anty-winkulinowe, mysi monoklonalny IgG1</td><td>Sigma</td><td>V9131</td><td>Rozcieńczenie: 1/600</td></tr><tr><td>Albumina surowicy bydlęcej, frakcja V</td><td>Roche</td><td>10735086001</td><td></td></tr><tr><td>DMEM, wysoka zawartość glukozy, pirogronian</td><td>Gibco</td><td>41966029</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F-12 + GlutaMAX (1x)</td><td></td>Mikroskop epifluorescencyjny <td>Gibco</td> 10565018 <td></td></tr><tr><td>DMi8</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Biosolve</td><td>0005250210BS</td><td></td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca</td><td>Serana</td><td>758093</td><td></td></tr><tr><td>Fidżi/ImageJ, wersja v1.53k</td><td>www.imageJ.nih.gov</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fluorescencyjny rozświetlacz</td><td>Stabilo</td><td>4006381333627</td><td></td></tr><tr><td>Żelatyna znakowana fluorescyną</td><td>Invitrogen</td><td>G13187</td><td>Stężenie: 0,01%</td></tr><tr><td>Roztwór formaldehydu</td><td>Merck</td><td>F8775</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełka nakrywkowe szklane 24 x 60 mm, #1</td><td>VWR</td><td>631-1575</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełka nakrywkowe, &oslash; = 32 mm, #1</td><td>Menzel-Gl&auml; obiektyw mikroskopowy ser</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HCX PL fluotar L 20X/0.40na</td><td>Leica</td><td>11506242</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Gibco</td><td>15630080</td><td></td></tr><tr><td>Ludzkie fibroblasty skóry</td><td>Lonza</td><td>CC-2511</td><td></td></tr><tr><td>Ludzkie pierwotne keratocyty</td><td>MERLN Instytut Medycyny</td><td></td><td></td>Regeneracyjnej Inspirowanej Technologią</tr><tr><td>Illustrator, wersja 26.0.1</td><td>Adobe</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Piec laboratoryjny</td><td>Karbolit</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kwas L-askorbinowy 2-fosforan sól seskwimagnezowa hydrat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A8960</td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie Leica Application Suite X, wersja 3.5.7.23225</td><td>Oprogramowanie Leica Microsystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Leonardo, wersja 4.16</td><td>Alv&eacute; </td><td></td><td></td>ole</tr><tr><td>Micro-manager, wersja 1.4.23</td><td>Otwarte obrazowanie</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mowiol 4-88</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>81381</td><td>medium montażowe</td></tr><tr><td>walerianian mPEG-sukcynimidyl MW 5,000 Da</td><td>Laysan Bio</td><td>MPEG-SVA-5000</td><td>Stężenie: 50 mg / ml</td></tr><tr><td>Negatywna forma szklana</td><td>FEMTOprint</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Odczynnik NucBlue Live Readyprobes (Hoechst 33342)</td><td>Invitrogen</td><td>R37605</td><td>2 krople/ml</td></tr><tr><td>Penicylina-Streptomycyna (10 000 U/mL)</td><td>Gibco</td><td>15140163</td><td></td></tr><tr><td>szalka Petriego (&oslash;=100 mm)</td><td>Greiner Bio-one</td><td>664160</td><td></td></tr><tr><td>Phalloidin Atto 647N</td><td>Sigma</td><td>65906</td><td>Rozcieńczenie: 1/250</td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanami</td><td>Sigma</td><td>P4417</td><td></td></tr><tr><td>Plazma asher</td><td>Emitech</td><td>K1050X</td><td></td></tr><tr><td>PLPP (fotoinicjator)</td><td>Alv&eacute; </td><td></td><td></td>ole</tr><tr><td>Poli-L-lizyna, sterylnie filtrowana</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4707</td><td>Stężenie: 0,01%</td></tr><tr><td>PRIMO</td><td>Alv&eacute; </td><td></td><td></td>ole</tr><tr><td>fibronektyna znakowana rodaminą</td><td>Cytoskeletn, Inc.</td><td>FNR01</td><td>Stężenie: 10 &mikro; g / ml</td></tr><tr><td>Przeciwciało drugorzędowe z Alexa 488, kozie przeciwciało anty-mysie IgG1 (H)</td> <td>Sondy molekularne</td><td>A21121</td><td>Rozcieńczenie: 1/300</td></tr><tr><td>Przeciwciało drugorzędowe z Alexa 555, kozie przeciwciało anty-mysie IgG1 (H)</td> <td>Sondy molekularne</td><td>A21127</td><td>Rozcieńczenie: 1/300</td></tr><tr><td>Powlekarka wirowa</td><td>Leurell Technologies Corporation</td><td>model WS-650MZ-23NPPB</td><td></td></tr><tr><td>SYLGARD 184 Zestaw elastomerów silikonowych</td><td>DOW</td><td>1673921</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop konfokalny TCS SP8X</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>tridekafluoro(1,1,2,2-tetrahydrooktylo)trichlorosilan</td><td>ABCR</td><td>AB111444</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE Express Enzyme (1x), bez czerwieni fenolowej</td><td>Gibco</td><td>12604013</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA (0,05%), czerwień fenolowa</td><td>Gibco</td><td>25300054</td><td></td></tr></tbody></table>

generowanie wielokierunkowych mikrośrodowisk komórkowych za pomocą fotomodelingu uv trójwymiarowych substratów do hodowli komórkowych

