Name: Analiza składu i funkcji nefronów w nerce dorosłego danio pręgowanego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-08-09T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 53 s
Description: Odkryj metody analizy składu i funkcji nefronów w nerce dorosłego danio pręgowanego z wykorzystaniem fluorescencyjnego znakowania dextriną i mikroskopii. Techniki te umożliwiają szczegółową ocenę anatomii nerki oraz badanie regeneracji i chorób nerek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca została wsparta funduszami dla RAW z następujących źródeł: National Institutes of Health przyznaje K01 DK083512, DP2 OD008470 i R01 DK100237; Nagroda grantowa March of Dimes Basil O'Connor Starter Scholar #5-FY12-75; pozyskanie funduszy z University of Notre Dame College of Science i Wydziału Nauk Biologicznych; oraz hojny dar dla Uniwersytetu Notre Dame od Elizabeth i Michaela Gallagherów w imieniu rodziny Gallagherów na wspieranie badań nad komórkami macierzystymi. Fundatorzy nie odgrywali żadnej roli w projektowaniu badania, gromadzeniu i analizie danych, podejmowaniu decyzji o publikacji ani przygotowaniu manuskryptu. Dziękujemy pracownikom Wydziału Nauk Biologicznych za ich wsparcie oraz Centrum Badań nad Danio Pręgowanym w Notre Dame za ich wyjątkowe poświęcenie w opiece i dobrostanie naszej kolonii danio pręgowanego. Na koniec dziękujemy członkom naszego laboratorium badawczego za ich komentarze, dyskusje i spostrzeżenia na temat tej pracy.

