Analiza składu i funkcji nefronów w nerce dorosłego danio pręgowanego

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest ocena składu i funkcjonalności segmentów nefronu w nerce dorosłego danio pręgowanego. Osiąga się to poprzez najpierw wstrzyknięcie fluorescencyjnie znakowanej dekstryny do gniazda, które wiąże rybę danio pręgowanego. Drugim krokiem jest usunięcie i unieruchomienie nerki w celu przygotowania tkanki do kolejnych metod znakowania.

Następnie nerka jest wybielana w celu usunięcia pigmentacji, a następnie barwiona w celu fluorescencyjnego znakowania pożądanych segmentów nefronu. Wyniki uzyskuje się za pomocą immunofluorescencji, mikroskopii i/lub obrazowania w jasnym polu, które umożliwiają wizualizację anatomii nerki na podstawie wybranego barwnika lub barwników. Poniższe metody znakowania mogą pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie nerek dotyczące anatomii narządów i mogą być wykorzystane do badania składu nefronów i oceny funkcjonalności nerek zarówno przed, jak i po zdarzeniu urazu.

Implikacje tych technik rozciągają się w kierunku badania anomalii genetycznych w tworzeniu się nerek u dorosłych i mogą być również stosowane do oceny stanu nerek podczas modelowania chorób przewlekłych. Aby rozpocząć, zdekantuj roztwór ze znieczulonej ryby i ostrożnie umieść zwierzę na mokrej gąbce formy brzusznej. Następnie napełnij strzykawkę insulinową 20 mikrolitrami rozmrażonego roztworu podstawowego dekstryny.

Umieścić igłę tak, aby wprowadzenie nastąpiło pod płytkim kątem w brzusznej linii środkowej brzucha. Aby uniknąć nieznacznego wstrzykiwania narządów, należy podnieść igłę zaraz po wstrzyknięciu, aby unieść ścianę ciała i stworzyć przestrzeń, w którą można wstrzyknąć roztwór. Po wstrzyknięciu delikatnie wróć rybę z powrotem do zbiornika, aby wyzdrowiała ze znieczulenia.

Na początek zdezynfekuj nadmiar roztworu ze znieczulonej ryby i umieść go na chusteczce lub ręczniku papierowym. Po usunięciu głowy i narządów wewnętrznych użyj bardzo cienkich igieł preparacyjnych, aby rozciąć ściany ciała. Zlokalizuj narząd nerkowy, który przylega do ściany grzbietowej zwierzęcia.

Użyj cienkich kleszczy, aby odłączyć nerkę od ściany grzbietowej. Delikatnie umieścić nerkę w pięciomililitrowej szklanej fiolce zawierającej jeden XPBS i myć ją trzy razy przez pięć minut każda. Wyjmij nerkę za pomocą pipety transferowej i umieść ją na czystej szklance Szkiełko z jedną lub dwiema kroplami jednego XPBS.

Użyj cienkich kleszczy, aby spłaszczyć nerkę na szkiełku, upewniając się, że żadna tkanka nie zwinęła się ani w inny sposób nie przewróciła się na siebie. Narzędzie z drutu wolframowego może być używane do wykonywania małych nacięć w tkance łącznej, aby ułatwić płaskie ustawienie nerki. Następnie umieść małe kawałki plasteliny na każdym rogu szklanego szkiełka nakrywkowego o wymiarach 18 na 18 milimetrów.

Powoli umieść szkiełko nakrywkowe na nerce, zachowując lekki kąt. Aby zminimalizować zatrzymywanie pęcherzyków powietrza, dodaj dodatkową kroplę jednego XPBS, aby w razie potrzeby wypełnić przestrzeń między szkiełkiem nakrywkowym a szkiełkiem. Oddzielna grupa danio pręgowanego jest uśpiona i moczona w utrwalaczu przez noc.

Gdy będziesz gotowy, użyj cienkich kleszczyków, aby ostrożnie odłączyć nerkę od grzbietowej ściany ciała i umieścić narząd w szklanej fiolce. Umyj wypreparowaną nerkę trzy razy trzema do pięciu mililitrami jednego XPBS z 0,05% tween przez pięć minut każdy. Następnie usuń roztwór PBS i płucz nerkę trzema mililitrami 5% roztworu sacharozy przez 30 minut.

Po tym czasie zastąp roztwór trzema mililitrami 30% sacharozy i przechowuj przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza następnego dnia. Usuń roztwór i umyj nerkę dwa razy przed dodaniem trzech do pięciu mililitrów roztworu wybielającego. Aby usunąć pigmentację melanocytów obecną na narządzie nerkowym, umieść szklaną fiolkę na rotatorze i uważnie obserwuj, jak pigmentacja znika.

