Od wokseli do wiedzy: praktyczny przewodnik po segmentacji złożonych danych 3D z mikroskopii elektronowej
13 sierpnia 2014
Wąskim gardłem dla komórkowej mikroskopii elektronowej 3D jest ekstrakcja cech (segmentacja) w bardzo złożonych mapach gęstości 3D. Opracowaliśmy zestaw kryteriów, które zawierają wskazówki dotyczące tego, które podejście do segmentacji (ręczne, półautomatyczne lub zautomatyzowane) najlepiej nadaje się do różnych typów danych, stanowiąc tym samym punkt wyjścia do skutecznej segmentacji.
Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest segmentacja interesujących cech ze złożonych zestawów danych mikroskopii elektronowej 3D komórek i tkanek do analizy ich kraju organizacji 3D. Osiąga się to poprzez zebranie zestawu danych składającego się z pojedynczych obrazów z mikroskopii elektronowej. Surowe dane 2D są następnie rekonstruowane do objętości 3D i filtrowane w celu zmniejszenia szumów i ulepszenia interesujących funkcji, w drugim kroku oceniane są obiektywne i subiektywne cechy danych, aby poinformować o najlepszym wyborze metody segmentacji.
Następnie, albo ręczne abstrakcję, generowanie modelu, ręczne śledzenie interesujących cech. Automatyczna segmentacja oparta na gęstości lub niestandardowa automatyczna segmentacja dostosowana do potrzeb klienta jest wykonywana w celu wyodrębnienia interesujących cech. Wyniki pokazują końcowe segmentowane modele 3D interesujących cech w oparciu o charakterystykę obrazu i osobiste cele w celu wyboru optymalnego podejścia do segmentacji.
Porównanie różnych podejść do różnych zbiorów danych pomoże wybrać właściwą strategię segmentacji. Pokazujemy różne metody ekstrakcji interesujących nas cech. Biorąc pod uwagę złożoność objętości subkomórkowej elektromikroskopii, każde podejście ma swoje zalety i ograniczenia.
Ogólnie rzecz biorąc, osoby, które są nowicjuszami w segmentacji, mogą mieć trudności, ponieważ określenie najlepszego podejścia dla różnych zestawów danych nie zawsze jest jasne. Wraz z wentylacją dla absolwentów. Tai demonstrujący procedurę będzie BU jako postdoc samochodowy.
W moim laboratorium Amit Hassan, pracownik naukowy w moim laboratorium i Joaquin Korea, inżynier systemów komputerowych w moim laboratorium Ręczne generowanie abstrakcyjnych modeli jest używane, gdy jedynym celem jest stworzenie modelu geometrycznego w celu dokonania pomiarów geometrycznych. Aby rozpocząć, zaimportuj wolumin danych do odpowiedniego programu. Do ręcznego generowania abstrakcyjnych modeli w tej demonstracji używane jest oprogramowanie kymera.
Najpierw wybierz plik i otwórz, aby wyświetlić okno dialogowe otwierania pliku, przejdź do lokalizacji pliku żądanej mapy. Następnie otwórz przeglądarkę woluminów i wybierz styl wyświetlania obiektów, aby wyświetlić dane z różnymi stylami renderowania. Dostosuj próg wyświetlania, przeciągając pionowy pasek na histogramie w oknie przeglądarki głośności.
Poruszaj się po objętości 3D, aby wybrać obszar zainteresowania do segmentacji i w razie potrzeby wyciąć mniejszą objętość podrzędną. W oknie dialogowym przeglądarki woluminu wybierz obiekty, wybór podregionu, kliknij i przeciągnij, aby utworzyć prostokątne pole wokół obszaru zainteresowania. Następnie umieść znaczniki wzdłuż interesującego obiektu i w razie potrzeby połącz je z konsolidatorami, aż model będzie gotowy.
