Trój- i czterowymiarowe podejścia do wizualizacji i analizy w celu badania wydłużenia osiowego i segmentacji kręgowców

Etapy organogenezy w zarodkach myszy pozostają słabo zbadane, częściowo ze względu na trudną wizualizację złożonych struktur zarodka. Protokół ten opisuje techniki, które umożliwiają wizualizację i analizę 3D i 4D zarodków myszy podczas osiowego wydłużania i segmentacji. Główną zaletą tej techniki jest to, że pozwala naukowcom badać i pokazywać złożone struktury zarodka myszy jako dynamiczne obiekty 3D.

Protokół ten zawiera techniki, które można wykorzystać w badaniu wrodzonych wad rozwojowych wpływających na kręg i rdzeń kręgowy ssaków, takich jak skolioza. Techniki te mogą być również stosowane w systemach modelowych in vitro, umożliwiając w ten sposób badanie rozwoju embrionalnego człowieka. Aby przygotować zarodki myszy między 8.25 dniem embrionalnym a 10.5 dniem embrionalnym do obrazowania na żywo, należy rozciąć zarodki na wstępnie podgrzanym podłożu M2 w temperaturze 37 stopni Celsjusza.

Delikatnie usuń woreczek żółtkowy za pomocą czystych kleszczy i raz umyj zarodek świeżym podłożem M2, aby usunąć krew i zanieczyszczenia powstałe podczas sekcji. Podczas procedury obrazowania na żywo inkubuj zarodki w pożywce DMEM o niskiej zawartości glukozy uzupełnionej 10% FBS zdefiniowanym przez HyClone, dwiema milimolowymi L-glutaminą i 1% streptomycyną penicyliny w komorze ogrzewanej o temperaturze 37 stopni Celsjusza i środowisku 65% tlenu i 5% dwutlenku węgla. Aby przygotować zarodki myszy w podobnym stadium do mikroskopii immunofluorescencyjnej, zamiast używać podgrzanego M2, należy wypreparować zarodki w zimnym PBS i utrwalić w 4% paraformaldehydzie.

Po wykonaniu całego protokołu barwienia immunofluorescencyjnego mount, zgodnie z opisem w manuskrypcie tekstowym, można uzyskać klirens tkanek za pomocą RapiClear. Najpierw umieść zarodki w środku wklęsłego szkła o wymiarach 75 na 25 milimetrów, usuń cały PBST ze szkiełka wgłębnego mikroskopu i dodaj 200 mikrolitrów roztworu klarującego, a następnie przykryj preparat szkiełka pudełkiem. Po 10 minutach ochrony przed światłem, gdy zarodki zaczną stawać się przezroczyste, wymień roztwór klarujący i odczekaj dodatkowe 20 minut.

Przykryj zarodek szkiełkiem nakrywkowym, zaczynając z jednej strony i delikatnie przesuwając się w kierunku drugiej. Próbka jest teraz gotowa do obrazowania. W celu oczyszczenia za pomocą salicylanu metylu lub BABB upewnij się, że zarodki są całkowicie odwodnione w 100% metanolu, a następnie rozpocznij serię BABB i metanolu z 20% kolejnymi wzrostami stężenia i 20-minutową inkubacją na każdym etapie.

Gdy roztwór BABB osiągnie 100%, wprowadź dwie dodatkowe zmiany, aby uzyskać świeże rozwiązanie. Przygotuj szkiełko nakrywkowe o wymiarach 20 na 60 milimetrów i grubości 1,5 milimetra, aby zamontować zarodki, aby uniknąć ściskania próbki. Dodaj przekładki wykonane z cienkich metalowych podkładek.

Przenieś oczyszczone zarodki na szkiełka mikroskopowe za pomocą wykałaczki, cienkiej bawełnianej końcówki lub pipety Pasteura. Następnie dodaj kroplę podłoża montażowego, przykryj innym podobnym szkłem nakrywkowym i uszczelnij roztopioną parafiną, aby lepiej ustabilizować preparat i uniknąć pęcherzyków. Umieść szkiełko nakrywkowe z jednej strony, a następnie stopniowo i delikatnie przesuwaj je na boki, w razie potrzeby dodając więcej podłoża.