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

W tym miejscu opisaliśmy metody, które umożliwiają wizualizację składowych segmentów nefronu u dorosłego danio pręgowanego. Wstrzyknięcie fluorescencyjnych koniugatów dekstranu umożliwia preferencyjne znakowanie PCT ze względu na właściwości endocytarne tych bliższych komórek kanalików30,38. Metoda ta może być wykonywana z dużą elastycznością ze względu na istnienie dektransu, który można uzyskać za pomocą szeregu różnych koniugatów fluorescencyjnych. Ponadto stosowanie dektransu utrwalanego lizyną jest szczególnie wygodnym sposobem znakowania segmentów PCT, ponieważ nie są wymagane procedury etykietowania wtórnego. Umożliwia to stosunkowo proste wykrywanie sygnału i jest kompatybilne z wieloma innymi znacznikami fluorescencyjnymi, znakowaniem immunologicznym i wykorzystaniem transgenicznych linii reporterowych. Znakowanie fosfatazą alkaliczną oznacza również kanaliki proksymalne, z silną reaktywnością w PCT i nieco słabszą reaktywnością w PST. Wreszcie, barwienie DBA umożliwia znakowanie dystalnych segmentów kanalików, które wykazują charakterystyczną rozgałęzioną morfologię. Różne cząsteczki lektyny, które są białkami wiążącymi cukier pochodzenia nieimmunologicznego, były szeroko stosowane do rozróżniania segmentów nefronu ssaków47. Interesujące jest to, że DBA u danio pręgowanego koreluje z dystalnymi segmentami kanalików, ponieważ jest wykorzystywany do oznaczania przewodów zbiorczych w nerkach ssaków47.
Podsumowując, metody te mogą być wykorzystywane w różnych kombinacjach do dokumentowania składu i funkcji nerek. Ponieważ wszystkie te metody mogą być stosowane w preparatach nerkowych, dostarczają one narzędzi do oceny struktury i funkcji nefronu w całym narządzie bez całkowitego polegania na bardziej czasochłonnych, żmudnych metodach, np. kriosekcji i znakowaniu immunologicznym. Jednak plamy opisane w tym artykule o metodach są żywotne w kriosekcji. Analiza kriosekcji generuje próbki (w porównaniu z całym wierzchem), które lepiej nadają się do immunohistochemii w celu wykrycia określonych peptydów, choć oczywiście ten rodzaj analizy wymaga dostępności odpowiednich przeciwciał pierwotnych. Niestety, jednym z głównych ograniczeń w pracy z modelem zwierzęcym danio pręgowanego pozostaje słaba dostępność przeciwciał. W związku z tym WISH pozostaje najpowszechniej stosowaną procedurą analizy ekspresji genów. WISH wykorzystujący reakcje substratowe BCIP, NBT i/lub INT w celu wytworzenia fioletowych lub czerwonych osadów nie jest kompatybilny z barwieniem fluorescencyjnym na kriosekcjach. Jedną z opcji byłoby zastosowanie fluorescencyjnej detekcji WISH, procedury, która została zoptymalizowana dla próbek embrionalnych danio pręgowanego i może być dostosowana do użytku z dorosłą nerką. Opis metod w tym artykule wideo powinien pozwolić na dalsze eksperymentowanie z technikami takimi jak fluorescencyjny WISH w połączeniu z transgenicznymi liniami danio pręgowanego, w których poszczególne segmenty są znakowane za pomocą reportera, takiego jak eGFP lub mCherry. Alternatywnie, opisane tutaj metody mogą być testowane w połączeniu z innymi ważnymi barwnikami, np. innymi lektynami. W związku z tym można by odwołać się do dalszej adaptacji i rozszerzenia opisanych tu metod, aby dostosować je do potrzeb badacza w zakresie preparatów i analizy całej nerki wierzchowca.
W związku z tym metody te mają duży potencjał do zastosowania w modelu danio pręgowanego w trwających badaniach nad regeneracją, a także w modelowaniu chorób genetycznych. Istnieje pilna potrzeba innowacyjnych badań i metod leczenia chorób nerek. Każdego roku miliony ludzi cierpią na jakąś formę choroby nerek, która wynika z przyczyn wrodzonych, ostrych i/lub przewlekłych. Co więcej, częstość występowania chorób nerek stale rośnie na całym świecie, co sprawia, że choroby te stanowią globalny problem zdrowia publicznego14,15. Dostępne są metody leczenia, takie jak hemodializa, w których zewnętrzna maszyna do dializy służy do usuwania odpadów metabolicznych z krwi pacjenta, jeśli jego nerki nie są w stanie pełnić tej roli. Niestety, interwencja ta ma ograniczenia, ponieważ do przeżycia konieczne jest ciągłe leczenie. Co więcej, pacjenci w końcu będą wymagać przeszczepu nerki, który może trwać latami po umieszczeniu pacjenta na liście oczekujących. Nawet po uzyskaniu przeszczepu nerki wielu pacjentów odczuwa działania niepożądane w wyniku zabiegu i musi walczyć z tymi skutkami do końca życia. Trudności te wskazują na poważną potrzebę opracowania nowych metod leczenia, które pomogą zapobiec chorobom nerek lub być może wspomóc regenerację tkanek8,16,52,53. Biorąc pod uwagę oczywiste ograniczenia etyczne związane z wykorzystywaniem ludzi w laboratoriach biomedycznych, modele zwierzęce są niezbędne do badania patogenezy chorób u ludzi oraz do testowania nowych metod leczenia. Ze względu na podobieństwo anatomiczne i bliskość ewolucyjną, mysz stała się najczęściej stosowanym modelem choroby człowieka45. Istnieją jednak pewne ograniczenia związane z tym zwierzęciem, w tym niemożność wizualizacji rozwoju narządów in vivo i praktyczność wykonywania badań genetycznych na dużą skalę. Danio pręgowany jest istotnym i użytecznym organizmem modelowym do badań nad rozwojem narządów i modelowaniem chorób człowieka45,46. Jeśli chodzi o choroby ludzkie, homologi funkcjonalne u danio pręgowanego istnieją dla prawie 70% wszystkich ludzkich genów54,55. 
Ostatnie prace podkreśliły przydatność danio pręgowanego w wielu obszarach badań nad nerkami31,37,56. Badania nad regeneracją i naprawą u danio pręgowanego po AKI sugerują, że regeneracja nabłonka kanalików i neonefrygeneza to dwa procesy, które zachodzą i nakładają się na siebie w całym okresie regeneracji30,37. Stosowanie antybiotyku aminoglikozydowego zwanego gentamycyną zostało wykorzystane jako paradygmat urazów, za pomocą którego badano wyniki AKI u dorosłych danio pręgowanego29,30,37. W ciągu około dwóch tygodni po uszkodzeniu przez gentamycynę kanaliki proksymalne regenerują się, a tymczasem w całym narządzie tworzą się nowe nefrony29,30,37. Ogólnie rzecz biorąc, mechanizmy regulujące regenerację nabłonka pozostają wysoce kontrowersyjne. Jednym z proponowanych mechanizmów procesu naprawy jest początkowy ostry uraz, po którym następuje złuszczenie martwych komórek do światła. Następnie następuje seria zdarzeń deróżnicowania, proliferacji i migracji, po których nowe komórki różnicują się, ponownie zasiedlając uszkodzoną błonę podstawną i przywracając funkcję w uszkodzonym miejscu. Alternatywnie, inne badania sugerują, że komórki zastępcze powstają z komórek macierzystych / progenitorowych, które znajdują się w kanalikach nefronowych. Jeśli chodzi o proces neonefrogenezy u zebry pręgowanego, zaobserwowano agregaty komórkowe po AKI przez wstrzyknięcie gentamycyny29,30. Agregaty te dojrzewają później do nowych nefronów, które zagłębiają się w już istniejące kanaliki29,30. Wspólnym mianownikiem łączącym regenerację nabłonka nefronów i neonfrogenezę jest ich tajemniczy czynnik: obecnie istnieje wykładniczo więcej pytań o to, jak zachodzą te wyczyny regeneracyjne, niż dostępnych informacji.
Do tej pory jednak kilka ekscytujących linii dowodów potwierdza pogląd, że badania nad regeneracją nerek z wykorzystaniem danio pręgowanego mogą rzeczywiście dostarczyć istotnych informacji porównawczych na temat ludzkiego AKI, które mogą mieć również bezpośredni potencjał translacyjny56-58. Chemiczne badania przesiewowe mające na celu identyfikację małych cząsteczek, które zwiększają proliferację komórek progenitorowych nerek w zarodku danio pręgowanego, doprowadziły niedawno do zidentyfikowania inhibitora deacetylazy histonowej metylo-4-(fenylotio)-butanianu (m4PTB)56,57. Podanie tego związku larwom danio pręgowanego z AKI indukowanym gentamycyną wykazało, że przeżywalność larw wzrosła i zwiększono proliferację kanalików nerkowych56,58. Kiedy myszy z umiarkowanym AKI wywołanym niedokrwieniem były leczone m4PTB, ich powrót do zdrowia został przyspieszony w związku ze zmniejszeniem zarówno atrofii kanalików, jak i zatrzymaniem cyklu komórkowego proliferujących komórek kanalików nerkowych58. Odkrycia te sugerują, że szlaki odpowiedzialne za prawidłowy rozwój nerek danio pręgowanego i/lub odpowiedź regeneracyjną na AKI zostaną zachowane u ssaków56.
Tak więc, chociaż potrzebne są dalsze badania, aby wyodrębnić mechanizmy regeneracji – a mianowicie zidentyfikować zaangażowane szlaki sygnałowe i zrozumieć ich interakcje – danio pręgowany stanowi jedną obiecującą drogę do osiągnięcia tego ważnego celu w dziedzinie nefrologii. Narzędzia takie jak znaczniki komórek nefronowych opisane w tym protokole reprezentują jedną grupę testów, które można wykorzystać do oceny składu i funkcjonalności nerek w modelach AKI. Co więcej, mogą być stosowane do charakteryzowania transgenicznych modeli chorób nerek i mogą dostarczyć sposobów identyfikacji chemicznych środków terapeutycznych zdolnych do promowania odbudowy struktury nefronu po uszkodzeniu nerek.