Aby to osiągnąć, z paska menu przeglądarki głośności wybierz narzędzia, okno dialogowe śledzenia głośności. Aby otworzyć tam okno dialogowe śledzenia woluminu, wybierz plik, nowy znacznik. Zbiór. W oknie dialogowym śledzenia głośności sprawdź mysz, umieść znaczniki na dużej gęstości, umieść znaczniki na danych, płaszczyzny przesuwają się i iz znaczniki łączą nowy znacznik z wybranym znacznikiem i łączą kolejno wybrane znaczniki.
Następnie w oknie śledzenia woluminu wybierz opcję umieść znaczniki za pomocą prawego przycisku myszy i wstaw promienie dla znaczników i linków. Następnie kliknij prawym przyciskiem myszy dane głośności, aby rozpocząć układanie znaczników. Znaczniki zostaną automatycznie połączone w oknie dialogowym śledzenia woluminu.
Wybierz plik, zapisz bieżący znacznik. Ustaw następnie znacznik zamknięcia pliku. Zbiór. Otwórz nowy zestaw znaczników, aby rozpocząć tworzenie modelu w drugą żądaną funkcję, która Cię interesuje.
Wykorzystaj kontrastujące kolory między zestawami znaczników, aby podkreślić różnice w cechach. Ręczne śledzenie interesujących cech jest czasochłonnym podejściem stosowanym, gdy gęstość zaludnienia jest stosunkowo niewielka i gdy dokładność ekstrakcji cech jest najważniejsza. Aby rozpocząć importowanie danych woluminu do programu z opcjami ręcznego śledzenia. Oprogramowanie.
Dzięki tej możliwości zazwyczaj oferuje się podstawowe narzędzie do malowania. W tej demonstracji oprogramowanie Amira jest używane do dużych tomów. Wybierz otwarte dane i kliknij prawym przyciskiem myszy nazwę pliku rec.
Następnie kliknij format, wybierz RAW jako duże dane na dysku. Dobra, i załaduj. Wybierz odpowiednie parametry danych pierwotnych z informacji nagłówka i kliknij przycisk OK.
Przełącz i zapisz jako nową nazwę pliku. am plik. W przypadku sekwencji obrazów 3D wybierz pozycję otwarte dane i wybierz nazwę pliku tiff lub nazwę pliku kropka mrmc.
Następnie przełącz, kliknij prawym przyciskiem myszy i wybierz Zapisz jako nazwę pliku am. W oknie przeglądarki 3D wybierz plasterek orto, aby otworzyć plik obrazu. Następnie użyj suwaka na dole, aby poruszać się po wycinkach, aby przyciąć większe dane otwarte jako dane z dużego dysku.
Przełącz nazwę pliku w oknie puli, kliknij prawym przyciskiem myszy i wybierz dostęp do kraty. Wprowadź żądany rozmiar pola, przesuń je do żądanego obszaru i kliknij przycisk Zastosuj. Zapisz nowy plik.
Następnie utwórz plik segmentacji, przełączając plik w oknie puli. Następnie kliknij prawym przyciskiem myszy i wybierz pole etykiety etykiety. Nowy plik zostanie utworzony i automatycznie załadowany w zakładce edytora segmentacji, a także w puli obiektów.
Użyj narzędzia pędzel, aby obrysować obramowanie pierwszego interesującego obiektu. Zmień rozmiar pędzla zgodnie z potrzebami, a następnie użyj wskaźnika myszy, aby obrysować obramowanie interesującego obiektu. Wypełnij obrysowany obszar skrótem F.Dodaj zaznaczenie, klikając przycisk z symbolem plusa.
Postępuj zgodnie z interesującą Cię funkcją przez wszystkie wycinki i powtórz ręczną segmentację śledzenia. Wygeneruj renderowanie powierzchni do wizualizacji i podstawowej analizy jakościowej lub ilościowej zgodnie z instrukcją obsługi oprogramowania na karcie puli obiektów, przełącz etykiety nazw plików am w oknie puli. Następnie kliknij prawym przyciskiem myszy i wybierz generację powierzchni.
Wybierz żądane właściwości powierzchni i kliknij przycisk Zastosuj. W puli zostanie utworzony nowy plik o nazwie surf. Aby zwizualizować wolumin podzielony na segmenty, przełącz nazwę pliku surf w oknie puli.
