Ocena funkcji nerek danio pręgowanego za pomocą fluorescencyjnego testu klirensu

Ogólnym celem niniejszej procedury jest opracowanie ilościowego testu funkcji nerek u danio pręgowanego. W tym celu w pierwszej kolejności znieczula się embriony danio pręgowanego w 72. godzinie po zapłodnieniu (HPF). Następnie embriony przenosi się do formy do iniekcji i ustawia tak, aby ich serca znajdowały się po lewej stronie pola widzenia.

Następnie do jamy osierdziowej wstrzykuje się fluorescencyjny barwnik rumine dextra, a następnie za pomocą epifluorescencyjnego mikroskopu stereoskopowego wykonuje się obrazy fluorescencyjne obszaru serca. Ostatecznie za pomocą mikroskopii epifluorescencyjnej ocenia się klirens nerkowy barwnika fluorescencyjnego. Główną zaletą tej techniki jest to, że pozwala ona na ilościową ocenę funkcji nerek u danio pręgowanego bez konieczności przeprowadzania badań krwi lub moczu, które w przypadku tego gatunku nie są możliwe do wykonania.

Metoda ta stanowi potężne narzędzie do oceny funkcji nerek w modelach chorób u danio pręgowanych. Po wyciągnięciu igieł i przygotowaniu formy zgodnie z protokołem tekstowym, odlej formę, wlewając najpierw 2% roztwór agarozy przygotowany w wodzie dla ryb do 90 mm szalki Petriego. Umieść formę na szalce Petriego, pozwalając, aby krawędzie ułożonych warstwowo szkiełek zanurzyły się pod kątem pod powierzchnią agarozy.

Pozostaw do zastygnięcia na 30 minut. Usuń formę do preparatu i użyj świeżej wody dla ryb zawierającej anestetyk tricaina w stosunku 1:25. Przykryj preparat z odciśniętymi osobnikami, aby przeprowadzić wstrzyknięcia barwnika fluorescencyjnego u rybek zebrafish.

Należy użyć standardowego zestawu do mikroiniekcji, składającego się z kompresora powietrza połączonego z systemem regulatora ciśnienia, który zasila prosty uchwyt do pipet przeznaczony do kapilar o średnicy zewnętrznej 1,0. Uchwyt do pipet powinien znajdować się wewnątrz urządzenia MN 33 compact. Trójośowy mikromanipulator sterujący przymocowany do stalowej płyty podstawowej za pomocą podstawy magnetycznej oraz stereomikroskop sekcyjny służący do wizualizacji, manipulacji i iniekcji embrionów, podczas gdy rybki danio są utrzymywane w standardowych warunkach opisanych w protokole tekstowym.

W zależności od wymagań eksperymentu należy użyć linii ryb danio pręgowanych typu dzikiego lub transgenicznych. W celu zapewnienia zebrania maksymalnej liczby ikry bez niepokojenia ryb, należy utrzymać zagęszczenie obsady na poziomie 15 samców i 15 samic na zbiornik o pojemności ośmiu litrów. Wieczorem przed zbiorem należy umieścić zbiorniki tarłowe w zbiornikach z populacją typu dzikiego.

W dniu zbioru należy odczekać od 30 do 40 minut, aż ryby złożą ikrę. Następnie za pomocą sitka o drobnych oczkach i świeżej wody akwariowej należy zebrać i wypłukać jaja. Oczyszczone jaja należy umieścić w 90 milimetrowej szalce Petri zawierającej medium dla embrionów i inkubować w temperaturze 28,5 stopnia Celsjusza, aby zahamować miogenezę.

W ósmym godzinie po zapłodnieniu (HPF) przenieść żywe embriony w minimalnej ilości cieczy do świeżych szalek Petri zawierających 1-100 µM PTU w medium do embrionów i inkubować dalej w temperaturze 28,5 °C.

Używając pęsety z cienkimi końcówkami, należy przełamać koniec igły. Następnie przesuń RD do końcówki igły, maksymalizując czas trwania impulsu do ustawienia minutowego. Gdy roztwór dotrze do końcówki, przełącz z powrotem na milisekundy.