Generation of Multicue Cellular Microenvironments by UV-Photopatterning of Three-Dimensional Cell Culture Substrates

Macierz zewnątrzkomórkowa jest ważnym regulatorem funkcji komórki. Coraz częściej wykazano, że sygnały środowiskowe istniejące w mikrośrodowisku komórkowym, takie jak dystrybucja ligandów i geometria tkanek, odgrywają kluczową rolę w zarządzaniu fenotypem i zachowaniem komórki. Jednak te sygnały środowiskowe i ich wpływ na komórki są często badane oddzielnie przy użyciu platform in vitro, które izolują poszczególne sygnały, strategia, która znacznie upraszcza złożoną sytuację in vivo wielu wskazówek. Podejścia inżynieryjne mogą być szczególnie przydatne w wypełnianiu tej luki poprzez opracowywanie konfiguracji eksperymentalnych, które ujmują złożoność mikrośrodowiska in vivo, zachowując jednocześnie stopień precyzji i możliwości manipulacji systemów in vitro.
To badanie podkreśla podejście łączące wzorowanie białek na bazie ultrafioletu (UV) i mikrofabrykację substratów opartą na litografii, które razem umożliwiają wysokoprzepustowe badanie zachowań komórek w środowiskach wielokierunkowych. Za pomocą bezmaskowego fotomodelowania UV możliwe jest tworzenie złożonych, adhezyjnych rozkładów białek na trójwymiarowych (3D) podłożach hodowli komórkowych na chipach, które zawierają różnorodne, dobrze zdefiniowane wskazówki geometryczne. Proponowana technika może być stosowana do substratów hodowlanych wykonanych z różnych materiałów polimerowych i połączonych z adhezyjnymi wzorzystymi obszarami szerokiej gamy białek. Dzięki takiemu podejściu, pojedyncze komórki, jak również monowarstwy, mogą być poddawane kombinacjom wskazówek geometrycznych i wskazówek dotyczących kontaktu prezentowanych przez wzorzyste podłoża. Systematyczne badania wykorzystujące kombinacje materiałów chipowych, wzorców białkowych i typów komórek mogą zatem dostarczyć fundamentalnych informacji na temat reakcji komórkowych na środowiska wielorakie.