Próbka jest teraz gotowa do zobrazowania w mikroskopie. Użyj Fiji/ImageJ, aby zmienić położenie zarodka do znormalizowanej pozycji osi przednio-tylnej i grzbietowo-brzusznej po obrazowaniu. Zmniejsz rozmiar zestawu danych na obrazie Fidżi, a następnie przeskaluj i wstaw wartości skali X, Y i Z niezbędne do zmniejszenia zestawu danych do mniej niż 200 megabajtów.

Upewnij się, że opcja utwórz nowe okno jest zaznaczona. Następnie przejdź do wtyczek i otwórz przeglądarkę 3D. W oknie przeglądarki 3D kliknij zarodek, aby go zaznaczyć, powodując pojawienie się czerwonego pola 3D.

W tym trybie można sterować obrotem zestawu danych za pomocą myszy. Po upewnieniu się, że zarodek znajduje się w idealnej pozycji, wybierz opcję edytuj, przekształć obraz i wyeksportuj przekształcony obraz w oknie przeglądarki 3D. Sprawdź różne płaszczyzny ortogonalne, a następnie przejdź do obrazu, a następnie ułóż w stos i wybierz widoki ortogonalne.

Po prawidłowym ułożeniu zarodka wybierz menu okna Przeglądarka 3D, a następnie edytuj, przekształć i zapisz matrycę transformacji do pliku tekstowego z rozszerzeniem mat. Otwórz plik tekstowy za pomocą Fiji/ImageJ, usuń pierwsze dwie linie i zapisz ponownie. Spowoduje to utworzenie pliku macierzy transformacji zgodnego z wtyczką TransformJ.

Przełącz się na zestaw danych pełnej rozdzielczości i wykonaj operacje wtyczki TransformJ i TransformJ affine. W nowym oknie przejdź do następnego zapisanego pliku macierzy, wybierz interpolację sześciennej krzywej B-splajn i ponownie próbkuj izotropowo, a następnie kliknij przycisk OK. Po prawidłowym przestawieniu zarodka należy przyciąć większość utworzonej pustej przestrzeni. Aby wykonać pełny obraz projekcji Z, kliknij stosy, Z Project i wybierz maksymalną intensywność.

Następnie narysuj minimalny zwrot z inwestycji, który zawiera cały zarodek w X i Y.Przełącz się na oryginalne okna obrazu zestawu danych, klikając edytuj, wybór, przywróć zaznaczenie i przytnij, wybierając obraz. Przytnij plasterki na początku i na końcu, które nie przecinają tkanek zarodka, wybierając obraz i otwierając stosy, kliknij narzędzia, wybierz narzędzie do usuwania plasterków i określ pierwszy i ostatni plasterek do usunięcia, upewniając się, że zmieniłeś przyrost na jeden. W razie potrzeby należy przeprowadzić dalszą analizę i rekonstrukcje 3D, korzystając z instrukcji zawartych w rękopisie tekstowym.

Aby przeprowadzić analizę 3D bardziej rozwiniętych zarodków, należy wypreparować płody embrionalne w 18,5 dniu w zimnym PBS, usunąć wszystkie dodatkowe błony embrionalne, a następnie kilkakrotnie umyć płody w świeżym PBS, aby usunąć krew i zanieczyszczenia powstałe podczas procedury sekcji. Napraw płody w 4% PFA wyprodukowane w PBS w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez pięć do siedmiu dni. Po kilkukrotnym umyciu zarodka w PBS, należy odwodnić płody, inkubując w 10%10 kolejnych wzrostach roztworów metanolu, aż do osiągnięcia 100% metanolu.