Nerka to złożony organ, który spełnia wiele funkcji fizjologicznych w organizmie. Najważniejszą funkcją nerek jest wydalanie produktów przemiany materii, a zadanie to jest ściśle powiązane z utrzymaniem homeostazy płynów. Nerka wykonuje te zadania, filtrując krew i tworząc mocz, jednocześnie regulując ciśnienie krwi, poziom elektrolitów i równowagę kwasowo-zasadową. Wysoce wyspecjalizowane kanaliki nabłonkowe zwane nefronami służą jako podstawowa jednostka funkcjonalna nerki1,2. U dorosłych kręgowców nefrony są zwykle zorganizowane w ciasno zwinięty układ otaczający scentralizowany system drenażowy, co pozwala na upakowanie wielu kanalików w dość małym narządzie. Na przykład każda ludzka nerka może zawierać ponad 1 milion nefronów3. Inne ssaki, takie jak mysz, posiadają około 8-10 tysięcy nefronów na nerkę4. Stopień złożoności nerek różni się między tymi ssakami a innymi kręgowcami ze względu na różnice w całkowitej liczbie nefronów i ich układzie architektonicznym w nerce. Gatunki kręgowców tworzą podczas rozwoju aż trzy kolejne struktury nerkowe, a każda forma wykazuje coraz większą złożoność w odniesieniu do wyposażenia i rozmieszczenia nefronów: pręcze, śródnercze i śródnercze. Ostatnia struktura nerkowa, która ma zostać zachowana, służy jako dorosły narząd nerkowy - zwykle mesonephros lub metanephros2. Każda forma nerkowa ma jednak skład oparty na nefronach2.
Nefron jest koniem pociągowym nerki i jest odpowiedzialny za filtrację krwi wraz z wydzielaniem metabolitów i reabsorpcją. Nefrony są prostymi strukturami rurkowymi składającymi się z komórek nabłonkowych i mają organizację segmentową, w której dyskretne, wysoce wyspecjalizowane domeny zróżnicowanego nabłonka wykonują określone zadania. W kolejności przepływu filtratu przez nefron zazwyczaj występują trzy główne części, które składają się na każdą jednostkę: (1) ciałko nerkowe, (2) kanalik z segmentami proksymalnym, pośrednim i dystalnym oraz (3) przewód zbiorczy1. Kanalik proksymalny jest odpowiedzialny za reabsorpcję substancji rozpuszczonych organicznych, w szczególności glukozy i aminokwasów1. Kanalik pośredni (lub pętla Henlego) jest głównym miejscem regulacji soli i wody1. Wreszcie, dostrajanie soli i innych jonów zachodzi w kanaliku dystalnym i kanale zbiorczym i jest silnie regulowane przez układ hormonalny1. Stamtąd filtrat przemieszcza się przez moczowód i pęcherz moczowy, ostatecznie opuszczając organizm jako produkt odpadowy1.
Utrata funkcji nerek może wynikać z wielu przyczyn, które uniemożliwiają normalną aktywność nefronów. Przyczyny te mogą wystąpić podczas rozwoju nerek, np. wady wrodzone, które prowadzą do wad rozwojowych nefronów5 lub przyczyny wynikające z różnego rodzaju urazów (wynikających zarówno z pochodzenia genetycznego, jak i środowiskowego). Urazy nabyte są szeroko klasyfikowane jako ostre uszkodzenie nerek (AKI) lub przewlekłe uszkodzenie nerek (PChN). AKI wiąże się z nagłą utratą funkcji nerek, często wynikającą z niedokrwienia lub ekspozycji na toksyny6,7. U ssaków naprawa nabłonka nefronów jest możliwa po takich urazach8, a wiele osób wykazuje pełne przywrócenie funkcji nerek po AKI. Jednak AKI wiąże się również z wysoką zachorowalnością i śmiertelnością, które zgłaszano w szerokim zakresie zachorowalności 30 - 70%6,7. Natomiast PChN wiąże się z postępującą utratą funkcji nerek, która wynika z wieloletniego długotrwałego uszkodzenia, zwykle związanego ze zwłóknieniem8,9. Co więcej, istnieje wzajemne oddziaływanie między AKI i CKD, ponieważ każdy z nich może predysponować osobę do pozostałych10-12. Na przykład ci, którzy cierpieli na AKI, są bardziej podatni na PChN, a nawet na śmierć13. Częstość występowania chorób nerek, zarówno w USA, jak i na całym świecie, osiągnęła rozmiary epidemii i przewiduje się, że będzie rosła wraz ze starzeniem się populacji – w związku z tym istnieje rosnąca potrzeba zidentyfikowania interwencji medycyny regeneracyjnej dla nerek14,15.
Pomimo wiedzy, że pacjenci z AKI mogą wyzdrowieć, od dawna uważano, że nerka jest organem bez wrodzonych zdolności regeneracyjnych. Ten tradycyjny pogląd został w ostatnich latach radykalnie zrewidowany16. Badania nad uszkodzeniem nerek u myszy i szczurów po AKI wykazały, że komórki nabłonkowe kanalików nefronowych mogą się namnażać i odbudowywać funkcjonalne nefrony17-20. Chociaż ssaki posiadają tę adaptacyjną zdolność do regeneracji nefronów, istnieją znaczące ograniczenia i mogą zostać wywołane nieprzystosowawcze reakcje, które prowadzą do zwłóknienia nerek i PChN21. Na przykład niedawne badanie wykazało, że powtarzająca się ablacja komórek nabłonka w mysich nefronach wiązała się ze zmniejszoną regeneracją i zwłóknieniem nerek – co sugeruje, że nefrony mają ograniczony próg regeneracji22. Nie ma dowodów na to, że nerka dorosłego ssaka tworzy nowe nefrony w miejsce utraconych lub uszkodzonych, a zatem ich zniszczenie prowadzi do trwałego deficytu nefronów8,9. Co ciekawe, niektóre kręgowce reagują na AKI poprzez regenerację nabłonka nefronów, a także poprzez wytwarzanie nowych nefronów, proces określany jako neonfrogeneza lub neogeneza nefronów23. Neonefrogeneza zachodzi u ryb po ekspozycji na toksyny lub częściowej resekcji, a modele urazów historycznie obejmowały złotą rybkę24,25, tilapię26, łyżwę27, medakę28, a ostatnio danio pręgowanego29,30. Spośród nich danio pręgowany stanowi realny model badań genetycznych w celu odkrycia szlaków komórkowych i molekularnych odpowiedzialnych za regenerację nerek.