Umieść mikrometr na stoliku mikroskopu, a następnie za pomocą regulatora ciśnienia i korekt końcówki igły dostosuj rozmiar wypuszczanej kropli do średnicy 100 mikronów lub objętości 0,5 nanolitrów przed iniekcją. Przygotuj dwie szalki Petriego o średnicy 35 milimetrów. Każda powinna zawierać pięć mililitrów pożywki dla embrionów; jedną z nich oznacz jako „trica”, a drugą jako „recovery”.

Dodaj 200 µL roztworu zapasowego trica do naczynia oznakowanego jako trica. Po przygotowaniu do iniekcji wybierz pojedynczy embrion w 72 HPF. Przenieś minimalną ilość cieczy do naczynia z trica i monitoruj aktywność embrionu.

Po znieczuleniu zarodka przenieś go do formy do iniekcji i ustaw w korytku tak, aby lewa strona była skierowana do góry. Ustaw serce po lewej stronie pola widzenia. Aby wstrzyknąć RD do serca, użyj igły do przebicia osierdzia i wstrzyknij 1 nanoliter RD do jamy osierdziowej.

Po wyjęciu igły przenieść wstrzyknięty embrion w minimalnej ilości cieczy do szalki regeneracyjnej i obserwować przez jedną minutę. Następnie przenieść poszczególne embriony do płytki 24-dołkowej zawierającej jeden mililitr świeżego medium do embrionów z dodatkiem PTU i odpowiednio je oznakować. Po wstrzyknięciu co najmniej 10 embrionów na grupę eksperymentalną inkubować w temperaturze 28,5 °C przez trzy godziny.

Trzy godziny po wstrzyknięciu (HPI) zarodki znieczulono zgodnie z wcześniejszym opisem. Następnie przeniesiono je do 35-milimetrowej szalki Petriego zawierającej 3% metylocelulozy. Zarodki delikatnie wciśnięto w metylocelulozę i ułożono tak, aby można było obrazować ich stronę boczną.

Używając filtra emisyjnego 570 nanometrów dla światła UV, należy wykonać obraz zarodka. Po wykonaniu zdjęcia należy pozwolić zarodkowi na regenerację przed umieszczeniem go z powrotem w wyznaczonej studzience; należy wykonać obrazy wszystkich wstrzykniętych zarodków, a następnie kontynuować inkubację w temperaturze 28.5 stopni Celsjusza. Po wykonaniu drugiej serii obrazów w 24 HP, wykorzystuję oprogramowanie ImageJ do ilościowego oznaczenia intensywności fluorescencji każdego wstrzykniętego zarodka poprzez otwarcie obrazu i określenie obszaru zainteresowania (ROI).

Wybierając opcję edycji zaznaczenia (edit selection), określ i ustaw wartość na 100 pikseli kwadratowych. Umieść serce w centrum ROI i wybierz analizuj (analyze), a następnie w ustawieniach pomiarów (measurements) zaznacz średnią skalę szarości (mean gray scale) oraz pole powierzchni (area). Następnie wykonaj pomiar, określ intensywność fluorescencji dla każdego zestawu obrazów w czasie 3 HPI oraz 24 HPI na jeden embrion i przenieś średnie wartości skali szarości do arkusza kalkulacyjnego w celu dalszej analizy.

Należy użyć odpowiedniego oprogramowania do przeprowadzenia analizy statystycznej i porównania grup pod kątem istotności statystycznej za pomocą testu t-Studenta, jak pokazano tutaj. Wstrzyknięcie RD do dziewięciu ryb Morpho z knockoutem bbbs spowodowało, że u 40% embrionów rozwinęły się cysty prone fric do piątego dnia po zapłodnieniu. Ponadto ryby morphanty wykazały ograniczoną zdolność do usuwania barwnika fluorescencyjnego po 24 h od wstrzyknięcia (HPI) w porównaniu z grupą kontrolną.

Grupa 10 ryb może zostać poddana iniekcji w ciągu 15 minut. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać dobrą wiedzę na temat wykorzystania przezroczystości optycznej danio pręgowanych do ilościowego monitorowania czasowego oczyszczania z mikroiniekcyjnego barwnika fluorescencyjnego jako skutecznego wskaźnika funkcji nerek danio pręgowanych.