Wykonuj każdą inkubację przez 25 minut na wytrząsarce w temperaturze pokojowej. Następnie inkubuj płody oddzielnie na shakerze, najpierw przez jeden dzień w 5% nadtlenku wodoru w metanolu, a następnie w 10% nadtlenku wodoru w metanolu przez okres do trzech dni, aż zarodki stracą całą naturalną pigmentację. Stopniowo nawadniaj zarodki w odwróconej serii metanolu w wodzie zdemineralizowanej przy każdej inkubacji przez 20 minut na shakerze w temperaturze pokojowej, a następnie myj zarodki trzy razy przez 30 minut na każde mycie w wodzie zdemineralizowanej.

Aby osadzić płód w 1% blokach agarozy, napełnij 50-mililitrową plastikową rurkę lub strzykawkę stopioną agarozą, a następnie umieść płód w agarozie w pozycji pionowej i utrzymuj tę pozycję kleszczami podczas krzepnięcia agarozy. Umieść foremkę z blokiem w temperaturze czterech stopni Celsjusza na 30 minut, aby agaroza w pełni się galaretowata, następnie wyjmij blok agarozy z płodem z formy i umieść go w pojemniku ze zdemoralizowaną wodą. Odwadnianie płodu należy przeprowadzać stopniowo, zwiększając stężenie metanolu o 10% rozcieńczonego w wodzie demineralizowanej lub PBS, utrzymując próbkę w stężeniu metanolu przez co najmniej 45 minut w temperaturze pokojowej na wytrząsarce, aż do osiągnięcia 100% metanolu.

Oczyść płody, przenosząc je przez seryjny roztwór BABB i metanol przez 2,5 godziny w każdym stężeniu z 25% wzrostem stężenia BABB, aż do osiągnięcia 100% BABB. Roztwór BABB należy wymieniać codziennie na świeży, aż płód stanie się całkowicie przezroczysty. Ten proces może potrwać od trzech do pięciu dni.

Za pomocą kleju przymocuj oczyszczony blok agarozy do osi silnika skanera OPT, a następnie wyreguluj optykę, aby uzyskać obraz całego płodu i przystąp do uzyskania pełnego zestawu danych projekcyjnych. Technika obrazowania na żywo 4D umożliwia dynamiczną analizę ekspresji reportera LuVeLu i zarodków z warunkowym nokautem Snai1 dnia embrionalnego. Wraz z normalnym sygnałem LuVeLu na mezodermie presomitowej, zarodki nokautujące warunkowe Snai1 wykazują ekspresję LuVeLu w wybrzuszeniu ektopowym, które powstaje z prymitywnej smugi.

Testy immunofluorescencyjne całego wierzchowca pozwalają na wykrycie potencjalnych NMP i kluczowych regulatorów różnicowania mezodermy. Białe i żółte strzałki podkreślają różnice w zarodkach typu zmutowanego i dzikiego. Renderyzacja 3D całych barwień immunologicznych wierzchowca umożliwia lepsze zrozumienie tkanki lub struktury w badaniu.

W tym przypadku lokalizacja potencjalnych NMP w zawiązku ogonowym była investigated. 3D rekonstrukcje tkanek są również ważne dla zrozumienia i scharakteryzowania wad morfologicznych w zarodkach myszy. Interaktywna wizualizacja rekonstrukcji 3D może być również budowana w przyjaznych dla użytkownika formatach.

Na przykład w pliku PDF. Te struktury ogonowe zarodka 3D mogą być wykorzystane do zilustrowania mocy modeli 3D dla bardziej ogólnej publiczności i do pomocy w badaniu w nauczaniu osiowego wydłużenia i segmentacji kręgowców. Wreszcie, możliwa jest wizualizacja 3D in toto bardziej rozwiniętych zarodków myszy przy użyciu techniki mikroskopii OTP.

Pokazano tutaj animowane renderingi, podkreślające kluczowe wycinki płodu embrionalnego w 18,5 dniu. Najważniejszą rzeczą do zapamiętania jest to, że wynik musi pozostać wiernym odwzorowaniem tego, co obserwuje się w zarodku. Naukowcy mogą korzystać z tych metod, aby wyjść poza prezentowanie tylko statycznych obrazów, ale także dołączyć filmy, trójwymiarowe rekonstrukcje, a nawet interaktywne modele 3D swoich danych.