Name: Multimodalne metody mikroskopii optycznej ujawniają morfologię i strukturę tkanek polipowych w karaibskich koralowcach budujących rafy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-09-05T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 39 s
Description: Odkryj multimodalne metody mikroskopii optycznej do analizy morfologii polipów koralowców Montastraea annularis i M. faveolata. Techniki te ujawniają strukturę tkanek i lokalizację pigmentów w 3D.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Donnie Epps, histologowi z Institute for Genomic Biology, University of Illinois Urbana-Champaign (UIUC), za jej kompetentną pomoc techniczną w przygotowaniu próbki i jej sekcji. Praca ta została wsparta grantem badawczym dla B.W. Fouke z Biura Badań Marynarki Wojennej (N00014-00-1-0609). Ponadto C.A.H. Miller otrzymał granty z Wydziału Geologii UIUC Wanless Fellowship, funduszu Leighton Wydziału Geologii UIUC oraz funduszu badań terenowych Wydziału Geologii UIUC Roscoe Jacksona. Interpretacje przedstawione w tym manuskrypcie są interpretacjami autorów i niekoniecznie muszą reprezentować interpretacje instytucji przyznających pomoc. Dziękujemy również Karaibskiemu Laboratorium Badań i Zarządzania Bioróżnorodnością (Carmabi) na Curaçao za wsparcie i współpracę w zbieraniu próbek z biopsji tkanki koralowej. Dziękujemy Claudii Lutz, specjaliście ds. komunikacji medialnej IGB za umiejętną korektę językową.

UWAGA: Odczynniki, które należy przygotować do seryjnego obrazowania powierzchni koralowców
1. Wosk przed infiltracją
<ol>
	<li>Rozpuść 3,6 g płatków STEARIN w szklanej zlewce. Dobrze wymieszać na gorącej płycie (60-70 °C).</li>
	<li>Dodać 400 mg Sudan IV (w celu zminimalizowania fluorescencji tła wosku). Dobrze wymieszaj i poczekaj, aż uzyskasz czerwony, półprzezroczysty roztwór.</li>
	<li>Dodaj 96 ml gorącej stopionej parafiny (100%) i dobrze wymieszaj.</li>
</ol>
1.2) Wosk do zatapiania
<ol>
	<li>Rozpuść 7,2 g płatków STEARIN w szklanej zlewce i dobrze wymieszaj na gorącej płycie (60-70 °C).</li>
	<li>Dodać 0,8 g Sudanu IV. Dobrze wymieszaj i poczekaj, aż uzyskasz czerwony, półprzezroczysty roztwór.</li>
	<li>Dodaj granulki parafiny (162 g) i mieszaj, aż parafina całkowicie się rozpuści.</li>
	<li>Dodać 30 g białego, granulowanego Vybaru i całkowicie rozpuść go w tej samej zlewce; po rozpuszczeniu wymieszaj.</li>
	<li>Luźno zamknij szklaną butelkę pokrywką. Umieść szklaną butelkę w piecu konwekcyjnym o temperaturze 60 °C, aby składniki pozostały w stanie płynnym. Przeprowadź wszystkie infiltracje w tym piekarniku.</li>
	<li>Podziel całkowitą objętość 200 ml czerwonego wosku na dwie szklane butelki po 100 ml każda. Użyj jednej podwielokrotności do infiltracji, a drugiej do ostatecznego osadzenia.</li>
</ol>
1.3) Osadzanie tkanek koralowych do obrazowania twarzy za pomocą bloków szeregowych
<ol>
	<li>Polipy koralowców zebrane w terenie (SI Wideo 1) i przechowywane (3-6 miesięcy w temperaturze 4-5 °C w paraformaldehydzie) należy umyć w roztworze soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (3 x 5 min) i odkamienić, gdy będą gotowe do zobrazowania. Odwapnić polipy w roztworze ExCal przez 24 godziny lub do momentu, gdy polipy będą całkowicie pozbawione CaCO3. Inkubuj kilka odwapnionych polipów koralowych jako pojedynczy blok w serii 25, 50, 75 i 100% etanolu, a następnie 1x substytut ksylenu w celu odwodnienia próbek.</li>
	<li>Przetworzone polipy należy umieścić w piekarniku nagrzanym do 65 °C zawierającym 100% substytut ksylenu. Inkubować przez 30 minut dwukrotnie, zmieniając roztwór na świeży. Ustaw polipy w taki sposób, aby górna część polipów była skierowana w dół, a górna powierzchnia była jak najbardziej płaska.</li>
	<li>Roztwory substytutu ksylenu ksylenu w proporcjach 2:1, 1:1 i 1:2 oraz wosku do filtracji wstępnej (krok 1.1) należy sporządzić w probówkach Falcon o pojemności 50 ml.</li>
	<li>Inkubuj polipy koralowców z tymi trzema rosnącymi stężeniami wosku przed infiltracją, a następnie 3x inkubuj w 100% wosku przed infiltracją przez 30-60 minut za każdym razem.</li>
	<li>Uwaga: W zależności od grubości próbek, kroki 1.3.1-1.3.5 mogą być zwiększane w dłuższych okresach czasu.</li>
	<li>Przenieść próbki do zatapiania wosku (patrz krok 1.2.6) po 3-krotnej inkubacji w 100% wosku do filtracji wstępnej.</li>
	<li>Po 30 minutach usunąć wosk do zatapiania. Zastąp go świeżym woskiem i kontynuuj inkubację przez co najmniej 4 godziny w temperaturze 65 °C.</li>
</ol>
1.4) Osadzanie w czerwonym wosku
<ol>
	<li>Sfotografuj blok (tacę ze stali nierdzewnej, na której umieszcza się biały wosk i na której umieszcza się próbkę). Jest to konieczne, ponieważ po osadzeniu w wosku lokalizacja próbki stanie się niewidoczna, ponieważ zatapiający się czerwony wosk jest nieprzezroczysty.</li>
	<li>Umieść małe krople wosku o wysokiej temperaturze topnienia wokół nowej podgrzanej formy do zatapiania ze stali nierdzewnej i pozwól jej ostygnąć. Wlać niewielką objętość świeżo stopionego wosku do zatapiania z drugiego pojemnika, jak podano w kroku 1.2.6.</li>
	<li>Umieść polip koralowy szybko skierowany w dół nad białą kropką wosku, a następnie umieść plastikowy uchwyt na próbkę na tacy ze stali nierdzewnej i wlej więcej wosku do zatapiania, aby wosk dotarł do powierzchni plastikowej formy.</li>
	<li>Wyjmij cały zestaw z piekarnika o temperaturze 65 °C i pozwól mu ostygnąć na ławce lub chłodnej powierzchni, aż wosk całkowicie stwardnieje.</li>
	<li>Może to potrwać od 6 godzin do dnia lub dwóch. Wysuszony blok umieścić w lodówce o temperaturze 4 °C, chroniony przed światłem, do długotrwałego przechowywania.</li>
</ol>
1.5) Sekcja w konfiguracji czoła bloku szeregowego
<ol>
	<li>Przyciąć blok i wyciąć odcinki 1 μm za pomocą mikrotomu. Nie zbieraj skrawków, ponieważ staną się one jak proszek. Pamiętaj, że obrazujemy tylko powierzchnię bloku. Próbka pojawia się, gdy biały wosk zaczyna znikać.</li>
	<li>Przechwytywanie obrazów gładkiej powierzchni bloku, która zawiera próbkę za każdym razem, gdy sekcja jest usuwana. Kontynuuj, aż polip koralowy zniknie, jak w SI Wideo 2.</li>
	<li>Nagrywaj/rejestruj obrazy za pomocą monochromatycznej kamery za pomocą filtra fluorescencyjnego FITC, aby uchwycić autofluorescencję chromatoforów/polipów koralowych. Obraz 3-4 odwapnione rdzenie z każdego gatunku.</li>
</ol>
2. Obrazowanie koralowców pod mikroskopią fluorescencyjną dwufotonową
<ol>
	<li>Przymocuj rdzenie polipów koralowców, z których każdy zawiera około 10-12 polipów o średnicy około cala, w 4% paraformaldehydu w miejscu zbioru (brzeg morza), gdy tylko zostaną zebrane pod wodą.</li>
	<li>Próbki należy przechowywać w temperaturze 4 °C do czasu rozpoczęcia obrazowania. Umyte rdzenie umieszcza się w tym samym roztworze do góry nogami w naczyniu ze szklanym dnem (o grubości 0,17 mm).</li>
	<li>Za pomocą lasera dwufotonowego o wzbudzeniu 780 nm zobrazuj 3-4 polipy w dwóch różnych powiększeniach (zoom cyfrowy) za pomocą obiektywu 10X (0,3 NA). Kształt i wysokość polipa koralowca różni się w zależności od próbki (zwykle 1-2 mm), a głębokość obrazowania jest również ograniczona odległością roboczą obiektywu obrazowania.</li>
	<li>Użyj trybu skanowania kafelków, aby zebrać około 25-100 (5 x 5 lub 10 x 10 kafelków) obrazów na płaszczyznę ogniskową w xy i 50-100 obrazów przez oś z w odstępach 10 lub 20 μm, co daje w sumie około 5 000-10 000 obrazów/polip koralowy.</li>
	<li>Wyobraź sobie trzy do czterech obszarów polipów, aby reprezentować rdzeń i gatunek koralowca. UWAGA: Czas akwizycji obrazu waha się od 2 do 5 godzin/obszar polipa.</li>
	<li>Przechowuj wszystkie obrazy w formacie surowych danych na dysku twardym systemu jako LSM 5. Renderuj 3D w oprogramowaniu do analizy i renderowania obrazów 3D.</li>
</ol>
3. 3D Renderowanie objętości i wizualizacja danych spektralnej fluorescencji SBFI i dwufotonowej fluorescencji spektralnej.
<ol>
	<li>Przytnij dane 2D, aby zmniejszyć rozmiar pliku, skupiając się na pojedynczym polipie za pomocą narzędzia do przycinania kwadratowego w programie i skompiluj jako pojedynczy plik tiff (zmniejsz rozmiar pliku również poprzez zapisanie pliku w formacie 8-bitowym) w oprogramowaniu do akwizycji.</li>
	<li>Otwórz zmontowane pliki danych SBFI (zebranych w kroku 1.5.1) lub ułożonych kafelkowo wielokrotnych stosów z dwóch fotonowych sekcji optycznych (zebranych w kroku 2.1.4) w module programu Imaris Surpass w algorytmie głośności.</li>
	<li>Rzutowanie danych SBFI renderowanych w 3D przy użyciu rzutowania cienia. Utwórz tryb izopowierzchni, w którym woksele są progowane w celu utworzenia szyku powierzchni bryłowej (SI Wideo 3).</li>
	<li>Wizualizuj projekcje 3D za pomocą algorytmu płaszczyzny tnącej w trybach ortogonalnych xy, xz i yz, aby ujawnić strukturę 3D i kształt koralowców.</li>
	<li>Animuj projekcje za pomocą modułu animacji klatek kluczowych w tym samym programie Imaris (SI Videos 3-7).</li>
	<li>Generuj pliki wideo z kompresją 5% i generuj klipy filmowe w formacie avi przy użyciu trybów głośności (SI Videos 4 i 6), 3D i Isosurface (SI Videos 5 i 7).</li>
</ol>

