Name: Protokół analizy replikacji wirusa zapalenia wątroby typu C (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-06-26T13:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 4 s
Description: Poznaj protokół analizy replikacji wirusa zapalenia wątroby typu C. Metoda obejmuje generowanie RNA genomowego HCV, transfekcję komórek i pomiar miana wirusowego. Technika umożliwia badanie cyklu replikacji HCV w systemie hodowli komórkowej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dziękujemy F. Chisari za dostarczenie linii komórkowej Huh-7.5.1. Chcielibyśmy podziękować Justine Ho za redakcję manuskryptu. Praca ta była wspierana przez Cedars-Sinai Medical Center Institutional Programmatic Research Award oraz National Center for Advancing Translational Sciences, Grant UL1TR000124 dla V.A.

Ogólny zarys protokołu jest zilustrowany na rysunku 1.
1. Komórki
<ol>
	<li>Przygotuj kompletną pożywkę wzrostową, która zawiera 10-15% płodowej surowicy bydlęcej (FBS), 10 mM aminokwasów endogennych, 10 mM Hepes, penicylinę (100 jednostek/ml), streptomycynę (100 mg/ml) i 2 mM L-glutaminę.</li>
	<li>Utrzymuj komórki Huh-7.5.113 w kompletnej pożywce wzrostowej zawierającej powyższe suplementy do analizy in vitro cyklu replikacji wirusa zapalenia wątroby typu C.</li>
	<li>Hodowla szczepów wirusa w komórkach Huh-7.5.1 z określoną uzupełnioną pożywką wzrostową w temperaturze 37 °C z 5% CO2 .</li>
</ol>
2. Konstrukty wirusów i plazmidów
<ol>
	<li>Wygeneruj komplementarną formę DNA (cDNA) RNA HCV i sklonuj ją do wektora plazmidowego, aby ułatwić manipulację genetyczną. Uwaga: Odkrycie izolatu japońskiego piorunującego wirusa zapalenia wątroby typu 1, JFH-1 (genotyp 2a HCV), miało kluczowe znaczenie dla badań nad HCV i jest wykorzystywane przede wszystkim do badania cyklu replikacji HCV11-13. Między- i intragenotypowe wirusy chimeryczne na bazie JFH-1 HCV są powszechnie stosowane w badaniach14-18. Budowa syntetycznego wirusa chimerycznego intragenotypu 2a, FNX-HCV oraz monocistronicznego chimerycznego szczepu reporterowego została opisana wcześniej19, a szczegóły budowy wykraczają poza zakres tego protokołu.</li>
	<li>Należy użyć wirusa pFNX-HCV intragenotypu 2a, ponieważ zawiera on 5'NTR, regiony strukturalne i p7 oraz część regionów niestrukturalnych NS2 (nukleotydy od 1 do 2878) szczepu rodzicielskiego J6CF (nr dostępu do NCBI. AF177036), a także niestrukturalne składniki szczepu wirusa JFH-1 (nr przystąpienia do NCBI). AB047639). Uwaga: FNX-HCV zsyntetyzowano na podstawie sekwencji chimerycznego HCV Jc1 intragenotypu 2a opisanej wcześniej15.</li>
	<li>Wygeneruj monocistroniczny chimeryczny konstrukt wirusa reporterowego, pFNX-Rluc, oparty na szczepie pFNX-HCV (powyżej w kroku 2.2) poprzez wstawienie genu lucyferazy Renilla między 5' NTR a gen rdzeniowy (między nt 388 i 389). Następnie połącz gen lucyferazy i gen rdzeniowy tego konstruktu za pomocą sekwencji peptydowej wirusa pryszczycy 2A (F2A), która działałaby jako sygnał rozszczepienia.</li>
	<li>Inżynieria konstruktu wirusa RNA-polimeraza zerowa (Pol-) przy użyciu tła wirusa pFNX-HCV lub pFNX-Rluc. Zastąp reszty katalityczne polimerazy NS5B, GDD (aa 2759-2761; nt 8615-8623) któregokolwiek z tych szkieletów wirusowych resztami aminokwasowymi AAG.</li>
</ol>
3. Transkrypcja RNA HCV in vitro
<ol>
	<li>Do oceny replikacji wirusa wirusa należy użyć chimerycznego wirusa FNX-HCV i FNX-HCV Pol null (Pol-) HCV (Figura 2A).</li>
	<li>Zlinearyzuj plazmidy wirusa enzymem restrykcyjnym XbaI, a następnie potraktuj nukleazą fasoli mung, aby uzyskać końce. Oczyść strawione plazmidy za pomocą chromatografii anionowymiennej. Sprawdź integralność zlinearyzowanego plazmidu, poddając DNA elektroforezie w żelu agarozowym (Figura 2B).</li>
	<li>Transkrybuj zlinearyzowane plazmidy wirusowe za pomocą polimerazy T7-RNA.</li>
	<li>Oczyść nowo zsyntetyzowane RNA poddane działaniu DNazy za pomocą zestawu do oczyszczania RNA.</li>
	<li>Sprawdź produkcję RNA za pomocą elektroforezy w żelu agarozowym (ryc. 2C).</li>