W tym artykule wideo pokazujemy, jak oznaczać segmenty nefronu u dorosłego danio pręgowanego. Wiedza na temat anatomii nefronu, cech molekularnych i cech funkcjonalnych jest niezbędna do udanych przyszłych badań nerek z wykorzystaniem danio pręgowanego. Nerka dorosłego danio pręgowanego jest strukturą mesonefrost i jest z natury mniej złożona pod względem liczby nefronów i organizacji niż struktura metanephros występująca u dorosłych ssaków, ptaków i31. Jednak organizacja segmentów nefronów danio pręgowanego jest analogiczna do ssaków i została po raz pierwszy udokumentowana w embrionalnej nerce na podstawie badań ekspresji genów31-35. Nefrony zarodkowe danio pręgowanego zawierają liniowe segmenty kanalików, które obejmują proksymalny kanalik kręty (PCT), proksymalny kanalik prosty (PST), dystalny wczesny (DE) i dystalny późny (DL) 31-35 (ryc. 1). Dorosłe nefrony danio pręgowanego mają podobne segmenty rurkowe30,31,36,37 (ryc. 1). PCT można również zidentyfikować na podstawie funkcjonalnego fenotypu: komórki nabłonkowe w PCT będą zawierać znakowane fluorescencyjnie związki dekstranu (o wielkości 10-70 kDA) obecne w krążeniu, które zostały wykorzystane zarówno w embrionalnej, jak i dorosłej nerce danio pręgowanego do oceny wychwytu endocytarnego przez te proksymalne komórki kanalików38-41 (Figura 1). Jedną z różnic w segmentach nefronów między danio pręgowanym a ssakami jest to, że danio pręgowany nie ma kanalika pośredniego lub pętli Henle30-37; Ponieważ ten segment funkcjonuje u ssaków w celu oszczędzania wody, a danio pręgowany jest gatunkiem słodkowodnym, który nie ma pilnej potrzeby koncentracji moczu, nie jest zaskakujące, że danio pręgowany nie ma tego segmentu32,33. Tak więc ogólny skład nefronów jest w dużej mierze zachowany między nerką danio pręgowanego a nerką ssaków32,33. Te podobieństwa sprawiły, że danio pręgowany stał się skutecznym narzędziem badawczym do badania funkcji genów wyrażających nerki podczas nefrostenezy rozwojowej32-35,42 oraz do modelowania licznych chorób nerek43,44, dodając w ten sposób do pokaźnej listy schorzeń ludzkich, które można badać za pomocą danio pręgowanego45,46.
Dzisiaj, dorosła nerka danio pręgowanego jest atrakcyjnym modelem do badań porównawczych regeneracji nerek ze względu na jej genetyczną wykonalność i poszerzające się podniebienie zasobów technologicznych dostępnych do badania funkcji genów i szlaków sygnałowych u tego gatunku. W kilku badaniach wykorzystano mesonephros danio pręgowanego do zbadania mechanizmów regeneracji po AKI29,30,37. Aby kontynuować badania AKI z wykorzystaniem nerki dorosłego danio pręgowanego, niezbędne jest posiadanie doskonałych metod oznaczania różnych regionów nefronu oraz metod badania funkcjonalności nefronów. Kilka metod analizy nerek dorosłych zostało zaadaptowanych z protokołów dotyczących nerek embrionalnych. Dootrzewnowe wstrzyknięcie znakowanego fluorescencyjnie dekstranu u dorosłego danio pręgowanego znakuje nabłonek PCT w nefronach mesonephros poprzez endocytozę30, jak w zarodkach danio pręgowanego38-41 (ryc. 1). Metoda ta została wykorzystana do wizualizacji, kiedy kanaliki proksymalne odzyskują swoje właściwości reabsorbujące po AKI, co umożliwia ocenę przywróconej funkcji fizjologicznej30 (ryc. 1). Inną cechą kanalika proksymalnego nefronu jest to, że komórki nabłonkowe w tym segmencie posiadają obwódkę szczotkową37, która wykazuje wysoki poziom endogennej fosfatazy alkalicznej. W ten sposób nabłonek proksymalny może być zlokalizowany wizualnie w nerce dorosłego danio pręgowanego przy użyciu techniki opartej na fluorescencji, znanej jako ELF-(Enzyme-Labeled Fluorescence)-9747.
Tutaj opisujemy, jak przeprowadzić testy wychwytu dekstranu fluorescencyjnego30,48 w nerce dorosłego danio pręgowanego, aby uzyskać funkcjonalną ocenę kanalika proksymalnego oraz zmapować rozmiar i kontury tego segmentu kanalika. Następnie opisujemy techniki znakowania proksymalnych obszarów kanalików dorosłego nefronu za pomocą fluorescencyjnej fosfatazy alkalicznej. Po trzecie, po raz pierwszy pokazujemy, że znakowana rodaminą lektyna Dolichos biflorus aglutynina (DBA), która została użyta jako ogólny marker przewodów zbiorczych w nerce ssaków49, oznacza dystalne kanaliki nerki dorosłego danio pręgowanego. Ponieważ DBA wzajemnie wyklucza się z barwieniem fosfatazą alkaliczną, etykiety te umożliwiają szerokie rozróżnienie rozciągnięć pan-proksymalnych i pan-dystalnych dorosłego nefronu danio pręgowanego. Podczas wdrażania tych fluorescencyjnych barwień zarówno w całych sekcjach histologicznych góry, jak i kriostatu, korelujemy te etykiety z domenami ekspresyjnymi genów transportera substancji rozpuszczonej, które jednoznacznie identyfikują każdy segment nefronu. W związku z tym protokół ten zawiera również przewodnik po zmodyfikowanych procedurach przetwarzania tkanek dla analizy hybrydyzacji in situ całych tkanek dorosłych (WISH) w oparciu o nasz protokół WISH50 dla zarodków. Procedury te mogą być stosowane w różnych kombinacjach (ryc. 2) w celu udokumentowania morfologicznych i funkcjonalnych atrybutów nefronów nerkowych dorosłego danio pręgowanego. W związku z tym protokoły te mogą być stosowane w badaniach nad regeneracją, charakterystyką fenotypową innych modeli chorób nerek, a nawet wykorzystywane do badania tworzenia się dorosłej nerki.