<ol><li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Climate+Change+2013%3A+The+Physical+Science+Basis.+Contribution+of+Working+Group+I+to+the+Fifth+Assessment+Report+of+the+Intergovernmental+Panel+on+Climate+Change%22">Climate Change 2013: The Physical Science Basis. Contribution of Working Group I to the Fifth Assessment Report of the Intergovernmental Panel on Climate Change</a>. Stocker, T. F., Qin, D., Plattner, G. -K., Tignor, M., Allen, S. K., Boschung, J., Nauels, A., Xia, Y., Bex, V., Midgley, P. M. , Cambridge University Press. 1535(2013).</li>
<li>Buddemeir, R. W., Kleypas, J. A., Aronson, R. B. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBuddemeir%2C+RW+%22Coral+Reefs+%26+Global+Climate+Change%3A+Potential+Contributions+of+Climate+Change+to+Stresses+on+Coral+Reef+Ecosystems%29%22">Coral Reefs & Global Climate Change: Potential Contributions of Climate Change to Stresses on Coral Reef Ecosystems)</a>. 46, Pew Center on Global Climate Change. (2004).</li>
<li>Wilkinson, C. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWilkinson%2C+C+%22Status+of+coral+reefs+of+the+world%22">Status of coral reefs of the world</a>. , Australian Institute of Marine Science. Townsville. 1-2 (2004).</li>
<li>Lough, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Climate+records+from+corals%5BTitle%5D)+AND+%22WIREs+Clim.+Chang%22%5BJournal%5D)">Climate records from corals.</a> WIREs Clim. Chang. 1, 318-331 (2010).</li>
<li>Harvell, C. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tropical+Archaea%3A+diversity+associated+with+the+surface+microlayer+of+corals%5BTitle%5D)+AND+%22Mar.+Ecol.+Prog.+Ser%22%5BJournal%5D)">Tropical Archaea: diversity associated with the surface microlayer of corals.</a> Mar. Ecol. Prog. Ser. 273, 81-88 (2004).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Coral+Health+and+Disease%22">Coral Health and Disease</a>. Rosenberg, E., Loya, Y. , Springer. (2004).</li>
<li>Rohwer, F., Breitbart, M., Jara, J., Azam, F., Knowlton, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diversity+of+bacteria+associated+with+the+Caribbean+coral+Montastrea+franksi%5BTitle%5D)+AND+%22Coral+Reefs%22%5BJournal%5D)">Diversity of bacteria associated with the Caribbean coral Montastrea franksi.</a> Coral Reefs. 20, 85-91 (2001).</li>
<li>Frias-Lopez, J., Zerkle, A. L., Bonheyo, G. T., Fouke, B. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Partitioning+of+bacterial+communities+between+seawater+and+healthy%2C+black+band+diseased%2C+and+dead+coral+surfaces%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Partitioning of bacterial communities between seawater and healthy, black band diseased, and dead coral surfaces.</a> Appl. Environ. Microbiol. 68, 2214-2228 (2002).</li>
<li>Stanley, G. D. Jr <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+evolution+of+modern+corals+and+their+early+history%5BTitle%5D)+AND+%22Earth+Sci.+Rev%22%5BJournal%5D)">The evolution of modern corals and their early history.</a> Earth Sci. Rev. 60, 195-225 (2003).</li>
<li>Piggot, A. M., Fouke, B. W., Sivaguru, M., Sanford, R., Gaskins, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Change+in+zooxanthellae+and+mucocyte+tissue+density+as+an+adaptive+response+to+environmental+stress+by+the+coral+Montastraea+annularis%5BTitle%5D)+AND+%22Mar.+Biol%22%5BJournal%5D)">Change in zooxanthellae and mucocyte tissue density as an adaptive response to environmental stress by the coral Montastraea annularis.</a> Mar. Biol. 156, 2379-2389 (2009).</li>
<li>Stanley, G. D. Jr <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photosymbiosis+and+the+evolution+of+modern+coral+reefs%5BTitle%5D)+AND+%22Evolution%22%5BJournal%5D)">Photosymbiosis and the evolution of modern coral reefs.</a> Evolution. 1, 3(2006).</li>
<li>Gordon, B. R., Leggat, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Symbiodinium%E2%80%94Invertebrate+Symbioses+and+the+Role+of+Metabolomics%5BTitle%5D)+AND+%22Mar.+Drugs%22%5BJournal%5D)">Symbiodinium—Invertebrate Symbioses and the Role of Metabolomics.</a> Mar. Drugs. 8, 2546-2568 (2010).</li>
<li>Schlichter, D., Weber, W., Fricke, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+chromatophore+system+in+the+hermatypic%2C+deep-water+coral+Leptoseris+fragilis+%28Anthozoa%3A+Hexacorallia%29%5BTitle%5D)+AND+%22Marine+Biology%22%5BJournal%5D)">A chromatophore system in the hermatypic, deep-water coral Leptoseris fragilis (Anthozoa: Hexacorallia).</a> Marine Biology. 89, 143-147 (1994).</li>
<li>Fouke, B. W., Meyers, W. J., Hanson, G. N., Beets, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chronostratigraphy+and+dolomitization+of+the+Seroe+Domi+Formation%2C+Curacao%2C+Netherlands+Antilles%5BTitle%5D)+AND+%22Facies%22%5BJournal%5D)">Chronostratigraphy and dolomitization of the Seroe Domi Formation, Curacao, Netherlands Antilles.</a> Facies. 35, 293-320 (1996).</li>
<li>Frias-Lopez, J., Bonheyo, G. T., Jin, Q., Fouke, B. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cyanobacteria+associated+with+coral+black+band+disease+in+Caribbean+and+Indo-Pacific+reefs%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Cyanobacteria associated with coral black band disease in Caribbean and Indo-Pacific reefs.</a> Appl. Environ. Microbiol. 69, 2409-2413 (2003).</li>
<li>Frias-Lopez, J., Klaus, J., Bonheyo, G. T., Fouke, B. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+bacterial+community+associated+with+black+band+disease+in+corals%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">The bacterial community associated with black band disease in corals.</a> Appl. Environ. Microbiol. 70, 5055-5062 (2004).</li>
<li>Frias-Lopez, J., Bonheyo, G. T., Fouke, B. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+differential+gene+expression+in+bacteria+associated+with+coral+black+band+disease+using+RNA-arbitrarily+primed+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Identification of differential gene expression in bacteria associated with coral black band disease using RNA-arbitrarily primed PCR.</a> Appl. Environ. Microbiol. 70, 3687-3694 (2004).</li>
