Name: Ocena funkcji nerek danio pręgowanego za pomocą fluorescencyjnego testu klirensu (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-02-20T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 13 s
Description: Naucz się ilościowej oceny funkcji nerek danio pręgowanego za pomocą fluorescencyjnego testu klirensu. Ta metoda umożliwia nieinwazyjne badanie przewlekłej choroby nerek bez konieczności pobierania krwi lub moczu.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Pomoc techniczna świadczona przez Jaipreet Bharj. Prace te były wspierane przez granty z 7PR UE (SYSCILIA -241955) oraz Holenderskiej Fundacji Nerek (CP11.18).

Oświadczenie etyczne: Utrzymanie zwierząt, hodowla i procedury są zdefiniowane i kontrolowane przez Ustawę o zwierzętach (procedury naukowe) z 1986 roku. Wszystkie eksperymenty na zwierzętach zostały przeprowadzone na podstawie licencji udzielonych przez Ministra Spraw Wewnętrznych (PIL nr 70/7892) zgodnie z Biological Services Management Group i Biological Services Ethical Committee, SGUL, Londyn, Wielka Brytania. Dołożono wszelkich starań, aby zmniejszyć liczbę wykorzystywanych zwierząt i udoskonalić zarówno procedury, jak i hodowlę, aby zminimalizować cierpienie i poprawić dobrostan.
1. Przygotowanie instrumentów, środka znieczulającego i barwnika fluorescencyjnego
<ol>
	<li>Za pomocą ściągacza do mikropipet i standardowych kapilar borokrzemianowych o standardowych ściankach (bez włókien) należy wyciągnąć igły o odpowiedniej długości do mikroiniekcji (ryc. 1A).</li>
	<li>Wykonać formę agarozową do orientacji zarodków w celu łatwego wstrzyknięcia do osierdzia (ryc. 1B). Sklej ze sobą około dziesięciu szklanych szkiełek mikroskopowych, aby utworzyć "schody" z offsetowych szkiełek. Aby uzyskać najlepsze rezultaty, użyj kropli szybko wiążącego kleju z żywicy epoksydowej na środku każdego szkiełka.</li>
	<li>Wyciąć odcinek o długości około 78 mm w połowie dwóch plastikowych pipet o pojemności 10 ml za pomocą podgrzewanego skalpela z palnikiem Bunsena, w razie potrzeby usunąć końcówki pipet. Przymocuj i przyklej sekcje pipet (z żywicy epoksydowej) do ułożonych w stos szkiełek szkiełkowych, aby zapewnić stabilność i umożliwić zanurzenie formy w szalce Petriego o średnicy 90 mm. Dołożyć wszelkich starań, aby narożniki prowadnicy były wyrównane prostopadle do podłogi szalki Petriego. Poczekaj, aż klej stwardnieje.</li>
	<li>Odlewać formę w 2% roztworze agarozy wyprodukowanej w wodzie dla ryb (uzyskanej z akwarium). Wlać agarozę do szalki Petriego o średnicy 90 mm i umieścić formę na otwartej szalce Petriego, tak aby ułożone w stos krawędzie szkiełka zanurzyły się pod kątem pod powierzchnią agarozy. Pozostaw na stole laboratoryjnym na 30 minut.</li>
	<li>Zdjąć odlew szkiełka i przykryć agarozę z nadrukiem na szkiełku świeżą wodą rybną zawierającą środek znieczulający Trikaina (patrz krok 1.9) w stosunku 1:25.</li>
	<li>Przygotuj roztwory barwnika dekstranu rodaminy (RD). Ponownie zawiesić dekstran znakowany rodaminą B 10 000 MW w autoklawowanej wodzie ultraczystej, aby uzyskać stężenie wyjściowe 50 mg/ml. W przypadku mikroiniekcji należy dodatkowo rozcieńczyć materiał do końcowego stężenia 5 mg/ml w autoklawowanej wodzie ultraczystej. 
	UWAGA: Pigmentowane komórki zaczynają różnicować się u danio pręgowanego od 24 godzin po zapłodnieniu (hpf); Mogą one zasłaniać markery fluorescencyjne podczas akwizycji obrazu.</li>
	<li>Hamują tworzenie melanocytów za pomocą N-fenylotiomocznika (PTU), który blokuje melanogenezę poprzez hamowanie tyrozynazy. Przygotować 0,003% roztwór podstawowy PTU, rozpuszczając proszek PTU w wodzie akwariowej, podgrzewać roztwór w temperaturze 60 °C do pełnego rozpuszczenia.</li>
	<li>Inkubuj zarodki danio pręgowanego w roztworze błękitu metylenowego, łagodnym fungicydzie, aby zapobiec zakwitom grzybów i zwiększyć przeżywalność. Dodać 2 ml roztworu podstawowego błękitu metylenowego, zawierającego 0,1% błękitu metylenowego w ultraczystej wodzie, do 1 l wody akwariowej i użyć jako standardowej pożywki dla zarodków.</li>
	<li>Uzupełnić stężenie podstawowe 15 mM soli metanosulfonianu trikainy/3-aminobenzoesanu etylu zgodnie z instrukcją zawartą w "Księdze danio pręgowanego" 23. Znieczulić zarodki, a następnie unieruchomić je w celu wykonania zabiegu mikroiniekcji.</li>
	<li>Po znieczuleniu zarodków należy je zorientować do obrazowania, wykorzystując nietoksyczne i lepkie właściwości metylocelulozy. Aby przygotować 200 ml preparatu 3% metylocelulozy, schłodzić 130 ml wody o temperaturze -20 °C przez 30 minut i umieścić na lodzie. Podgrzać 70 ml wody w szklanej zlewce do temperatury 80 °C, dodać 6 g metylocelulozy i mieszać za pomocą szklanej pałeczki aż do zwilżenia i równomiernego rozproszenia. Dodać lodowatą wodę, wymieszać i pozostawić preparat do ostygnięcia w temperaturze 4 °C przez 30 minut, a następnie rozdzielić do probówek o pojemności 50 ml. 
	UWAGA: Obniżenie temperatury pozwala na rozpuszczenie metylocelulozy. Roztwór stanie się gęstszy w miarę uwodnienia proszku. 3% metylocelulozy może być przechowywana bez rozwoju bakterii przez krótkie okresy tygodnia w temperaturze 4 °C lub dłużej w temperaturze -20 °C. Przed użyciem należy upewnić się, że metyloceluloza osiągnęła temperaturę realną.</li>
	<li>Aby wykonać wstrzyknięcia barwnika fluorescencyjnego do danio pręgowanego, należy użyć standardowego zestawu do mikroiniekcji (ryc. 1C). Składa się on ze sprężarki powietrza podłączonej do systemu regulatora ciśnienia, który zasila prosty uchwyt na pipety do użytku z kapilarnami o średnicy zewnętrznej 1,0. Uchwyt na pipety powinien być umieszczony w kompaktowym 3-osiowym mikromanipulatorze MM33 przymocowanym do stalowej płyty podstawy za pomocą stojaka magnetycznego. Zarodki mogą być wizualizowane, manipulowane i wstrzykiwane za pomocą stereoskopowego mikroskopu preparacyjnego.</li>
</ol>
2. Hodowla danio pręgowanego i leczenie przed iniekcją
<ol>
	<li>Utrzymuj danio pręgowanego zgodnie z wcześniejszym opisem23. Użyj zestawu akwariowego, który zapewnia recyrkulację wody o stałej temperaturze 28,5 °C, kondycjonowanej do pH 6,8 - 7,2 i przewodności 450-550 μS odpowiednio z wodorowęglanem sodu i natychmiastową solą morską oceaniczną. Używaj linek do danio pręgowanego typu dzikiego lub transgenicznego, stosownie do doświadczenia, utrzymując gęstość obsady od 15 samców do 15 samic na zbiornik o pojemności 8 litrów. Ustaw fotocykl w obiekcie rybackim na 14 godzin światła dziennego w godzinach od 9 do 23</li>.
