Sortowanie komórek aktywowane fluorescencją w celu izolacji populacji komórek skleraktynów
May 31st, 2020
Koralowce tworzą bioróżnorodne ekosystemy ważne zarówno dla ludzi, jak i organizmów morskich. Jednak nadal nie rozumiemy pełnego potencjału i funkcji wielu komórek koralowców. W tym miejscu przedstawiamy protokół opracowany do izolacji, znakowania i rozdzielania populacji kamiennych komórek koralowców.
Protokół ten ułatwia identyfikację i izolację żywych populacji komórek koralowców na poziomie opisowym, który wcześniej nie był możliwy. Główną zaletą tej techniki jest to, że umożliwia ona dostęp do poziomu swoistości komórek, który do tej pory był w większości nieosiągalny. Procedurę zademonstruje dr Shannon Saigh, pracownik naukowy z działu cytometrii przepływowej w Sylvester Comprehensive Cancer Center.
Aby skonfigurować cytometr przepływowy do sortowania żywych komórek koralowców, otwórz nowy szablon projektu w oprogramowaniu cytometru przepływowego i wybierz odpowiednie lasery do analizy w panelu laserowym. Następnie utwórz boczny wykres punktowy i wykres punktowy do przodu na odpowiednich wykresach, aby skonfigurować strategię bramkowania i analizy. W celu analizy cytometrycznej przepływowej i sortowania żywych komórek koralowców, załaduj kontrolną niebarwioną próbkę komórek do komory na próbki cytometru i rozpocznij proces odczytu.
Ponieważ komórki koralowców są szczególnie delikatne, utrzymuj niskie ciśnienie w cytometrze, aby zapobiec lizie komórek. Na wykresie punktowym dostosuj napięcie mnożnika zdjęć, aby wyśrodkować punkty i rozpocząć rejestrowanie zdarzeń. Na wykresie punktowym do przodu i z boku utwórz bramkę wokół komórek w odległości od około 10 do 4 znaku na osi x rozproszenia do przodu.
Zastąp próbkę kontrolną pierwszą próbką barwionych komórek i zapisz około 10 000 komórek przed wstrzymaniem. Następnie bramkują zdarzenia, które są unikatowe dla barwionej grupy próbek. Aby posortować żywe komórki koralowców, po wybraniu interesującej populacji komórek w oprogramowaniu cytometru przepływowego, umieść jedną probówkę mikrowirówki zawierającą od 250 do 500 mikrolitrów odpowiedniego roztworu do pobrania w komorze zbiorczej cytometru dla każdej populacji do sortowania.
Po upływie odpowiedniej ilości czasu na wypłukanie gruzu rozpocznij sortowanie żądanej populacji, aby zebrać od 10 000 do kilku milionów komórek. Za każdym razem, gdy używany jest nowy barwnik, gatunek lub sortownik, należy posortować co najmniej 20 000 interesujących komórek w 500 mikrolitrach podłoża barwiącego, aby umożliwić przeprowadzenie kontroli czystości na populacji będącej przedmiotem zainteresowania i ponownie przeanalizować posortowane komórki, aby potwierdzić, że zdarzenia są odczytywane w bramce używanej do początkowego sortowania. W przypadku badań in vitro należy przechowywać posortowane komórki na lodzie do czasu przeniesienia ich do inkubatora lub wysterylizowanego środowiska.
Aby wprowadzić inne cząstki niekomórkowe, które nie mają takiego samego kształtu lub ziarnistości jak komórki koralowe, można je usunąć z analizy, tworząc wybór bramki na wykresie punktowym do przodu i z boku. Martwe komórki można wykluczyć, porównując sygnał DAPI niebarwionych i barwionych zawiesin komórkowych za pomocą histogramu i bramkując komórki o wysokiej ekspresji DAPI. Równolegle komórki, w których występuje symbiodeneazja autofluorescencji, mogą być usuwane poprzez bramkowanie względem komórek o wysokim sygnale w odległym kanale czerwonym.
Po tym iteracyjnym procesie bramkowania pozostałe komórki reprezentują nienaruszone żywe populacje komórek koralowych pozbawione symbiodeneazji. Komórki te można następnie zaklasyfikować do różnych subpopulacji komórkowych poprzez barwienie pod kątem takich cech, jak aktywność reaktywnych form tlenu i/lub zawartość lizosomów. Ważne jest, aby pamiętać, że niektóre komórki są bardziej delikatne niż inne i przeprowadzić ten proces tak ostrożnie, jak to możliwe.
