Analiza rozwoju nerek danio pręgowanego z obrazowaniem poklatkowym przy użyciu mikroskopu preparacyjnego wyposażonego w sekcję optyczną

Ogólnym celem tej procedury jest umożliwienie analizy time-lapse różnorodnych procesów rozwojowych przy użyciu fluorescencyjnego mikroskopu dissectingowego, z zastosowaniem prostych strategii ponownego ustawienia po przesunięciu preparatu w dowolnym kierunku. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania z dziedziny biologii rozwoju, ponieważ pozwala na bezpośrednią obserwację rozwoju tkanek i organów w żywych embrionach przez kilka godzin. Główną zaletą tej metody jest to, że stanowi ona przystępną cenowo i łatwą w użyciu alternatywę dla bardziej złożonych technik zazwyczaj stosowanych do rejestracji time-lapse rozwijających się tkanek i organów, takich jak mikroskopia skaningowa laserowa lub mikroskopia z oświetleniem.

Chociaż metoda ta może dostarczyć informacji o zmianach przestrzennych i czasowych występujących podczas rozwoju zarodków i larw ryby sweeper, można ją również zastosować do badania wczesnych procesów rozwojowych u innych organizmów modelowych. Ponadto nadaje się ona do obserwacji procesów dynamicznych u osobników dorosłych, takich jak gojenie i regeneracja korzeni. W ramach przygotowań należy wyselekcjonować wysoce reprodukcyjne dorosłe ryby z transgenicznej linii wykazującej ekspresję GFP.

Popołudniem, w dniu poprzedzającym mikroiniekcję roślin, umieść pięć par samców i samic ryb rozrodczych w pięciu pojemnikach hodowlanych. W pojemnikach utrzymuj samca i samicę oddzielnie za pomocą wyjmowanego sita przez całą noc. Następnego ranka, tuż po zapaleniu świateł, umieść samca i samicę razem nad sitem, co zapobiegnie zjadaniu przez nie ikry.

Teraz obserwuj ryby podczas tarła. Gdy para złoży około 50 jaj, oddziel je od siebie. Następnie przenieś jaja za pomocą pipety Pasteura do szalki Petriego wypełnionej wodą do embrionów w celu przeprowadzenia pierwszej serii iniekcji.

Powtórz ten proces dla każdej pary kopulacyjnej. Jeśli potrzebne są dodatkowe jaja, te same pary mogą być ponownie łączone i rozdzielane kilka razy. W przypadku mikroiniekcji, wstępne przygotowanie szalek i igieł do iniekcji przeprowadza się w sposób standardowy.

Szczegółowe informacje znajdują się w protokole tekstowym. Należy rozpocząć od załadowania przygotowanej igły do iniekcji. Używając końcówki mikroładownika, należy wypełnić igłę od tyłu 2 µL roztworu roboczego MO, a następnie zamocować igłę w mikromanipulatorze.

Następnie można otworzyć końcówkę igły. Obserwując ją pod mikroskopem sekcyjnym, należy użyć pęsety, aby rozewrzeć koniec, lub docisnąć końcówkę do twardej powierzchni. Następnie należy skalibrować objętość wstrzykiwania, wstrzykując roztwór MO do kropli oleju mineralnego na siatce pomiarowej.

Dostosuj wtryskiwanie tak, aby uzyskać krople o wielkości 75 mikronów, co będzie odpowiadać około 200 pikolitrom roztworu. Następnie przygotuj zarodki do wstrzyknięcia. Ułóż zarodki w stadium około 21 komórek wzdłuż rowka naczynia do mikroiniekcji, tak aby biegun wegetatywny był skierowany w stronę igły do mikroiniekcji, która znajduje się pod kątem 45 stopni względem rowka.

Następnie należy wstrzyknąć roztwór do embrionów. Za pomocą igły należy przebić błonę chorionową oraz żółtko, a następnie wstrzyknąć przygotowany roztwór Morpholino do żółtka. Metoda ta jest odpowiednia dla embrionów w stadium jednego lub dwóch komórek.

Po wstrzyknięciu wszystkich embrionów, użyj pipety Pasteura o szerokim otworze, aby je zebrać. Przenieś wstrzyknięte embriony do naczyń Petri wypełnionych wodą dla embrionów i inkubuj je w temperaturze 28,5 °C. Później po południu odessij martwe embriony i wymień wodę dla embrionów.

Następnego ranka, po przejściu embrionów przez gastrulację, należy zahamować ich melanizację, zastępując wodę wodą dla embrionów zawierającą śladową ilość PTU. Należy zachować ostrożność, ponieważ PTU zaburza prawidłowy rozwój przed gastrulacją. Później, na pożądanym etapie rozwoju, należy usunąć osłonki chorionowe z embrionów za pomocą ostrych pincet.

Korzystając z mikroskopu, chwyć chorion jedną pęsetą, a następnie spróbuj chwycić drugą stronę chorionu drugą pęsetą. Następnie ostrożnie rozsuń pęsety, nie uszkadzając zarodka. Potem znieczul zarodki Tricaine, a następnie przystąp do osadzania zarodków i agarozy na siatce relokacyjnej 15 micron umieszczonej w mikropłytce z dnem z lamellki.