Zgodnie z opisanym protokołem, trójwymiarowe podłoża do hodowli komórkowych z PDMS mogą zostać poddane fotopat wzorowaniu UV w celu stworzenia precyzyjnych i wysokoprzepustowych obszarów adhezyjnych odpowiednich do przywierania komórek. W ten sposób komórki są jednocześnie poddane działaniu odpowiedniej geometrii podłoża oraz wzorów ligandów adhezyjnych. Właściwości komórek, takie jak orientacja, powierzchnia komórki i liczba adhezji ogniskowych, mogą być łatwo monitorowane i wykorzystywane do lepszego zrozumienia zachowania komórek w złożonych środowiskach przypominających warunki in vivo.
Aby zweryfikować procesy wzorcowania na trójwymiarowych podłożach PDMS, zmierzono atomowy skład powierzchni materiału na różnych etapach protokołu, wykorzystując rentgenowską spektroskopię fotoelektronów (XPS)48. Podsumowując, pomiary XPS wykazały obecność łańcuchów PEG ze zwiększonym sygnałem węgla w próbkach pasywowanych, który uległ zmniejszeniu po fotowzorcowaniu. Inkubacja z fibronektyną doprowadziła do wzrostu sygnału węgla, co ponownie wskazało na skuteczną adhezję białka na powierzchni chipa do hodowli komórek. Następnie rozdzielczość i dopasowanie wzorców na elementach 3D scharakteryzowano na różnych wklęsłych dołkach z wzorcem kolistym (ĸ = 1/250 µm-1, ĸ = 1/1,000 µm-1 oraz ĸ = 1/3,750 µm-1, patrz Rysunek 6). Na podstawie projekcji maksymalnej intensywności można wywnioskować, że wzorzec białkowy został pomyślnie naniesiony na wszystkie trzy elementy 3D. Profil intensywności na Rysunku 6A wykazuje wysoką rozdzielczość wzorca z ostrymi przejściami między obszarami wzorcowanymi a niewzorcowanymi. Ponadto uzyskano spójną intensywność białka w obrębie całego wzorca w dołku.
Wklęsły dołek o ĸ = 1/250 µm-1 został uformowany przy użyciu metody jednej płaszczyzny ogniskowej (jeden wzór), natomiast dołki o ĸ = 1/1,000 µm-1 oraz ĸ = 1/3,750 µm-1 zostały uformowane przy użyciu odpowiednio dwóch i trzech płaszczyzn ogniskowych (wzorów). Jak widać na projekcjach maksymalnej intensywności na Rysunku 6, obie metody zapewniają idealne dopasowanie wzorów do struktur. Nie zaobserwowano żadnych przesunięć w przejściach między dwiema różnymi płaszczyznami ogniskowymi i wzorami.
Stosując opisany protokół, szeroki zakres wzorów białkowych można nanieść na różnorodne geometrie (patrz Rycina 7 i Wideo 1). Aby zilustrować wszechstronność tej metody, półcylindry (wypukłe i wklęsłe), powierzchnię siodłową oraz wgłębienie wzorowano za pomocą linii i okręgów o różnych szerokościach. Fotowzorowane materiały mogą być następnie wykorzystywane do hodowli komórkowych (patrz Rycina 7, Rycina 8, Wideo 2, Wideo 3 oraz Wideo 4). Przykład fibroblastów skóry hodowanych na wzorowanym (linie fibronektyny, czerwone, szerokość 5 µm i przerwy 5 µm) wklęsłym półcylindrze przedstawiono na Rycynie 8, Rycynie 9 oraz w Wideo 4. Podczas eksperymentu komórki wyczuwają i przylegają do wielostymulującego podłoża hodowlanego, zachowując żywotność w czasie. Jak wynika z barwienia immunofluorescencyjnego na Rycynie 8, komórki tworzą adhezje ogniskowe (skupiska winkuliny) głównie na liniach fibronektyny.
Kolejne badanie z wykorzystaniem tych materiałów do hodowli komórkowych zostało niedawno opublikowane przez naszą grupę48. W tej pracy ludzkie miofibroblasty i komórki śródbłonka poddano kombinacji sygnałów kierowania kontaktowego (contact guidance) oraz topografii geometrycznej. In vivo oba typy komórek doświadczają sygnałów związanych z krzywizną i kierowaniem kontaktowym w tkankach natywnych, takich jak naczynia krwionośne człowieka. Poddając komórki in vitro środowisku łączącemu oba te sygnały środowiskowe, można odtworzyć sytuację in vivo, co pozwala na głębsze zrozumienie roli mikrośrodowiska w zachowaniu komórek. Wykazano, że ludzkie miofibroblasty ustawiają się zgodnie z sygnałami kierowania kontaktowego (równoległe linie fibronektyny) na wklęsłych podłożach cylindrycznych48. Jednak na strukturach wypukłych o zwiększającej się krzywiźnie sygnały geometryczne przeważyły nad sygnałami biochemicznymi, co sugeruje, że miofibroblasty potrafią wyczuwać zarówno stopień, jak i znak krzywizny. Co ciekawe, komórki śródbłonka mogły przylegać jedynie do wklęsłych podłoży wielosygnałowych, a nie do wypukłych podłoży z PDMS. Na wklęsłych podłożach z wzorami białkowymi komórki śródbłonka orientują się w kierunku sygnału kierowania kontaktowego. Ta podstawowa wiedza in vitro ma znaczenie fizjologiczne w dziedzinie inżynierii tkanki naczyniowej i może w przyszłości pomóc w projektowaniu inteligentnych konstrukcji inżynierii tkankowej.
<img alt="Schemat wytwarzania hodowli komórkowej 3D; etapy: przygotowanie chipa PDMS, fotopatronowanie UV i barwienie." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63988/63988fig01.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1: Harmonogram eksperymentalny stosowania sygnałów prowadzenia kontaktowego na podłożach do hodowli komórkowej 3D. W pierwszej kolejności pozytywne chipy do hodowli komórkowej są wytwarzane z negatywowej formy PDMS zawierającej zestaw geometrii. Nieutwardzony PDMS jest wlewany do formy i utwardzany przez 3 h w temperaturze 65 °C. Następnie PDMS jest poddawany działaniu plazmy O2 i inkubowany z PLL oraz mPEG-SVA (kolor niebieski, oznaczone), aby spasywować powierzchnię podłoża do hodowli komórkowej. Po przemyciu podłoże zostaje odwrócone do góry dnem w kropelce fotoinicjatora (PLPP, kolor zielony, oznaczone) i poddane fotopatronowaniu UV z wykorzystaniem podejścia LIMAP. W tym etapie używana jest maska cyfrowa z zdefiniowanym przez użytkownika wzorem, aby usunąć warstwę pasywacyjną w określonych miejscach. Następnie można przeprowadzić inkubację z roztworem białka (kolor czerwony, oznaczone), który przyłączy się tylko do miejsc, w których usunięto warstwę pasywacyjną. Komórki wysiane na podłożu są poddawane zarówno wzorom geometrycznym, jak i białkowym, co umożliwia badanie zachowania komórek w złożonych środowiskach naśladujących warunki in vivo. Skróty: PDMS = polidimetylosiloksan; mPEG-SVA = metoksypolietylenglikol-sukcynimidylowy walerianian; PLPP = chlorek 4-benzoilbenzylo-trimetyloamoniowy; LIMAP = indukowana światłem molekularna adsorpcja białek. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63988/63988fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Schemat procesu mikrowytwarzania; forma szklana, chip PDMS, chip do hodowli komórkowej do użytku laboratoryjnego." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63988/63988fig02.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2: Różne etapy produkcji i pasywacji podłoża do 3D hodowli komórkowej. Negatywowa forma szklana (#1) została zaprojektowana w programie wspomaganego projektowania komputerowego (CAD) i wykonana przy użyciu techniki bezpośredniego zapisu laserem femtosekundowym. Forma ta służy do wytworzenia pośredniego pozytywowego chipa PDMS (#2) oraz negatywowej formy PDMS (#3), które są następnie wykorzystywane do produkcji końcowego chipa do hodowli komórkowej (#4). Skrót: PDMS = polidimetylosiloksan. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63988/63988fig02large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Schemat fotolitografii UV: podłoże, laser UV, płaszczyzny ogniskowania, wyniki wzorowania, tworzenie struktury 3D." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63988/63988fig03.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3: Schematyczny rysunek dwóch metod wzorowania. Po lewej: fotolitografia UV jest wykonywana dla mniejszych elementów (około jednego DMD) przy użyciu pojedynczej płaszczyzny ogniskowania i wzoru. W rezultacie cały element zostaje ukształtowany w jednym kroku. Po prawej: w przypadku zastosowania większych elementów (większych niż jeden DMD), proces wzorowania jest podzielony na wiele płaszczyzn ogniskowania i wzorów. Skrót: DMD = cyfrowe urządzenie lustrzane (digital mirror device). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63988/63988fig03large.jpg" target="_blank">Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Analiza wzoru koncentrycznego w mikroskopii; porównanie stanów normalnego i wysuszonego; widoki XY, XZ." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63988/63988fig04.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rycina 4"> 
Rycina 4: Typowy przykład normalnego i wysuszonego podłoża inkubowanego z białkiem. Projekcje maksymalnej intensywności (XY) oraz widoki ortogonalne (XZ) normalnego i wysuszonego podłoża inkubowanego z białkiem. Podczas płukania wzorowanego podłoża do hodowli komórek po inkubacji z roztworem białka kluczowe jest, aby próbka zawsze pozostała mokra. Chociaż wzór na elementach jest identyczny na wszystkich obrazach (ĸ = 1/1,000 µm-1), żelatyna-flurorescyna (zielona) zagregowała się, tworząc dużą grudkę, gdy próbka została pozostawiona do wyschnięcia na kilka sekund. Jeśli próbka pozostaje stale mokra, można zaobserwować prawidłowe wzory białkowe. Paski skali = 100 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63988/63988fig04large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Schemat kanałów mikroprzepływowych; strzałki wskazują analizę wzorców przepływu cieczy w mikroskopii z czerwonym filtrem." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63988/63988fig05.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rycina 5"> 
Rycina 5: Obrazy w polu jasnym po wysianiu. Pierwotne keratocyty (lewo) i fibroblasty skóry właściwej (prawo) 4 h po wysianiu na trójwymiarowe struktury geometryczne (wklęsłe zagłębienie o ĸ = 1/1,000 µm-1 oraz półcylindry o ĸ = 1/500, 1/375, 1/250, 1/175 i 1/125 µm-1). Wstawki w lewym górnym rogu przedstawiają wzór liniowy użyty do formowania geometrii. Białe strzałki wskazują rozprzestrzeniające się komórki, które wykazują już orientację. Paski skali = 250 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63988/63988fig05large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Wzory koncentrycznych pierścieni w mikroskopii fluorescencyjnej; wykres intensywności; wartości κ: 1/250, 1/1,000, 1/3,750 μm⁻¹." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63988/63988fig06.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rycina 6"> 
Rycina 6: Charakterystyka wzorów kolistych na wklęsłych wgłębieniach. (A) Projekcja maksymalnej intensywności (XY) oraz widok ortogonalny (XZ) wklęsłego wgłębienia (ĸ = 1/250 µm-1) ustrukturyzowanego za pomocą LIMAP (szerokość linii: 20 µm, szerokość przerwy: 20 µm) i inkubowanego z żelatyną-fluoresceiną (zielony). Profil intensywności wzdłuż białej linii przedstawiono w funkcji odległości, co wykazuje spójną jakość i rozdzielczość wzoru. (B) Dodatkowe ustrukturyzowanie wykonane na wklęsłych wgłębieniach z ĸ = 1/1,000 µm-1 oraz ĸ = 1/3750 µm-1, wykazujące elastyczność w zakresie cech geometrycznych, które mogą być wykorzystane do ustrukturyzowania. Ponownie zwizualizowano zarówno projekcje maksymalnej intensywności (XY), jak i widoki ortogonalne (XZ). Paski skali = 100 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63988/63988fig06large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Mikroskopia fluorescencyjna 3D fibronektyny i F-aktyny w macierzy komórkowej do analizy strukturalnej." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63988/63988fig07.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rycina 7"> 