<li>Klaus, J. S., Frias-Lopez, J., Bonheyo, G. T., Heikoop, J. M., Fouke, B. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+communities+inhabiting+the+healthy+tissues+of+two+Caribbean+reef+corals%3A+interspecific+and+spatial+variation%5BTitle%5D)+AND+%22Coral+Reefs%22%5BJournal%5D)">Bacterial communities inhabiting the healthy tissues of two Caribbean reef corals: interspecific and spatial variation.</a> Coral Reefs. 24, 129-137 (2005).</li>
<li>Klaus, J., Janse, I., Sandford, R., Fouke, B. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coral+microbial+communities%2C+zooxanthellae%2C+and+mucus+along+gradients+of+seawater+depth+and+coastal+pollution%5BTitle%5D)+AND+%22Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Coral microbial communities, zooxanthellae, and mucus along gradients of seawater depth and coastal pollution.</a> Environ. Microbiol. 9, 1291-1305 (2007).</li>
<li>van Duyl, F. C. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3avan+Duyl%2C+FC+%22Atlas+of+the+living+reefs+of+Curacao+and+Bonaire+%28Netherlands+Antilles%29%22">Atlas of the living reefs of Curacao and Bonaire (Netherlands Antilles)</a>. , Diss. Vrije Universiteit. Amsterdam. (1985).</li>
<li>Carricart-Ganivet, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sea+surface+temperature+and+the+growth+of+the+West+Atlantic+reef+building+coral+Montastraea+annularis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Mar.+Biol.+Ecol%22%5BJournal%5D)">Sea surface temperature and the growth of the West Atlantic reef building coral Montastraea annularis.</a> J. Exp. Mar. Biol. Ecol. 302, 249-260 (2004).</li>
<li>Barnes, D. J., Lough, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coral+skeletons%3A+Storage+and+recovery+of+environmental+information%5BTitle%5D)+AND+%22Global+Chang.+Biol%22%5BJournal%5D)">Coral skeletons: Storage and recovery of environmental information.</a> Global Chang. Biol. 2, 569-582 (1996).</li>
<li>Mohun, T. J., Weninger, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+volume+data+by+episcopic+three-dimensional+imaging+of+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">Generation of volume data by episcopic three-dimensional imaging of embryos.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 6, 069591(2012).</li>
<li>Mohun, T. J., Weninger, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+heart+development+using+high-resolution+episcopic+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Genet.+Dev%22%5BJournal%5D)">Imaging heart development using high-resolution episcopic microscopy.</a> Curr. Opin. Genet. Dev. 21, 573-578 (2011).</li>
<li>Mohun, T. J., Weninger, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embedding+embryos+for+episcopic+fluorescence+image+capturing+%28EFIC%29%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Embedding embryos for episcopic fluorescence image capturing (EFIC).</a> Cold Spring Harb. Protoc. 6, 069575(2012).</li>
<li>Rosenthal, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+high+resolution+three+dimensional+reconstruction+of+embryos+with+episcopic+fluorescence+image+capture%5BTitle%5D)+AND+%22Birth+Defects+Res.+C%3A+Embryo+Today%3A+Rev%22%5BJournal%5D)">Rapid high resolution three dimensional reconstruction of embryos with episcopic fluorescence image capture.</a> Birth Defects Res. C: Embryo Today: Rev. 72, 213-223 (2004).</li>
<li>Slyfield, C. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+surface+texture+visualization+of+bone+tissue+through+epifluorescence-based+serial+block+face+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Microsc%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional surface texture visualization of bone tissue through epifluorescence-based serial block face imaging.</a> J. Microsc. 236, 52-59 (2009).</li>
<li>Weninger, W., Mohun, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenotyping+transgenic+embryos%3A+a+rapid+3-D+screening+method+based+on+episcopic+fluorescence+image+capturing%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Genet%22%5BJournal%5D)">Phenotyping transgenic embryos: a rapid 3-D screening method based on episcopic fluorescence image capturing.</a> Nat. Genet. 30, 59-65 (2001).</li>
<li>Weninger, W., Mohun, T. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWeninger%2C+W+%22Three-dimensional+analysis+of+molecular+signals+with+episcopic+imaging+techniques.+Reporter+Genes%22">Three-dimensional analysis of molecular signals with episcopic imaging techniques. Reporter Genes</a>. , Humana Press. 35-46 (2007).</li>
<li>Gerneke, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surface+imaging+microscopy+using+an+ultramiller+for+large+volume+3D+reconstruction+of+wax-and+resin-embedded+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Microsc.+Res.+Tech%22%5BJournal%5D)">Surface imaging microscopy using an ultramiller for large volume 3D reconstruction of wax-and resin-embedded tissues.</a> Microsc. Res. Tech. 70, 886-894 (2007).</li>
<li>Denk, W., Horstmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serial+block-face+scanning+electron+microscopy+to+reconstruct+three-dimensional+tissue+nanostructure%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Serial block-face scanning electron microscopy to reconstruct three-dimensional tissue nanostructure.</a> PLoS Biol. 2, e329(2004).</li>
<li>Salih, A., Larkum, A., Cox, G., Kühl, M., Hoegh-Guldberg, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+pigments+in+corals+are+photoprotective%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Fluorescent pigments in corals are photoprotective.</a> Nature. 408, 850-853 (2000).</li>
<li>Sivaguru, M., Mander, L., Fried, G., Punyasena, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Capturing+the+surface+texture+and+shape+of+pollen%3A+A+comparison+of+microscopy+techniques%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Capturing the surface texture and shape of pollen: A comparison of microscopy techniques.</a> PloS one. 7 (6), (2012).</li>
<li>Helmchen, F., Denk, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deep+tissue+two-photon+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Deep tissue two-photon microscopy.</a> Nat. Methods. 2, 932-940 (2005).</li>
</ol>

