Analiza rozwoju nerek danio pręgowanego z obrazowaniem poklatkowym przy użyciu mikroskopu preparacyjnego wyposażonego w sekcję optyczną
April 7th, 2016
Opisana tutaj metoda pozwala na analizę poklatkową rozwoju narządów w zarodkach danio pręgowanego za pomocą fluorescencyjnego mikroskopu preparacyjnego, zdolnego do wykonywania sekcji optycznych i prostych strategii dostosowania w celu skorygowania dryfu ogniskowego i płaskiego.
Ogólnym celem tej procedury jest umożliwienie poklatkowej analizy różnych procesów rozwojowych przy użyciu fluorescencyjnego mikroskopu preparacyjnego z prostymi strategiami wyrównania po dryfowaniu w dowolnym kierunku. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie biologii rozwoju, ponieważ umożliwia bezpośrednią obserwację rozwoju tkanek i narządów w żywych zarodkach przez kilka godzin. Główną zaletą tej metody jest to, że jest ona przystępną cenowo i łatwą w użyciu alternatywą dla bardziej złożonych technik zwykle stosowanych do nagrywania poklatkowego rozwijających się tkanek i narządów, takich jak skanowanie laserowe lub mikroskopia świetlana.
Chociaż metoda ta może dostarczyć informacji na temat zmian przestrzennych i czasowych, które zachodzą podczas rozwoju zarodków i larw ryb wymiatających, może być również stosowana do badania wczesnych procesów rozwojowych i innych organizmów modelowych. Ponadto nadaje się do obserwacji dynamicznych procesów zachodzących w organizmach dorosłych, takich jak gojenie i regeneracja korzeni. W ramach przygotowań należy zidentyfikować dorosłe ryby o wysokiej reprodukcji na podstawie transgenicznej linii ekspresji GFP.
Po południu przed mikroiniekcją roślin należy umieścić pięć par samców i samic ryb reprodukcyjnych w pięciu pojemnikach hodowlanych. W pojemnikach trzymaj samca i samicę oddzielone przez wyjmowane sito przez noc. Następnego ranka, zaraz po zapaleniu się świateł, umieść samca i samicę razem nad sitem, co zapobiegnie zjedzeniu jaj.
Teraz obserwuj ryby podczas tarła. Gdy para wyprodukuje około 50 jaj, rozdziel je. Następnie przenieś jaja za pomocą pipety Pasteura na szalkę Petriego wypełnioną wodą z zarodka w celu wykonania pierwszej rundy wstrzyknięcia.
Powtórz ten proces dla każdej sparowanej pary. Jeśli potrzebne są dodatkowe jaja, te same pary godowe można kilkakrotnie zebrać i rozdzielić. W przypadku mikroiniekcji zaawansowane przygotowanie potraw i igieł iniekcyjnych odbywa się w dość standardowy sposób.
Szczegóły znajdują się w protokole tekstowym. Rozpocząć od naładowania przygotowanej igły do wstrzykiwań. Za pomocą końcówki do mikroładowarki wypełnij igłę dwoma mikrolitrami roztworu roboczego MO, a następnie przymocuj igłę do mikromanipulatora.
Następnie można otworzyć końcówkę igły. Oglądając go za pomocą mikroskopu preparacyjnego, użyj pęsety, aby rozprysnąć koniec lub dociśnij końcówkę do sztywnej powierzchni. Następnie skalibruj objętość wstrzyknięcia, wstrzykując roztwór MO do kropli oleju mineralnego na siatkę.
Dostosuj wstrzyknięcie, aby uzyskać krople o wielkości 75 mikronów, co odpowiada około 200 pikolitrom roztworu. Następnie należy przygotować zarodki do wstrzyknięcia. Ułóż około 21 zarodków w stadium komórkowym wzdłuż rowka naczynia do mikroiniekcji z biegunem roślinnym skierowanym w stronę podejścia igły do mikroiniekcji, która znajduje się pod kątem 45 stopni od rowka.
Teraz wstrzyknij zarodki. Za pomocą igły przebić kosmówkę i żółtko, a następnie wstrzyknąć załadowany roztwór Morpholino do żółtka. Działa to w przypadku zarodków w stadium jedno- lub dwukomórkowym.
Po wstrzyknięciu wszystkich zarodków użyj Pasteura o szerokim otworze, aby je zebrać. Przenieś wstrzyknięte zarodki na szalki Petriego wypełnione wodą z zarodków i inkubuj je w temperaturze 28,5 stopni Celsjusza. Późnym popołudniem odsysaj martwe zarodki i wymieniaj wodę z zarodków.
Następnego ranka, po tym jak zarodki przejdą przez gastrulację, zahamuj ich melanizację, zastępując ich wodę wodą zarodkową zawierającą śladową ilość PTU. Bądź ostrożny, PTU zakłóci prawidłowy rozwój przed gastrulacją. Później, na pożądanym etapie rozwoju, dechorionate zarodki za pomocą ostrej pęsety.