Następnie nanieś alikwoty 1 ml roztopionej agarozy do probówek reakcyjnych o pojemności 1,5 ml. Umieść probówki w blokach grzewczych ustawionych na 36 °C i poczekaj, aż ostygną. Następnie, używając pipety o szerokim wylocie, przenieś embrion do mikrodyszki.

Odssać nadmiar wody z embrionami i przykryć embrion agarozą. Gdy agaroza jest jeszcze w stanie ciekłym, użyć dwóch małych końcówek do pipety, aby zorientować embriony. Ustawić strukturę, która jest przedmiotem badania – w tym przypadku pronefros – jak najbliżej szklanego dna oraz w bezpośrednim sąsiedztwie siatki.

Siatka nie powinna nakładać się na badaną strukturę. Zaleca się osadzenie do czterech embrionów w oddzielnych mikro-szalkach i zaplanowanie obrazowania tego najlepiej zachowanego. Prawidłowe osadzanie wymaga pewnej wprawy.

Dopóki agaroza pozostaje w stanie ciekłym, należy zorientować embrion w pożądanej pozycji. Upewnij się, że pronefros znajduje się blisko szklanego dna i w odpowiedniej odległości od siatki relokacyjnej. Regularnie sprawdzaj stan agarozy.

Gdy żel będzie wystarczająco twardy, aby utrzymać embriony, należy odczekać kolejne dwie do trzech minut. Następnie osadzone embriony należy przykryć wodą dla embrionów zawierającą śladowe ilości PTU i tricainy. Nadmiar wody dla embrionów należy odlać lub odessać, a następnie zamknąć pokrywkę, aby zapobiec parowaniu.

Wynik nie powinien zawierać pęcherzyków powietrza. Embrion można teraz obrazować, kierując szklanym dnem w stronę obiektywu. Przy wykorzystaniu preparatu do wykonywania obrazowania poklatkowego, na przykład poprzez okresowe robienie zdjęć w stosie Z (Z-stack) przez kilka godzin, konieczna jest korekta dryfu ostrości.

Jeśli to możliwe, zastosuj strategię automatycznego ustawiania ostrości. Włącz opcję auto-focus w panelu sterowania oprogramowaniem. Dla kanału referencyjnego wybierz kanał światła transmitowanego w jasnym polu, aby zminimalizować fototoksyczność.

Niezbędne jest również wybranie odpowiednio szerokiego zakresu wyszukiwania w obrębie preparatu, aby autofokus działał prawidłowo. Przed rozpoczęciem akwizycji obrazów należy ustawić wybrany punkt naniesionej siatki w pobliżu badanej struktury w centrum celownika oprogramowania, a następnie zapisać tę pozycję, wykonując zrzut ekranu. Następnie, tuż przed zakończeniem każdego interwału czasowego obrazowania, należy odnieść się do zrzutu ekranu i skorygować położenie stolika oraz ostrość, jeśli autofokus nie jest używany.

Przedstawiona metoda została wykorzystana do analizy rozwoju nerek w embrionach linii transgenicznej danio przebrzuchego poddanych morfizacji WT1A. Podczas wczesnej nefrogenezy linia ta wykazywała zieloną fluorescencję w mezodermie pośredniej, w której powstają progenitory nerek, a w późniejszym etapie rozwoju w formujących się cewkach i prymordiach nefronów. Obrazowanie time-lapse wykazało prawidłową nefrogenezę w embrionach kontrolnych po wstrzyknięciu Morpholino.

W 20 godzinie po zapłodnieniu widoczne były rozwijające się cewkipronefryczne. Na ich przednich końcach można było wykryć sferyczne skupisko komórek reprezentujące tworzące się prymordia nefronów. W ciągu kolejnych godzin cewki i prymordia nefronów rosły, a prymordia zaczęły zlewać się w linii środkowej.

W przeciwieństwie do tego, nefrogeneza była poważnie zaburzona u mutantów. Chociaż 20 godzin po zapłodnieniu widoczne były struktury kanalikowe wykazujące ekspresję GFP, były one rozproszone i niedorozwinięte. Obrazowanie time-lapse wykazało, że primordia nefronów nigdy nie powstały, a znacząca liczba fluorescencyjnych komórek zlokalizowanych poza rozwijającymi się pronefronami migrowała brzusznie, opuszczając pole pronefryczne.

Podczas realizacji niniejszego protokołu należy pamiętać, że brak dodatkowego wyposażenia, takiego jak kontrola temperatury lub stoły przeciwwparne, wymaga regularnego sprawdzania odchyleń i wprowadzania korekt. Po zastosowaniu tej procedury opracowane obrazy embrionów mogą zostać wykorzystane do przeprowadzenia innych metod, takich jak immunohistochemia, in situ hybridization lub real-time PCR, w celu identyfikacji specyficznych komponentów komórek, tkanek lub oceny ekspresji genów.