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Badania raf koralowych są wysoce interdyscyplinarnym przedsięwzięciem badawczym, obejmującym analizę jednoczesnych zjawisk fizycznych, chemicznych i biologicznych zachodzących w środowisku morskim. Badanie złożonych ekosystemów raf koralowych najlepiej zatem przeprowadzić w ramach kontekstowych "potęg dziesięciu" (rys. 10). Ta kompilacja graficzna pokazuje, że ekosystem koralowców obejmuje szeroki zakres wymiarów przestrzennych (10-9 do 10,5 m). Co więcej, ćwiczenie to pokazuje, że ...

Globalne ocieplenie i towarzyszące mu zmiany środowiskowe bezpośrednio wpływają na zdrowie i rozmieszczenie tropikalnych koralowców morskich1-4. Obserwuje się wielorakie skutki, w tym blaknięcie koralowców i pojawienie się chorób zakaźnych5-6. Jednak dokładniejsze przewidywanie przyszłej reakcji koralowców na te zagrożenia środowiskowe będzie wymagało ustalenia histologicznej "linii bazowej", która określa morfologię tkanek oraz skład i rozmieszczenie komórek dla "pozornie zdrowych" koralowców. Z kolei "dotknięte" koralowce mogą być następnie porównywane ilościowo. Co więcej, ten punkt odniesienia powinien zostać ustalony dla pozornie zdrowych koralowców w różnych warunkach środowiskowych, tak aby "zdrowa reakcja" mogła być również mierzona w gradientach środowiskowych. Jako pierwszy krok w kierunku ustalenia tej linii bazowej, podjęto badanie 3D w wysokiej rozdzielczości, aby sprawdzić, w jaki sposób pozornie zdrowa morfologia i skład komórkowy tkanki polipów koralowców reagują na wzrost głębokości wody (WD) i towarzyszące temu spadki natężenia promieniowania słonecznego. Wyniki mogą być następnie wykorzystane do ustalenia bardziej wszechstronnego mechanistycznego zrozumienia adaptacji koralowców, a także do uzyskania wglądu w ewolucję koralowców i poprawę pozyskiwania światła.
Kamienne koralowce (Scleractinia) to kolonialne morskie bezkręgowce, które są domem dla złożonego zbioru innych mikroorganizmów, zbiorczo określanych jako holobiont koralowy7-10. Badania podjęte w niniejszym badaniu mają na celu wykorzystanie zestawu najnowocześniejszych technologii obrazowania do jednoczesnego śledzenia zmian wraz ze wzrostem głębokości wody w pigmentach tkankowych i symbiotycznych zooksantelliach pozornie zdrowych koralowców gospodarzy. Pozwoli to na ustalenie wymaganej porównawczej "linii bazowej" komórek tkankowych w poprzek gradientu batymetrycznego dla pozornie zdrowych koralowców i będzie działać jako wskaźniki zdrowia koralowców10. Pigmenty koralowe, zwane chromatoforami, działają w celu pochłaniania, odbijania, rozpraszania, załamywania, dyfrakcji lub w inny sposób zakłócania padającego promieniowania słonecznego11. Endosymbiotyczny związek zooksantelli-chromatoforu umożliwił koewolucję strategicznie korzystnej optymalizacji zbierania światła i strategii wzrostu szkieletu, a także plastyczności troficznej (zmiana strategii żywieniowych tam iz powrotem od autotrofii do heterotrofii) dla zwierzęcia koralowego12.
Południowy karaibski wyspiarski naród Curaçao (dawniej część Antyli Holenderskich) leży około 65 km na północ od Wenezueli w obrębie archipelagu Aruba-La Blanquilla o trendzie wschód-zachód (Rysunek 1A). Południowe wybrzeże Curaçao o długości 70 km zawiera ciągły współczesny i mioceńsko-plioceński, plejstoceński i holoceński starożytny obszar rafy koralowej13,14. Średnia roczna SST na Curaçao waha się około 3 °C rocznie, od minimum 26 °C pod koniec stycznia do maksimum 29 °C na początku września, ze średnią roczną temperaturą 27,5±0,5 ºC (NOAA SST Data Sets, 2000-2010). Rafa koralowa w Playa Kalki (12°22'31.63"N, 69°09'29.62"W), leżąca w pobliżu północno-zachodniego krańca Curaçao (Ryc. 1A), została wybrana do pobierania próbek, ponieważ została wcześniej dobrze przebadana, a ekosystem morski w tym miejscu jest skąpany w świeżej, niezanieczyszczonej wodzie morskiej7,15-19. Dwa blisko spokrewnione gatunki koralowców skleraktyńskich, M. annularis i M. faveolata, zostały wybrane do eksperymentów i analiz w tym badaniu, ponieważ każdy gatunek: (1) wykazuje wyraźnie różne i nienakładające się na siebie rozmieszczenia batymetryczne na szlaku rafy w odniesieniu do pęknięcia szelfu i związanych z nim środowisk osadów węglanowych (zakres M. annularis = 0-10 m WD; Zasięg M. faveolata = 10-20 m WD20; Rysunki 1B, 2A i 2B); (2) jest powszechnym budowniczym ram raf koralowych na całym Morzu Karaibskim21; oraz (3) ma dobrze zbadane zależności ekologiczne, fizjologiczne i ewolucyjne22.
Próbkowanie terenowe do niniejszego badania zostało przeprowadzone przy użyciu standardowych technik nurkowania u wybrzeży Playa Kalki na Curaçao. Ustanowiono transekt batymetryczny od płytkiej do głębokiej wody, który biegł w poprzek szelfu, nad pęknięciem szelfu i do głębokich wód przed rafą. Najwyraźniej zdrowe głowy koralowców zostały następnie zidentyfikowane do pobrania próbek wzdłuż tego batymetrycznego transektu, w tym: (1) trzy pojedyncze głowy koralowców M. annularis o średnicy ~ 1 m, z których wszystkie znajdowały się na głębokości 5 m wody (WD); oraz (2) trzy pojedyncze głowy koralowców M. faveolata o średnicy ~ 1 m, z których wszystkie znajdowały się na głębokości 12 m WD. Promieniowanie fotosyntetycznie aktywne (PAR) mierzono jako 33-36% PAR przy 5 m WD i 18-22% PAR przy 10 m WD. Pobieranie próbek przeprowadzono w styczniu, gdy SST wynosił 26 °C na głębokości wody zarówno 5 m, jak i 12 m. Próbki każdej z tych sześciu głów koralowców pobrano w trzech egzemplarzach w równoważnych pozycjach przestrzennych (tj. około 45° szerokości geograficznej północnej na każdej z sześciu półkulistych głów koralowców). Każda indywidualna próbka składała się z biopsji rdzenia tkanki koralowej o średnicy 2,5 cm, którą pobrano za pomocą oczyszczonego stempla łukowego. Trzy biopsje tkanki koralowej i szkieletu zostały pobrane na standardowym nurkowaniu z rękami w rękawiczkach z każdej z głów koralowców (9 z kolonii M. annularis na 5 m WD i 9 z M. faveolata na 12 m WD). Natychmiast po pobraniu na głębokość, każda próbka rdzenia biopsji została umieszczona w sterylnej probówce wirówkowej z polipropylenu o pojemności 50 ml, zakręcona i zwrócona na powierzchnię. Woda morska została zdekantowana z każdej probówki wirówkowej, a następnie każda biopsja rdzeniowa została zanurzona, przechowywana i transportowana w 4% paraformaldehydzie.
Obrazowanie SBFI zostało wcześniej wykonane na szerokim zakresie próbek biologicznych, w tym na tkankach ludzkich całego mózgu i całego serca, nienaruszonych embrionach myszy, zarodkach ryb zebry i wielu rodzajach próbek zwierzęcych z nienaruszonymi kośćmi23-30. Większość z tych badań wykorzystywała mikroskopię optyczną/świetlną z technikami fluorescencji lub jasnego pola. Jednak w ciągu ostatnich31 lat przeprowadzono badania przy ultrawysokich powiększeniach przy użyciu skaningowego obrazowania twarzy bloku szeregowego elektronów. W niniejszym badaniu po raz pierwszy opracowano zmodyfikowany protokół SBFI i zastosowano go do koralowców. Ponieważ polipy koralowców M. annularis i M. faveolata mają grubość 1-2 mm, żadna z rutynowych technik mikroskopii świetlnej nie byłaby w stanie przeniknąć całej grubości tkanki polipa koralowca. Dlatego mamy protokół przygotowania próbek SBFI zaprojektowany specjalnie dla próbek koralowców. Ponadto zaprojektowaliśmy na zamówienie uchwyt mikroskopu stereoskopowego, który jest napędzany silnikiem, aby poruszać się zarówno w kierunku x, jak i y. Aparatura ta wykonuje obrazy powierzchni bloku próbki, zamiast zbierać skrawki za pomocą zwykłego mikrotomu przed mikroskopem. Wprowadziliśmy również inną nieliniową technikę optycznego mikroskopu dwufotonowego do obrazowania tych samych polipów koralowców na całej grubości tkanek koralowców. W ten sposób przezwycięża się ograniczenia narzucone przez SBFI w zakresie odwapnienia i możliwości zmian w morfologii i objętości tkanek (kurczenie się), które mogą być wywołane przez przygotowanie próbki (odwodnienie) i protokoły przetwarzania. Co więcej, profile emisyjne z koralowców zostały rozdzielone spektralnie w celu zidentyfikowania ich szczytowych emisji i zmian między chromatoforami a fotosyntetycznymi zooksantellami. Wyniki te zostały ocenione w kontekście zastosowanej metody i jej indywidualnych zalet w zakresie czasu akwizycji, czasu analizy i zdolności do rozwiązywania drobnych szczegółów strukturalnych bez naruszania integralności strukturalnej tkanki koralowej.