	<li>Tarło danio pręgowanego rozpoczyna się na początku fotocyklu, kiedy rano włączają się światła. Aby zapewnić zebranie maksymalnej ilości ikry bez przeszkadzania rybom, wieczorem przed zbiorem zanurz zbiorniki hodowlane (zawierające wkładki siatkowe, dostępne u specjalistów od danio pręgowanego) w zbiornikach hodowlanych typu dzikiego.</li>
	<li>W dniu zbioru odczekaj 30 - 40 minut na tarło ryb, po czym zbierz i opłucz jaja za pomocą sitka do herbaty i świeżej wody akwariowej. Oczyszczone jaja umieścić na szalce Petriego o średnicy 90 mm zawierającej pożywkę dla zarodków i inkubować w temperaturze 28,5 °C.</li>
	<li>Traktuj zarodki PTU w celu zahamowania melanogenezy. Przy 8 hpf przenieść zdolne do życia zarodki w minimalnej ilości płynu na świeże szalki Petriego zawierające 1:100 PTU do pożywki dla zarodków i dalej inkubować w temperaturze 28,5 °C do temperatury 72 hpf. 
	UWAGA: PTU może powodować wady rozwojowe, jeśli jest stosowany we wcześniejszych stadiach, więc powinien być ograniczony do etapów po 8 hpf, ale może być leczony dopiero po 24 hpf. Późne dodanie PTU nie blokuje w pełni pigmentacji oka, ale jest ogólnie skuteczne i hamuje tworzenie się melanocytów tułowia.</li>
</ol>
3. Mikroiniekcja
UWAGA: Osierdzie otacza serce, ale jest oddzielone dla ochrony i łatwości ruchu serca przez płyn w jamie osierdziowej. Celem tego zabiegu jest wstrzyknięcie RD do jamy osierdziowej, co pozwala na szybki wychwyt barwnika do układu naczyniowego.
<ol>
	<li>Załadować igły rozcieńczonym 6 μl RD za pomocą końcówek do mikroładowarki i przymocować do uchwytu igły mikromanipulatora. Złam koniec igły za pomocą kleszczyków z cienką końcówką (Rysunek 1A). Przenieś roztwór RD na końcówkę igły, maksymalizując czas trwania impulsu do ustawienia minut, a po zakończeniu przełącz z powrotem na ms.</li>
	<li>Użyj mikrometru stopniowego, regulatora ciśnienia i udoskonaleń długości końcówki igły (za pomocą kleszczy), aby dostosować rozmiar wydmuchiwanej kropli do 100 μm średnicy, co odpowiada objętości 0,5 nl (rysunek 2A). 
	UWAGA: Podczas łamania igły należy uważać, aby nie odłamać jej zbyt mocno, w przeciwnym razie utrudni to kalibrację objętości wstrzyknięcia. W razie potrzeby należy dodatkowo złamać końcówkę igły, aby zwiększyć rozmiar kropli, jednak należy zachować grubość igły, która umożliwia wejście do osierdzia bez nadmiernego zginania lub uszkodzenia tkanki.</li>
	<li>Przed wstrzyknięciem należy znieczulić zarodki w pożywce zarodkowej zawierającej trikainę. Ustawić 2 szalki Petriego o średnicy 35 mm zawierające 5 ml pożywki dla zarodków, oznaczyć jedną z nich jako "Trikaina", a drugą jako "Odzyskiwanie".</li>
	<li>Do odpowiednio oznakowanego naczynia dodać 200 μl bulionu Tricaine. Gdy będzie gotowy do wstrzyknięcia, wybierz pojedynczy zarodek w temperaturze 72 hpf i przenieś w minimalnej ilości płynu do szalki Tricaine. Monitoruj aktywność zarodka, przetestuj, czy zarodek jest znieczulony i unieruchomiony przez delikatne mieszanie za pomocą ściętej końcówki mikroładowacza.</li>
	<li>Przenieś znieczulony zarodek do formy iniekcyjnej i ustaw zarodek w korycie z agarozą tak, aby lewa strona była skierowana do góry, ustawiając serce po lewej stronie pola widzenia.</li>
	<li>Aby wstrzyknąć RD do serca, przekłuć osierdzie igłą i wstrzyknąć 1 nl RD do jamy osierdziowej znieczulonego zarodka (ryc. 2B, prawy panel). Po wstrzyknięciu należy wyjąć igłę. Przenieść wstrzyknięty zarodek w minimalnej ilości płynu do "naczynia regeneracyjnego" i monitorować przez 1 minutę. Przenieść pojedynczy zarodek na 24-dołkową płytkę zawierającą 1 ml świeżej pożywki dla zarodków (zawierającej PTU) i odpowiednio oznaczyć. 
	UWAGA: Osierdzie jest twarde, jednak na przecięciu znajduje się zauważalny słaby punkt, w którym osierdzie styka się z brzuszno-ogonowymi łukami gardła i grzbietowo-rostralnym woreczkiem żółtkowym (ryc. 2B). Igła powinna być skierowana do tego rowka. Gdy igła jest na swoim miejscu, mocne stuknięcie palcem w mikromanipulator ułatwi wejście do jamy osierdziowej.</li>
	<li>Powtórzyć kroki 3.2 - 3.6 dla co najmniej 10 zarodków na grupę doświadczalną, umieścić każdą rybę w oddzielnym dołku i niepowtarzalnie oznaczyć, aby umożliwić indywidualne obserwacje doświadczalne. Inkubować w temperaturze 28,5 °C przez 3 godziny.</li>
</ol>
4. Akwizycja obrazowania
<ol>
	<li>Po 3 godzinach od wstrzyknięcia (hpi) znieczulić zarodki zgodnie z wcześniejszym opisem i przenieść na szalkę Petriego o średnicy 35 mm zawierającą 3% metylocelulozy. Delikatnie wepchnij zarodki do metylocelulozy i ustaw tak, aby można było zobrazować boczną stronę.</li>
	<li>Uzyskaj obraz zarodka w promieniowaniu UV, używając filtra do wizualizacji emitowanego światła o długości fali 570 nm (ryc. 2C). Po uzyskaniu obrazu pozwól zarodkowi zregenerować się przed umieszczeniem go w wyznaczonym dołku. Pobrać obrazy wszystkich wstrzykniętych zarodków i kontynuować inkubację w temperaturze 28,5 °C. 
	UWAGA: W tym protokole użyliśmy stereoskopu fluorescencyjnego z zestawem filtrów TXR, kamerą DFC300FX i odpowiednim oprogramowaniem użytkowym. Zanotuj dokładne ustawienia akwizycji dla późniejszej akwizycji obrazu.</li>
	<li>Przy 24 hpi uzyskaj drugą rundę obrazów, jak opisano powyżej. Po uzyskaniu wszystkich obrazów, zarówno przy 3 hpi, jak i 24 hpi, humanitarnie pozbyć się zarodków lub wykorzystać je do innych środków eksperymentalnych, np. immunohistochemii.</li>
</ol>
5. Przetwarzanie obrazu
<ol>
	<li>Określ ilościowo intensywność fluorescencji każdego wstrzykniętego zarodka, przy 3 hpi i 24 hpi, analizując obrazy za pomocą oprogramowania ImageJ NIH. Aby zmierzyć intensywność fluorescencji, otwórz obraz w ImageJ i określ obszar zainteresowania (roi) na 100 px2 (Edytuj → zaznaczenie, → określić).</li>
	<li>Umieść serce w środku roi (Rysunek 2C), ustaw pomiary tak, aby obejmowały średnią skalę szarości i obszar (Analizuj → ustaw pomiary), wykonaj pomiar (Analizuj → zmierz). Wypełnij dla każdego zestawu obrazów, przy 3 hpi i 24 hpi, na zarodek i przenieś średnie wartości skali szarości do arkusza kalkulacyjnego w celu dalszego przetwarzania. 
	UWAGA: Wybraliśmy stały rozmiar roi 100 px2, ponieważ obejmuje on poszczególne serca między zarodkami. Serce zostało wybrane do wykonywania pomiarów ze względu na jego duży rozmiar, który umożliwia dogodne miejsce do pomiaru zawartości fluorescencji krwi przed wejściem do nerki.</li>
	<li>Przeprowadzanie analiz statystycznych przy użyciu odpowiedniego oprogramowania statystycznego. Porównywanie grup pod kątem istotności statystycznej za pomocą testu t studenta.</li>
</ol>