Rycina 7: Dane z mikroskopii 3D struktur wzorcowanych. Typowe przykłady materiałów do hodowli komórkowej z wzorowaniem 3D po fotowzorcowaniu i hodowli komórek, wizualizowane za pomocą oprogramowania do renderowania 3D. (A) Wypukły półcylinder z naniesionymi liniami o szerokości 10 µm (rodamina-fibronektyna, czerwony) i przerwami o szerokości 10 µm. Pasek skali = 5 µm. (B) Fibroblasty skóry właściwej barwione na F-aktynę (zielony), hodowane na wklęsłym półcylindrze z naniesionymi liniami o szerokości 20 µm (rodamina-fibronektyna, czerwony) i przerwami o szerokości 20 µm. Pasek skali = 5 µm. (C) Powierzchnia siodłowata z naniesionymi liniami o szerokości 20 µm (rodamina-fibronektyna, czerwony) i przerwami o szerokości 20 µm. Pasek skali = 5 µm. (D) Wklęsły dołek z naniesionymi koncentrycznymi okręgami linii o szerokości 20 µm (żelatyna-fluoresceina, zielony) i przerwami o szerokości 20 µm. Cytoszkielet F-aktynowy ludzkich keratocytów został zabarwiony faloidyną i zwizualizowany na czerwono. Pasek skali = 200 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63988/63988fig07large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Mikroskopia konfokalna adhezji komórek do fibronektyny; nałożenie kanałów dla F-aktyny, jądra i winkuliny." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63988/63988fig08.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rycina 8"> 
Rycina 8: Barwienie immunofluorescencyjne ludzkich fibroblastów skórnych na fotowzorowanym, wklęsłym półcylindrze. (A) Projekcja maksymalnej intensywności (XY) i przekroje ortogonalne (XZ i YZ) ludzkich fibroblastów skórnych hodowanych przez 24 h na wzorowanym (linie fibronektyny, czerwone, szerokość 5 µm i przerwy 5 µm) wklęsłym półcylindrze. Komórki zostały zabarwione na F-aktynę (magenta), winkulinę (zielony) i jądra (niebieski). Pasek skali = 100 µm. (B) Powiększenie komórki przylegającej do środowiska wielostymulującego. Paski skali = 50 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63988/63988fig08large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Mikroskopia poklatkowa przedstawiająca migrację komórek w biofilmie w ciągu 3180 min, seria mikrografii." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63988/63988fig09.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rycina 9"> 
Rycina 9: Obrazy poklatkowe w polu jasnym ludzkich fibroblastów skóry na wzorowanym, wklęsłym cylindrze. Wklęsły półcylinder (ĸ = 1/250 µm-1) został wzorowany równoległymi liniami (szerokość 5 µm i odstępy 5 µm) i inkubowany z rodaminą-fibronektyną przed wysianiem komórek. Obrazowanie poklatkowe rozpoczęto 1 h po wstępnym wysianiu komórek (lewo, 0 min), gdy komórki były jeszcze zaokrąglone i nieprzylegały (strzałki). Po około 24 h (środek, 1 420 min) komórki przyległy do podłoża wielostymulującego i wykazują reakcję ustawienia zgodnie ze wzorem prowadzenia kontaktowego. Zarówno reakcja ustawienia, jak i żywotność komórek są utrzymywane przez cały czas trwania hodowli (prawo, 3 180 min). Paski skali = 200 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63988/63988fig09large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny.</a>
Wideo 1: Przykład wzoru na cylindrycznym podłożu 3D. Reprezentacja 3D wypukłego cylindra z naniesionym wzorem z rodaminy-fibronektyny (czerwony). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63988/Video%201.zip" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać to wideo.</a>
Wideo 2: Reprezentacja 3D fibroblastów skórnych hodowanych na wzorcowanym, cylindrycznym podłożu 3D (ĸ = 1/500 µm-1). Fibroblasty skórne hodowane przez 24 h na wypukłym półcylindrze z naniesionym wzorem (linie z fibronektyny, czerwone, szerokość 10 µm, przerwy 10 µm). Komórki barwione na F-aktynę (magenta), winukulinę (zielony) oraz jądra komórkowe (niebieski). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63988/Video%202.zip" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać to wideo.</a>
Wideo 3: Reprezentacja 3D ludzkich keratocytów hodowanych w ustrukturyzowanym zagłębieniu 3D (ĸ = 1/3,750 µm-1). Reprezentacja 3D ludzkich keratocytów hodowanych przez 24 h w wklęsłym, ustrukturyzowanym zagłębieniu (kółka żelatynowe, zielone, o szerokości 20 µm, oraz przerwy 20 µm). Komórki zabarwiono na F-aktynę (czerwony). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63988/Video%203.zip" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać to wideo.</a>
Wideo 4: Obrazowanie timelapse w świetle białym ludzkich fibroblastów skóry na wzorcowanym, wklęsłym cylindrze. Wklęsły półcylinder (ĸ = 1/250 µm-1) został wzorcowany równoległymi liniami (szerokość 5 µm i przerwy 5 µm) i inkubowany z rodaminą-fibronektyną przed wysianiem komórek. Obrazowanie timelapse rozpoczęto 1 h po wstępnym wysianiu komórek, gdy wykazały one początkową adhezję do środowiska wielostymulującego. Podczas całego procesu timelapse komórki orientowały się głównie wzdłuż wskazówek przewodnictwa kontaktowego, przy zachowaniu żywotności komórek. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63988/Video%204.zip" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać to wideo.</a>