<table><tbody><tr>Szkielet <td></td><td></td><td>tkanki koralowej</td><td>2,5 cm Biopsja z naturalnego środowiska</td></tr> Arch <tr><td>Punch Coring Device</td><td>C.S. Osborne and Company</td><td>No. 149</td><td>Do kolekcji biopsji koralowców</td></tr><tr><td>Paraformaldehydowa</td><td>mikroskopia elektronowa Sciences</td><td>RT 15700</td><td>16% wstępnie rozcieńczona</td></tr><tr><td>mikroskopia elektronowa</td><td>Histoclear/Safeclear II</td> Sciences <td>RT 64111-04</td><td>Nietoksyczna alternatywa dla ksylenu, odwodnienia i deparafinizacji</td></tr><tr><td>Ksylen i etanol</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td>Odwadniający</td></tr><tr><td>wosk parafinowy</td><td>Richard Allen Scientific Typ</td><td>H REF 8338</td><td>Roztwór infiltracyjny</td></tr><tr><td>Vybar</td><td>Producent</td><td></td> świec <td>Składnik czerwonego wosku</td></tr><tr><td>Stearyna</td><td>Producent</td><td></td> świec <td>Składnik czerwonego wosku</td></tr><tr><td>Sudan IV</td><td>Fisher Chemical</td><td>S667-25</td><td>Czerwony wosk-nieprzezroczyste tło</td></tr><tr><td>Agglutynina z kiełków pszenicy (WGA)</td><td>Life Technologies</td><td>W32466</td><td>Do etykietowania&nbsp; Coral Mucus</td></tr><tr><td>Prolong</td><td>Gold Life Technologies</td><td>P36095</td><td>Anty-blaknięcie Nośnik montażowy</td></tr><tr><td>Fluoro Dish</td><td>World Precision Instruments</td><td>FD-35-100</td><td>Do obrazowania dwufotonowego</td></tr><tr><td>Silnik XY, sterownik i kontroler</td><td>Lin Engineering</td><td>211-13-01R0, R325, R256-RO</td><td>XY Ruch translacyjny</td></tr><tr><td>Gorąca płyta</td><td>Corning</td><td>DC-220</td><td>Topienie całego wosku</td></tr><tr><td>Piec konwekcyjny</td><td>Yamato</td><td>DX-600</td> Procesor tkanek do <td>infiltracji i zatapiania</td></tr><tr><td></td><td>Leica</td><td>ASP 300</td><td>Odwodnienie, mikrotom infiltracyjny</td></tr><tr><td></td><td>Leica</td><td>RM2055</td><td>Noże jednorazowe</td></tr><tr><td>Mikroskop stereoskopowy</td><td>Carl Zeiss</td><td>Stereolumar V 12</td><td>1,5x (30 mm WD) Obiektywowy</td></tr><tr><td>mikroskop fluorescencyjny z ApoTome</td><td>Carl Zeiss</td><td>Axiovert M 200, System ApoTome I</td><td>Obrazowanie cienkiego przekroju polipa: Kamera Zooxanthellae</td></tr><tr><td>Axiocam</td><td>Carl Zeiss</td><td>MRm</td><td>Kamera monochromatyczna 1388x1040 pikseli</td></tr><tr><td>Oprogramowanie Axiovision</td><td>Carl Zeiss</td><td>Wersja 4.8</td><td>Program do akwizycji obrazów</td></tr><tr><td>Widmo lasera dwufotonowego</td><td></td><td>Maitai eHP, laser pulsacyjny (70 fs)</td><td>Z modułem DeepSee</td></tr><tr><td>Laserowy mikroskop skaningowy</td><td>Carl Zeiss</td><td>LSM 710 z detektorem spektralnym</td><td>34-kanałowa detekcja PMT</td></tr><tr><td>Zen Software</td><td>Carl Zeiss</td><td>2010 lub nowszy</td><td>do akwizycji obrazów dwufotonowych i spektralnych</td></tr><tr><td>Oprogramowanie Imaris Suite</td><td>Bitplane, Inc.,</td> <td>wersja 7.0 lub nowsza</td><td>Objętość 3D, Renderowanie powierzchni ISO, Wizualizacja</td></tr></tbody></table>

