Multimodalne metody mikroskopii optycznej ujawniają morfologię i strukturę tkanek polipowych w karaibskich koralowcach budujących rafy

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest zobrazowanie polipów koralowych o grubości od jednego do dwóch milimetrów w 3D, aby zrozumieć drobną strukturę, a także pigmenty koralowców i ich lokalizację. Osiąga się to poprzez najpierw zanurzenie próbki w wosku, a następnie pocięcie próbki na jednomikronowe odcinki za pomocą mikrotomu. Następnie stosuje się specjalnie zaprojektowaną technikę twarzy bloku szeregowego do obrazowania polipów koralowych i rekonstrukcji obrazu 3D.

Korzystając z wielu obrazów 2D, uzyskuje się wyniki, które pokazują zdolność tej techniki do rozwiązywania drobnych szczegółów strukturalnych tkanki koralowej bez naruszania jej integralności strukturalnej. Demonstracja procedury. Dzisiaj będzie guru dr Maunde Śiwa, współpracownikiem mojej grupy badawczej.

Aby przygotować wosk do filtracji wstępnej, rozpuść 3,6 grama wołu w płatkach w szklanej zlewce na gorącej płycie. Następnie dodaj 400 miligramów Sudanu. Cztery, aby zminimalizować fluorescencję tła wosku, dobrze wymieszaj i poczekaj, aż uzyskasz czerwony, półprzezroczysty roztwór.

Następnie dodaj 81 gramów parafiny i dobrze wymieszaj. Następnie dodać 15 gramów białego granulowanego pręta VI i całkowicie rozpuść w tej samej zlewce. Po stopieniu wymieszaj go ponownie, aby uzyskać całkowicie wymieszany roztwór wosku.

Teraz dodaj mieszaninę do szklanej butelki i zamknij luźno pokrywką. Umieść szklaną butelkę w piecu konwekcyjnym o temperaturze 60 stopni Celsjusza, aby utrzymać składniki w stanie płynnym i aby miały miejsce wszystkie infiltracje. To rozwiązanie można przygotować do 200 mililitrów i podzielić na dwie 100-mililitrowe butelki.

Jedna do infiltracji i jedna do ostatecznego osadzenia próbek koralowców budujących rafę karaibską pobrano z AU i utrwalono w paraformaldehydzie w terenie. Aby osadzić tkanki koralowców dla SBFI, najpierw umyj polipy koralowców zebrane w terenie i przechowuj je w temperaturze czterech stopni Celsjusza w paraformaldehydzie. Następnie umyj je w PB S3 razy przez pięć minut za każdym razem, gdy będą gotowe do obrazowania.

Odwapnić polipy w roztworze ex Cal two przez 24 godziny lub do momentu, gdy polipy będą całkowicie pozbawione węglanu wapnia. Inkubuj kilka odwapnionych polipów koralowych jako pojedynczy blok w serii 25, 50, 75 i 100% etanolu, a następnie jeden x ksylen. Zastąp przez 30 minut każdą sesję, aby odwodnić próbki.

Następnie umieść przetworzone polipy w 100% ksylenie. Zastąp w piekarniku o temperaturze 65 stopni Celsjusza na 30 minut. Następnie zastąp świeżym roztworem i inkubuj przez kolejne 30 minut.

Ustaw polipy tak, aby wierzchołki były skierowane w dół, a powierzchnia była jak najbardziej płaska. Twórz rozwiązania dwa do jednego, jeden do jednego i jeden do dwóch. Substytut ksylenu i wosk do filtracji wstępnej.

W 50-mililitrowych probówkach Falcon inkubuje się polipy koralowców z tymi trzema rosnącymi stężeniami wosku do filtracji wstępnej, a następnie trzy inkubacje w 100% wosku do filtracji wstępnej przez 30 minut do jednej godziny za każdym razem. Teraz przenieś próbkę do wosku do zatapiania. Usuń wosk do zatapiania po 30 minutach, a następnie zastąp go świeżym woskiem do zatapiania i kontynuuj inkubację przez co najmniej cztery godziny w temperaturze 65 stopni Celsjusza.

Następnie sfotografuj blok. Jest to konieczne, ponieważ po osadzeniu w wosku lokalizacja próbki stanie się niewidoczna, ponieważ zatapiający się czerwony wosk jest nieprzezroczysty. Następnie umieść małe krople wosku o wysokiej temperaturze topnienia wokół nowej, wstępnie podgrzanej formy do zatapiania ze stali nierdzewnej i pozwól jej ostygnąć.