Za pomocą mikroskopu chwyć kosmówkę jedną parą pęsety i spróbuj złapać drugą stronę kosmówki drugą parą pęset. Następnie ostrożnie rozsuń pęsetę, nie naruszając zarodka. Następnie znieczulij zarodki trikainą i przystąp do osadzania zarodków i agarozy na 15-mikronowej siatce relokacyjnej umieszczonej w mikronaczyniu ze szklanym dnem.
Następnie załaduj jedną mililitrową porcję stopionej agarozy do 1,5 mililitrowych probówek reakcyjnych. Umieść rurki w blokach grzewczych ustawionych na 36 stopni Celsjusza i poczekaj, aż ostygną. Następnie, za pomocą pipety o szerokim otworze, przenieś zarodek do mikronaczynia.
Odsysać nadmiar wody z zarodka i pokryć zarodek agarozą. Gdy agaroza jest jeszcze płynna, użyj dwóch małych końcówek pipet, aby zorientować zarodki. Umieść interesującą strukturę, w tym przypadku przednercze, jak najbliżej szklanego dna i w bliskim sąsiedztwie siatki.
Siatka nie powinna nakładać się na interesującą strukturę. Korzystne jest umieszczenie do czterech zarodków w różnych mikronaczyniach i zaplanowanie zobrazowania najlepszego z nich. Prawidłowe osadzanie wymaga pewnej praktyki.
Podczas gdy agaroza jest jeszcze płynna, zarodek musi być ustawiony w pożądanej pozycji. Jeśli jest to przednerczew blisko szklanego dna i w odpowiedniej odległości od siatki relokacji. Rutynowo sprawdzaj agarozę.
Gdy będzie wystarczająco twardy, aby utrzymać zarodki, pozwól mu osiąść przez kolejne dwie do trzech minut. Następnie należy nałożyć osadzony zarodek na zarodek wodny zawierający śladowe ilości PTU i trikainy. Zdekantować lub odsysić nadmiar wody z zarodków i zablokować pokrywkę, aby zapobiec parowaniu.
Rezultat nie powinien zawierać żadnych pęcherzyków powietrza. Zarodek można teraz obrazować ze szklanym dnem skierowanym w stronę soczewki obiektywu. Korzystając z preparatu do wykonywania zdjęć poklatkowych, na przykład poprzez wykonywanie zdjęć stosu Z okresowo przez kilka godzin, konieczne jest skorygowanie przesunięcia ogniskowej.
Jeśli to możliwe, zastosuj strategię automatycznego ustawiania ostrości. Przełącz opcję automatycznego ustawiania ostrości w kontrolce oprogramowania. Jako kanał referencyjny wybierz kanał jasnego pola światła przechodzącego, aby zminimalizować fototoksyczność.
Istotne jest również, aby wybrać wystarczająco duży zakres wyszukiwania zależny od próbki, aby autofokus działał poprawnie. Przed zebraniem obrazów umieść określony punkt nadrukowanej siatki blisko interesującej nas struktury na celowniku oprogramowania, a następnie zapisz tę pozycję za pomocą zrzutu ekranu. Następnie, tuż przed zakończeniem każdego interwału czasu obrazowania, odwołaj się do zrzutu ekranu i ponownie dostosuj położenie stolika i ostrość, jeśli autofokus nie jest używany.
Przedstawioną metodę wykorzystano do analizy rozwoju nerek w morfizowanych zarodkach WT1A transgenicznej linii danio pręgowanego. We wczesnych fazach nefrogennych linia ta wybrała zieloną fluorescencję w mezodermie pośredniej, w której powstają przodkowie nerek, a później podczas rozwoju w kanalikach tworzących się i zawiązkach nefronowych. Obrazowanie poklatkowe wykazało prawidłową nefrogenezę w zarodkach kontrolnych, którym wstrzyknięto Morfolino.
Po 20 godzinach od zapłodnienia widoczne były rozwijające się kanaliki pronerczne. Na ich przednich końcach można było wykryć kuliste nagromadzenie komórek reprezentujących tworzące się zawiązki nefronów. W ciągu następnych godzin kanaliki i zawiązki nefronów rosły, a primodia zaczęły się zrastać na linii środkowej.
W przeciwieństwie do tego, nefrosteneza była poważnie zaburzona u mutantów. Chociaż struktury rurkowe GFP dodatnie były widoczne po 20 godzinach od zapłodnienia, były rozproszone i słabo rozwinięte. Obrazowanie poklatkowe wykazało, że zawiązki nefronów nigdy się nie uformowały, a uderzająca liczba komórek fluorescencyjnych znajdujących się poza rozwijającymi się pronefronami migrowała brzusznie, opuszczając pole pronefriczne.
Próbując tego protokołu, należy pamiętać, że brak dodatkowego wyposażenia, takiego jak kontrola temperatury lub stoły zapobiegające parowaniu, wymaga regularnych kontroli pod kątem znoszeń i ponownych regulacji. Po tej procedurze zarodki obrazowe mogą być przetwarzane w celu wykonania innych metod, takich jak immunohistochemia, incetrohipertyzacja lub PCR w czasie rzeczywistym w celu identyfikacji określonych składników komórek, tkanek lub oceny ekspresji genów.