multimodalne metody mikroskopii optycznej ujawniają morfologię i strukturę tkanek polipowych w karaibskich koralowcach budujących rafy

Multimodal Optical Microscopy Methods Reveal Polyp Tissue Morphology and Structure in Caribbean Reef Building Corals

Zintegrowany zestaw technik obrazowania został zastosowany do określenia trójwymiarowej (3D) morfologii i struktury komórkowej tkanek polipów, składających się na karaibskie koralowce budujące rafy Montastraeaannularis i M. faveolata. Podejścia te obejmują mikroskopię fluorescencyjną (FM), obrazowanie twarzy w bloku szeregowym (SBFI) i dwufotonową konfokalną laserową mikroskopię skaningową (TPLSM). SBFI zapewnia głębokie obrazowanie tkanek po fizycznym przekroju; szczegółowo opisuje teksturę powierzchni tkanki i wizualizację 3D do głębokości tkanki większej niż 2 mm. Komplementarne FM i TPLSM dają obrazy struktury komórkowej tkanek o ultrawysokiej rozdzielczości. Wyniki: (1) zidentyfikowały wcześniej nieopisywane morfologie tkanek płatowych na zewnętrznej ścianie poszczególnych polipów koralowców oraz (2) stworzyły pierwsze mapy powierzchni rozkładu 3D i gęstości tkanek chromatoforów i endosymbiontów zooksantelli podobnych do glonów. Widmowe piki absorpcji wynoszące odpowiednio 500 nm i 675 nm sugerują, że M. annularis i M. faveolata zawierają podobne typy chlorofilu i chromatoforów. Jednak M. annularis i M. faveolata wykazują znaczące różnice w gęstości tkanek i rozmieszczeniu 3D tych kluczowych składników komórkowych. To badanie koncentrujące się na metodach obrazowania wskazuje, że SBFI jest niezwykle przydatny do analizy dużych próbek w skali mm odwapnionych tkanek koralowców. Uzupełniające FM i TPLSM ujawniają subtelne zmiany w skali submilimetrowej w rozmieszczeniu i gęstości komórek w nieodwapnionych próbkach tkanek koralowców. Technika TPLSM zapewnia: (1) minimalnie inwazyjne przygotowanie próbki, (2) doskonałą zdolność cięcia optycznego oraz (3) minimalną absorpcję i rozpraszanie światła, jednocześnie umożliwiając obrazowanie głębokich tkanek.

Specjalnie zaprojektowane urządzenie SBFI (wykonane specjalnie na potrzeby niniejszego badania; Rycina 3) pozwoliło na stworzenie pierwszych szczegółowych cyfrowych modeli wysokościowych (DEM) w 3D tekstury powierzchni zewnętrznej i morfologii polipów koralowców M. annularis oraz M. faveolature (Rycina 4 oraz Filmy SI 1-2). Uzyskano obrazy wcześniej nieopisanych, warstwowych płatów tkanki koralowca, promieniujących koncentrycznie od centrum każdego poli...

Zintegrowany zestaw technik obrazowania został zastosowany do określenia morfologii polipów i struktury tkanek u karaibskich koralowców Montastraeaannularis i M. faveolata. Fluorescencja, szeregowa powierzchnia blokowa i dwufotonowa konfokalna laserowa mikroskopia skaningowa pozwoliły zidentyfikować strukturę płatów, ściany polipów oraz oszacować gęstości i rozkłady chromatoforów i zooksantelli.

Multimodalne metody mikroskopii optycznej ujawniają morfologię i strukturę tkanek polipowych w karaibskich koralowcach budujących rafy

An integrated suite of imaging techniques has been applied to determine the three-dimensional (3D) morphology and cellular structure of polyp tissues ...