Po wyizolowaniu określonych komórek można je wykorzystać do testów funkcjonalnych x-vivo, takich jak tworzenie kultur komórkowych i tworzenie profili transkryptomicznych.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Przegląd
Niniejsze badanie dotyczy potrzeby lepszego zrozumienia komórek koralowców, które są niezwykle ważne dla bioróżnorodności w ekosystemach morskich. Autorzy przedstawiają nowy protokół do izolacji i oznakowywania populacji komórek koralowców wapiennych, osiągając niespotykaną dotąd precyzję w szczególności komórek.
Kluczowe elementy badania
Obszar badań
- Biologia koralowców
- Techniki izolacji komórek
- Bioróżnorodność ekosystemów
Tło
- Korale tworzą zasadnicze ekosystemy dla życia morskiego.
- Obecna wiedza na temat funkcji komórek koralowców jest ograniczona.
- Izolowanie określonych populacji komórek koralowców jest niezbędne do dalszych badań.
Stosowane metody
- Cytometria przepływowa do sortowania żywych komórek
- Koral wapienny jako organizm modelowy
- Strategia bramkowa do identyfikacji i izolacji określonych typów komórek
Główne wyniki
- Protokół pozwala na identyfikację i sortowanie żywych populacji komórek koralowców.
- Gwarantuje czystość i żywotność posortowanych komórek dla przyszłych badań.
- Ułatwia badanie subpopulacji i ich funkcji.
Wnioski
- Badanie przedstawia niezawodną metodę izolacji komórek koralowców, zwiększającą potencjał badań.
- Wyniki wnoszą cenne informacje na temat biologii koralowców i zdrowia ekosystemów.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Isolating specific cell populations from complex tissues remains a critical challenge in early-stage target validation and mechanistic de-risking. Fluorescence-activated cell sorting (FACS) enables high-resolution cellular interrogation, supporting predictive confidence in pathway-specific responses. This capability is directly applicable to biopharma discovery workflows requiring precise functional assays and transcriptomic profiling of rare or fragile cell types.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses at single-cell resolution by isolating live populations for functional validation.
- Operational Value: Reduces mechanistic ambiguity by separating viable cell subpopulations from debris, dead cells, and symbiont-associated signals.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by generating purified inputs for downstream assays that clarify target engagement and pathway modulation.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Produces standardized, viable cell suspensions suitable for reproducible functional assays and dose-response profiling.
- Operational Value: Establishes gating strategies that ensure assay readiness and minimize variability across experimental runs.
- Scalability: Allows collection of sufficient cell numbers (10,000 to several million) for multi-well screening and omics applications.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Bridges discovery and preclinical stages by enabling consistent isolation of disease-relevant cell populations for mechanistic follow-up.
- Biomarker Alignment: Facilitates staining for stress-response markers (e.g., reactive oxygen species, lysosome content) to correlate cellular phenotypes with functional outcomes.
- Risk-Adjusted Advancement: Purified populations improve data reliability in preclinical models, reducing false positives from heterogeneous samples.
Pipeline & Workflow Integration
FACS integrates into the discovery continuum from target hypothesis testing through lead identification to preclinical validation by enabling precise cellular inputs at each stage.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by isolating live coral (or analogous mammalian) cell populations for pathway-specific functional interrogation.
- Screening: Delivers standardized, gated cell populations that enhance assay reproducibility and quantitative readout reliability.
- Analytics: Generates high-purity samples enabling accurate transcriptomic, proteomic, or metabolic profiling to compare experimental conditions.
- Translational Research: Connects early discovery to preclinical validation through consistent preparation of viable, stress-responsive cell subsets.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable platform capability across projects requiring subcellular resolution, independent of model system.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence by reducing noise from non-target cells and enabling mechanistic de-risking of targets.
- Operational Value: Standardizes sample preparation through reproducible gating, low-pressure sorting, and viability-preserving collection methods.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing cleaner biological data, reducing late-stage failure risk from flawed target assumptions.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization through reliable subpopulation-specific data that informs advancement criteria.
Implementation Considerations
- Requires expertise in flow cytometry setup, including laser selection, voltage optimization, and scatter plot gating for fragile cells.
- Dependent on instrumentation capable of low-pressure sorting and multi-parameter detection (forward/side scatter, fluorescence channels).
- Necessitates cross-team standardization of staining protocols, collection media, and gating thresholds to ensure reproducibility.
- Must account for variability in cell fragility across species or conditions, requiring iterative optimization of shear stress and staining duration.
- Limited by sample preparation quality; enzymatic or mechanical dissociation must preserve epitope integrity and cell viability for accurate sorting.
