Ocena funkcji nerek danio pręgowanego za pomocą fluorescencyjnego testu klirensu

Ogólnym celem tej procedury jest wygenerowanie ilościowego testu funkcji nerek u ryb danio pręgowanego. Osiąga się to poprzez pierwsze znieczulenie zarodków danio pręgowanego w temperaturze 72 HPF. Następnie zarodki są przenoszone do formy iniekcyjnej i ustawiane tak, aby ich serca znajdowały się po lewej stronie pola widzenia.

Następnie do jamy osierdzia wstrzykuje się barwnik fluorescencyjny żwacza Dextra i wymagane są obrazy fluorescencyjne okolicy serca za pomocą mikroskopu preparacyjnego epi fluorescencyjnego. Ostatecznie klirens nerkowy barwnika fluorescencyjnego ocenia się za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej. Główną zaletą tej techniki jest to, że daje ona ilościowy odczyt funkcji nerek zebry bez konieczności wykonywania badań krwi lub moczu, które nie są możliwe u danio pręgowanego.

Metoda ta stanowi potężne narzędzie do oceny funkcji nerek w modelach choroby danio pręgowanego. Po wyciągnięciu igieł i przygotowaniu formy zgodnie z protokołem tekstowym, odlew formę, wlewając najpierw 2% roztwór aro wykonany w wodzie rybnej do 90-milimetrowej szalki Petriego. Umieść formę na szalce Petriego, pozwalając ułożonym w stos krawędziom suwaka zanurzyć się pod kątem pod powierzchnią agro.

Pozostaw na 30 minut. Zdejmij odlew szkiełka i użyj świeżej wody rybnej zawierającej środek znieczulający trica w proporcji od 1 do 25. Aby zakryć szkiełko, nadrukowano aros do wykonania zastrzyków z barwnika fluorescencyjnego dla ryb danio pręgowanego.

Należy użyć standardowego zestawu do mikroiniekcji składającego się ze sprężarki powietrza podłączonej do systemu regulatora ciśnienia, który zasila do prostego uchwytu na pipety do użytku z kapilarnami o średnicy zewnętrznej 1,0. Uchwyt na pipety powinien być umieszczony w kompakcie MN 33. Trójosiowy mikromanipulator sterujący przymocowany do stalowej płyty podstawy za pomocą magnetycznego mikroskopu preparacyjnego użytkownika w celu wizualizacji, manipulowania i wstrzykiwania zarodków podczas utrzymywania ryb pręgowanych przy użyciu standardowych warunków, jak opisano w protokole tekstowym.

Użyć lin do nawożenia zebry typu dzikiego lub transgenicznego, stosownie do eksperymentu. Utrzymanie zagęszczenia obsady od 15 samców do 15 samic na ośmiolitrowy zbiornik, aby zapewnić zebranie maksymalnej ilości jaj bez przeszkadzania rybom. Zanurz zbiorniki hodowlane w zbiornikach hodowlanych typu dzikiego wieczorem przed odbiorem.

W dniu zbioru odczekaj od 30 do 40 minut na tarło ryby. Następnie użyj sitka siatkowego i świeżej wody akwariowej, aby zebrać i opłukać jaja. Umieść oczyszczone jaja na 90-milimetrowej szalce Petriego zawierającej zarodek, pożywkę i inkubuj w temperaturze 28,5 stopni Celsjusza, aby zahamować miogenezę.

O ósmej godzinie. Po zapłodnieniu lub HPF. Przenieść zdolne do życia zarodki w minimalnej ilości płynu na świeże szalki Petriego zawierające od 1 do 100 PTU do pożywki dla zarodków i dalej inkubować w temperaturze 28,5 stopnia Celsjusza.

Użyj kleszczyków z cienką końcówką, aby złamać koniec igły. Następnie przesuń RD na końcówkę igły, maksymalizując czas trwania impulsu do ustawienia minut. Gdy roztwór dotrze do końcówki, przełącz się z powrotem na milisekundy.

