Generowanie wzorców dla mikroskopii trakcyjnej mikrowzorców

Protokół ten pozwala na konsekwentne tworzenie mikrowzorców białek o wysokiej wierności o dowolnym pożądanym kształcie, w szczególności izolowanych wysp wzorca do badania klastrów komórkowych. Technika ta może być wykorzystana do wykonania izolowanych mikrowzorów wyspowych o dowolnym kształcie i rozmiarze w jednym kroku, podczas gdy wcześniej wykonanie takich wzorów wymagało dwóch oddzielnych kroków. Zacznij od wymieszania PDMS w odpowiednim stosunku utwardzacza do zasady, zgodnie z opisem w instrukcjach producenta.

Inkubować w temperaturze i ciśnieniu pokojowym przez 15 minut, a następnie odgazowywać mieszaninę w próżni przez 15 minut. Wlej PDMS do formy głównej i przenieś go do inkubatora ustawionego na 37 stopni Celsjusza, aby utwardził się przez noc. Wyjmij formę wzorcową z inkubatora i pozwól jej ostygnąć do temperatury pokojowej.

Podczas gdy forma wzorcowa stygnie, sonikować 25-milimetrowe szkiełka nakrywkowe w etanolu przez 10 minut. Użyj tylu szkiełek nakrywkowych, ile jest przygotowywanych stempli. Dokładnie spłucz szkiełka nakrywkowe wodą DI i wysusz je za pomocą pistoletu z filtrowanym powietrzem.

Szkiełka nakrywkowe należy traktować plazmą przez jedną minutę za pomocą środka do czyszczenia plazmowego pod wysoką próżnią. Po zabiegu powoli zwolnij próżnię, aby zapobiec przemieszczaniu się szkiełek nakrywkowych wewnątrz komory. Pokryj każde szkiełko nakrywkowe 100 mikrolitrami znakowanego fluorescencyjnie roztworu białka w pomieszczeniu pozbawionym bezpośredniego światła słonecznego lub górnego oświetlenia.

Przykryj próbki dla dodatkowej ochrony przed światłem i inkubuj je przez 20 minut w temperaturze pokojowej. Dokładnie spłucz każde szkiełko nakrywkowe wodą DI. Usuń nadmiar wody z powierzchni, delikatnie stukając bokami każdego szkiełka nakrywkowego o ręcznik papierowy lub podobny materiał chłonny.

Pozostaw szkiełka nakrywkowe do całkowitego wyschnięcia, pozostawiając je odkryte w ciemności na co najmniej 30 minut. Gdy szkiełka nakrywkowe pokryte białkiem wyschną, usuń stempel PDMS z formy głównej, przecinając go skalpelem lub dowolnym ostrym ostrzem. Traktuj stemple PDMS plazmą przez dwie minuty w wysokiej próżni.

Umieść znaczki w pojemniku z pokrywką pod wyciągiem, a następnie pokryj każdy stempel cienką warstwą 10%3-APTMS rozcieńczonego w 100% etanolu. Przykryj pojemnik stemplami i inkubuj w temperaturze pokojowej przez pięć minut. Dokładnie spłucz każdy stempel z obu stron wodą DI.

Umieść stemple w czystym pojemniku i pokryj je 2,5% aldehydem glutarowym przygotowanym w wodzie DI. Przykryj stemple i inkubuj je w temperaturze pokojowej przez 30 minut. Dokładnie spłucz stemple wodą DI.

Usuń nadmiar wody z powierzchni zgodnie z wcześniejszym opisem i pozostaw stempele do wyschnięcia bez przykrycia przez 30 minut. Jeśli po 30 minutach pokryte białkiem szkiełka nakrywkowe lub stemple nie są całkowicie suche, użyj pistoletu na przefiltrowane powietrze, aby całkowicie je wysuszyć. Dociśnij stronę wzoru stempli do szkiełek nakrywkowych z wystarczającym naciskiem, aby się całkowicie zetknęły.

Pozostaw w spokoju na 15 minut. Następnie ostrożnie odklej stemple PDMS od szkiełek nakrywkowych. Za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego z odpowiednim filtrem sprawdź wierność wzorzystych szkiełek nakrywkowych.

Wzorzyste szkiełka nakrywkowe należy użyć natychmiast lub przechowywać je z dala od bezpośredniego światła do czasu dalszego użycia. Przed przygotowaniem prekursora hydrożelu PAA należy wyjąć z lodówki ester NHS kwasu akrylowego, aby osiągnął temperaturę pokojową przed otwarciem. Przygotuj wymienny zestaw naczyń nakrywkowych, sterylizując je 70% etanolem, a następnie inkubuj go w świetle UV w komorze bezpieczeństwa biologicznego przez co najmniej 30 minut przed użyciem.