<table><tbody><tr><td>1X PBS</td><td></td><td></td><td>Wykonany przez rozcieńczenie 10 X PBS w wodzie destylowanej.</td></tr><tr><td>1X detergent PBST</td><td></td><td></td><td>0,1% Tween-20 w 1 X PBS.</td></tr><tr><td>1X PBS z 0,05% detergentem Tween</td><td></td><td></td><td>0,05% Tween-20 w 1 X PBS.</td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>American Bioanalytical</td><td>AB02038</td><td></td></tr><tr><td>4% PFA/1X PBS</td><td></td><td></td><td>Rozpuścić 4% PFA (w/v) (Electron Microscopy Sciences, Cat # 19210) w 1 X PBS, doprowadzić do wrzenia na płycie grzejnej w dygestorium. Schłodzić i zamrozić porcje do przechowywania w zamrażarce w temperaturze -20 stopni C. Rozmrozić tuż przed użyciem i nie zamrażać ponownie zapasów.</td></tr><tr><td>Cienkie kleszcze</td><td>Roboz</td><td>RS-1050</td><td>Dumont Pęseta Wzór #55&nbsp;</td></tr><tr><td>Szkiełko szklane</td><td>Thermo-Fisher</td><td>4445</td><td>White Frost&nbsp;</td></tr><tr><td>Szkiełko nakrywkowe</td><td>szklane Thermo-Fisher</td><td>12-540A</td><td>18 x 18 mm</td></tr><tr><td>Plastelina</td><td>Hasbro</td><td>Playdoh</td><td>Inne plasteliny można zastąpić i działać podobnie</td></tr><tr><td>Uchwyt do szkiełek</td><td>Thermo-Fisher</td><td>12-587</td><td>Opcjonalnie: taca kartonowa do przechowywania preparatów na płasko</td></tr><tr><td>Roztwór</td><td></td><td></td> <td>wybielającyFormuła mieszanki wybielacza (na 20 ml roztworu): 1,6 ml 10% roztworu wodorotlenku potasu 0,6 ml 30% roztworu nadtlenku wodoru 100 &mu; l 20% Tween Napełnij do 20 ml wodą destylowaną</td></tr><tr><td>Wodorotlenek potasu</td><td>Sigma</td><td>221473</td><td></td></tr><tr><td>Nadtlenek wodoru</td><td>Sigma</td><td>H1009</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór</td><td></td><td></td><td>blokujący Roztwór blokujący (dla 10 ml roztworu): 8 ml 1X PBS z 0,05% Tween 2 ml płodu surowicy cielęcej 150 &mu; l wykrywania</td></tr><tr><td>aktywności fosfatazy alkalicznej</td> DMSO <td>Invitrogen</td><td>E6601</td><td>Używamy zestawu do wykrywania endogennej fosfatazy ELF 97.&nbsp; Aby przygotować roztwór substratu roboczego, należy rozcieńczyć substrat 20-krotnie w buforze detekcyjnym, zgodnie z instrukcją producenta.</td></tr><tr>Roztwór <td></td><td></td><td>do płukania fosfatazy alkalicznej</td><td>Przepis na roztwór buforowy do przemywania (na 100 ml roztworu): 5 ml 0,5 M EDTA 120 mg lewamizolu 95 ml 1X PBS</td></tr><tr><td>Dextran, fluoresceina, 40 000 MW</td><td>Invitrogen</td><td>D1844</td><td>Rozcieńczyć wodą destylowaną, aby uzyskać roztwór podstawowy o stężeniu 50 mg/ml, i przechowywać porcje w zamrażarce w temperaturze -20°C.</td></tr><tr><td>Dekstran, błękit kaskadowy, 10 000 MW</td><td>Invitrogen</td><td>D1976</td><td>Rozcieńczyć wodą destylowaną, aby uzyskać roztwór podstawowy o stężeniu 50 mg/ml, a podwielokrotności przechowywać w zamrażarce w temperaturze -20°C.</td></tr><tr><td>Dekstran, lucyfer żółty, 10 000 MW</td><td>Invitrogen</td><td>D1825</td><td>Rozcieńczyć wodą destylowaną, aby uzyskać roztwór podstawowy o stężeniu 50 mg/ml i przechowywać podwielokrotności w zamrażarce w temperaturze -20 stopni C.</td></tr><tr><td>Dekstran, tetrametylorodamina (fluoro-rubin), 10 000 MW</td><td>Invitrogen</td><td>D1817</td><td>Rozcieńczyć wodą destylowaną, aby uzyskać roztwór podstawowy o stężeniu 50 mg/ml i przechowywać podwielokrotności w zamrażarce w temperaturze -20 stopni C.</td></tr><tr><td>Dolichos biflorus aglutynina (DBA)-rodamina</td><td>Vector laboratories</td><td>RL-10-32</td><td>DBA Roztwór do barwienia (dla 100 &mu; l roztwór): 1 &MU; l z DBA 99 &mu; l z 1X PBS</td></tr><tr><td>Jodek propidyny</td><td>Invitrogen</td><td>E6601</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Invitrogen</td><td>P1304MP</td><td></td></tr><tr><td>Vectashield twardy zestaw podłoża montażowego</td><td>Laboratoria wektorowe</td><td>H-1400</td><td></td></tr><tr><td>Szkło z mikro pokrywą</td><td>VWR</td><td>48393081</td><td></td></tr><tr><td>Dimetylosulfotlenek, DMSO</td><td>American Bioanalytical</td><td>67-68-5</td><td></td></tr><tr><td>Sacharoza</td><td>Sigma</td><td>S0289</td><td></td></tr><tr><td>EDTA, 0,5 M roztwór, pH 8,0</td> Amerykańska <td>AB00502</td><td></td><td>Bioanalityczna</td></tr><tr><td>Lewamizol</td><td>Sigma</td><td>L-9756</td><td></td></tr><tr><td>Podłoże do zamrażania tkanek</td><td>Triangle Biomedical Sciences, Inc.</td><td>TFM-C</td><td></td></tr><tr><td>Tissue-Tek Biopsja Cryomold, 10 x 10x 5 mm</td> Szkiełka mikroskopowe samoprzylepne <td>Sakura Finetek</td><td>4565</td><td></td></tr><tr><td>TruBond 380</td> Tru <td>Scientific</td><td>0380W</td><td></td></tr><tr><td>Liquid blocker &ndash; super PAP</td><td>pen Mikroskopia elektronowa Sciences</td><td>71312</td><td></td></tr><tr><td>Komora wilgotnościowa na plamy immunologiczne</td><td>Evergreen Scientific</td><td>240-9020-Z10</td><td></td></tr><tr><td>Kriostat</td><td>Therm</td><td>Microm&handel; HM 525 Kriostat</td><td></td></tr><tr><td>Stereoskop</td><td>Nikon</td><td>SMZ645; SMZ1000; 83455 P-niebieski GFP/DAPI; 83457 P-Endow GFP/FITC; 83457 Używany zestaw filtrów P-TRITC</td><td>był następujący: Filtr Hoechst/DAPI był używany do wykrywania DAPI, jodku propidyny, błękitu kaskadowego dekstranu i fosfatazy alkalicznej. Filtr GFP/FITC zastosowano do wykrywania dekstranu-FITC, dekstranu lucyfera i anty-GFP. Filtr TRITC został użyty do wykrywania dektran-fluoro-rubinu, PI i DBA.&nbsp;</td></tr><tr><td>Mikroskop złożony</td><td>Nikon</td><td>96310 C-FL UV-2E/C DAPI; 96311 C-FL B-2E/C FITC; 96313 C-FL Y-2E/C Texas Red</td><td>Zestaw filtrów był następujący: Filtr Hoechst/DAPI był używany do wykrywania DAPI, jodku propidyny, błękitu kaskadowego dekstranu i fosfatazy alkalicznej. Filtr GFP/FITC zastosowano do wykrywania dekstranu-FITC, dekstranu lucyfera i anty-GFP. Filtr Texas Red został użyty do wykrywania dektran-fluoro-rubinu, PI i DBA.&nbsp; &nbsp;</td></tr></tbody></table>