	<li>Określić ilościowo RNA za pomocą spektrofotometrii.</li>
	<li>Powstały RNA należy przechowywać w temperaturze -80 °C w podwielokrotnościach roboczych o wielkości 10 μg. Uwaga: Aby zminimalizować różnice w jakości RNA w każdym projekcie eksperymentalnym, poprzez transkrypcję całego RNA dla każdej próbki wirusa i kontroli w tym samym czasie.</li>
</ol>
4. Transfekcja RNA HCV i pobieranie próbek
<ol>
	<li>Zbierz komórki Huh-7.5.1 za pomocą trypsyny.</li>
	<li>Aby przepłukać komórki, należy odwirować i ponownie zawiesić zawiesinę dwukrotnie zimną pożywką o niskiej surowicy. Zawiesić komórki w pożywce o niskim stężeniu 1 x 107komórek na ml.</li>
	<li>Wymieszaj łącznie 10 μg transkrybowanego wirusowego RNA z 400 μl ponownie zawieszonych komórek (4 x 106 komórek) w 0,4-centymetrowej kuwecie do elektroporacji. Transfekcja ogniw za pomocą elektroporacji przy napięciu 270 V, 100 Ω i 950 μF.</li>
	<li>Ponownie zawiesić elektroporowane ogniwa w 10 ml kompletnej pożywce wzrostowej z 15% FBS. Uwaga: Zwiększoną przeżywalność komórek poddanych elektroporacji obserwuje się, gdy komórki Huh-7.5.1 były hodowane w 15% płodowej surowicy bydlęcej.</li>
	<li>Umieść komórki w obu kolbach T-25 (~1,2 x 106 komórek na kolbę), jak i na płytkach 48-dołkowych (1 x 104 komórki na dołek) dla każdego z następujących punktów czasowych: 4, 48 i 96 godzin.</li>
	<li>Zastąp pożywkę po 4-8 godzinach od transfekcji świeżą uzupełnioną pożywką wzrostową z 10% FBS, aby usunąć martwe resztki komórek z kolb i płytek hodowlanych.</li>
	<li>Zebrać supernatanty do hodowli komórkowych w 48, 96 godzinach i usunąć resztki komórkowe z pobranych próbek przez odwirowanie komórek z prędkością 1 500 obr./min przez 10 minut w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Przechowywać bezkomórkowe supernatanty w temperaturze -80 ºC. Poddać komórki lizie do analizy białek i RNA metodą Western blot i odwrotnej transkrypcji ilościowej PCR we wskazanych punktach czasowych.</li>
</ol>
5. Odwrotna transkrypcja-ilościowy PCR (RT-qPCR) do oceny kopii genomu HCV
<ol>
	<li>Wykonaj dwuetapowy RT-qPCR w celu określenia liczby kopii genomowego RNA HCV.</li>
	<li>Odwrotna transkrypcja 1 μg całkowitego komórkowego RNA przy użyciu odwrotnej transkryptazy i startera specyficznego dla nici wyczuwalnej HCV, która wiąże się z 5'NTR (JFH RTQ R: 5'CCTATCAGGCAGTACCACA-3') lub starterem specyficznym dla izomerazy genu peptydyloprolilu G (PPIG R: 5'-GTCTCTCTCCCTTCTCCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTTT-3'). Odwrotna transkrypcja RNA FNX-HCV (wygenerowanego w kroku 3) znanych kopii genomu (standard 10,1 do 10,9) przy użyciu startera nici sensacyjnej HCV.</li>
	<li>Przeprowadzić qPCR, używając 50 ng otrzymanego transkrybowanego cDNA przy użyciu specyficznych starterów HCV (JFH RTQ F: 5'CTGGGTCCTTTCTTGGATAA-3; JFH RTQ R: 5'CCTATCAGGCAGTACCACA-3') i zielony barwnik wiążący DNA zawierający super mieszankę qPCR. Wykonaj również qPCR dla genu porządkowego PPIG (startery PPIG F: 5'-GAAGAGTGCGATCAAGAACCCATGAC-3'; PPIG R: 5'-GTCTCTCCCTTCTCCTCTCTCTCTCTCTCT-3') Uwaga: Aby obliczyć dokładny wewnątrzkomórkowy poziom RNA HCV w próbkach, użyj genu porządkowania komórkowego, PPIG, poziomu ekspresji (cykl Ct) do normalizacji. Użyj numeru kopii genomu FNX-HCV jako standardu do określania liczby kopii.</li>
	<li>Użyj następujących warunków podczas uruchamiania qPCR, aby określić liczbę kopii RNA HCV: 95 ºC przez 15 sekund i 60 ºC przez 30 sekund (40 cykli) przy użyciu systemu PCR w czasie rzeczywistym.</li>
	<li>Patrz rysunki 3A i 3B, aby zapoznać się z wynikami replikacji genomu.</li>
</ol>
6. Analiza Western Blotting do wykrywania ekspresji białka HCV (Rysunek 3C)
<ol>
	<li>Użyj lizatów komórkowych z wirusowego RNA transfekowanego w 96 godzin po transfekcji do analizy białka western blot.</li>
	<li>Rozpuścić lizat komórkowy za pomocą SDS-PAGE i przenieść do membrany z polifluorku winylidenu (PVDF).</li>