<ol><li>Hentschel, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acute+renal+failure+in+zebrafish%3A+a+novel+system+to+study+a+complex+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Renal+Physiol%22%5BJournal%5D)">Acute renal failure in zebrafish: a novel system to study a complex disease.</a> Am J Physiol Renal Physiol. 288 (5), 923-929 (2005).</li>
<li>Drummond, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Making+a+zebrafish+kidney%3A+a+tale+of+two+tubes%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Making a zebrafish kidney: a tale of two tubes.</a> Trends Cell Biol. 13 (7), 357-365 (2003).</li>
<li>Ma, M., Jiang, Y. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Jagged2a-notch+signaling+mediates+cell+fate+choice+in+the+zebrafish+pronephric+duct%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">Jagged2a-notch signaling mediates cell fate choice in the zebrafish pronephric duct.</a> PLoS Genet. 3 (1), e18(2007).</li>
<li>Liu, Y., Pathak, N., Kramer-Zucker, A., Drummond, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Notch+signaling+controls+the+differentiation+of+transporting+epithelia+and+multiciliated+cells+in+the+zebrafish+pronephros%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Notch signaling controls the differentiation of transporting epithelia and multiciliated cells in the zebrafish pronephros.</a> Development. 134 (6), 1111-1122 (2007).</li>
<li>Drummond, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kidney+development+and+disease+in+the+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Soc+Nephrol%22%5BJournal%5D)">Kidney development and disease in the zebrafish.</a> J Am Soc Nephrol. 16 (2), 299-304 (2005).</li>
<li>Cardenas-Rodriguez, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+CCDC28B+reveals+its+role+in+ciliogenesis+and+provides+insight+to+understand+its+modifier+effect+on+Bardet-Biedl+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Genet%22%5BJournal%5D)">Characterization of CCDC28B reveals its role in ciliogenesis and provides insight to understand its modifier effect on Bardet-Biedl syndrome.</a> Hum Genet. 132 (1), 91-105 (2013).</li>
<li>Osborn, D. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+FTO+antagonises+Wnt+signaling+and+leads+to+developmental+defects+associated+with+ciliopathies%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Loss of FTO antagonises Wnt signaling and leads to developmental defects associated with ciliopathies.</a> PLoS One. 9 (2), e87662(2014).</li>
<li>Pearson, C. G., Osborn, D. P., Giddings, T. H., Beales, P. L., Winey, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basal+body+stability+and+ciliogenesis+requires+the+conserved+component+Poc1%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Basal body stability and ciliogenesis requires the conserved component Poc1.</a> J Cell Biol. 187 (6), 905-920 (2009).</li>
<li>Tobin, J. L., Beales, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Restoration+of+renal+function+in+zebrafish+models+of+ciliopathies%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatr+Nephrol%22%5BJournal%5D)">Restoration of renal function in zebrafish models of ciliopathies.</a> Pediatr Nephrol. 23 (11), 2095-2099 (2008).</li>
<li>Torres, V. E., Harris, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autosomal+dominant+polycystic+kidney+disease%3A+the+last+3+years%5BTitle%5D)+AND+%22Kidney+Int%22%5BJournal%5D)">Autosomal dominant polycystic kidney disease: the last 3 years.</a> Kidney Int. 76 (2), 149-168 (2009).</li>
<li>Bogdanova, N., Markoff, A., Horst, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autosomal+dominant+polycystic+kidney+disease+-+clinical+and+genetic+aspects%5BTitle%5D)+AND+%22Kidney+Blood+Press+Res%22%5BJournal%5D)">Autosomal dominant polycystic kidney disease - clinical and genetic aspects.</a> Kidney Blood Press Res. 25 (5), 265-283 (2002).</li>
<li>Harris, P. C., Ward, C. J., Peral, B., Hughes, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polycystic+kidney+disease.+1%3A+Identification+and+analysis+of+the+primary+defect%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Soc+Nephrol%22%5BJournal%5D)">Polycystic kidney disease. 1: Identification and analysis of the primary defect.</a> J Am Soc Nephrol. 6 (4), 1125-1133 (1995).</li>
<li>Reynolds, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aberrant+splicing+in+the+PKD2+gene+as+a+cause+of+polycystic+kidney+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Soc+Nephrol%22%5BJournal%5D)">Aberrant splicing in the PKD2 gene as a cause of polycystic kidney disease.</a> J Am Soc Nephrol. 10 (11), 2342-2351 (1999).</li>
<li>Pazour, G. J., San Agustin, ajt, Follit, J. A., Rosenbaum, J. L., Witman, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polycystin-2+localizes+to+kidney+cilia+and+the+ciliary+level+is+elevated+in+orpk+mice+with+polycystic+kidney+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Polycystin-2 localizes to kidney cilia and the ciliary level is elevated in orpk mice with polycystic kidney disease.</a> Curr Biol. 12 (11), R378-R380 (2002).</li>
<li>Yoder, B. K., Hou, X., Guay-Woodford, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+polycystic+kidney+disease+proteins%2C+polycystin-1%2C+polycystin-2%2C+polaris%2C+and+cystin%2C+are+co-localized+in+renal+cilia%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Soc+Nephrol%22%5BJournal%5D)">The polycystic kidney disease proteins, polycystin-1, polycystin-2, polaris, and cystin, are co-localized in renal cilia.</a> J Am Soc Nephrol. 13 (10), 2508-2516 (2002).</li>
<li>Baker, K., Beales, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Making+sense+of+cilia+in+disease%3A+the+human+ciliopathies%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Med+Genet+C+Semin+Med+Genet%22%5BJournal%5D)">Making sense of cilia in disease: the human ciliopathies.</a> Am J Med Genet C Semin Med Genet. 151C (4), 281-295 (2009).</li>
<li>Veland, I. R., Awan, A., Pedersen, L. B., Yoder, B. K., Christensen, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+cilia+and+signaling+pathways+in+mammalian+development%2C+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nephron+Physiol%22%5BJournal%5D)">Primary cilia and signaling pathways in mammalian development, health and disease.</a> Nephron Physiol. 111 (3), 39-53 (2009).</li>
<li>Hruscha, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+CRISPR%2FCas9+genome+editing+with+low+off-target+effects+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Efficient CRISPR/Cas9 genome editing with low off-target effects in zebrafish.</a> Development. 140 (24), 4982-4987 (2013).</li>
<li>Bedell, V. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+genome+editing+using+a+high-efficiency+TALEN+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">In vivo genome editing using a high-efficiency TALEN system.</a> Nature. 491 (7422), 114-118 (2012).</li>
<li>Eisen, J. S., Smith, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controlling+morpholino+experiments%3A+don%27t+stop+making+antisense%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Controlling morpholino experiments: don't stop making antisense.</a> Development. 135 (10), 1735-1743 (2008).</li>
<li>Gerlach, G. F., Wingert, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kidney+organogenesis+in+the+zebrafish%3A+insights+into+vertebrate+nephrogenesis+and+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Wiley+Interdiscip+Rev+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Kidney organogenesis in the zebrafish: insights into vertebrate nephrogenesis and regeneration.</a> Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 2 (5), 559-585 (2013).</li>
<li>Wingert, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cdx+genes+and+retinoic+acid+control+the+positioning+and+segmentation+of+the+zebrafish+pronephros%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">The cdx genes and retinoic acid control the positioning and segmentation of the zebrafish pronephros.</a> PLoS Genet. 3 (10), 1922-1938 (2007).</li>
<li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWesterfield%2C+M+%22The+zebrafish+book.+A+guide+for+the+laboratory+use+of+zebrafish+%28Danio+Rerio%29%22">The zebrafish book. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio Rerio)</a>. , 4th, Univ. of Oregon Press. Eugene. (2000).</li>
<li>Forsythe, E., Beales, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bardet-Biedl+syndrome%29%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Hum+Genet%22%5BJournal%5D)">Bardet-Biedl syndrome).</a> Eur J Hum Genet. 21 (1), 8-13 (2013).</li>
<li>Corbetta, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+prevalence+of+simple+kidney+cysts+in+patients+with+primary+hyperparathyroidism%5BTitle%5D)+AND+%22J+Endocrinol+Invest%22%5BJournal%5D)">High prevalence of simple kidney cysts in patients with primary hyperparathyroidism.</a> J Endocrinol Invest. 32 (8), 690-694 (2009).</li>
<li>Veleri, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Knockdown+of+Bardet-Biedl+syndrome+gene+BBS9%2FPTHB1+leads+to+cilia+defects%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Knockdown of Bardet-Biedl syndrome gene BBS9/PTHB1 leads to cilia defects.</a> PLoS One. 7 (3), e34389(2012).</li>
<li>Vize, P., Woolf, A. S., Bard, J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aVize%2C+P+%22The+Kidney%3A+From+Normal+Development+to+Congenital+Disease%22">The Kidney: From Normal Development to Congenital Disease</a>. , Academic Press. (2003).</li>
<li>Chang, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Permselectivity+of+the+glomerular+capillary+wall+to+macromolecules.+II.+Experimental+studies+in+rats+using+neutral+dextran%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Permselectivity of the glomerular capillary wall to macromolecules. II. Experimental studies in rats using neutral dextran.</a> Biophys J. 15 (9), 887-906 (1975).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Danio pręgowany stanowi cenne narzędzie do modelowania chorób genetycznych człowieka, a ich wykorzystanie jako instrumentu naukowego do badań in vivo umożliwiło szczegółowe badania genetycznego rozkładu wielu układów biologicznych, w tym nerek. Obecnie wiele wiadomo o tym, jak rozwija się i funkcjonuje nerka danio pręgowanego. Uderzające podobieństwa do ludzkiej nefrostenezy i homologii z genami powodującymi chorobę21 zilustrowały, w jaki sposób danio pręgowany stał się fundamentalny w zrozumieniu, w ...