analiza składu i funkcji nefronów w nerce dorosłego danio pręgowanego

Analysis of Nephron Composition and Function in the Adult Zebrafish Kidney

Model danio pręgowanego stał się odpowiednim systemem do badania rozwoju, regeneracji i chorób nerek. Zarówno embrionalne, jak i dorosłe nerki danio pręgowanego składają się z jednostek funkcjonalnych znanych jako nefrony, które są wysoce konserwatywne z innymi kręgowcami, w tym ssakami. Badania na danio pręgowanym wykazały niedawno, że po uszkodzeniu dorosłych nefronów zachodzą dwa charakterystyczne zjawiska: po pierwsze, w istniejących nefronach zachodzi silna regeneracja, która zastępuje zniszczone komórki nabłonka kanalików; Po drugie, całkowicie nowe nefrony są wytwarzane z komórek progenitorowych nerek w procesie znanym jako neonefrogeneza. Natomiast ludzie i inne ssaki wydają się mieć tylko ograniczoną zdolność do regeneracji nabłonka nefronu. Do tej pory mechanizmy odpowiedzialne za te zjawiska regeneracji nerek pozostają słabo poznane. Ponieważ dorosłe nerki danio pręgowanego przechodzą zarówno regenerację nabłonka nefronów, jak i neonefrogenezę, stanowią one znakomity paradygmat eksperymentalny do badania tych zdarzeń. Co więcej, w modelu danio pręgowanego dostępnych jest wiele narzędzi genetycznych i farmakologicznych, które można wykorzystać do nakreślenia mechanizmów komórkowych i molekularnych regulujących regenerację nerek. Jednym z istotnych aspektów takich badań jest ocena struktury i funkcji nefronu. Protokół ten opisuje zestaw technik znakowania, które można wykorzystać do oceny składu nerkowego i badania funkcjonalności nefronów w nerce dorosłego danio pręgowanego. W związku z tym metody te mają szerokie zastosowanie w przyszłej charakterystyce fenotypowej paradygmatów uszkodzenia nerek dorosłego danio pręgowanego, które obejmują między innymi reżimy ekspozycji na nefrotoksyny lub genetyczne metody docelowej śmierci komórek, takie jak technika ablacji komórek za pośrednictwem nitroreduktazy. Co więcej, metody te mogą być wykorzystywane do badania zaburzeń genetycznych w tworzeniu się nerek u dorosłych, a także do oceny stanu nerek podczas modelowania chorób przewlekłych.

Dorosła nerka danio pręgowanego jest doskonałym systemem do regeneracji nerek i badań nad chorobami. Istotnym aspektem takich badań jest ocena struktury i funkcji nefronu. Protokół ten opisuje kilka metodologii, które można zastosować do oceny składu kanalików nefronowych i oceny wchłaniania zwrotnego przez nerki.

Analiza składu i funkcji nefronów w nerce dorosłego danio pręgowanego

The zebrafish model has emerged as a relevant system to study kidney development, regeneration and disease. Both the embryonic and adult zebrafish kidneys ...