	<li>Zablokuj membranę za pomocą roztworu blokującego zawierającego 5% odtłuszczonego mleka, 0,2% Tween 20 w roztworze soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS).</li>
	<li>Inkubować błonę z pierwotnym mysim przeciwciałem monoklonalnym NS3 (rozcieńczenie 1 do 1,000) i beta-aktyną (1:5,000 rozcieńczenia).</li>
	<li>Dodać kozią antymysią IgG sprzężoną z peroksydazą chrzanową (rozcieńczenie 1 do 5 000) i wykryć przez chemiluminescencję.</li>
</ol>
7. Test immunofluorescencyjny (IFA)
<ol>
	<li>Utrwalić komórki zakażone HCV i transfekowane za pomocą metanolu przez 30 minut w temperaturze -20 ºC w celu przeprowadzenia testu immunofluorescencyjnego.</li>
	<li>Umyj komórkę trzykrotnie PBS i zablokuj buforem blokującym IFA.</li>
	<li>Użyj króliczego poliklonalnego przeciwciała anty-NS5A głównie (uprzejmie dostarczonego przez dr Dasgupta, UCLA) lub mysiego przeciwciała monoklonalnego anty-dsRNA J2 w rozcieńczeniu 1:200 (1 μg / ml) i inkubuj przez 5 godzin do nocy w temperaturze 4 ºC.</li>
	<li>Przemyj komórki PBS trzy razy po przeciwciałie pierwszorzędowym.</li>
	<li>Dodać kozie przeciwciało anty-królicze IgG-488 poliklonalne przeciwciało drugorzędowe lub kozie przeciwciało anty-mysie IgG-594 poliklonalne przeciwciało drugorzędowe w rozcieńczeniu 1:1,000 (1 μg/ml) i inkubować przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Umyj komórki trzykrotnie PBS i wybarwij jądra barwnikiem Hoechst i obejrzyj za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego (ryc. 3D).</li>
</ol>
8. Pomiar miana wirusa
<ol>
	<li>Płytki naiwne komórki Huh-7.5.1 w około 3 x 103 komórki / studzienka przy użyciu płytki 96-dołkowej. Następnego dnia wykonaj 10-krotne seryjne rozcieńczenia supernatantu do hodowli bezkomórkowej pobranego z komórek transfekowanych RNA HCV za pomocą pożywki wzrostowej i zaszczepij w trzech egzemplarzach na komórkach Huh-7.5.1.</li>
	<li>Utrwalić komórki w 72 godzinach po zakażeniu za pomocą metanolu (przez 30 minut w temperaturze -20 ºC) i barwienia immunologicznego białka HCV NS5A, jak podano w sekcji 7.</li>
	<li>Użyj najwyższego rozcieńczenia, aby policzyć dodatnie ogniska NS5A i obliczyć średnią liczbę jednostek tworzących ognisko (FFU) na mililitr. Patrz rysunek 4 dla miana HCV.</li>
</ol>
9. Test reporterowy Renilla Lucyferazy do replikacji genomu wirusa i zakaźności
<ol>
	<li>Do oceny replikacji genomu wirusa, płytki HCV RNA elektroporowały komórki Huh-7.5.1 w trzech egzemplarzach na 48-dołkowych płytkach (1 x 104 komórki / dołek).</li>
	<li>Lizuj komórki za pomocą 75 μl pasywnego buforu do lizy po 6, 48 godzinach i 96 godzinach po transfekcji.</li>
	<li>Delikatnie kołysać płytkami przez 15 minut w temperaturze pokojowej i przechowywać w temperaturze -80 ºC.</li>
	<li>Aby zmierzyć aktywność enzymatyczną lucyferazy Renilla, rozmrozić lizat białkowy i odczynniki do oznaczania lucyferazy Renilla do temperatury pokojowej.</li>
	<li>Dodać 20 μl lizatu białkowego do dołka 96-dołkowej białej płytki luminescencyjnej i umieścić płytkę w luminometrze.</li>
	<li>Dozować 100 μl odczynnika do oznaczania lucyferazy Renilla (substrat coelenterazine + bufor) do dołka i po 2 sekundach opóźnienia wstępnego odczytu; całkować wyemitowane światło przez 10 sekund.</li>
	<li>Obliczyć średnią i odchylenie standardowe dla każdej próbki od wartości lucyferazy w biologicznych potrójnych próbkach i poddać dane analizie statystycznej (ryc. 5).</li>
	<li>W celu oceny zakaźności należy zaszczepić 500 μl bezkomórkowego supernatantu uzyskanego z komórek transfekowanych HCV RNA we wskazanych punktach czasowych (48 godzin i 96 godzin) w trzech egzemplarzach na naiwnych komórkach Huh-7.5.1 na płytkach 48-dołkowych.</li>
	<li>Zastąp inokulum wirusa 500 μl świeżej pożywki na dołek po 6 godzinach po zakażeniu.</li>
	<li>Poddaj komórki lizie po 48 godzinach od zakażenia i poddaj testowi lucyferazy Renilla, jak opisano w krokach od 8.2 do 8.7 (Figura 5).</li>
</ol>
10. Analiza statystyczna
<ol>
	<li>Słupki błędów na wykresach wskazują odchylenia standardowe (SD). Wartości P obliczono za pomocą niesparowanego testu t.</li>
</ol>