Wlej niewielką objętość świeżo stopionego i ściółkowego wosku z drugiej porcji i szybko umieść polip koralowy skierowany w dół na białą kropkę wosku. Następnie umieść plastikowy uchwyt na próbkę na tacy ze stali nierdzewnej i wlej więcej wosku do zatapiania, aby wosk dotarł do powierzchni plastikowej formy. Teraz wyjmij cały zestaw z piekarnika o temperaturze 65 stopni Celsjusza i pozwól mu ostygnąć na ławce lub chłodnej powierzchni, aż wosk całkowicie stwardnieje.

Następnie umieść wysuszony blok w lodówce w temperaturze czterech stopni Celsjusza, chroniony przed światłem do długotrwałego przechowywania w celu podzielenia bloku na sekcje. Najpierw przytnij go i wytnij odcinki o długości jednego mikrona. Za pomocą mikrotomu uchwyć obraz gładkiej powierzchni bloku, która zawiera próbkę.

Za każdym razem. Po usunięciu skrawka próbka pojawia się, gdy biały wosk zaczyna znikać. Następnie uchwyć obrazy za pomocą monochromatycznego aparatu fotograficznego przy użyciu fitzy filtra fluorescencyjnego, aby uchwycić autofluorescencję chromatoforów lub obrazu polipów koralowych, od trzech do czterech odwapnionych rdzeni z każdej próbki.

Aby wykonać obrazowanie fluorescencyjne dwóch fotonów, umieść umyte rdzenie polipów koralowych w 4% para formaldehydzie do góry nogami w przykrytym szklanym naczyniu za pomocą lasera dwufotonowego o długości 780 nanometrów obraz wzbudzenia od trzech do czterech polipów przy dwóch różnych powiększeniach za pomocą obiektywu 10x. Następnie użyj trybu skanowania kafelków, aby zebrać około 25 do 100 obrazów na płaszczyznę ogniskowej w XY w odstępach 10 lub 20 mikronów. Następnie zbierz od 50 do 100 obrazów przez oś Z w odstępach 10 lub 20 mikronów, co da łącznie około 5 000 do 10 000 obrazów na polip koralowca.

Po tym obrazie trzy do czterech obszarów polipów reprezentujących rdzeń i gatunek koralowca. Następnie zapisz wszystkie obrazy w formacie surowych danych na dysku twardym systemu. W tej procedurze przytnij dane 2D, aby zmniejszyć rozmiar pliku, skupiając się na pojedynczym polipie za pomocą narzędzia do przycinania kwadratowego i skompiluj je jako pojedynczy plik TIF.

W oprogramowaniu do akwizycji. Otwórz zmontowane pliki danych SBFI lub ułożone kafelkowo stosy wielokrotne Z dwóch fotonowych sekcji optycznych w module programu EMERIS przewyższają projekt algorytmu objętościowego, dane SBFI renderowane w 3D. Korzystając z rzutowania cienia, utwórz tryb ISOSURFACE, w którym woksele są progowe, aby utworzyć wzór powierzchni bryłowej.

Wizualizuj projekcje 3D za pomocą algorytmu przycinania w trybach ortogonalnych XY, xz i YZ, aby ujawnić strukturę i kształt 3D koralowców. Następnie animuj projekcje za pomocą modułu animacji klatek kluczowych. W tym samym programie erris generuj pliki wideo z kompresją 5% i generuj klipy filmowe w formacie VI przy użyciu modalności objętości 3D i izopowierzchni.

Oto dwa obrazy 3D fluorescencji fotonowej polipów koralowców z M Anis i M fa Lata. Te dwa obrazy zostały wykonane bez separacji spektralnej komponentów przy użyciu 780 nanometrowego wzbudzenia lasera dwufotonowego z sygnałem optycznym zebranym z 450 do 700 nanometrów, a te dwa obrazy zostały zebrane z tym samym wzbudzeniem, ale do zebrania danych z dwóch komponentów użyto jednocześnie dwóch detektorów lampowych powielacza zdjęć, jeden od 500 do 550 nanometrów, a drugi od 650 do 720 nanometrów. Są to obrazy z powłoką głębionkową.

Czerwony to najpłytsze, a niebieski to najgłębsze komponenty w 2D. tak. Podejmując się tej procedury, należy pamiętać o odpowiednim przygotowaniu próbki zatopionej w czerwonym wosku. Połączenie obrazowania twarzy w bloku szeregowym i mikroskopii fluorescencyjnej z użyciem dwóch stóp na powierzchni koralowców umożliwia analizę pigmentacji koralowców i struktury komórkowej w różnych skalach soczewek.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak obchodzić się i obrazować koralowce budujące rafy koralowe oraz ich właściwości spektralne w trzech wymiarach.