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest ocena składu i funkcjonalności segmentów nefronu w nerce dorosłego danio pręgowanego. Osiąga się to poprzez najpierw wstrzyknięcie fluorescencyjnie znakowanej dekstryny do gniazda, które wiąże rybę danio pręgowanego. Drugim krokiem jest usunięcie i unieruchomienie nerki w celu przygotowania tkanki do kolejnych metod znakowania.Następnie nerka jest wybielana w celu usunięcia pigmentacji, a następnie barwiona w celu fluorescencyjnego znakowania pożądanych segmentów nefronu. Wyniki uzyskuje się za pomocą immunofluorescencji, mikroskopii i/lub obrazowania w jasnym polu, które umożliwiają wizualizację anatomii nerki na podstawie wybranego barwnika lub barwników. Poniższe metody znakowania mogą pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie nerek dotyczące anatomii narządów i mogą być wykorzystane do badania składu nefronów i oceny funkcjonalności nerek zarówno przed, jak i po zdarzeniu urazu.Implikacje tych technik rozciągają się w kierunku badania anomalii genetycznych w tworzeniu się nerek u dorosłych i mogą być również stosowane do oceny stanu nerek podczas modelowania chorób przewlekłych. Aby rozpocząć, zdekantuj roztwór ze znieczulonej ryby i ostrożnie umieść zwierzę na mokrej gąbce formy brzusznej. Następnie napełnij strzykawkę insulinową 20 mikrolitrami rozmrażonego roztworu podstawowego dekstryny.Umieścić igłę tak, aby wprowadzenie nastąpiło pod płytkim kątem w brzusznej linii środkowej brzucha. Aby uniknąć nieznacznego wstrzykiwania narządów, należy podnieść igłę zaraz po wstrzyknięciu, aby unieść ścianę ciała i stworzyć przestrzeń, w którą można wstrzyknąć roztwór. Po wstrzyknięciu delikatnie wróć rybę z powrotem do zbiornika, aby wyzdrowiała ze znieczulenia.Na początek zdezynfekuj nadmiar roztworu ze znieczulonej ryby i umieść go na chusteczce lub ręczniku papierowym. Po usunięciu głowy i narządów wewnętrznych użyj bardzo cienkich igieł preparacyjnych, aby rozciąć ściany ciała. Zlokalizuj narząd nerkowy, który przylega do ściany grzbietowej zwierzęcia.Użyj cienkich kleszczy, aby odłączyć nerkę od ściany grzbietowej. Delikatnie umieścić nerkę w pięciomililitrowej szklanej fiolce zawierającej jeden XPBS i myć ją trzy razy przez pięć minut każda. Wyjmij nerkę za pomocą pipety transferowej i umieść ją na czystej szklance Szkiełko z jedną lub dwiema kroplami jednego XPBS.Użyj cienkich kleszczy, aby spłaszczyć nerkę na szkiełku, upewniając się, że żadna tkanka nie zwinęła się ani w inny sposób nie przewróciła się na siebie. Narzędzie z drutu wolframowego może być używane do wykonywania małych nacięć w tkance łącznej, aby ułatwić płaskie ustawienie nerki. Następnie umieść małe kawałki plasteliny na każdym rogu szklanego szkiełka nakrywkowego o wymiarach 18 na 18 milimetrów.Powoli umieść szkiełko nakrywkowe na nerce, zachowując lekki kąt. Aby zminimalizować zatrzymywanie pęcherzyków powietrza, dodaj dodatkową kroplę jednego XPBS, aby w razie potrzeby wypełnić przestrzeń między szkiełkiem nakrywkowym a szkiełkiem. Oddzielna grupa danio pręgowanego jest uśpiona i moczona w utrwalaczu przez noc.Gdy będziesz gotowy, użyj cienkich kleszczyków, aby ostrożnie odłączyć nerkę od grzbietowej ściany ciała i umieścić narząd w szklanej fiolce. Umyj wypreparowaną nerkę trzy razy trzema do pięciu mililitrami jednego XPBS z 0,05% tween przez pięć minut każdy. Następnie usuń roztwór PBS i płucz nerkę trzema mililitrami 5% roztworu sacharozy przez 30 minut.Po tym czasie zastąp roztwór trzema mililitrami 30% sacharozy i przechowuj przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza następnego dnia. Usuń roztwór i umyj nerkę dwa razy przed dodaniem trzech do pięciu mililitrów roztworu wybielającego. Aby usunąć pigmentację melanocytów obecną na narządzie nerkowym, umieść szklaną fiolkę na rotatorze i uważnie obserwuj, jak pigmentacja znika.Depigmentacja trwa zazwyczaj około 20 minut, ale czasami może trwać nawet 60 minut. Jeśli roztwór wybielający zostanie pozostawiony zbyt długo, może dojść do rozpadu, dlatego zaleca się monitorowanie próbki co 10 do 15 minut w celu sprawdzenia integralności po dwukrotnym usunięciu pigmentacji z płukania nerek i inkubację z 4% roztworem PFA przez godzinę w temperaturze pokojowej. Następnie usuń 4% roztwór PFA i umyj nerkę trzy razy po ostatnim płukaniu w trzech do pięciu mililitrach roztworu blokującego i inkubuj nerkę w temperaturze pokojowej przez dwie godziny.Po zakończeniu blokowania przejdź bezpośrednio do wybranego protokołu barwienia. Usunąć roztwór blokujący i umyć nerkę trzy razy, zanim nerka zanurzy się w jednym XPBS przez co najmniej 10 minut. W tym czasie przenieś nerkę do 12-dołkowego lub 24-dołkowego naczynia hodowlanego.Zastąp jeden XPBS wystarczającym roboczym roztworem substratu fosfatazy alkalicznej, aby pokryć próbkę i umieść próbkę na rotatorze na 30 minut w temperaturze pokojowej. Po tym czasie należy zatrzymać reakcję, przemłukując nerkę roztworem buforowym fosfatazy alkalicznej. Przepłukać nerkę trzema zmianami roztworu buforowego do przemywania przez 10 do 15 minut.Następnie usuń roztwór buforowy do przemywania i zamontuj nerkę na czystej szklance. Wsunąć podłoże montażowe fosfatazy zawarte w zestawie do etykietowania. Wizualizuj nerkę zabarwioną fosfatazą alkaliczną za pomocą mikroskopu stereoskopowego lub mikroskopu złożonego z podłączonym do zestawu filtrów Debbie.Najpierw przygotuj działający roztwór DBA o pojemności 200 mikrolitrów, rozcieńczając DBA w jednym XPBS. Zastąp roztwór PBS 200 mikrolitrami roztworu DBA i umieść próbkę na rotatorze na jedną godzinę w temperaturze pokojowej. Po tym czasie usunąć roztwór DBA i przemyć nerkę trzy razy trzema do pięciu mililitrami jednego XPBS przez pięć minut każdy.Wyjmij jeden XPBS i zamontuj nerkę na czystym szklanym szkiełku. Jak wykazano wcześniej, wizualizuj zabarwione DBA dystalne segmenty nerki za pomocą standardowego filtra Trixie lub Texas Red ustawiony na fluorescencyjnym mikroskopie stereoskopowym lub mikroskopie złożonym. Na tym obrazie w jasnym polu niebielonej nerki pigmentacja odpowiada rozproszonej populacji melanocytów.Tutaj segmenty PCT nefronu są wizualizowane trzy dni po wstrzyknięciu dekstryny. Wstawka zawiera obraz pojedynczego nefronu z melanocytami. To zdjęcie przedstawia dorosłą nerkę po usunięciu pigmentacji melanocytów.Te reprezentatywne obrazy przedstawiają niewielkie różnice morfologiczne między segmentami PCT, podczas gdy wiele nefronowych PCT jest ciasno zwiniętych. Inne nefrony zawierają regiony PCT, które mają minimalną kaskadę zwijania dekstryny niebieskiej dekstryny, żółci Lucyfera i dekstryny fluororubinowej preferencyjnie znakują segmenty PCT w nefronach nerkowych, zarówno dekstryna Cascade Blue, jak i Lucifer Yellow wykazują pewne niespecyficzne znakowanie ze znacznie wyższym tłem obserwowanym w nerkach leczonych żółcią Lucyfera. W przeciwieństwie do tego, dekstryna fluoro Ruby wykazała znacznie zmniejszone tło z intensywnym znakowaniem PCT.Dorosła nerka wybarwiona chęcią wykrycia specyficznego markera typu komórki transportera PCT wykazuje wzorzec ekspresji charakterystyczny dla wychwytu dekstryny z rozkładem różnych ciasno zwiniętych zapętlonych domen PCT, a także bardziej wydłużonych odcinków PCT, które wykazują stałą szeroką średnicę. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak skutecznie oznaczać segmenty nefronu w nerce dorosłego danio pręgowanego, takie jak kanalik proksymalny fosfatazą alkaliczną i kanalik dystalny medyczny za pomocą DBA. Nie zapominaj, że praca z 4% paraldehydem może być bardzo niebezpieczna, a podczas wykonywania tej procedury należy zawsze zachować środki ostrożności, takie jak noszenie płaszcza, rękawiczek i okularów.

analysis-nephron-composition-function-adult-zebrafish

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Analiza składu i funkcji nefronu w nerkach dorosłych rybek zebra

Niniejszy protokół opisuje procedurę identyfikacji i wycinania narządów z dorosłego danio pręgowanego.