Tradycyjnie, hodowla komórkowa jest przeprowadzana na płaskich podłożach, które słabo naśladują naturalne środowisko komórek in vivo. W tym miejscu opisujemy metodę wytwarzania substratów do hodowli komórkowych o fizjologicznie istotnych zakrzywionych geometriach i mikrowzorach białek zewnątrzkomórkowych, co pozwala na systematyczne badania nad komórkowym wykrywaniem tych zewnątrzkomórkowych sygnałów.

Generowanie wielokierunkowych mikrośrodowisk komórkowych za pomocą fotomodelingu UV trójwymiarowych substratów do hodowli komórkowych

The extracellular matrix is an important regulator of cell function. Environmental cues existing in the cellular microenvironment, such as ligand ...

Wpływ czynników mikrośrodowiskowych na zachowanie komórek jest często badany przy użyciu nadmiernie uproszczonych platform in vitro, które izolują pojedyncze sygnały. Nasze podejście tworzy substraty do hodowli komórkowych, które łączą wiele z tych wskazówek. Podejście to jest bardzo wszechstronne i umożliwia systematyczne badanie z wykorzystaniem szerokiej gamy materiałów do hodowli komórkowych, wzorców naprowadzania kontaktowego, odczytów komórkowych i białek.Procedura zostanie zademonstrowana przez dwóch kandydatów PSE z naszego laboratorium. CAS VAN DER PUTTEN i MIRKO D'URSO Po pierwsze, stwórz szklaną formę negatywową za pomocą techniki lasera femtosekundowego bezpośrednio w prawo, zawierającą wszystkie interesujące Cię cechy. Następnie ostrożnie umieść szklaną formę negatywową na dnie szalki Petriego i wlej prepolimer polidimetylosiloksanu na wierzch formy ze szkła ujemnego, aby całkowicie ją przykryć.Umieść tę szalkę Petriego w eksykatorze próżniowym i uruchom pompę próżniową. Po osiągnięciu próżni odczekaj 5 minut, aby usunąć wszystkie pęcherzyki obecne na granicy między powierzchnią formy a prepolimerem polidimetylosiloksanu. Utwardź prepolimer PDMS przez noc w piekarniku w temperaturze 65 stopni Celsjusza.Po utwardzeniu użyj szpatułki, aby podnieść krawędzie PDMS. Wyjmij nowo utwardzony dodatni chip PDMS z ujemnej formy szklanej, a jeśli dodatni chip PDMS ma tendencję do przyklejania się do ujemnej szklanej formy, dodaj etanol lub wodę do krawędzi odcisku podczas podnoszenia. Następnie umieść dodatni chip polidimetylosiloksanu w eksykatorze obok małej fiolki z kroplą środka silanizacyjnego i pozostaw chip pod próżnią na noc.Wlej prepolimer PDMS do ujemnej formy PDMS, aby wytworzyć wiele chipów hodowli komórkowych o grubości 5 milimetrów. Następnie usuń pęcherzyki za pomocą eksykatora i utwardź przez trzy godziny w temperaturze 65 stopni Celsjusza. Użyj żyletki, aby przyciąć wióry do ostatecznego rozmiaru i przechowywać je w temperaturze pokojowej Aby pasywować podłoże za pomocą pęsety, umieść wiór w koszu plazmowego Ashera.Następnie użyj plazmy tlenowej, aby aktywować grupy hydroksylowe na powierzchni chipa i odpowietrzyć komorę popielnictwa za pomocą azotu. Wyjmij chips z kosza i umieść go w małym pojemniku z polidimetylosiloksanu. Teraz użyj pipety Pasteura, aby dodać 500 mikrolitrów poli-L-lizyny na wierzch chipa, aby całkowicie zanurzyć powierzchnię w roztworze i inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej.Następnie usuń 450 mikrolitrów poli-L-lizyny z chipa hodowli komórkowej za pomocą pipety. Następnie przepłucz powierzchnię chipa 500 mikrolitrami 0,1-molowego buforu HEPES. Utrzymuj końcową jakość wzoru, pozostawiając niewielką objętość płynu na chipie polidimetylosiloksanu, aby zapobiec wysuszeniu próbki.Tuż przed użyciem przygotuj 500 mikrolitrów 50 miligramów na mililitr roztworu walerianianu metoksypolietylenowo-glikozowego cyjanamidu w buforze 0,1 molowym na chip do hodowli komórkowej i inkubuj w nim próbkę przez 60 minut. Za pomocą mikropipety usuń 450 mikrolitrów roztworu walerianianu cyjanamidu z polietylenu etylenu. Umyj powierzchnię wióra pięciokrotnie za pomocą PBS, pipetując do wewnątrz i na zewnątrz.Aby usunąć wszystkie niepowiązane mPEG-SVA. Umieść szklane szkiełko z fluorescencyjnym zakreślaczem w torze optycznym mikroskopu. Przełącz się w tryb fluorescencyjny w mikroskopie i ostrożnie ustaw ostrość obrazu primo, upewniając się, że zarówno logo, jak i tekst są ostre.Kliknij dalej, aby wyświetlić dane kalibracji i wzór, aby zakończyć procedurę kalibracji. Zapisz położenie Z stolika podczas kalibracji i użyj tego położenia jako odniesienia w dalszej części protokołu. Po zdjęciu szkiełka kalibracyjnego ze stolika należy umieścić na stoliku szkiełko podstawowe zawierające kroplę fotoinicjatora i umieścić substrat do hodowli komórkowej PDMS do góry nogami, w kropli fotoinicjatora.Upewnij się, że cechy 3D na powierzchni podłoża do hodowli komórkowej są skierowane w stronę szkiełka i są całkowicie zanurzone w inicjatorze fotograficznym, aby zapewnić prawidłowe wzory. Skoncentruj się odpowiednio na górze lub na dole wypukłych lub wklęsłych struktur i skup się na obszarze chipa we właściwym miejscu, zgodnie z opisem w manuskrypcie. Dostosuj ustawienia wzoru zgodnie z funkcją i wybierz dawkę 1000 milidżuli na mililitr.Kliknij przycisk odtwarzania w prawym dolnym rogu ekranu, aby rozpocząć tworzenie wzoru. Po zakończeniu obserwuj wzór wyświetlany na zielono. Za pomocą mikropipety dodaj dwa mililitry PBS do fiolki zawierającej 20 mikrogramów fibronektyny znakowanej rodaminą, aby uzyskać stężenie 10 mikrogramów na mililitr.Delikatnie odpipetować, aby uniknąć grudek białka i chronić przed światłem. Za pomocą mikropipety dodaj od 200 do 500 mikrolitrów roztworu białkowego do chipa do hodowli komórkowej. Dostosuj czas inkubacji i temperaturę w zależności od wybranego białka i upewnij się, że próbka jest pokryta.Usuń roztwór białkowy i umyj chip pięć razy 500 mikrolitrami sterylnego PBS. Upewnij się, że pipetujesz PBS w górę i w dół wiele razy powyżej wszystkich istotnych cech chipa do hodowli komórkowej, aby usunąć wszelkie niezwiązane białka. Po przygotowaniu zawiesiny komórek usuń PBS i dodaj 1 mililitr zawiesiny komórek do chipa.Następnie inkubuj go przez 60 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Sprawdź przyczepność komórek do chipa hodowli komórek wzorcowych pod mikroskopem jasnego pola. Szukaj wydłużonych morfologii komórek w przypadku wzorów linii.A jeśli komórki zaczęły przylegać poza wzorzystym obszarem, usuń je, pipetując pożywkę w górę iw dół bezpośrednio nad komórkami na podłożu. Po zabarwieniu umieść wybarwioną próbkę do góry nogami w kropli PBS na szkiełku podstawowym na szkiełku podstawowym. Następnie, w zależności od wymaganego poziomu szczegółowości, wykonaj stosy Z z odpowiednim obiektywem i odstępami Z, aby zapewnić prawidłową akwizycję obrazu.Utwórz render 3D stosu Z za pomocą oprogramowania do renderowania 3D. Wklęsły dół został ukształtowany przy użyciu indukowanej światłem absorpcji molekularnej białek, a projekcja maksymalnej intensywności i widok ortogonalny zostały zwizualizowane. Profil intensywności wykazywał wysoką rozdzielczość wzorca, ostre przejścia między obszarami wzorzystymi i niewzorzystymi oraz stałą intensywność białka.Wzorowanie przy użyciu metody pojedynczej płaszczyzny ogniskowej oraz dwóch i trzech płaszczyzn ogniskowych wykazało idealne wyrównanie wzorów na wierzchu cech. Półcylindry wklęsłe, półcylindry wypukłe, powierzchnia siodła i PID zostały ukształtowane za pomocą linii lub koncentrycznych okręgów o różnych szerokościach. Afekt wewnątrz szkieletu ludzkich keratocytów jest barwiony za pomocą folidenu i wizualizowany.Fibroblasty skóry wyhodowano na wzorzystym wklęsłym półcylindrze i uwidoczniono. Komórki wyczuwały i przylegały do substratu hodowli komórkowej z wieloma wskazówkami i pozostawały żywotne w czasie, jak uwidoczniono za pomocą F-aktyny, winkuliny i jąder. Ponadto komórki tworzyły zrosty ogniskowe głównie na liniach fibronektyny.Ludzkie fibroblasty skórne hodowane na wzorzystym wklęsłym cylindrze w obecności fibronektyny rodaminy przylegały do podłoża multi cue i wykazywały reakcję wyrównania, zgodnie ze wzorcem prowadzenia kontaktu. Odpowiedź na wyrównanie i żywotność komórek są utrzymywane przez cały czas trwania hodowli. Najważniejszą rzeczą podczas wykonywania tego protokołu jest zapobieganie wysychaniu powierzchni chipa hodowli komórkowej.Stosowanie różnych materiałów podłoża, powłok białkowych i typów komórek może wymagać dodatkowej optymalizacji. Dostarczanie wielu wskazówek środowiskowych w 3D może otworzyć nowe możliwości sterowania organizacją komórkową w złożonych tkankach inżynieryjnych.