<ol><li>Alter, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((J.+Epidemiology+of+hepatitis+C%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology.%22%5BJournal%5D)">J. Epidemiology of hepatitis C.</a> Hepatology.. 26(3 Suppl 1), (1997).</li>
<li>Alter, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((J.+Epidemiology+of+hepatitis+C+virus+infection%5BTitle%5D)+AND+%22World+J+Gastroenterol%22%5BJournal%5D)">J. Epidemiology of hepatitis C virus infection.</a> World J Gastroenterol. 13 (17), 2436-2441 (2007).</li>
<li>Lavanchy, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+global+burden+of+hepatitis+C%5BTitle%5D)+AND+%22Liver+Int%22%5BJournal%5D)">The global burden of hepatitis C.</a> Liver Int. 29 (Suppl 1), 74-81 (2009).</li>
<li>Lindenbach, B. D., Thiel, H. J., Rice, C. M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLindenbach%2C+BD+%22Flaviviridae%3A+viruses+and+their+replication+in+Fields+Virology%22">Flaviviridae: viruses and their replication in Fields Virology</a>. , Philadelphia, PA. 1101-1152 (2007).</li>
<li>Ciesek, S., Manns, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hepatitis+in+2010%3A+the+dawn+of+a+new+era+in+HCV+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Gastroenterol+Hepatol%22%5BJournal%5D)">Hepatitis in 2010: the dawn of a new era in HCV therapy.</a> Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 8 (2), 69-71 (2011).</li>
<li>Ghany, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+update+on+treatment+of+genotype+1+chronic+hepatitis+C+virus+infection%3A+2011+practice+guideline+by+the+American+Association+for+the+Study+of+Liver+Diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">An update on treatment of genotype 1 chronic hepatitis C virus infection: 2011 practice guideline by the American Association for the Study of Liver Diseases.</a> Hepatology. 54 (4), 1433-1444 (2011).</li>
<li>Choo, Q. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+a+cDNA+clone+derived+from+a+blood-borne+non-A%2C+non-B+viral+hepatitis+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Isolation of a cDNA clone derived from a blood-borne non-A, non-B viral hepatitis genome.</a> Science. 244 (4902), 359-362 (1989).</li>
<li>Kolykhalov, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transmission+of+hepatitis+C+by+intrahepatic+inoculation+with+transcribed+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Transmission of hepatitis C by intrahepatic inoculation with transcribed RNA.</a> Science. 277 (5325), 570-574 (1997).</li>
<li>Lohmann, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Replication+of+subgenomic+hepatitis+C+virus+RNAs+in+a+hepatoma+cell+line%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Replication of subgenomic hepatitis C virus RNAs in a hepatoma cell line.</a> Science. 285 (5424), 110-113 (1999).</li>
<li>Blight, K. J., Kolykhalov, A. A., Rice, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+initiation+of+HCV+RNA+replication+in+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Efficient initiation of HCV RNA replication in cell culture.</a> Science. 290 (5498), 1972-1974 (2000).</li>
<li>Lindenbach, B. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complete+replication+of+hepatitis+C+virus+in+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Complete replication of hepatitis C virus in cell culture.</a> Science. 309 (5734), 623-626 (2005).</li>
<li>Wakita, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+infectious+hepatitis+C+virus+in+tissue+culture+from+a+cloned+viral+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Production of infectious hepatitis C virus in tissue culture from a cloned viral genome.</a> Nat Med. 11 (7), 791-796 (2005).</li>
<li>Zhong, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Robust+hepatitis+C+virus+infection+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Robust hepatitis C virus infection in vitro.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (26), 9294-9299 (2005).</li>
<li>Yi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Compensatory+mutations+in+E1%2C+p7%2C+NS2%2C+and+NS3+enhance+yields+of+cell+culture-infectious+intergenotypic+chimeric+hepatitis+C+virus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Compensatory mutations in E1, p7, NS2, and NS3 enhance yields of cell culture-infectious intergenotypic chimeric hepatitis C virus.</a> J Virol. 81 (2), 629-638 (2007).</li>
<li>Pietschmann, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Construction+and+characterization+of+infectious+intragenotypic+and+intergenotypic+hepatitis+C+virus+chimeras%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Construction and characterization of infectious intragenotypic and intergenotypic hepatitis C virus chimeras.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (19), 7408-7413 (2006).</li>
<li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+efficient+full-length+hepatitis+C+virus+genotype+1+%28strain+TN%29+infectious+culture+system%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Highly efficient full-length hepatitis C virus genotype 1 (strain TN) infectious culture system.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (48), 19757-19762 (2012).</li>
<li>Yi, M., Lemon, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genotype+1a+HCV+%28H77S%29+infection+system%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Genotype 1a HCV (H77S) infection system.</a> Methods Mol Biol. 510, 337-346 (2009).</li>
<li>Gottwein, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+application+of+hepatitis+C+reporter+viruses+with+genotype+1+to+7+core-nonstructural+protein+2+%28NS2%29+expressing+fluorescent+proteins+or+luciferase+in+modified+JFH1+NS5A%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Development and application of hepatitis C reporter viruses with genotype 1 to 7 core-nonstructural protein 2 (NS2) expressing fluorescent proteins or luciferase in modified JFH1 NS5A.</a> J Virol. 85 (17), 8913-8928 (2011).</li>
<li>Arumugaswami, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+functional+profiling+of+hepatitis+C+virus+genome%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">High-resolution functional profiling of hepatitis C virus genome.</a> PLoS Pathog. 4 (10), (2008).</li>
<li>Chu, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+analysis+of+enhancer+and+critical+cis-acting+RNA+elements+in+the+protein-encoding+region+of+the+hepatitis+C+virus+genome%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Systematic analysis of enhancer and critical cis-acting RNA elements in the protein-encoding region of the hepatitis C virus genome.</a> J Virol. 87 (10), 5678-5696 (2013).</li>
<li>Salloum, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rab18+binds+to+hepatitis+C+virus+NS5A+and+promotes+interaction+between+sites+of+viral+replication+and+lipid+droplets%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Rab18 binds to hepatitis C virus NS5A and promotes interaction between sites of viral replication and lipid droplets.</a> PLoS Pathog. 9 (8), (2013).</li>
<li>Gonzalez, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selection+of+an+optimal+RNA+transfection+reagent+and+comparison+to+electroporation+for+the+delivery+of+viral+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol+Methods%22%5BJournal%5D)">Selection of an optimal RNA transfection reagent and comparison to electroporation for the delivery of viral RNA.</a> J Virol Methods. 145 (1), 14-21 (2007).</li>
<li>Phan, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hepatitis+C+virus+NS2+protein+contributes+to+virus+particle+assembly+via+opposing+epistatic+interactions+with+the+E1-E2+glycoprotein+and+NS3-NS4A+enzyme+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Hepatitis C virus NS2 protein contributes to virus particle assembly via opposing epistatic interactions with the E1-E2 glycoprotein and NS3-NS4A enzyme complexes.</a> J Virol. 83 (17), 8379-8395 (2009).</li>
<li>Schaller, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+hepatitis+C+virus+superinfection+exclusion+by+using+novel+fluorochrome+gene-tagged+viral+genomes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Analysis of hepatitis C virus superinfection exclusion by using novel fluorochrome gene-tagged viral genomes.</a> J Virol. 81 (9), 4591-4603 (2007).</li>
<li>Li, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+hepatitis+C+virus+lacking+the+envelope-encoding+genes+for+single-cycle+infection+by+providing+homologous+envelope+proteins+or+vesicular+stomatitis+virus+glycoproteins+in+trans%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Production of hepatitis C virus lacking the envelope-encoding genes for single-cycle infection by providing homologous envelope proteins or vesicular stomatitis virus glycoproteins in trans.</a> J Virol. 85 (5), 2138-2147 (2011).</li>
<li>Jones, C. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hepatitis+C+virus+p7+and+NS2+proteins+are+essential+for+production+of+infectious+virus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Hepatitis C virus p7 and NS2 proteins are essential for production of infectious virus.</a> J Virol. 81 (16), 8374-8383 (2007).</li>
<li>Steinmann, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hepatitis+C+virus+p7+protein+is+crucial+for+assembly+and+release+of+infectious+virions%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Hepatitis C virus p7 protein is crucial for assembly and release of infectious virions.</a> PLoS Pathog. (7), (2007).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Na tej ilustracji opisano metodę analizy cyklu replikacji wirusa zapalenia wątroby typu C. HCV jest ludzkim patogenem i należy ściśle przestrzegać przepisanego protokołu bezpieczeństwa biologicznego. Zakaźne systemy hodowli komórek HCV zostały opisane wcześniej11-13,16,17. Jest kilka kluczowych punktów, które wdrażamy, postępując zgodnie z ilustrowanym protokołem. Po pierwsze, bardzo ważne jest posiadanie dobrej jakości nienaruszonego genomowego RNA wirusa o pełnej długości do dalszych badań. Plazmid wejściowy...