Depigmentacja trwa zazwyczaj około 20 minut, ale czasami może trwać nawet 60 minut. Jeśli roztwór wybielający zostanie pozostawiony zbyt długo, może dojść do rozpadu, dlatego zaleca się monitorowanie próbki co 10 do 15 minut w celu sprawdzenia integralności po dwukrotnym usunięciu pigmentacji z płukania nerek i inkubację z 4% roztworem PFA przez godzinę w temperaturze pokojowej. Następnie usuń 4% roztwór PFA i umyj nerkę trzy razy po ostatnim płukaniu w trzech do pięciu mililitrach roztworu blokującego i inkubuj nerkę w temperaturze pokojowej przez dwie godziny.

Po zakończeniu blokowania przejdź bezpośrednio do wybranego protokołu barwienia. Usunąć roztwór blokujący i umyć nerkę trzy razy, zanim nerka zanurzy się w jednym XPBS przez co najmniej 10 minut. W tym czasie przenieś nerkę do 12-dołkowego lub 24-dołkowego naczynia hodowlanego.

Zastąp jeden XPBS wystarczającym roboczym roztworem substratu fosfatazy alkalicznej, aby pokryć próbkę i umieść próbkę na rotatorze na 30 minut w temperaturze pokojowej. Po tym czasie należy zatrzymać reakcję, przemłukując nerkę roztworem buforowym fosfatazy alkalicznej. Przepłukać nerkę trzema zmianami roztworu buforowego do przemywania przez 10 do 15 minut.

Następnie usuń roztwór buforowy do przemywania i zamontuj nerkę na czystej szklance. Wsunąć podłoże montażowe fosfatazy zawarte w zestawie do etykietowania. Wizualizuj nerkę zabarwioną fosfatazą alkaliczną za pomocą mikroskopu stereoskopowego lub mikroskopu złożonego z podłączonym do zestawu filtrów Debbie.

Najpierw przygotuj działający roztwór DBA o pojemności 200 mikrolitrów, rozcieńczając DBA w jednym XPBS. Zastąp roztwór PBS 200 mikrolitrami roztworu DBA i umieść próbkę na rotatorze na jedną godzinę w temperaturze pokojowej. Po tym czasie usunąć roztwór DBA i przemyć nerkę trzy razy trzema do pięciu mililitrami jednego XPBS przez pięć minut każdy.

Wyjmij jeden XPBS i zamontuj nerkę na czystym szklanym szkiełku. Jak wykazano wcześniej, wizualizuj zabarwione DBA dystalne segmenty nerki za pomocą standardowego filtra Trixie lub Texas Red ustawiony na fluorescencyjnym mikroskopie stereoskopowym lub mikroskopie złożonym. Na tym obrazie w jasnym polu niebielonej nerki pigmentacja odpowiada rozproszonej populacji melanocytów.

Tutaj segmenty PCT nefronu są wizualizowane trzy dni po wstrzyknięciu dekstryny. Wstawka zawiera obraz pojedynczego nefronu z melanocytami. To zdjęcie przedstawia dorosłą nerkę po usunięciu pigmentacji melanocytów.

Te reprezentatywne obrazy przedstawiają niewielkie różnice morfologiczne między segmentami PCT, podczas gdy wiele nefronowych PCT jest ciasno zwiniętych. Inne nefrony zawierają regiony PCT, które mają minimalną kaskadę zwijania dekstryny niebieskiej dekstryny, żółci Lucyfera i dekstryny fluororubinowej preferencyjnie znakują segmenty PCT w nefronach nerkowych, zarówno dekstryna Cascade Blue, jak i Lucifer Yellow wykazują pewne niespecyficzne znakowanie ze znacznie wyższym tłem obserwowanym w nerkach leczonych żółcią Lucyfera. W przeciwieństwie do tego, dekstryna fluoro Ruby wykazała znacznie zmniejszone tło z intensywnym znakowaniem PCT.

Dorosła nerka wybarwiona chęcią wykrycia specyficznego markera typu komórki transportera PCT wykazuje wzorzec ekspresji charakterystyczny dla wychwytu dekstryny z rozkładem różnych ciasno zwiniętych zapętlonych domen PCT, a także bardziej wydłużonych odcinków PCT, które wykazują stałą szeroką średnicę. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak skutecznie oznaczać segmenty nefronu w nerce dorosłego danio pręgowanego, takie jak kanalik proksymalny fosfatazą alkaliczną i kanalik dystalny medyczny za pomocą DBA. Nie zapominaj, że praca z 4% paraldehydem może być bardzo niebezpieczna, a podczas wykonywania tej procedury należy zawsze zachować środki ostrożności, takie jak noszenie płaszcza, rękawiczek i okularów.