generation-multicue-cellular-microenvironments-uv-photopatterning

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Wodne systemy dwufazowe były używane do jednoczesnego modelowania wielu populacji komórek. Ta szybka i łatwa metoda modelowania komórek wykorzystuje separację faz wodnych roztworów dekstranu i glikolu polietylenowego oraz napięcie międzyfazowe, które istnieje między tymi dwoma roztworami polimerów.

Modelowanie kohodowli komórkowych przy użyciu wodnych systemów dwufazowych

Opisujemy protokół modyfikacji powinowactwa komórek powierzchni rusztowania w środowisku wodnym. Metoda wykorzystuje fotokatalizę dwutlenku tytanu do rozkładu filmu organicznego w obszarze napromieniowanym światłem. Pokazujemy, że można go wykorzystać do tworzenia mikrodomen białek rusztowań, zarówno ex situ, jak i in situ.

Fotowzorcowanie białek i komórek w środowisku wodnym za pomocą fotokatalizy TiO2

Poniższy protokół opisuje procedurę składania kultur podobnych do kanapek, które mają być używane jako etap pośredni między dwuwymiarowymi (2D) i trójwymiarowymi (3D) środowiskami komórkowymi. Opracowane systemy mogą znaleźć zastosowanie w badaniach mikroskopii, biomechaniki, biochemii i biologii komórki.