Ludzka nerka odgrywa kluczową rolę w filtrowaniu odpadów metabolicznych z krwi i odzyskiwaniu wymaganych substancji rozpuszczonych do utrzymania homeostazy komórkowej. Istnieje wiele chorób genetycznych człowieka, które powodują dysfunkcję nerek. Najczęstszą dziedziczną chorobą nerek jest autosomalna dominująca wielotorbielowatość nerek (ADPKD), charakteryzująca się rozwojem wypełnionych płynem worków w kanalikach nerkowych; Uszkodzenia spowodowane cystogenezą są szkodliwe dla funkcji nerek10. ADPKD występuje w stosunku 1:800 - 1:1 000 i stanowi 8 - 10% pacjentów ze schyłkową niewydolnością nerek (ESRF)11. Za ADPKD uważa się kilka genów, w tym policystynę-1 (PKD1) i -2 (PKD2), co stanowi odpowiednio około 85% i 15% przypadków12,13. Ponadto produkty genów PKD1 i -2 lokalizują się w rzęsce i mają fundamentalne znaczenie dla ciliogenezy14,15. Obecnie istnieje uznana rodzina chorób genetycznych u ludzi, znanych jako ciliopaty, które wpływają na funkcję rzęsek i prowadzą do PChN16.
Rosnąca liczba chorób genetycznych człowieka wpływających na rozwój i funkcję rzęsek przyciąga globalne zainteresowanie tą niegdyś uważaną za szczątkową organellę. Rzęska, przypominająca włos wypukłość komórkowa, jest wzbogacona o receptory i kanały jonowe niezbędne do transdukcji kluczowych zdarzeń sygnalizacji komórkowej. Rzęska składa się z aksonemu opartego na mikrotubulach, zwykle zbudowanego z dziewięciu promieniście ułożonych dubletów mikrotubul z centralną parą mikrotubul lub bez niej. Struktura aksonemna określa rodzaj i sposób działania rzęsek. Układ mikrotubul 9+2 nadaje ruchliwość rzęsce, gdzie jest wykorzystywany w ruchu płynów po powierzchniach nabłonka. Konfiguracja 9+0 jest nieruchoma, ale uważa się, że działa głównie w zdarzeniach sygnalizacji komórkowej17. Oprócz PChN, konsekwencjami dysfunkcji rzęsek jest zespół charakterystycznych cech ciliopatii, które obejmują otyłość, zwyrodnienie siatkówki, polidaktylię i upośledzenie funkcji poznawczych16. Przewlekła choroba nerek jest jednak jedną z najbardziej szkodliwych dla jakości życia pacjenta i dlatego jest główną siłą napędową rozwoju odpowiednich modeli in vivo PChN związanych z rzęskami.
Danio pręgowany jest doskonałym modelem do zrozumienia etiologii chorób genetycznych człowieka. Ich szybki rozwój, produkcja dużej liczby jaj, przezroczystości tkanek i wzrost ex utero pozwala na wizualizację procesów rozwojowych danio pręgowanego i manipulowanie zdarzeniami biologicznymi ze znaczną łatwością. Geny mogą być modyfikowane genetycznie za pomocą niedawnych sukcesów narzędzi do edycji genomu (CRISPR18 i TALENS19), niszczone za pomocą technologii antysensownej morfoliny20 lub regulowane farmakologicznie przez dodawanie związków do ich środowiska wodnego. Rzeczywiście, danio pręgowany oferuje platformę do przeprowadzania eksperymentów, które nie są dopuszczalne w innych modelach zwierzęcych. Chociaż danio pręgowany jest stosunkowo prostym kręgowcem (w porównaniu z ludźmi), mają wiele funkcjonalnie zachowanych narządów, genów i procesów sygnalizacyjnych wspólnych z ludźmi. Na przykład nerka danio pręgowanego jest niezwykle podobna pod względem budowy i funkcji w porównaniu z ludźmi21,22. Jednak w przeciwieństwie do nerki ssaków, która rozwija się poprzez szereg faz, z których każda charakteryzuje się bardziej rozwiniętą nerką (pronephros, mesonephros i metanephros), embrionalny danio pręgowany rozwija tylko przednercze, najbardziej niedojrzałą formę nerki. Podczas gdy miliony nefronów można znaleźć jako elementy budulcowe nerki ssaków, zarodek danio pręgowanego posiada tylko dwa. Kłębuszki nerkowe, które pozwalają na początkowy przesącz krwi, są zrośnięte w linii środkowej tuż brzusznie do aorty. Krew filtruje się przez kłębuszki nerkowe do kanalików pronerkowych, które biegną doogonowo wzdłuż osi, łącząc się przed wyjściem przez kloakę. Kanaliki nerczowe są silnie orzęsione ruchliwymi rzęskami, które są przepuszczalne dla przepływu filtratu w kierunku wyjścia ogonowego3,4. Ta prosta struktura pronefryczna utrzymuje homeostazę danio pręgowanego przez kilka tygodni wzrostu larw, gdzie ostatecznie rozwijają się w bardziej złożoną strukturę śródnercza21. Jednak danio pręgowany nigdy nie rozwija metanephros21. Pomimo specyfiki danio pręgowanego, nefron danio pręgowanego jest podzielony na segmenty z profilami ekspresji genów równymi profilom obserwowanym u ssaków, a zatem stanowi niezrównany model nefrostenezy in vivo 3,22.
Rutynowo pacjenci są badani pod kątem czynności nerek za pomocą serii badań krwi i moczu. Zazwyczaj krew jest analizowana pod kątem rozpuszczonych soli, mocznika i kreatyniny. Wysoki poziom mocznika, kreatyniny i nieprawidłowe stężenie soli wskazują na problemy z funkcjonowaniem nerek. Analiza moczu za pomocą paska kolorymetrycznego wykrywa nieprawidłowy poziom białka, krwi, ropy, bakterii i cukru obecnych w próbkach moczu. Takie testy zwykle wymagają około 30 ml moczu lub 5 - 10 ml krwi. Trudno było przełożyć tego typu testy na małe organizmy modelowe in vivo, takie jak danio pręgowany, głównie ze względu na niemożliwy charakter zebrania wystarczającej ilości krwi lub moczu do przeprowadzenia testu. W tym miejscu zajmiemy się brakiem odpowiednich testów funkcji nerek danio pręgowanego i opiszemy innowacyjną technikę jego badania. Wstrzykując barwnik fluorescencyjny do krwiobiegu, jesteśmy w stanie monitorować i indywidualnie określać ilościowo w czasie filtrację i wydalanie aktywności fluorescencyjnej z krwi przez nerki. Metoda ta może być wykorzystana do badania uszkodzeń nerek spowodowanych chorobą, której podajemy przykład.

