Protokół analizy replikacji wirusa zapalenia wątroby typu C

Ogólnym celem tej procedury jest zbadanie różnych etapów cyklu replikacji wirusa zapalenia wątroby typu C. Osiąga się to poprzez pierwsze wygenerowanie genomowego RNA HCV, transkryptów ze zlinearyzowanych konstruktów plazmidu HCV. Drugim krokiem jest transfekcja komórek za pomocą H-C-V-R-N-A.

Następnie komórki są platerowane dla różnych punktów czasowych i testów. Ostatnim krokiem jest pobranie supernatantu z hodowli komórkowej do pomiaru miana wirusa i pobranie transfekowanych komórek pod kątem białka i RNA. Ostatecznie przeprowadza się odwrotną transkrypcję, test immunofluorescencyjny PCR Western blot i miano HCV, które wykazują solidny system hodowli komórek zakaźnych HCV.

Główną zaletą tego zakaźnego systemu hodowli komórek wirusa zapalenia wątroby typu C w porównaniu z systemem replikującym HCV jest to, że można badać etapy wchodzenia i wychodzenia wirusa. Protokół ten może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie wirusologii zapalenia wątroby typu C, takie jak Vion, morfogeneza i interakcja między patogenem. Implikacje tej techniki rozciągają się na rozwój szczepionek, ponieważ pozwala ona na scharakteryzowanie atenuowanych szczepów wirusa, które mogą być oceniane jako potencjalni kandydaci na szczepionki.

Chociaż metoda ta może dostarczyć informacji na temat wirusa zapalenia wątroby typu C, można ją również zastosować do innych wirusów RNA z rodziny Lab Verde. Ogólnie rzecz biorąc, osoby, które dopiero zaczynają korzystać z tej metody, staną przed wyzwaniem uzyskania wysokiej jakości badań genomowego RNA HCV. Pełny cykl replikacji HCV stał się możliwy do zrealizowania w hodowli komórkowej po odkryciu genotypu drugiego A, wirusa HCV w Japonii, piorunującego izolatu wirusa zapalenia wątroby typu one.

Wizualna demonstracja testu wirusologicznego ma kluczowe znaczenie, ponieważ test będzie wymagał specjalistycznej wiedzy zarówno w zakresie technik molekularnych, jak i komórkowych Wykorzystanie chimerycznego wirusa wewnątrz genotypu dwa, F-N-X-H-C-V i F-N-X-H-C-V poll null HCV do oceny replikacji wirusa. Linearyzuj wcześniej wygenerowane plazmidy wirusowe przez trawienie jednym enzymem restrykcyjnym XBA w dwumililitrowej probówce. Następnie potraktuj plazmidy nukleazą fasoli mung, aby wytworzyć końce.

Oczyść strawione plazmidy za pomocą chromatografii anionowymiennej. Sprawdź integralność zlinearyzowanego plazmidu, poddając DNA elektroforezie żelowej AROS. Następnie dodaj zlinearyzowaną matrycę plazmidowego DNA do 0,2 mililitrowej probówki zawierającej T siedem składników reakcji polimerazy RNA w celu syntezy transkryptów genomowego RNA HCV.

Oczyść nowo zsyntetyzowane DNA potraktowane RNA za pomocą zestawu do oczyszczania RNA. Następnie zweryfikuj produkcję RNA za pomocą elektroforezy w żelu Agros. Następnie określ ilościowo RNA za pomocą fotometrii spektralnej.

Odłącz siedem przylegających komórek opartych na HU za pomocą leczenia enzymem trypsyny i zbierz komórki w stożkowy o pojemności 50 mililitrów. Dwa po odwirowaniu resus. Zawiesić osad komórkowy za pomocą zimnego podłoża o niskiej surowicy Po powtórzeniu wirowania ponownie zawieś komórki w pożywce o niskiej surowicy raz 10 do siedmiu komórek na mililitr.