Przegląd
Ta metoda umożliwia analizę time-lapse rozwoju narządów w zarodkach rybki labiryntowej za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej. Pozwala na bezpośrednie obserwowanie tkanek i rozwoju narządów przez kilka godzin, dostarczając wglądu w biologię rozwoju.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Biologia rozwoju
- Embriologia rybki labiryntowej
- Techniki mikroskopowe
Tło
- Zdjęcia time-lapse są kluczowe dla badań procesów rozwojowych.
- Tradycyjne metody mogą być skomplikowane i drogie.
- Ta metoda oferuje prostszą i tańszą alternatywę.
- Może być stosowana do różnych organizmów modelowych.
Cel badania
- Aby ułatwić obserwację rozwoju narządów w żywych zarodkach.
- Aby zapewnić metodę łatwą w użyciu i opłacalną.
- Aby umożliwić badaczom badanie dynamicznych procesów rozwojowych.
Stosowane metody
- Przygotowanie dorosłych ryb labiryntowych do rozmnażania.
- Wstrzyknięcie mikro-iniekcyjne roztworów Morpholino do zarodków.
- Zanurzenie zarodków w agarose do celów obrazowania.
- Zdjęcia time-lapse za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej.
Główne wyniki
- Udana obserwacja rozwoju narządów w zarodkach rybki labiryntowej.
- Wykazano skuteczność metody dla zdjęć time-lapse.
- Dostarczono wglądu w zmiany przestrzenne i czasowe podczas rozwoju.
- Pokazano możliwość zastosowania do innych procesów rozwojowych i organizmów.
Wnioski
- Ta metoda jest cennym narzędziem dla badań w biologii rozwoju.
- Upraszcza proces obserwacji żywych zarodków w czasie.
- Otwiera nowe szanse na badanie różnych zjawisk rozwojowych.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
This method provides an accessible approach for time-lapse imaging of organogenesis in zebrafish embryos, enabling direct observation of developmental processes without requiring complex or expensive microscopy infrastructure. By supporting longitudinal imaging of tissue dynamics in a vertebrate model, it facilitates early-stage target validation and mechanistic de-risking in discovery pipelines. The technique offers a cost-effective alternative for generating quantitative, reproducible data on morphogenetic events relevant to disease modeling and phenotypic screening.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of gene function in kidney development by visualizing spatial and temporal alterations in nephrogenesis upon wt1a knockdown.
- Operational Value: Supports hypothesis testing through direct visualization of pronephric tubule formation and nephron primordia fusion in live embryos.
- Predictive Value: Facilitates assessment of phenotypic severity in morphant models, aiding in target confidence evaluation for renal disease pathways.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative z-stack and time-lapse readouts of fluorescently labeled kidney structures for comparative analysis between control and perturbed conditions.
- Operational Value: Utilizes a fluorescence dissecting microscope with autofocus and relocation grids to minimize drift, enhancing reproducibility across imaging sessions.
- Assay Readiness: Produces standardized imaging outputs that can be used to establish baseline phenotypes for compound screening or genetic modifier studies.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Enables observation of conserved developmental processes in zebrafish, a disease-relevant system for modeling human kidney disorders.
- Mechanistic De-risking: Allows tracking of cellular migration and tubule morphogenesis defects, providing insight into off-target or pathway-specific effects of genetic perturbations.
- Preclinical Alignment: Supports progression from discovery to preclinical validation by establishing dose- or time-dependent phenotypic readouts.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target hypothesis testing through lead identification, particularly for renal pathways where dynamic tissue imaging informs mechanism of action and phenotypic outcome.
- Discovery Biology: Supports functional validation of targets like wt1a by enabling real-time observation of downstream developmental consequences in a living system.
- Screening: Generates reproducible fluorescence-based readouts suitable for assessing compound effects on kidney morphogenesis in a vertebrate context.
- Analytics: Provides quantitative measurements of tubule length, primordia formation, and cellular localization over time, enabling objective comparison across experimental groups.
- Translational Research: Connects early developmental phenotypes to later-stage organ dysfunction, supporting biomarker-aligned assessment of renal toxicity or repair.
- Enterprise Reuse: Represents a scalable imaging capability that can be applied across multiple developmental models and organ systems with minimal reconfiguration.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity in target validation by linking genetic perturbation to observable developmental defects in a physiological context.
- Operational Value: Enhances reproducibility through hardware-based drift correction (autofocus, relocation grids) and standardized embryo preparation.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision efficiency by providing early, visual confirmation of pathway modulation in a whole-organism assay.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets based on severity and specificity of developmental phenotypes observed in vivo.
Implementation Considerations
- Requires expertise in zebrafish husbandry, microinjection, and embryo staging for successful application.
- Dependent on fluorescence dissecting microscope with z-stack capability and software supporting autofocus and stage repositioning.
- Necessitates standardization of agarose embedding and embryo orientation to ensure consistent imaging quality across users and sessions.
- Adaptation to other organs or models may require changes in transgenic reporters, injection timing, or developmental staging.
- Practical limitations include lower throughput compared to automated systems and manual effort required for drift monitoring when autofocus is not used.