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest zobrazowanie polipów koralowych o grubości od jednego do dwóch milimetrów w 3D, aby zrozumieć drobną strukturę, a także pigmenty koralowców i ich lokalizację. Osiąga się to poprzez najpierw zanurzenie próbki w wosku, a następnie pocięcie próbki na jednomikronowe odcinki za pomocą mikrotomu. Następnie stosuje się specjalnie zaprojektowaną technikę twarzy bloku szeregowego do obrazowania polipów koralowych i rekonstrukcji obrazu 3D.Korzystając z wielu obrazów 2D, uzyskuje się wyniki, które pokazują zdolność tej techniki do rozwiązywania drobnych szczegółów strukturalnych tkanki koralowej bez naruszania jej integralności strukturalnej. Demonstracja procedury. Dzisiaj będzie guru dr Maunde Śiwa, współpracownikiem mojej grupy badawczej.Aby przygotować wosk do filtracji wstępnej, rozpuść 3,6 grama wołu w płatkach w szklanej zlewce na gorącej płycie. Następnie dodaj 400 miligramów Sudanu. Cztery, aby zminimalizować fluorescencję tła wosku, dobrze wymieszaj i poczekaj, aż uzyskasz czerwony, półprzezroczysty roztwór.Następnie dodaj 81 gramów parafiny i dobrze wymieszaj. Następnie dodać 15 gramów białego granulowanego pręta VI i całkowicie rozpuść w tej samej zlewce. Po stopieniu wymieszaj go ponownie, aby uzyskać całkowicie wymieszany roztwór wosku.Teraz dodaj mieszaninę do szklanej butelki i zamknij luźno pokrywką. Umieść szklaną butelkę w piecu konwekcyjnym o temperaturze 60 stopni Celsjusza, aby utrzymać składniki w stanie płynnym i aby miały miejsce wszystkie infiltracje. To rozwiązanie można przygotować do 200 mililitrów i podzielić na dwie 100-mililitrowe butelki.Jedna do infiltracji i jedna do ostatecznego osadzenia próbek koralowców budujących rafę karaibską pobrano z AU i utrwalono w paraformaldehydzie w terenie. Aby osadzić tkanki koralowców dla SBFI, najpierw umyj polipy koralowców zebrane w terenie i przechowuj je w temperaturze czterech stopni Celsjusza w paraformaldehydzie. Następnie umyj je w PB S3 razy przez pięć minut za każdym razem, gdy będą gotowe do obrazowania.Odwapnić polipy w roztworze ex Cal two przez 24 godziny lub do momentu, gdy polipy będą całkowicie pozbawione węglanu wapnia. Inkubuj kilka odwapnionych polipów koralowych jako pojedynczy blok w serii 25, 50, 75 i 100% etanolu, a następnie jeden x ksylen. Zastąp przez 30 minut każdą sesję, aby odwodnić próbki.Następnie umieść przetworzone polipy w 100% ksylenie. Zastąp w piekarniku o temperaturze 65 stopni Celsjusza na 30 minut. Następnie zastąp świeżym roztworem i inkubuj przez kolejne 30 minut.Ustaw polipy tak, aby wierzchołki były skierowane w dół, a powierzchnia była jak najbardziej płaska. Twórz rozwiązania dwa do jednego, jeden do jednego i jeden do dwóch. Substytut ksylenu i wosk do filtracji wstępnej.W 50-mililitrowych probówkach Falcon inkubuje się polipy koralowców z tymi trzema rosnącymi stężeniami wosku do filtracji wstępnej, a następnie trzy inkubacje w 100% wosku do filtracji wstępnej przez 30 minut do jednej godziny za każdym razem. Teraz przenieś próbkę do wosku do zatapiania. Usuń wosk do zatapiania po 30 minutach, a następnie zastąp go świeżym woskiem do zatapiania i kontynuuj inkubację przez co najmniej cztery godziny w temperaturze 65 stopni Celsjusza.Następnie sfotografuj blok. Jest to konieczne, ponieważ po osadzeniu w wosku lokalizacja próbki stanie się niewidoczna, ponieważ zatapiający się czerwony wosk jest nieprzezroczysty. Następnie umieść małe krople wosku o wysokiej temperaturze topnienia wokół nowej, wstępnie podgrzanej formy do zatapiania ze stali nierdzewnej i pozwól jej ostygnąć.Wlej niewielką objętość świeżo stopionego i ściółkowego wosku z drugiej porcji i szybko umieść polip koralowy skierowany w dół na białą kropkę wosku. Następnie umieść plastikowy uchwyt na próbkę na tacy ze stali nierdzewnej i wlej więcej wosku do zatapiania, aby wosk dotarł do powierzchni plastikowej formy. Teraz wyjmij cały zestaw z piekarnika o temperaturze 65 stopni Celsjusza i pozwól mu ostygnąć na ławce lub chłodnej powierzchni, aż wosk całkowicie stwardnieje.Następnie umieść wysuszony blok w lodówce w temperaturze czterech stopni Celsjusza, chroniony przed światłem do długotrwałego przechowywania w celu podzielenia bloku na sekcje. Najpierw przytnij go i wytnij odcinki o długości jednego mikrona. Za pomocą mikrotomu uchwyć obraz gładkiej powierzchni bloku, która zawiera próbkę.Za każdym razem. Po usunięciu skrawka próbka pojawia się, gdy biały wosk zaczyna znikać. Następnie uchwyć obrazy za pomocą monochromatycznego aparatu fotograficznego przy użyciu fitzy filtra fluorescencyjnego, aby uchwycić autofluorescencję chromatoforów lub obrazu polipów koralowych, od trzech do czterech odwapnionych rdzeni z każdej próbki.Aby wykonać obrazowanie fluorescencyjne dwóch fotonów, umieść umyte rdzenie polipów koralowych w 4% para formaldehydzie do góry nogami w przykrytym szklanym naczyniu za pomocą lasera dwufotonowego o długości 780 nanometrów obraz wzbudzenia od trzech do czterech polipów przy dwóch różnych powiększeniach za pomocą obiektywu 10x. Następnie użyj trybu skanowania kafelków, aby zebrać około 25 do 100 obrazów na płaszczyznę ogniskowej w XY w odstępach 10 lub 20 mikronów. Następnie zbierz od 50 do 100 obrazów przez oś Z w odstępach 10 lub 20 mikronów, co da łącznie około 5 000 do 10 000 obrazów na polip koralowca.Po tym obrazie trzy do czterech obszarów polipów reprezentujących rdzeń i gatunek koralowca. Następnie zapisz wszystkie obrazy w formacie surowych danych na dysku twardym systemu. W tej procedurze przytnij dane 2D, aby zmniejszyć rozmiar pliku, skupiając się na pojedynczym polipie za pomocą narzędzia do przycinania kwadratowego i skompiluj je jako pojedynczy plik TIF.W oprogramowaniu do akwizycji. Otwórz zmontowane pliki danych SBFI lub ułożone kafelkowo stosy wielokrotne Z dwóch fotonowych sekcji optycznych w module programu EMERIS przewyższają projekt algorytmu objętościowego, dane SBFI renderowane w 3D. Korzystając z rzutowania cienia, utwórz tryb ISOSURFACE, w którym woksele są progowe, aby utworzyć wzór powierzchni bryłowej.Wizualizuj projekcje 3D za pomocą algorytmu przycinania w trybach ortogonalnych XY, xz i YZ, aby ujawnić strukturę i kształt 3D koralowców. Następnie animuj projekcje za pomocą modułu animacji klatek kluczowych. W tym samym programie erris generuj pliki wideo z kompresją 5% i generuj klipy filmowe w formacie VI przy użyciu modalności objętości 3D i izopowierzchni.Oto dwa obrazy 3D fluorescencji fotonowej polipów koralowców z M Anis i M fa Lata. Te dwa obrazy zostały wykonane bez separacji spektralnej komponentów przy użyciu 780 nanometrowego wzbudzenia lasera dwufotonowego z sygnałem optycznym zebranym z 450 do 700 nanometrów, a te dwa obrazy zostały zebrane z tym samym wzbudzeniem, ale do zebrania danych z dwóch komponentów użyto jednocześnie dwóch detektorów lampowych powielacza zdjęć, jeden od 500 do 550 nanometrów, a drugi od 650 do 720 nanometrów. Są to obrazy z powłoką głębionkową.Czerwony to najpłytsze, a niebieski to najgłębsze komponenty w 2D. tak. Podejmując się tej procedury, należy pamiętać o odpowiednim przygotowaniu próbki zatopionej w czerwonym wosku. Połączenie obrazowania twarzy w bloku szeregowym i mikroskopii fluorescencyjnej z użyciem dwóch stóp na powierzchni koralowców umożliwia analizę pigmentacji koralowców i struktury komórkowej w różnych skalach soczewek.Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak obchodzić się i obrazować koralowce budujące rafy koralowe oraz ich właściwości spektralne w trzech wymiarach.