Następnie kliknij prawym przyciskiem myszy i wybierz widok powierzchni. Wygeneruj powierzchnię do wizualizacji i analizy jakościowej zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Automatyczna segmentacja oparta na gęstości jest stosowana w zestawach danych o dowolnej różnorodności kontrastu, ostrości lub zatłoczenia, aby wycofać interesujące gęstości w celu rozpoczęcia importu danych objętościowych do programu wyposażonego w magiczną różdżkę progową lub inne narzędzia oparte na gęstości do automatycznej segmentacji.
Podobnie jak w przypadku techniki ręcznego śledzenia cech będących przedmiotem zainteresowania, w tej demonstracji użyto oprogramowania Amira dla cech bez wyraźnie rozróżnialnych marginesów. Użyj narzędzia próg, wybierając ikonę progu. Dostosuj suwak, aby dostosować gęstość w żądanym zakresie, tak aby maskowane były tylko interesujące obiekty.
Kliknij w przycisk zaznaczania, a następnie dodaj zaznaczenie, klikając przycisk z symbolem plusa lub skrótem. A wygeneruj powierzchnię do wizualizacji i analizy jakościowej zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Wszystko to czwarte podejście.
Niestandardowa, dostosowana do potrzeb automatyczna segmentacja może być używana do efektywnej segmentacji dużych zbiorów danych, ale wymaga wiedzy w programach takich jak Matlab. Zapoznaj się z dodatkowym filmem na temat segmentacji dostosowanej do potrzeb klienta, aby uzyskać instrukcje krok po kroku dotyczące tej metody: Sześć przykładowych zestawów danych zostało podzielonych na segmenty za pomocą czterech podejść. Ręczne generowanie abstrakcyjnych modeli, ręczne śledzenie interesujących cech, automatyczna segmentacja oparta na gęstości i niestandardowe dostosowane do potrzeb automatyczne generowanie abstrakcyjnych modeli było skuteczne w przypadku żywicy.
Wbudowana barwiona tomografia stereocilii miała na celu stworzenie modelu do celów ilościowych, a nie wyodrębnienie dokładnych gęstości dla tomografii barwionej żywicą ściany komórkowej rośliny. Zautomatyzowana segmentacja oparta na gęstości była najbardziej skuteczna w przypadku szybkiej ekstrakcji celulozy przez wiele warstw. Metody ręczne wymagały więcej wysiłku tylko na kilku wycinkach danych.
Ręczne generowanie abstrakcyjnego modelu pozwoliło na uzyskanie trypletu mikrotubul w tomografii etapowej kinocilium, podczas gdy dwa zautomatyzowane podejścia pozwoliły na szybsze wyodrębnienie gęstości i dlatego były preferowane ze względu na kształt mitochondriów ze skupionych wiązek jonów, skaningowej mikroskopii elektronowej komórek nabłonka piersi. Ręczne śledzenie zapewniło najczystszy wynik, a niska gęstość zaludnienia pozwoliła na szybką segmentację. Biorąc pod uwagę dużą objętość, która wymagała segmentacji, niestandardowa, dostosowana do potrzeb automatyczna segmentacja okazała się najbardziej efektywna w przypadku segmentacji danych bakterii z mikroskopii elektronowej ze skanowaniem szeregowym bloku.
Chociaż czasochłonna, jedyną metodą ekstrakcji skupionej wiązki jonów skaningowej mikroskopii elektronowej błony komórkowej nabłonka piersi było ręczne śledzenie. Rozwój podejść do segmentacji toruje drogę naukowcom z tej rozwijającej się dziedziny strukturalnej biologii komórki do badania i określania komórkowej architektury 3D na poziomie kompleksów makromolekularnych, organelli i komórek w wielu różnych kulturach komórkowych, hodowlach organoidów lub organizmach modelowych. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak wybrać i zastosować optymalne podejście do segmentacji dla swojego zestawu danych.