Wirus zapalenia wątroby typu C (HCV) powoduje marskość wątroby i raka wątroby. Dotyka 170 milionów ludzi na całym świecie, a 350 000 osób umiera rocznie1-3. HCV jest wirusem o dodatniej nici RNA o wielkości genomu 9,6 kb. Genom HCV jest tłumaczony jako pojedyncza poliproteina składająca się z ~ 3,000 reszt aminokwasowych, która jest proteolitycznie rozszczepiana przez różne proteazy komórkowe i wirusowe na 10 polipeptydów. HCV jest prototypem wirusa z rodzaju Hepacivirus i należy do rodziny Flaviviridae4. Po ekspozycji HCV powoduje przewlekłą infekcję u 80% osób. Zakażenie przebiega w większości bezobjawowo, a szybka diagnoza może pozwolić na interwencję terapeutyczną w celu zapobieżenia pogorszeniu stanu wątroby. Obecne leczenie jest nieoptymalne i nie jest dostępna żadna szczepionka5,6.
Etiologia wirusowego zapalenia wątroby typu C została po raz pierwszy opisana w 1989 roku 7. Badanie replikacji wirusa HCV jest ważne dla badań nad szczepionką przeciwko wirusowemu zapaleniu wątroby typu C i jego leczeniem, ale przez długi czas było utrudnione przez brak wydajnego systemu hodowli wirusów. Wykazano, że molekularny klon HCV jest zakaźny u szympansów po inokulacji wewnątrzwątrobowej8. Następnie opisano subgenomowe replikony HCV, które pozwoliły na analizę etapu replikacji genomu wirusa w systemie hodowli komórkowej9,10. Odkrycie izolatu HCV o genotypie 2a JFH-1 (Japanese Piorunant hepatitis-1), zdolnego do infekowania hodowli komórkowych, otworzyło nowe możliwości badań nad replikacją HCV11-13. Dostępne są również między- i wewnątrzgenotypowe wirusy chimeryczne oparte na szczepie JFH-1 o genotypie 2a oraz systemy hodowli zakaźnych oparte na genotypie 1 HCV14-18.
Udało nam się użyć szczepu JFH-1 i chimerycznego wirusa HCV intragenotypu 2a, aby uzyskać mapę profilowania funkcjonalnego o wysokiej rozdzielczości domen białkowych i elementów RNA działających cis.19,20. W związku z tym opisujemy tutaj skuteczny system hodowli rutynowo stosowany, który umożliwia badanie różnych etapów cyklu replikacji HCV i interakcji gospodarz-patogen. Przedstawiono testy wirusologiczne do oceny replikacji genomu wirusa i zakaźności de novo HCV intragenotypu 2a i reporterowego HCV opartego na lucyferazy Renilla.