<table><tbody><tr><td>P-97 SUTTER Ściągacz do mikropipet typu płomieniowego/brązowego</td><td>Intracel</td><td>P-97</td><td></td></tr> standardowe <tr><td>kapilary borokrzemianowe o standardowych ściankach</td><td>Aparat Harvarda</td><td>30-0017</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełka mikroskopowe</td><td>VWR International</td><td>631-0109</td><td></td></tr><tr><td>Klej do żywicy epoksydowej</td><td>Evo-Stik</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rodamina B 10 000 MW z oznaczeniem Dextran</td><td>Life technologies&nbsp;</td><td>D-1824</td><td></td></tr><tr><td>N-fenylotiomocznik&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>P7629</td><td></td></tr><tr><td>Blues metylenowy&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M9140</td><td></td></tr><tr><td>Sól metanosulfonianu etylu 3-aminobenzoesanu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5040</td><td></td></tr><tr><td>metyloceluloza</td><td>Sprężarka powietrza Sigma-Aldrich</td><td>M0512</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Jun-Air</td><td>OF302-15</td><td></td></tr><tr><td>Picospritzer III&nbsp;</td><td>Instrumenty Parker&nbsp;</td><td>051-0500-900</td><td></td></tr><tr><td>Kompaktowy 3-osiowy mikromanipulator sterujący&nbsp;</td><td>Marzhauser</td><td>MM33&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop preparacyjny stereoskopowy</td><td>Nikon</td><td>SMZ1000</td><td></td></tr><tr><td>końcówki do mikroładowarek</td><td>Eppendorf</td><td>5242956003</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 kleszcze&nbsp;</td><td>Mikrometr stopniowy Sigma-Aldrich</td><td>F6521</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Pyser- SGI</td><td>02A00404</td><td></td></tr></tbody></table>