Przegląd
Niniejsza praca podejmuje problematykę ekstrakcji cech w danych z trójwymiarowej mikroskopii elektronowej. Przedstawia ona zestaw kryteriów, które mają pomóc badaczom w wyborze najodpowiedniejszej metody segmentacji dla różnych typów danych.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Biologia
- Mikroskopia elektronowa
Wstęp
- Trójwymiarowa mikroskopia elektronowa dostarcza szczegółowych informacji na temat struktur komórkowych.
- Segmentacja jest kluczowa dla analizy złożonych trójwymiarowych map gęstości.
- Różne metody segmentacji obejmują podejścia manualne, półautomatyczne oraz automatyczne.
- Wybór odpowiedniej metody może być dla badaczy wyzwaniem.
Cel badania
- Segmentacja interesujących cech z kompleksowych trójwymiarowych zbiorów danych mikroskopii elektronowej.
- Ocena charakterystyki danych w celu podjęcia odpowiednich decyzji dotyczących segmentacji.
- Porównanie różnych strategii segmentacji w celu optymalnej ekstrakcji cech.
Zastosowane metody
- Kolekcja pojedynczych obrazów z mikroskopii elektronowej.
- Rekonstrukcja surowych danych 2D w wolumen 3D.
- Filtrowanie w celu redukcji szumów i uwydatnienia cech.
- Ocena charakterystyki danych w celu wyboru odpowiedniej metody segmentacji.
Główne wyniki
- Zaprezentowano różne metody ekstrakcji cech.
- Przedstawiono końcowe trójwymiarowe modele segmentacyjne opracowane na podstawie wybranych strategii segmentacji.
- Wskazano zalety i ograniczenia każdego podejścia do segmentacji.
- Przedstawiono wytyczne dla badaczy rozpoczynających pracę z segmentacją.
Wnioski
- Skuteczna segmentacja jest niezbędna do analizy danych z trójwymiarowej mikroskopii elektronowej.
- Wybór odpowiedniej metody zależy od specyficznych charakterystyk zbioru danych.
- Niniejsze badanie oferuje ramy pozwalające badaczom na usprawnienie praktyk segmentacji.
Najczęściej Zadawane Pytania
Znaczenie dla Przemysłu
W badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym dokładna analiza ultrastrukturalna 3D komponentów komórkowych jest kluczowa dla walidacji celu oraz ograniczania ryzyka mechanistycznego. Niniejszy przewodnik przedstawia ramy decyzyjne służące do wyboru optymalnych strategii segmentacji w oparciu o charakterystykę danych, co bezpośrednio wspiera powtarzalny screening fenotypowy oraz rozwój testów. Poprzez umożliwienie precyzyjnej wizualizacji i kwantyfikacji kompleksów makromolekularnych oraz organelli, zwiększa on pewność predykcyjną w modelach przedklinicznych i redukuje niejednoznaczność biologiczną we wczesnych etapach odkrywania leków.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia weryfikację hipotez terapeutycznych poprzez wyjaśnienie organizacji 3D kompleksów adhezyjnych i struktur cytoszkieletu.
- Wartość operacyjna: Wspiera ograniczanie ryzyka biologicznego poprzez funkcjonalną walidację celu za pomocą bezpośredniej wizualizacji maszynerii makromolekularnej w kontekście natywnym.
- Wartość prognostyczna: Usprawnia selekcję projektów w portfolio poprzez dostarczenie ilościowych danych strukturalnych do oceny oddziaływania na cel oraz mechanizmu działania.
Przesiewanie i opracowanie testu
- Wartość naukowa: Przygotowuje zwalidowane systemy biologiczne do dalszych etapów analizy poprzez generowanie reprodukowalnych, 3D segmentowanych modeli organelli i struktur komórkowych.
- Wartość operacyjna: Rozwiązuje kwestie standaryzacji i skalowalności testów dzięki spójnemu renderowaniu powierzchni oraz ilościowym wynikom analiz.