<table><tbody><tr><td>Dulbecco' s zmodyfikowany Orzeł" s medium (DMEM)</td><td>Fisher Scientific</td><td>10-017-CV</td><td></td></tr><tr><td>Aminokwas endogenny</td><td>Fisher Scientific</td><td>MT25025CI</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Life Technologies</td><td>15630080</td><td></td></tr><tr><td>Glutamax</td><td>Life Technologies</td><td>35050061</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM Zredukowane podłoże w surowicy, bez fenolu Red</td><td>Life Technologies</td><td>11058-021</td><td></td></tr><tr><td>Huh-7.5.1</td>Instytut <td></td><td>Badawczy Scripps</td><td>Linia komórkowa została uprzejmie dostarczona przez dr Francisa Chisari dr Arumugaswamiemu w ramach wykonanego MTA między Instytutem Badawczym Scripps a plazmidami Cedars-Sinai Medical Center</td></tr><tr><td>(pFNX-HCV, pFNX-HCV Pol null, pFNX-Rluc i pFNX-Rluc Pol null)&nbsp;</td>Centrum <td></td><td>Medyczne Cedars-Sinai</td><td>Plazmidy HCV zostały zsyntetyzowane przez dr Arumugaswami przy użyciu nakładających się oligonukleotydów.</td></tr><tr><td>XbaI</td><td>Nowa Anglia Biolabs Inc.</td><td>R0145S</td><td></td></tr><tr><td>Nukleaza fasoli mung</td><td>Nowa Anglia Biolabs Inc.</td><td>M0250S</td><td></td></tr><tr><td>T7 RiboMAX Express System produkcji RNA na dużą skalę Promega</td><td></td><td>P1320</td><td></td></tr><tr><td>Rneasy Mini Kit</td><td>Qiagen</td><td>74104</td><td></td></tr><tr><td>Nanodrop 2000</td><td>Thermo Scientific</td><td>Nanodrop 2000</td><td></td></tr><tr><td>Kuweta do elektroporacji (4 mm)</td><td>Bioexpress</td><td>E-5010-4</td><td></td></tr><tr><td>Gene Pulser Xcell Total System</td><td>Bio-Rad</td><td>165-2660</td><td></td></tr><tr><td>mysie przeciwciało monoklonalne anty-dsRNA J2&nbsp;</td><td>Angielski & Doradztwo Naukowe Kft.</td><td></td><td></td>10010200</tr><tr><td>Koza anty-królicza IgG Alexa Fluor 488</td><td>Life Technologies</td><td>A11008</td><td></td></tr><tr><td>Kozia anty-królicza IgG Alexa Fluor 594</td><td>Life Technologies</td><td>A11020</td><td></td></tr><tr><td>Pakiet membran PVDF</td><td>Bio-Rad</td><td>162-0263</td><td></td></tr><tr><td>Blotting Grade Blocker Beztłuszczowe mleko w suchym mleku</td><td>Bio-Rad</td><td>170-6404XTU</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Bio-Rad</td><td>170-6531XTU</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało przeciw wirusowi zapalenia wątroby typu C NS3 [8 G-2]</td><td>Abcam</td><td>ab65407</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało przeciw wirusowi zapalenia wątroby typu C NS3 [H23]</td><td>Abcam</td><td>ab13830</td><td></td></tr><tr><td>Kozia anty-mysia IgG skoniugowana z peroksydazą chrzanową (HRP)&nbsp;</td><td>Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc.</td><td>115-035-003</td><td></td></tr><tr><td>Odczynniki do wykrywania Western Blotting Amersham ECL Prime&nbsp;</td><td>GE Healthcare Nauki Przyrodnicze</td><td>RPN2236</td><td></td></tr><tr><td>INDEKS GÓRNY III RT&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>18080085</td><td></td></tr><tr><td>SYBR QPCR SUPERMIX W/ROX</td><td>Life Technologies</td><td>11744500</td><td></td></tr><tr><td>System PCR w czasie rzeczywistym ViiA 7</td><td>Life Technologies</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw systemu oznaczania lucyferazy Renilla</td><td>Promega</td><td>E2810</td><td></td></tr> Bez <tr><td>RNaz DNaza</td><td>Promega</td><td>M6101</td><td></td></tr><tr><td>GloMax-Multi Detection System (luminometr)</td><td>Preparat Promega</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