ocena funkcji nerek danio pręgowanego za pomocą fluorescencyjnego testu klirensu

Evaluation of Zebrafish Kidney Function Using a Fluorescent Clearance Assay

Zarodek danio pręgowanego stanowi łatwy do wykonania model do badania organogenezy i modelowania chorób genetycznych człowieka. Pomimo swojej względnej prostoty nerka danio pręgowanego rozwija się i funkcjonuje prawie tak samo jak ludzie. Główną różnicą w budowie ludzkiej nerki jest obecność milionów nefronów w porównaniu z danio pręgowanym, który ma tylko dwa. Jednak uproszczenie tak złożonego systemu do podstawowych jednostek funkcjonalnych pomogło nam zrozumieć, jak rozwija się i działa nerka. U danio pręgowanego kłębuszki nerkowy znajdujący się w linii środkowej jest odpowiedzialny za początkową filtrację krwi do dwóch kanalików przednerczowych, które rozchodzą się, biegnąc dwustronnie w dół osi zarodka, zanim zrośnią się ze sobą w kloace. Kanaliki pronefriczne są silnie zaludnione przez ruchliwe rzęski, które ułatwiają ruch filtratu wzdłuż segmentowanego kanalika, umożliwiając wymianę różnych substancji rozpuszczonych przed ostatecznym wyjściem przez kloakę2-4. Wiele genów odpowiedzialnych za PChN, w tym te związane z ciliogenezą, badano u danio pręgowanego5. Jednak główną wadą jest trudność w ocenie funkcji nerek danio pręgowanego po manipulacji genetycznej. Tradycyjne testy do pomiaru dysfunkcji nerek u ludzi okazały się nietranslacyjne dla danio pręgowanego, głównie ze względu na ich środowisko wodne i niewielkie rozmiary. Na przykład fizycznie nie jest możliwe pobranie krwi od ryb w stadium zarodkowym w celu analizy zawartości mocznika i kreatyniny, ponieważ są one zbyt małe. Ponadto danio pręgowany nie wytwarza wystarczającej ilości moczu do badania na prostym wskaźniku białkomoczu, który często wykonuje się podczas wstępnych badań pacjenta. Opisujemy test fluorescencyjny, który wykorzystuje przezroczystość optyczną danio pręgowanego do ilościowego monitorowania klirensu barwnika fluorescencyjnego w czasie z układu krwionośnego i na zewnątrz przez nerki, aby uzyskać odczyt funkcji nerek1,6-9.

Zespół Bardeta-Biedla (BBS) to rzadka, heterogeniczna ciliopatia, która dotyka około 1:160 000 osób na całym świecie16. U pacjentów występuje szereg problemów towarzyszących, w tym wielotorbielkowatość nerek, w wyniku czego pacjenci często wymagają dializ lub transplantacji nerek24. Schyłkowa niewydolność nerek (ESRF) jest najczęstszą przyczyną zgonów w BBS, a około 30% pacjentów rozwija przewlekłą chorobę nerek (CKD)16. Obecnie z BBS powiązano 20 niezwiązanych ze sobą genów, przy czym ni...

Danio pręgowany jest popularnym narzędziem do modelowania przewlekłej choroby nerek (PChN). Jednak ich niewielkie rozmiary uniemożliwiają ocenę funkcji nerek tradycyjnymi metodami. Opisujemy fluorescencyjny test usuwania nerekbarwnika 1, który umożliwia analizę ilościową funkcji nerek danio pręgowanego w PChN.