Następnie wymieszaj w sumie 10 mikrogramów transkrybowanego wirusowego RNA z 400 mikrolitrami ponownie zawieszonych komórek w wstępnie schłodzonym weterynarzu do elektroporacji o średnicy 0,4 centymetra, a następnie dostarcz wirusowe RNA do komórek za pomocą elektroporacji przy 270 woltach, 100 omach i 950 mikroferrach. Po zakończeniu, ponownie zawieś elektroporowane ogniwa w 10 mililitrach kompletnej pożywki wzrostowej z 15% FBS w tym momencie, pokryj komórki w obu kolbach T 25 około 1,2 razy 10 do sześciu komórek na kolbę i 48 płytkach dołkowych raz razy 10 do czwartych komórek na dołek przez 4, 48 i 96 godzin. Zastąp pożywkę po czterech do ośmiu godzinach po transfekcji świeżą uzupełnioną pożywką wzrostową z 10% FBS, aby usunąć martwe resztki komórek z kolb i płytek hodowlanych.

Za pomocą pipety serologicznej pobrać supernatanty z kultur komórkowych w punktach czasowych 48 N 96 godzin do stożkowej probówki o pojemności 15 mililitrów. Następnie usuń resztki komórkowe z pobranych próbek przez odwirowanie z prędkością 15 000 obr./min przez 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza po odwirowaniu. Przechowywać bezkomórkowe supernatanty w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza.

Lyce komórki do analizy białek i RNA za pomocą western blot i odwrotnej transkrypcji ilościowego PCR lub R-T-Q-P-C-R we wskazanych punktach czasowych. Odwrotna transkrypcja jednego mikrograma całkowitego komórkowego RNA przy użyciu enzymu odwrotnej transkryptazy i specyficznego startera dla nici zmysłowej HCV, która wiąże się z pięcioma pierwszymi nieulegającymi translacji regionami w probówce o pojemności 0,2 mililitra. Dokonaj również odwrotnej transkrypcji F-N-X-H-C-V-R-N-A znanych kopii genomu przy użyciu startera nici HCV przy użyciu systemu PCR w czasie rzeczywistym.

Przeprowadzić QPCR przy użyciu 50 nanogramów otrzymanej transkrybowanej płyty CD NA przy użyciu specyficznych starterów HCV i zielonego barwnika wiążącego DNA zawierającego super mieszankę QPCR. Podczas uruchamiania QPCR należy użyć następujących warunków, aby określić numer kopii H-C-V-R-N-A po QPCR. Rozpuść lizat komórkowy z wirusowego RNA transfekowanego po 96 godzinach.

Transfekcja po użyciu strony SDS. Następnie przenieś rozpuszczone białka w żelu do membrany z polifluorku winorośli metodą trans plot turbo. Zablokuj membranę za pomocą roztworu blokującego zawierającego 5% odtłuszczonego mleka i 0,2% między 20 a 20 w PBS i umieść w pojemniku.

Inkubować błonę z pierwotnym mysim przeciwciałem monoklonalnym i S3 w rozcieńczeniu jeden na 1000 i beta-aktyną w rozcieńczeniu jeden na 5 000 w chłodni o czterech stopniach Celsjusza. Po inkubacji dodać kozią immunoglobulinę przeciw myszom sprzężoną z peroksydazą chrzanową w rozcieńczeniu jeden do 5 000 i wykryć przez chemiluminescencję. W tym momencie utrwal transfekowane komórki H-C-V-R-N-A za pomocą metanolu przez 30 minut w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza do testu immunofluorescencji.

Po zakończeniu umyj komórki PB S3 razy po zablokowaniu testem immunofluorescencyjnym buforem blokującym, użyj króliczego przeciwciała poliklonalnego anty NS five a i mysiego przeciwciała monoklonalnego anty DS RNA J dwa w rozcieńczeniu od jednego do 200 i inkubuj przez pięć godzin do nocy w chłodni o czterech stopniach Celsjusza. Po inkubacji przemyć komórki PB S3 razy po przeciwciałie pierwszorzędowym. Następnie dodać kozią immunoglobulinę przeciw królikowi G 4 8 8 poliklonalne przeciwciało drugorzędowe i kozie przeciwciało drugorzędowe anty muse immunoglobulinę 5 9 4 w rozcieńczeniu jeden do 1000 i inkubować przez godzinę w temperaturze pokojowej na bujaku stołowym.