Disekcja organów dorosłej rybki zebrafish

Nerka danio pręgowanego jest siedliskiem zarówno nerkowych, jak i krwiotwórczych dorosłych komórek macierzystych i progenitorowych, co stanowi wyjątkową okazję do badania tych typów komórek oraz ich potomstwa w kręgowym organizmie modelowym. W niniejszej pracy prezentujemy szczegółową procedurę sekcji, która umożliwia badaczowi identyfikację i chirurgiczne usunięcie nerki dorosłego danio pręgowanego, co może być wykorzystane w takich zastosowaniach jak izolacja komórek, transplantacja oraz...

Sekcja nerek dorosłego danio pręgowanego

Ostre uszkodzenie nerek (AKI) u ludzi jest częstym problemem klinicznym spowodowanym uszkodzeniem komórek nabłonkowych tworzących nefrony nerkowe, a AKI wiąże się z wysoką śmiertelnością na poziomie 50-70%1. Po zniszczeniu komórek nabłonkowych nefrony mają ograniczoną zdolność do regeneracji, choć mechanizmy i ograniczenia sterujące tym zjawiskiem pozostają słabo poznane. W niniejszym artykule wideo opisujemy naszą technikę celowanej ablacji laserowej komórek nefronu nerki w nerce zarodka ryby...

Ablacja laserowa pronefry ryby danio w celu badania regeneracji nabłonka nerkowego

Ten film pokazuje sekcję i przygotowanie płaskiego mocowania nerki dorosłego danio pręgowanego. Przygotowane płaskie mocowanie można zobrazować pod mikroskopem w celu analizy próbki.

Przygotowanie płaskiego mocowania nerki: procedura preparowania i przygotowania płaskiego mocowania do analizy mikroskopowej nerki dorosłego danio pręgowanego

W tym filmie pokazujemy depigmentację nerki dorosłego danio pręgowanego i jej późniejsze przygotowanie do zabiegów barwienia. Po barwieniu dorosła nerka danio pręgowanego może być wykorzystana do badania regeneracji nerek, charakterystyki fenotypowej modeli chorób nerek i funkcjonalności nefronów.

Depigmentacja i wstępne barwienie nerki danio pręgowanego: technika przygotowania nerki dorosłego danio pręgowanego do barwienia

Tutaj prezentujemy wiarygodną metodę badania regeneracji nerek u dorosłych poprzez wywoływanie ostrego uszkodzenia nerek przez wstrzyknięcie gentamycyny. Pokazujemy, że uraz jest zależny od dawki gentamycyny i temperatury otoczenia, stosując hybrydyzację in situ do znakowania lhx1a+, tworząc nowe nefrony.

Regeneracja nerek u dorosłego danio pręgowanego przez uraz wywołany gentamycyną

Danio pręgowany jest popularnym narzędziem do modelowania przewlekłej choroby nerek (PChN). Jednak ich niewielkie rozmiary uniemożliwiają ocenę funkcji nerek tradycyjnymi metodami. Opisujemy fluorescencyjny test usuwania nerekbarwnika 1, który umożliwia analizę ilościową funkcji nerek danio pręgowanego w PChN.

Ocena funkcji nerek danio pręgowanego za pomocą fluorescencyjnego testu klirensu

Opisana tutaj metoda pozwala na analizę poklatkową rozwoju narządów w zarodkach danio pręgowanego za pomocą fluorescencyjnego mikroskopu preparacyjnego, zdolnego do wykonywania sekcji optycznych i prostych strategii dostosowania w celu skorygowania dryfu ogniskowego i płaskiego.

Analiza rozwoju nerek danio pręgowanego z obrazowaniem poklatkowym przy użyciu mikroskopu preparacyjnego wyposażonego w sekcję optyczną

Uszkodzenia nerek spowodowane nefrotoksynami, które obejmują różne leki, od antybiotyków po chemioterapeutyki, mogą powodować złożone zaburzenia, których patogeneza pozostaje nie do końca poznana. Protokół ten pokazuje, w jaki sposób danio pręgowany może być wykorzystany do modelowania chorób tych stanów, co można zastosować do identyfikacji środków renoprotekcyjnych.

Mikroiniekcja nefrotoksyny u danio pręgowanego w celu modelowania ostrego uszkodzenia nerek

Ten protokół opisuje procedury wywoływania ostrego uszkodzenia nerek (AKI) u dorosłych ryb pręgowanych przy użyciu cisplatyny jako środka nefrotoksycznego. Szczegółowo opisaliśmy etapy oceny odtwarzalności techniki oraz dwie techniki analizy stanu zapalnego i śmierci komórek w tkance nerkowej, odpowiednio cytometrię przepływową i TUNEL.

Model ostrego uszkodzenia nerek wywołanego cisplatyną u dorosłych danio pręgowanego

Danio pręgowany jest ważnym modelem do zrozumienia rozwoju nerek. W tym przypadku protokół hybrydyzacji in situ jest zoptymalizowany pod kątem wykrywania ekspresji genów u larw danio pręgowanego i osobników młodocianych podczas rozwoju mesonephros.

In Situ Hybrydyzacja u larw danio pręgowanego i osobników młodocianych podczas rozwoju Mesonephros

Odkryj metody analizy składu i funkcji nefronów w nerce dorosłego danio pręgowanego z wykorzystaniem fluorescencyjnego znakowania dextriną i mikroskopii. Techniki te umożliwiają szczegółową ocenę anatomii nerki oraz badanie regeneracji i chorób nerek.

Analiza składu i funkcji nefronów w nerce dorosłego danio pręgowanego

Przeglądaj więcej filmów