protokół analizy replikacji wirusa zapalenia wątroby typu c

A Protocol for Analyzing Hepatitis C Virus Replication

Wirus zapalenia wątroby typu C (HCV) dotyka 3% światowej populacji i powoduje poważne dolegliwości wątroby, w tym przewlekłe zapalenie wątroby, marskość wątroby i raka wątrobowokomórkowego. HCV jest wirusem otoczkowym RNA należącym do rodziny Flaviviridae. Obecne leczenie nie jest w pełni skuteczne i powoduje niepożądane skutki uboczne. Nie ma dostępnej szczepionki przeciwko HCV. W związku z tym konieczne są dalsze wysiłki na rzecz opracowania szczepionki i lepszej terapii. System hodowli komórek HCV ma kluczowe znaczenie dla badania różnych etapów wzrostu HCV, w tym wnikania wirusa, replikacji genomu, pakowania i wyjazdu. W przedstawionej obecnie procedurze użyliśmy chimerycznego wirusa intragenotypu 2a typu dzikiego, FNX-HCV, oraz rekombinowanego wirusa FNX-Rluc przenoszącego gen reporterowy Lucyferazy Renilla do zbadania replikacji wirusa. Ludzka linia komórkowa wątrobiaka (oparta na Huh-7) została wykorzystana do transfekcji transkrybowanych in vitro genomowych RNA HCV. Supernatanty z hodowli bezkomórkowych, lizaty białkowe i całkowite RNA zebrano w różnych punktach czasowych po transfekcji w celu oceny wzrostu HCV. Status replikacji genomu HCV oceniano za pomocą ilościowego RT-PCR i wizualizacji obecności dwuniciowego RNA HCV. Ekspresję białka HCV zweryfikowano za pomocą testów Western blot i immunofluorescencji przy użyciu przeciwciał specyficznych dla białek HCV NS3 i NS5A. Komórki transfekowane RNA HCV uwolniły zakaźne cząstki do supernatantu hodowli i zmierzono miano wirusa. Testy lucyferazy wykorzystano do oceny poziomu replikacji i zakaźności reporterowego HCV. Podsumowując, przedstawiamy różne testy wirusologiczne do charakteryzowania różnych etapów cyklu replikacji HCV.

Wirus zapalenia wątroby C jest wirusem RNA. W związku z tym, w celu manipulacji genetycznych, cDNA genomowe HCV sklonowano do bakteryjnego wektora plazmidowego. Sekwencję promotora polimerazy RNA T7 wprowadzono bezpośrednio przed końcem 5’ genomu HCV. Ogólny schemat procedury analizy HCV przedstawiono na Rysunku&#160;1. Aby uzyskać genomowe RNA HCV z precyzyjnym końcem 3’, plazmid zawierający genom HCV przecięto enzymem restrykcyjnym XbaI, a powstały jednoniciowy nawis wyrównano poprzez trawieni...

Wirus zapalenia wątroby typu C (HCV) jest głównym ludzkim patogenem, który powoduje choroby wątroby, w tym marskość wątroby i raka. System hodowli komórek zakaźnych HCV jest niezbędny do zrozumienia molekularnego mechanizmu replikacji HCV i opracowania nowych podejść terapeutycznych. W tym miejscu opisujemy protokół badania różnych etapów cyklu replikacji HCV.

Protokół analizy replikacji wirusa zapalenia wątroby typu C

Hepatitis C Virus (HCV) affects 3% of the world&#8217;s population and causes serious liver ailments including&#160;chronic hepatitis, cirrhosis, and ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest zbadanie różnych etapów cyklu replikacyjnego wirusa zapalenia wątroby typu C. Jest to realizowane poprzez wstępne generowanie transkryptów genomowego RNA HCV z linearyzowanych konstruktów plazmidowych HCV. Drugim krokiem jest transfekcja komórek RNA HCV. Następnie komórki są wysiewane na płytki w celu przeprowadzenia analiz w różnych punktach czasowych. Ostatnim etapem jest pobranie nadsączu hodowli komórkowej do pomiaru miana wirusa oraz zbiór transfektowanych komórek w celu izolacji białek i RNA. W końcowej fazie przeprowadza się reakcję RT-PCR, Western blotting, analizę immunofluorescencyjną oraz oznaczanie miana HCV, co pozwala na wykazanie obecności stabilnego systemu zakaźnej hodowli komórkowej HCV.Główną zaletą tego systemu hodowli komórkowej zakażonych wirusem zapalenia wątroby C w stosunku do systemu replikonu HCV jest możliwość badania etapów wnikania wirusa, składania wirionów oraz ich uwalniania. Niniejszy protokół może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie wirusologii HCV, takie jak morfogeneza wirionów oraz interakcje między patogenem a gospodarzem. Zastosowania tej techniki obejmują również rozwój szcze

a-protocol-for-analyzing-hepatitis-c-virus-replication

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Opisujemy dwie metody warunkowej komplementacji trans w procesie składania wirusa zapalenia wątroby C (HCV) i dopełnienia pełnego cyklu życiowego wirusa, które opierają się na tworzeniu heterokaryonów. Techniki te są odpowiednie do przesiewania linii komórkowych wykazujących ekspresję dominujących czynników restrykcyjnych, które uniemożliwiają produkcję zakaźnego potomstwa HCV.

