Multimodalna platforma obrazowania optycznego do badania metabolizmu komórkowego

Nasze badania polegają na wykorzystaniu naszego mikroskopu multimodalnego do pomiaru różnic molekularnych i metabolicznych w kilku patologiach oraz wizualizacji ich przestrzennej niejednorodności. Multimodalne podejście do obrazowania optycznego pozwala nam identyfikować zmiany patofizjologiczne z różnych perspektyw. Multimodalne podejście do mikroskopii optycznej stale poszerza swoje zastosowania, szczególnie w warunkach klinicznych, gdzie rozwój mikroendoskopów otworzył drogę do obrazowania klinicznego.

Obecne wyzwania eksperymentalne polegają na złożoności łączenia ze sobą całego sprzętu, co jest jednym z powodów, dla których korzystamy z niestandardowego systemu mikroskopowego. Dzięki zastosowaniu naszej multimodalnej platformy obrazowania optycznego poczyniliśmy znaczące postępy w bezznacznikowym badaniu chorób bioortogonalnych, w tym w klasyfikacji różnych podtypów raka piersi oraz analizie metabolizmu lipidów w mózgu drosophila i myszy. Korzystając z naszego bezznacznikowego multimodalnego obrazowania optycznego, jesteśmy w stanie jednocześnie wizualizować metabolizm, morfologię i skład molekularny, co jest potężnym narzędziem do badania chorób i procesu starzenia.

Aby rozpocząć, rozgrzej laser i odczekaj około 15 do 20 minut. Włącz skrzynkę sterowniczą, a następnie kontroler panelu dotykowego, zasilacz sieciowy do głównego pilota laserowego i zasilacz sieciowy do pilota podrzędnego lasera, a następnie włącz krzemowy detektor fotodiod i wzmacniacz blokujący. Skonfiguruj system laserowy z wiązką pompy przestrajalną od 780 nanometrów do 990 nanometrów, z szerokością impulsu od pięciu do sześciu pikosekund i częstotliwością powtarzania 80 megaherców.

Wiązka lasera Stokes powinna mieć stałą długość fali 1031 nanometrów, impuls sześciopikosekundowy i częstotliwość powtarzania 80 megaherców. Upewnij się, że zarówno belka pompy, jak i stokes mają niską moc, co najmniej 20 miliwatów, aby były widoczne na płycie wyrównującej. Nałóż olej na skraplacz oleju o dużej aperturze numerycznej.

Zamontuj szkiełko mikroskopowe na skraplaczu oleju i umieść dużą kroplę wody na szkiełku mikroskopu dla obiektywu wodnego 25X. Dostosuj stopień Z, aby dostroić ostrość, aż jasny obraz próbki biologicznej w jasnym polu będzie widoczny pod obiektywem wodnym 25X. Rozpocznij proces obrazowania we właściwej kolejności, aby uniknąć fotowybielania.

Aby szybko przełączać się między MPF i SHG, przełącz się z belki pompy na stałą belkę stokes. Wybierz rozdzielczość obrazu jako 512 na 512 pikseli. Ustaw czas zatrzymania na osiem mikrosekund na piksel dla MPF i SHG, przy średniej klatce powyżej trzech.

Użyj 40 mikrosekund na piksel ze średnią klatką wynoszącą dwie dla modalności SRS. Aby uzyskać autofluorescencję za pomocą MPF, wyłącz wiązkę lasera Stokesa. Dostosuj laser pompy do 800 nanometrów, aby wzbudzić NADH i flawinę.

Zdobądź sygnał z włókna kolagenowego za pomocą SHG. Wyłącz wiązkę laserową pompy i używaj tylko wiązki laserowej Stokes o mocy 500 miliwatów. Uzyskaj rozkład przestrzenny białek i lipidów za pomocą SRS.

Utrzymuj obie wiązki laserowe włączone i dostosuj częstotliwość wiązki laserowej, aby dopasować ją do określonego trybu wibracji dla każdej cząsteczki. Aby uzyskać zestawy danych obrazu hiperspektralnego SRS, wybierz tryb pakietu i ustaw zakres długości fali od 781.3 nanometrów do 806.5 nanometrów. Wybierz stos o numerze co najmniej 60 i uchwyć stos obrazów hiperspektralnych.

Zapisz wszystkie obrazy z tych samych obszarów zainteresowania w tym samym folderze i upewnij się, że format obrazu to plik Olympus OIR. Autofluorescencja i obrazowanie SRS z powodzeniem pozwoliły na uchwycenie informacji metabolicznych i strukturalnych z ludzkiej tkanki płucnej. Analiza ratiometryczna optycznego stosunku redoks i współczynnika nienasycenia lipidów dostarczyła przestrzennych rozkładów aktywności metabolicznej i składu molekularnego w tkance płucnej człowieka.

Ilościowe porównanie stresu oksydacyjnego i nienasycenia lipidami między tkanką zdrową a nowotworową ujawnia różnice w stanach metabolicznych.