- Wartość strategiczna: Umożliwia wiarygodną ocenę związków poprzez zapewnienie gotowości do segmentacji w zróżnicowanych zestawach danych o różnych stosunkach sygnału do szumu oraz gęstości cech.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Wartość naukowa: Omawia znaczenie dla przebiegu choroby, łącząc zmiany ultrastrukturalne w organellach z mechanizmami patofizjologicznymi w systemach modelowych.
- Wartość operacyjna: Opisuje ciągłość procesu od odkrycia do walidacji przedklinicznej, umożliwiając międzyplatformowe porównanie wyników segmentacji.
- Wartość prognostyczna: Koncentruje się na ograniczaniu ryzyka mechanistycznego poprzez redukcję niejednoznaczności w interpretacji ścieżek docelowych dzięki obiektywnej ekstrakcji cech.
Integracja rurociągu i przepływu pracy
Metoda ta integruje się z kontinuum odkryć – od testowania hipotez we wczesnej biologii po identyfikację związków wiodących i walidację przedkliniczną – wspierając decyzje oparte na danych na każdym etapie w oparciu o wierność ultrastrukturalną.
- Biologia odkrywcza: Wyjaśnia, w jaki sposób metoda ta wspiera testowanie hipotez, wyjaśnianie szlaków sygnałowych oraz ograniczanie ryzyka biologicznego poprzez umożliwienie bezpośredniej wizualizacji oddziaływań cech w przestrzeni 3D.
- Screening: Opisuje gotowość testów, ich powtarzalność oraz wyniki ilościowe uzyskane dzięki ustandaryzowanemu renderowaniu powierzchni i ekstrakcji cech w podejściach manualnych, półautomatycznych i automatycznych.
- Analityka: Wskazuje na pomiary, odczyty i wyniki statystyczne, takie jak objętość, powierzchnia oraz parametry morfologiczne, które pomagają zespołom porównywać warunki i oceniać efekty działania związków.
- Badania translacyjne: Łączy metodę z ciągłością badań przedklinicznych i dopasowaniem biomarkerów poprzez powiązanie fenotypów ultrastrukturalnych z wynikami funkcjonalnymi w systemach istotnych dla przebiegu chorób.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Przedstawia metodę jako wielokrotnie wykorzystywalną kompetencję, a nie jednorazową technikę, co umożliwia standaryzację międzyprojektową i transfer wiedzy pomiędzy zespołami.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorstwowy
- Wartość naukowa: Pewność predykcyjna, walidacja celu, redukcja niejednoznaczności mechanistycznej.
- Wartość operacyjna: Standaryzacja, powtarzalność i skalowalność.
- Wartość strategiczna: Lepsze decyzje go/no-go, efektywność kapitałowa i zredukowane ryzyko biologiczne na późnych etapach.
- Wpływ na portfolio: Priorytetyzacja i decyzje o dalszym rozwoju skorygowane o ryzyko.
Kwestie związane z wdrożeniem
- Wymagana wiedza specjalistyczna z zakresu biologii ultrastrukturalnej i interpretacji danych 3D.
- Potrzeby w zakresie instrumentarium i infrastruktury analitycznej, w tym platform do obrazowania EM oraz oprogramowania do segmentacji (np. Amira, Kymera, MATLAB).
- Wymagania dotyczące standaryzacji międzyzespołowej w celu zapewnienia spójnego progowania, śledzenia i stosowania algorytmów w różnych ośrodkach.
- Kwestie adaptacji w różnych systemach modelowych, takich jak komórki, tkanki, organoidy i organizmy modelowe.
- Ograniczenia praktyczne, w tym nakład czasu przy metodach manualnych oraz zapotrzebowanie obliczeniowe dla niestandardowych potoków automatyzacji.
Najczęściej zadawane pytania dotyczące biofarmacji
Chapters in this video
0:05
Title
4:47
Manual Tracing of Features of Interest
2:04
Manual Abstracted Model Generation
8:10
Automated Density-based Segmentation
9:15
Custom-tailored Automated Segmentation
9:41
Results: Application of Four Segmentation Approaches to Example Data Sets
11:29
Conclusion