Dwie metody tworzenia heterokaryonów w celu wykrycia czynników restrykcyjnych HCV

Source: Allaire, A., et al. Immunofluorescence to Monitor the Cellular Uptake of Human Lactoferrin and its Associated Antiviral Activity Against the Hepatitis C Virus. J. Vis. Exp. (2015).The video demonstrates the procedure for preparing cells to assess the intracellular uptake and activity of an antiviral agent against the hepatitis C virus.

Preparing Cells to Analyze Intracellular Uptake and Activity of an Antiviral Agent

Source: Ren, S., et al. A Protocol for Analyzing Hepatitis C Virus Replication. J. Vis. Exp. (2014).This video demonstrates the procedure for quantifying Hepatitis C viral RNA using quantitative reverse transcription PCR to measure viral load in infected cell cultures.

Measuring Hepatitis C Viral Load Using Quantitative Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction

Source: Ren, S., et al. A Protocol for Analyzing Hepatitis C Virus Replication. J. Vis. Exp. (2014).This video demonstrates an immunofluorescence-based method to detect Hepatitis C virus replication in infected hepatoma cells. The protocol involves cell fixation, antibody staining for viral protein and double-stranded RNA, and visualization using fluorophore-tagged secondary antibodies. Dual signal detection under a fluorescence microscope confirms active viral replication within the host cells.

Immunofluorescence Assay to Detect Hepatitis C Virus Replication Complexes in Infected Cells

Źródło: Ren, S., et al. A Protocol for Analyzing Hepatitis C Virus Replication. J. Vis. Exp. (2014)Niniejszy film prezentuje test ognisk fluorescencyjnych stosowany do ilościowego oznaczania zakaźnego wirusa zapalenia wątroby typu C w hodowli komórkowej. Przedstawiono w nim seryjne rozcieńczanie supernatantu wirusowego, zakażanie komórek hepatomy oraz detekcję miejsc replikacji wirusa za pomocą fluorescencyjnej mikroskopii z wykorzystaniem przeciwciał.

Ilościowe oznaczenie zakaźnego wirusa zapalenia wątroby C za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej

Ten film demonstruje test przyczepiania wirusów do badania przesiewowego związków przeciwwirusowych. Wykorzystując genetycznie zmodyfikowany wirus zapalenia wątroby typu C i lucyferazy, ocenia hamujący wpływ na przyłączanie się wirusa, na co wskazuje niższe natężenie światła w studzienkach poddanych działaniu kooperacji w porównaniu ze studzienkami leczonymi samym wirusem.

Test przyłączania wirusa do badań przesiewowych związków przeciwwirusowych

Tutaj opisujemy nowo opracowany system zgłaszania wirusa zapalenia wątroby typu B (HBV) do monitorowania wczesnych etapów cyklu życia wirusa HBV. Ten uproszczony system in vitro pomoże w badaniach przesiewowych środków anty-HBV przy użyciu strategii wysokoprzepustowej.

Opracowanie systemu zgłaszania wirusa zapalenia wątroby typu B w celu monitorowania wczesnych etapów cyklu replikacji

Kropelki lipidów są ważnymi organellami do replikacji kilku patogenów, w tym wirusa zapalenia wątroby typu C (HCV). Opisujemy metodę izolowania kropelek lipidów do ilościowej spektrometrii mas powiązanych białek; Może być stosowany w różnych warunkach, takich jak infekcja wirusowa, stres środowiskowy lub leczenie farmakologiczne.

Izolacja kropelek lipidów do ilościowej analizy spektrometrii mas

Opisujemy tutaj generowanie in vitro DNA HBV za pomocą systemu infekcji wirusem zapalenia wątroby typu B i bardzo czułe wykrywanie jego (1-2 kopii) integracji za pomocą odwrotnego zagnieżdżonego PCR.

Wykrywanie zintegrowanego wirusowego DNA o niskiej liczbie kopii utworzonego w wyniku zakażenia in vitro wirusowym zapaleniem wątroby typu B

Celem tego protokołu jest dostarczenie przewodnika krok po kroku do przeprowadzenia eksperymentów 3-D z wirusem zapalenia wątroby typu B.

Hodowle "wątroby na chipie" pierwotnych hepatocytów i komórek Kupffera w leczeniu zakażenia wirusem zapalenia wątroby typu B

Protokół opisuje metodę wprowadzania kontrolowanej różnorodności genetycznej w genomie wirusa zapalenia wątroby typu C poprzez połączenie pełnej długości syntezy zmutowanego RNA za pomocą podatnego na błędy PCR i genetyki odwrotnej. Metoda ta stanowi model selekcji fenotypu i może być stosowana do 10 kb długich genomów wirusa RNA o dodatnim sensie.

Genetyka odwrotna w celu inżynierii wariantów wirusa RNA o pozytywnym wyczuwaniu

Poznaj protokół analizy replikacji wirusa zapalenia wątroby typu C. Metoda obejmuje generowanie RNA genomowego HCV, transfekcję komórek i pomiar miana wirusowego. Technika umożliwia badanie cyklu replikacji HCV w systemie hodowli komórkowej.

Protokół analizy replikacji wirusa zapalenia wątroby typu C

Przeglądaj więcej filmów