Pod wyciągiem dodaj 1,25 mililitra 40% akrylamidu przygotowanego w wodzie DI do 15-mililitrowej stożkowej rurki. Do tej samej probówki dodaj 175 mikrolitrów roztworu bis-akrylamidu przygotowanego w wodzie DI. Następnie dodaj 500 mikrolitrów 10X PBS, a następnie 2,915 mililitra wody DI.

Odpipetuj 969 mikrolitrów tego prekursora do 1,5 mililitrowej probówki wirówkowej, a resztę przechowuj w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez okres do dwóch tygodni. Odmierz od 50 do 100 miligramów APS w świeżej probówce do mikrowirówek i rozcieńcz ją do 100 miligramów na mililitr w wodzie DI. Otwórz ester NHS w kapturze i ostrożnie odmierz do trzech miligramów NHS w probówce do mikrowirówki.

Rozcieńczyć ester NHS do jednego miligrama na mililitr w 1X PBS. Pod wyciągiem dodać dwa mikrolitry TEMED do probówki mikrowirówki zawierającej 969 mikrolitrów podwielokrotności prekursora PAA. Dodaj 15 mikrolitrów jednego molowego HCL, aby obniżyć pH roztworu hydrożelu i uniknąć hydrolizy estru NHS.

Dodaj 10 mikrolitrów roztworu estru NHS do probówki. Wykonaj następujące czynności w komorze bezpieczeństwa biologicznego. Ostrożnie umieść 30-milimetrowe szkiełko nakrywkowe w środkowej części zestawu nakrywek z 3-APTMS i aldehydem glutarowym stroną do góry i przykręć plastikowy pierścień na górze.

Ustaw wzorzyste szkiełko nakrywkowe przy minimalnym naświetleniu, aby przygotować się do następnego kroku. Odpipetować pięć mikrolitrów roztworu APS do probówki z podwielokrotnym prekursorem PAA, a następnie odwrócić i wymieszać. Natychmiast odpipetować 35 mikrolitrów tego roztworu na 30-milimetrowe szkiełko nakrywkowe.

Umieść wzorzyste szkiełko nakrywkowe na roztworze stroną z białkiem do dołu. Należy uważać, aby w hydrożelu nie tworzyć pęcherzyków powietrza. Chronić hydrożel przed światłem i pozostawić do polimeryzacji przez 90 minut.

Po polimeryzacji hydrożelu użyj żyletki lub skalpela, aby usunąć górne szkiełko nakrywkowe, upewnij się, że szkiełko nakrywkowe nie opada do tyłu ani nie zsuwa się z żelu po usunięciu, aby uniknąć zniszczenia wzoru na powierzchni żelu. Aby pasywować pozostały ester NHS w hydrożelu, dodaj dwa mililitry sterylnego PBS do żelu i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 45 minut. Żele należy natychmiast przygotować do eksperymentów lub przechowywać je przez noc w sterylnym PBS w temperaturze czterech stopni Celsjusza do czasu dalszego użycia.

Hydrożele zostały pośrednio modelowane za pomocą fluorescencyjnej fibronektyny w celu wizualizacji i pomiaru komórkowych sił trakcyjnych w klastrach oraz stworzenia wzorów wyspowych o z góry określonym rozmiarze i kształcie. Jakość wzoru była bezpośrednio związana z wiernością formy wzorcowej, z której odlano stempel PDMS. Metoda ta może wytworzyć izolowane, dobrze zdefiniowane wzory wysp o z góry określonym kształcie.

Kropki adhezyjne fibronektyny były obecne tylko w pożądanym obszarze wyspy. Te izolowane wyspy punktów adhezyjnych dodatkowo pozwoliły na lepszą kontrolę kształtu gromady. Powlekanie stempli PDMS dwoma małymi 3-APTMS ma kluczowe znaczenie, ponieważ ograniczy skuteczność metody usuwania, podczas gdy zbyt duża ilość stworzy pomarańczowy osad na powierzchni stempla.

Utworzone w ten sposób wzorce można wykorzystać do określenia komórkowych sił trakcyjnych zarówno w pojedynczych komórkach, jak i klastrach, co daje wgląd w ich zdolność do utrzymania homeostazy mechanicznej.