Po umyciu komórek PB S3 razy wybarwić jądra za pomocą matrycy herx i obejrzeć za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego. Następny odcień naiwny na płytce, 7,5 0,1 komórki w przybliżeniu trzy razy 10 do trzeciej komórki na studzienkę. Używając 96-dołkowej płytki następnego dnia, wykonaj dziesięciokrotne seryjne rozcieńczenie bezkomórkowego supernatantu hodowlanego zebranego z komórek transfekowanych H-C-V-R-N-A za pomocą pożywki wzrostowej i zaszczepij trzykrotnie na odcień.

7,5 0,1 komórki Utrwal komórki po 72 godzinach od zakażenia za pomocą metanolu przez 30 minut w temperaturze ujemnej 20 stopni Celsjusza po wyjęciu komórek z zamrażarki barwienie aminowe dla białka H-C-V-N-S five A przy użyciu wcześniej opisanych warunków za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego. Policz NS pięć, dodatnie ogniska komórkowe w studzience o najwyższym rozcieńczeniu wirusa i oblicz średnią liczbę jednostek tworzących ognisko na mililitr. Jakość zlinearyzowanego plazmidu HCV oceniano za pomocą elektroforezy żelowej.

H-C-V-D-N-A poddano polimerazie T 7RNA za pośrednictwem transkrypcji in vitro, w wyniku której uzyskano pojedynczy produkt RNA o stężeniu 9,6 kilozasad. Wyniki R-T-Q-P-C-R wskazują, że wirus typu dzikiego skutecznie replikował genom. Typ dziki wykazywał od jednego do trzech logarytmicznie wyższy poziom replikacji genomu w porównaniu z wirusem bezsondażowym.

Wirus typu dzikiego wytwarzał białko NS three biorące udział w rozszczepianiu białek wirusa i replikacji genomu. Wirus typu dzikiego wykazywał również ekspresję białka NS 5a, a NS 5 białka i dwuniciowego RNA zlokalizowanego w cytoplazmie komórkowej transfekowanych komórek typu dzikiego, co sugeruje, że pomiary miana wirusa aktywnej replikacji wirusa wykazały, że wirus typu dzikiego jest zakaźny i wytwarza ponad 10 000 jednostek tworzących ogniska na mililitr zakaźnej cząstki w ciągu sześciu godzin po transfekcji. Zarówno wirusy typu dzikiego, jak i biegun zerowy miały podobną aktywność lucyferazy, co wskazuje na podobny poziom wejściowy transfekcji.

RNA uległo jednak translacji po 48 godzinach i 96 godzinach od transfekcji. Wirus typu dzikiego wykazywał zwiększony poziom replikacji genomu w porównaniu z wirusem bezpoślizgowym. Wirus typu dzikiego wytwarzał również wirusowe białko NS trzy.

Wirus poll null miał aktywność lucyferazy na poziomie podstawowym, podczas gdy wirus typu dzikiego miał dwa do trzech logarytmicznie wyższy poziom replikacji w porównaniu z wirusem reporterowym poll null. Po opanowaniu testów wirusologicznych na zapalenie wątroby typu TC można wykonać w ciągu dwóch tygodni, jeśli zostaną wykonane prawidłowo. Podczas próby tej procedury ważne jest, aby mieć solidne komórki i wysokiej jakości transkrypty genomowego RNA HCV. Po tej procedurze można scharakteryzować szczepy HCV w systemach modeli zwierzęcych w celu zbadania dopasowania in vivo i interakcji patogenów gospodarza.

Opracowanie zakaźnego systemu hodowli komórek HCV utorowało naukowcom drogę do zbadania etapów wirionu, morfogenezy i wychodzenia wirusa w cyklu replikacji HCV. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak wykonywać różne testy wirusologiczne w celu scharakteryzowania różnych etapów cyklu replikacji wirusa zapalenia wątroby typu C. Nie zapominaj, że praca z wirusem zapalenia wątroby typu C może być bardzo niebezpieczna i ze względów bezpieczeństwa należy zawsze przestrzegać odpowiednich środków ochrony osobistej podczas wykonywania tej procedury.