Ocena funkcji nerek danio pręgowanego za pomocą fluorescencyjnego testu klirensu

The zebrafish embryo offers a tractable model to study organogenesis and model human genetic disease. Despite its relative simplicity, the zebrafish ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest opracowanie ilościowego testu funkcji nerek u danio pręgowanego. W tym celu w pierwszej kolejności znieczula się embriony danio pręgowanego w 72. godzinie po zapłodnieniu (HPF). Następnie embriony przenosi się do formy do iniekcji i ustawia tak, aby ich serca znajdowały się po lewej stronie pola widzenia.Następnie do jamy osierdziowej wstrzykuje się fluorescencyjny barwnik rumine dextra, a następnie za pomocą epifluorescencyjnego mikroskopu stereoskopowego wykonuje się obrazy fluorescencyjne obszaru serca. Ostatecznie za pomocą mikroskopii epifluorescencyjnej ocenia się klirens nerkowy barwnika fluorescencyjnego. Główną zaletą tej techniki jest to, że pozwala ona na ilościową ocenę funkcji nerek u danio pręgowanego bez konieczności przeprowadzania badań krwi lub moczu, które w przypadku tego gatunku nie są możliwe do wykonania.Metoda ta stanowi potężne narzędzie do oceny funkcji nerek w modelach chorób u danio pręgowanych. Po wyciągnięciu igieł i przygotowaniu formy zgodnie z protokołem tekstowym, odlej formę, wlewając najpierw 2% roztwór agarozy przygotowany w wodzie dla ryb do 90 mm szalki Petriego. Umieść formę na szalce Petriego, pozwalając, aby krawędzie ułożonych warstwowo szkiełek zanurzyły się pod kątem pod powierzchnią agarozy.Pozostaw do zastygnięcia na 30 minut. Usuń formę do preparatu i użyj świeżej wody dla ryb zawierającej anestetyk tricaina w stosunku 1:25. Przykryj preparat z odciśniętymi osobnikami, aby przeprowadzić wstrzyknięcia barwnika fluorescencyjnego u rybek zebrafish.Należy użyć standardowego zestawu do mikroiniekcji, składającego się z kompresora powietrza połączonego z systemem regulatora ciśnienia, który zasila prosty uchwyt do pipet przeznaczony do kapilar o średnicy zewnętrznej 1,0. Uchwyt do pipet powinien znajdować się wewnątrz urządzenia MN 33 compact. Trójośowy mikromanipulator sterujący przymocowany do stalowej płyty podstawowej za pomocą podstawy magnetycznej oraz stereomikroskop sekcyjny służący do wizualizacji, manipulacji i iniekcji embrionów, podczas gdy rybki danio są utrzymywane w standardowych warunkach opisanych w protokole tekstowym.W zależności od wymagań eksperymentu należy użyć linii ryb danio pręgowanych typu dzikiego lub transgenicznych. W celu zapewnienia zebrania maksymalnej liczby ikry bez niepokojenia ryb, należy utrzymać zagęszczenie obsady na poziomie 15 samców i 15 samic na zbiornik o pojemności ośmiu litrów. Wieczorem przed zbiorem należy umieścić zbiorniki tarłowe w zbiornikach z populacją typu dzikiego.W dniu zbioru należy odczekać od 30 do 40 minut, aż ryby złożą ikrę. Następnie za pomocą sitka o drobnych oczkach i świeżej wody akwariowej należy zebrać i wypłukać jaja. Oczyszczone jaja należy umieścić w 90 milimetrowej szalce Petri zawierającej medium dla embrionów i inkubować w temperaturze 28,5 stopnia Celsjusza, aby zahamować miogenezę.W ósmym godzinie po zapłodnieniu (HPF) przenieść żywe embriony w minimalnej ilości cieczy do świeżych szalek Petri zawierających 1-100 µM PTU w medium do embrionów i inkubować dalej w temperaturze 28,5 °C.Używając pęsety z cienkimi końcówkami, należy przełamać koniec igły. Następnie przesuń RD do końcówki igły, maksymalizując czas trwania impulsu do ustawienia minutowego. Gdy roztwór dotrze do końcówki, przełącz z powrotem na milisekundy.Umieść mikrometr na stoliku mikroskopu, a następnie za pomocą regulatora ciśnienia i korekt końcówki igły dostosuj rozmiar wypuszczanej kropli do średnicy 100 mikronów lub objętości 0,5 nanolitrów przed iniekcją. Przygotuj dwie szalki Petriego o średnicy 35 milimetrów. Każda powinna zawierać pięć mililitrów pożywki dla embrionów; jedną z nich oznacz jako „trica”, a drugą jako „recovery”.Dodaj 200 µL roztworu zapasowego trica do naczynia oznakowanego jako trica. Po przygotowaniu do iniekcji wybierz pojedynczy embrion w 72 HPF. Przenieś minimalną ilość cieczy do naczynia z trica i monitoruj aktywność embrionu.Po znieczuleniu zarodka przenieś go do formy do iniekcji i ustaw w korytku tak, aby lewa strona była skierowana do góry. Ustaw serce po lewej stronie pola widzenia. Aby wstrzyknąć RD do serca, użyj igły do przebicia osierdzia i wstrzyknij 1 nanoliter RD do jamy osierdziowej.Po wyjęciu igły przenieść wstrzyknięty embrion w minimalnej ilości cieczy do szalki regeneracyjnej i obserwować przez jedną minutę. Następnie przenieść poszczególne embriony do płytki 24-dołkowej zawierającej jeden mililitr świeżego medium do embrionów z dodatkiem PTU i odpowiednio je oznakować. Po wstrzyknięciu co najmniej 10 embrionów na grupę eksperymentalną inkubować w temperaturze 28,5 °C przez trzy godziny.Trzy godziny po wstrzyknięciu (HPI) zarodki znieczulono zgodnie z wcześniejszym opisem. Następnie przeniesiono je do 35-milimetrowej szalki Petriego zawierającej 3% metylocelulozy. Zarodki delikatnie wciśnięto w metylocelulozę i ułożono tak, aby można było obrazować ich stronę boczną.Używając filtra emisyjnego 570 nanometrów dla światła UV, należy wykonać obraz zarodka. Po wykonaniu zdjęcia należy pozwolić zarodkowi na regenerację przed umieszczeniem go z powrotem w wyznaczonej studzience; należy wykonać obrazy wszystkich wstrzykniętych zarodków, a następnie kontynuować inkubację w temperaturze 28.5 stopni Celsjusza. Po wykonaniu drugiej serii obrazów w 24 HP, wykorzystuję oprogramowanie ImageJ do ilościowego oznaczenia intensywności fluorescencji każdego wstrzykniętego zarodka poprzez otwarcie obrazu i określenie obszaru zainteresowania (ROI).Wybierając opcję edycji zaznaczenia (edit selection), określ i ustaw wartość na 100 pikseli kwadratowych. Umieść serce w centrum ROI i wybierz analizuj (analyze), a następnie w ustawieniach pomiarów (measurements) zaznacz średnią skalę szarości (mean gray scale) oraz pole powierzchni (area). Następnie wykonaj pomiar, określ intensywność fluorescencji dla każdego zestawu obrazów w czasie 3 HPI oraz 24 HPI na jeden embrion i przenieś średnie wartości skali szarości do arkusza kalkulacyjnego w celu dalszej analizy.Należy użyć odpowiedniego oprogramowania do przeprowadzenia analizy statystycznej i porównania grup pod kątem istotności statystycznej za pomocą testu t-Studenta, jak pokazano tutaj. Wstrzyknięcie RD do dziewięciu ryb Morpho z knockoutem bbbs spowodowało, że u 40% embrionów rozwinęły się cysty prone fric do piątego dnia po zapłodnieniu. Ponadto ryby morphanty wykazały ograniczoną zdolność do usuwania barwnika fluorescencyjnego po 24 h od wstrzyknięcia (HPI) w porównaniu z grupą kontrolną.Grupa 10 ryb może zostać poddana iniekcji w ciągu 15 minut. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać dobrą wiedzę na temat wykorzystania przezroczystości optycznej danio pręgowanych do ilościowego monitorowania czasowego oczyszczania z mikroiniekcyjnego barwnika fluorescencyjnego jako skutecznego wskaźnika funkcji nerek danio pręgowanych.