Umieść mikrometr na stoliku mikroskopu i za pomocą regulatora ciśnienia i udoskonaleń na końcówce igły, dostosuj wielkość kropli wydalania do 100 mikronów średnicy lub objętości 0,5 nanolitra przed wstrzyknięciem. Ustaw 2 szalki Petriego o średnicy 35 milimetrów. Każdy z nich zawiera pięć mililitrów pożywki zarodkowej, oznacza jedną trikę, a drugą regenerację.

Dodaj 200 mikrolitrów bulionu trica do naczynia oznaczonego jako trica. Gdy zarodek jest gotowy do wstrzyknięcia, należy wybrać pojedynczy zarodek o stężeniu 72 HPF. Przenieś minimalną ilość płynu do naczynia trica i monitoruj aktywność zarodka.

Po znieczuleniu zarodka przenieś go do formy wtryskowej i ustaw w korycie tak, aby lewa strona była skierowana do góry. Ustawienie serca po lewej stronie pola widzenia. Aby wstrzyknąć RD do serca, użyj igły do przekłucia osierdzia i wstrzyknij jeden nanolitr RD do jamy osierdzia.

Po wyjęciu igły przenieść wstrzyknięty zarodek w minimalnej ilości płynu do naczynia regeneracyjnego i monitorować przez jedną minutę. Następnie przenieść pojedynczy zarodek na 24-dołkową płytkę zawierającą jeden mililitr świeżej pożywki dla zarodków zawierającej PTU i odpowiednio oznaczyć. Po wstrzyknięciu co najmniej 10 zarodków na grupę eksperymentalną inkubuj w temperaturze 28,5 stopni Celsjusza przez trzy godziny.

Po trzech godzinach od wstrzyknięcia lub znieczuleniu zarodków HPI, jak opisano wcześniej. I przenieś na 35-milimetrową szalkę Petriego zawierającą 3% metylocelulozy. Delikatnie wepchnij zarodki do metylocelulozy i ustaw tak, aby można było zobrazować boczną stronę.

Używając filtra emisyjnego o długości 570 nanometrów dla światła UV, uzyskaj obraz zarodka. Pozwól zarodkowi zregenerować się przed umieszczeniem go w wyznaczonym dołku, uzyskaj obrazy dla wszystkich wstrzykniętych zarodków, a następnie kontynuuj inkubację w temperaturze 28,5 stopnia Celsjusza. Po uzyskaniu drugiej rundy obrazów w temperaturze 24 HP, używam oprogramowania do obrazowania J, aby określić ilościowo intensywność fluorescencji każdego wstrzykniętego zarodka, otwierając obraz i określając obszar zainteresowania lub ROI.

Wybierając opcję Edytuj zaznaczenie, określ i ustaw wartość na 100 pikseli kwadratowych. Umieść serce na środku ROI i wybierz analizę, ustaw pomiary i ustaw pomiary tak, aby obejmowały średnią skalę szarości i obszar. Następnie wykonaj pomiar, określ ilościowo fluorescencję dla każdego zestawu obrazów przy trzech HPI i 24 HPI na zarodek i przenieś średnie wartości skali szarości do arkusza kalkulacyjnego w celu dalszego przetwarzania.

Użyj odpowiedniego oprogramowania do przeprowadzenia analizy statystycznej i porównania grup pod kątem istotności statystycznej za pomocą testu T-studenta, jak pokazano tutaj. Wstrzyknięcie RD do dziewięciu ryb, którym wstrzyknięto morfo, spowodowało, że u 40% zarodków rozwinęły się podatne torbiele fric w ciągu pięciu dni po zapłodnieniu. Ponadto, ryby morfinowe wykazywały zmniejszenie zdolności do usuwania barwnika fluorescencyjnego po 24 HPI w porównaniu z grupą kontrolną.

Raz musi to zrobić grupa 10 ryb może zostać wstrzyknięta w ciągu 15 minut. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak wykorzystać przezroczystość optyczną danio pręgowanego do ilościowego monitorowania czasowego klirensu barwnika fluorescencyjnego z mikroiniekcją jako skutecznego odczytu funkcji nerek danio pręgowanego.