Mikrośrodowiska przypominające kanapki w celu wykorzystania interakcji między komórkami a materiałami

Ludzkie pluripotencjalne komórki macierzyste (hPSC) mają wrodzoną zdolność do różnicowania się i samoorganizacji w odrębne wzorce tkankowe; chociaż wymaga to prezentacji przestrzennych gradientów środowiskowych. Przedstawiamy mikrowzorce szablonowe jako prostą i solidną metodę generowania gradientów biochemicznych i mechanicznych w celu kontrolowania wzorców różnicowania hPSC.

Szablonowe mikrowzorce ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych do badania przestrzennej organizacji losów różnicowania

Opisujemy sekwencyjny proces tworzenia za pośrednictwem światła i późniejszego biochemicznego wzorcowania syntetycznych matryc hydrożelowych do zastosowań w trójwymiarowych hodowlach komórkowych. Przedstawiono budowę i modyfikację hydrożeli za pomocą cytokompatybilnej chemii photoclick. Ponadto przedstawiono łatwe techniki ilościowego określania i obserwacji wzorców oraz określania żywotności komórek w tych hydrożelach.

Tworzenie i modelowanie hydrożeli za pośrednictwem światła do zastosowań w hodowlach komórkowych

Ten artykuł opisuje szczegółową metodologię przygotowania matrycy Multiplexed Artificial Cellular MicroEnvironment (MACME) do wysokoprzepustowej manipulacji fizycznych i chemicznych sygnałów naśladujących mikrośrodowiska komórkowe in vivo oraz do identyfikacji optymalnego środowiska komórkowego dla ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych (hPSC) z profilowaniem pojedynczych komórek.

Wytwarzanie multipleksowanej sztucznej macierzy mikrośrodowiska komórkowego

Przedstawiamy procedurę kontrolowania początkowego kształtu klastra komórkowego w trójwymiarowej matrycy zewnątrzkomórkowej w celu uzyskania powtarzalnego formowania wzoru. Sześcienne urządzenie zawierające dwa różne hydrożele jest wykorzystywane do uzyskania wielokierunkowego obrazowania w celu tworzenia wzoru tkankowego.

Wstępna kontrola klastrów komórkowych 3D w hybrydowym urządzeniu do tworzenia sześcianów żelowych w celu tworzenia powtarzalnych wzorów

Przedstawiona tutaj metoda wykorzystuje mikrowzorce wraz z obrazowaniem ilościowym, aby ujawnić organizację przestrzenną w kulturach ssaków. Technika ta jest łatwa do wdrożenia w standardowym laboratorium biologii komórki i oferuje elastyczny system do badania wzorców in vitro.

Mapowanie wyłaniającej się organizacji przestrzennej komórek ssaków za pomocą mikrowzorców i obrazowania ilościowego

Ten protokół wprowadza metodę mikrowzorowania bez litografii, która jest prosta i dostępna dla osób z ograniczonym doświadczeniem w bioinżynierii. Metoda ta wykorzystuje spersonalizowane, wycinane laserowo szablony do mikromodelowania białek macierzy zewnątrzkomórkowej w kształcie interesującym do modulowania morfologii komórek. Procedura mikrowzorcowania została zademonstrowana przy użyciu indukowanych pluripotencjalnych kardiomiocytów pochodzących z komórek macierzystych.

Proste, wolne od litografii mikromodelowanie pojedynczych komórek przy użyciu szablonów wycinanych laserowo

Tutaj prezentujemy protokół do generowania trójwymiarowego, uproszczonego i niezróżnicowanego modelu skóry za pomocą mikroobrabianej platformy mikroprzepływowej. Podejście oparte na przepływie równoległym pozwala na osadzanie na miejscu komory skórnej w celu wysiewu komórek nabłonka na wierzchu, a wszystko to kontrolowane przez pompy strzykawkowe.

Generowanie uproszczonego trójwymiarowego modelu typu skin-on-a-chip w mikroobrabianej platformie mikroprzepływowej

Przedstawiony tutaj protokół umożliwia zautomatyzowane wytwarzanie mikrowzorów, które standaryzują kształt komórki, do badania struktur cytoszkieletu w komórkach ssaków. Ta przyjazna dla użytkownika technika może być skonfigurowana z dostępnymi na rynku systemami obrazowania i nie wymaga specjalistycznego sprzętu niedostępnego dla standardowych laboratoriów biologii komórki.

Kontrola geometrii komórki za pomocą mikromodelowania wspomaganego laserem w podczerwieni

Poznaj metodę tworzenia wielokierunkowych mikrośrodowisk komórkowych przy użyciu fotomodelingu UV trójwymiarowych substratów PDMS. Technika ta umożliwia systematyczne badanie odpowiedzi komórek na sygnały zewnątrzkomórkowe.

Generowanie wielokierunkowych mikrośrodowisk komórkowych za pomocą fotomodelingu UV trójwymiarowych substratów do hodowli komórkowych (Wideo) | JoVE Journal

Generowanie wielokierunkowych mikrośrodowisk komórkowych za pomocą fotomodelingu UV trójwymiarowych substratów do hodowli komórkowych

Przeglądaj więcej filmów