evaluation-zebrafish-kidney-function-using-fluorescent-clearance

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Ocena działania nerek ryby zebrowej z wykorzystaniem fluorescencyjnego testu klaransu

Opisujemy technikę mikroiniekcji aminoglikozydu, gentamyciny, do larw zebrafish w 2. dniu po zapłodnieniu (dpf) w celu wywołania ostrego uszkodzenia nerek (AKI). Opisujemy również metodę immunohistochemii całego preparatu, zatapiania w plastiku i sekcjonowania larw zebrafish w celu wizualizacji uszkodzeń wywołanych przez AKI.

Dożylne mikroiniekcje u larw rybiek zebra w celu badania ostrego uszkodzenia nerek

Transplantacja komórek jest kluczową techniką w badaniu regeneracji tkanek oraz w opracowywaniu terapii chorób opartych na komórkach. Przedstawiamy tutaj technikę mikrochirurgiczną, która umożliwia transplantację genetycznie znakowanych komórek bezpośrednio do nerki dorosłych ryb zebrafish.

Transplantacja komórek bezpośrednio do nerki dorosłych danio-ostroskrzelnych

Nerka danio pręgowanego jest siedliskiem zarówno nerkowych, jak i krwiotwórczych dorosłych komórek macierzystych i progenitorowych, co stanowi wyjątkową okazję do badania tych typów komórek oraz ich potomstwa w kręgowym organizmie modelowym. W niniejszej pracy prezentujemy szczegółową procedurę sekcji, która umożliwia badaczowi identyfikację i chirurgiczne usunięcie nerki dorosłego danio pręgowanego, co może być wykorzystane w takich zastosowaniach jak izolacja komórek, transplantacja oraz...

Sekcja nerek dorosłego danio pręgowanego

W tym filmie pokazujemy depigmentację nerki dorosłego danio pręgowanego i jej późniejsze przygotowanie do zabiegów barwienia. Po barwieniu dorosła nerka danio pręgowanego może być wykorzystana do badania regeneracji nerek, charakterystyki fenotypowej modeli chorób nerek i funkcjonalności nefronów.

Depigmentacja i wstępne barwienie nerki danio pręgowanego: technika przygotowania nerki dorosłego danio pręgowanego do barwienia

Dorosła nerka danio pręgowanego jest doskonałym systemem do regeneracji nerek i badań nad chorobami.  Istotnym aspektem takich badań jest ocena struktury i funkcji nefronu. Protokół ten opisuje kilka metodologii, które można zastosować do oceny składu kanalików nefronowych i oceny wchłaniania zwrotnego przez nerki.

Analiza składu i funkcji nefronów w nerce dorosłego danio pręgowanego

Tutaj prezentujemy wiarygodną metodę badania regeneracji nerek u dorosłych poprzez wywoływanie ostrego uszkodzenia nerek przez wstrzyknięcie gentamycyny. Pokazujemy, że uraz jest zależny od dawki gentamycyny i temperatury otoczenia, stosując hybrydyzację in situ do znakowania lhx1a+, tworząc nowe nefrony.

Regeneracja nerek u dorosłego danio pręgowanego przez uraz wywołany gentamycyną

Danio pręgowany jest doskonałym organizmem doświadczalnym do badania procesów rozwojowych kręgowców i modelowania chorób ludzkich. W tym miejscu opisujemy protokół, w jaki sposób przeprowadzić ręczne, wysokoprzepustowe badanie chemiczne na zarodkach danio pręgowanego z odczytem hybrydyzacji in situ (WISH) w całości.

Ręczne badanie przesiewowe małych cząsteczek zbliżające się do wysokiej przepustowości przy użyciu zarodków danio pręgowanego

Opisana tutaj metoda pozwala na analizę poklatkową rozwoju narządów w zarodkach danio pręgowanego za pomocą fluorescencyjnego mikroskopu preparacyjnego, zdolnego do wykonywania sekcji optycznych i prostych strategii dostosowania w celu skorygowania dryfu ogniskowego i płaskiego.

Analiza rozwoju nerek danio pręgowanego z obrazowaniem poklatkowym przy użyciu mikroskopu preparacyjnego wyposażonego w sekcję optyczną

Uszkodzenia nerek spowodowane nefrotoksynami, które obejmują różne leki, od antybiotyków po chemioterapeutyki, mogą powodować złożone zaburzenia, których patogeneza pozostaje nie do końca poznana. Protokół ten pokazuje, w jaki sposób danio pręgowany może być wykorzystany do modelowania chorób tych stanów, co można zastosować do identyfikacji środków renoprotekcyjnych.

Mikroiniekcja nefrotoksyny u danio pręgowanego w celu modelowania ostrego uszkodzenia nerek

Ta praca przedstawia nowy model in vivo segmentowego uszkodzenia nerek przy użyciu transgenicznego danio pręgowanego GFP. Model pozwala na indukcję celowanej ablacji komórek nabłonka nerek w celu ukazania komórkowych mechanizmów uszkodzenia i naprawy nefronów.

Precyzyjne podejście do ablacji komórkowej do modelowania ostrego uszkodzenia nerek u rozwijającego się danio pręgowanego

Ten protokół opisuje procedury wywoływania ostrego uszkodzenia nerek (AKI) u dorosłych ryb pręgowanych przy użyciu cisplatyny jako środka nefrotoksycznego. Szczegółowo opisaliśmy etapy oceny odtwarzalności techniki oraz dwie techniki analizy stanu zapalnego i śmierci komórek w tkance nerkowej, odpowiednio cytometrię przepływową i TUNEL.

Model ostrego uszkodzenia nerek wywołanego cisplatyną u dorosłych danio pręgowanego

Naucz się ilościowej oceny funkcji nerek danio pręgowanego za pomocą fluorescencyjnego testu klirensu. Ta metoda umożliwia nieinwazyjne badanie przewlekłej choroby nerek bez konieczności pobierania krwi lub moczu.

Ocena funkcji nerek danio pręgowanego za pomocą fluorescencyjnego testu klirensu

Przeglądaj więcej filmów