multimodal-optical-microscopy-methods-reveal-polyp-tissue-morphology

Research

JoVE Journal

Environment

Środowisko

Opisano montaż i użycie multimodalnego mikroendoskopu, który może rejestrować dane obrazu tkanek powierzchownych z parametrami fizjologicznymi tkanek, w tym stężeniem hemoglobiny, stężeniem melaniny i nasyceniem tlenem. Technika ta może być przydatna do oceny struktury tkanki i perfuzji oraz może być zoptymalizowana pod kątem indywidualnych potrzeb badacza.

Multimodalna platforma obrazowania i spektroskopii mikroendoskopii z wiązkami włókien do nieinwazyjnej analizy tkanek in vivo

Pokazujemy użycie różnych metod mikroskopowych, które są przydatne do obserwacji zwapnienia tubeworma, Hydroides elegans, a także do lokalizowania i charakteryzowania pierwszego zwapniałego materiału. Mikroskopia na żywo i mikroskopia elektronowa są używane razem w celu dostarczenia informacji funkcjonalnych i materiałowych, które są ważne w badaniu biomineralizacji.

Charakterystyka zwapnień przy użyciu technik mikroskopii optycznej i elektronowej na żywo w rurowcu morskim

Koralowce tworzą bioróżnorodne ekosystemy ważne zarówno dla ludzi, jak i organizmów morskich. Jednak nadal nie rozumiemy pełnego potencjału i funkcji wielu komórek koralowców. W tym miejscu przedstawiamy protokół opracowany do izolacji, znakowania i rozdzielania populacji kamiennych komórek koralowców.

Sortowanie komórek aktywowane fluorescencją w celu izolacji populacji komórek skleraktynów

Prezentowana tutaj jest wielofotonowa mikroskopijna platforma do obrazowania powierzchni oka myszy na żywo. Fluorescencyjna mysz transgeniczna umożliwia wizualizację jąder komórkowych, błon komórkowych, włókien nerwowych i naczyń włosowatych na powierzchni oka. Nieliniowe sygnały generujące drugą harmoniczną pochodzące ze struktur kolagenowych zapewniają obrazowanie bez znaczników dla architektur zrębowych.

Niestandardowa platforma mikroskopii wielofotonowej do obrazowania na żywo rogówki i spojówki myszy

Ratowanie polipów to proces wywołany ostrym stresem, w którym polipy koralowców trawią tkankę łączącą je z ich kolonią i odłączają się od niej, aby żyć jako jednostki. Niniejszy protokół opisuje, w jaki sposób indukować mikrorozmnażanie koralowców poprzez ratowanie za pomocą hipersoli fizjologicznej lub bezwapniowej wody morskiej.

Indukowanie ratowania polipów w koloniach koralowców w celu uzyskania zindywidualizowanych mikropropagatów do laboratoryjnego użytku eksperymentalnego

Zacumowane struktury geodezyjne zwane Arkami Koralowymi stanowią modułową, skalowalną i pionowo regulowaną platformę badawczą, która może być używana do budowania, monitorowania i zakłócania społeczności raf koralowych na wcześniej niedziałających obszarach, w tym na morzu.

Arki rafy koralowej: mezokosmos in situ i zestaw narzędzi do tworzenia społeczności rafowych

Tutaj prezentujemy ekstrakcję i przygotowanie polarnych i półpolarnych metabolitów z holobiontu koralowca, a także wydzielonych tkanek gospodarza koralowców i frakcji komórek Symbiodiniaceae, do analizy metodą chromatografii gazowej i spektrometrii mas.

Ukierunkowana metabolomika próbek koralowców twardych oparta na chromatografii gazowej i spektrometrii mas

Prezentowany tutaj jest protokół do zbierania i przetwarzania danych z podwodnej fotogrametrii, w tym znacznie uproszczony i w pełni zautomatyzowany potok przetwarzania obrazów, którego wynikiem są dane wyjściowe z odniesieniami geograficznymi i dostosowane do szeregów czasowych, gotowe do ekologicznej ekstrakcji, analizy i zastosowania danych.

Reefshape: system do efektywnego gromadzenia i automatycznego przetwarzania danych z podwodnej fotogrametrii szeregów czasowych do monitorowania siedlisk bentosowych

Ten protokół obejmuje czteroetapową metodologię badań obrazowania dużych obszarów, używaną do wyodrębniania wskaźników złożoności strukturalnej, składu społeczności i demografii populacji dla społeczności raf koralowych. Jakość zebranych zobrazowań i zintegrowany dostęp do zobrazowań źródłowych są traktowane priorytetowo na każdym etapie protokołu.

Pomiar struktury, składu i zmian środowiska podwodnego za pomocą obrazowania wielkopowierzchniowego

Korzystając z platformy multimodalnej łączącej metody obrazowania optycznego bez znaczników, opracowaliśmy protokół do wizualizacji i ilościowego określania dynamiki komórkowej i metabolizmu. Dzięki obrazowaniu za pomocą fluorescencji wielofotonowej, generowania drugiej harmonicznej i wymuszonej mikroskopii rozpraszania Ramana możemy uzyskać całościowy przegląd środowiska komórkowego i molekularnego.

Multimodalna platforma obrazowania optycznego do badania metabolizmu komórkowego

Proponujemy protokół oceny regeneracji kości na różnych poziomach hierarchicznych. To podejście multimodalne umożliwia analizę strukturalną na różnych skalach długości, skutecznie rozwiązując wyzwania związane z przygotowaniem próbek. Zapewnia również wiarygodny sposób oceny skuteczności biomateriałów w wspieraniu regeneracji kości.

Podejście multimodalne do oceny regeneracji kości i wydajności rusztowania

Odkryj multimodalne metody mikroskopii optycznej do analizy morfologii polipów koralowców Montastraea annularis i M. faveolata. Techniki te ujawniają strukturę tkanek i lokalizację pigmentów w 3D.

Multimodalne metody mikroskopii optycznej ujawniają morfologię i strukturę tkanek polipowych w karaibskich koralowcach budujących rafy (Wideo) | JoVE Journal

Multimodalne metody mikroskopii optycznej ujawniają morfologię i strukturę tkanek polipowych w karaibskich koralowcach budujących rafy

Przeglądaj więcej filmów