Sortowanie komórek aktywowane fluorescencją w celu izolacji populacji komórek skleraktynów
31 maja 2020
Koralowce tworzą bioróżnorodne ekosystemy ważne zarówno dla ludzi, jak i organizmów morskich. Jednak nadal nie rozumiemy pełnego potencjału i funkcji wielu komórek koralowców. W tym miejscu przedstawiamy protokół opracowany do izolacji, znakowania i rozdzielania populacji kamiennych komórek koralowców.
Protokół ten ułatwia identyfikację i izolację żywych populacji komórek koralowców na poziomie opisowym, który wcześniej nie był możliwy. Główną zaletą tej techniki jest to, że umożliwia ona dostęp do poziomu swoistości komórek, który do tej pory był w większości nieosiągalny. Procedurę zademonstruje dr Shannon Saigh, pracownik naukowy z działu cytometrii przepływowej w Sylvester Comprehensive Cancer Center.
Aby skonfigurować cytometr przepływowy do sortowania żywych komórek koralowców, otwórz nowy szablon projektu w oprogramowaniu cytometru przepływowego i wybierz odpowiednie lasery do analizy w panelu laserowym. Następnie utwórz boczny wykres punktowy i wykres punktowy do przodu na odpowiednich wykresach, aby skonfigurować strategię bramkowania i analizy. W celu analizy cytometrycznej przepływowej i sortowania żywych komórek koralowców, załaduj kontrolną niebarwioną próbkę komórek do komory na próbki cytometru i rozpocznij proces odczytu.
Ponieważ komórki koralowców są szczególnie delikatne, utrzymuj niskie ciśnienie w cytometrze, aby zapobiec lizie komórek. Na wykresie punktowym dostosuj napięcie mnożnika zdjęć, aby wyśrodkować punkty i rozpocząć rejestrowanie zdarzeń. Na wykresie punktowym do przodu i z boku utwórz bramkę wokół komórek w odległości od około 10 do 4 znaku na osi x rozproszenia do przodu.
Zastąp próbkę kontrolną pierwszą próbką barwionych komórek i zapisz około 10 000 komórek przed wstrzymaniem. Następnie bramkują zdarzenia, które są unikatowe dla barwionej grupy próbek. Aby posortować żywe komórki koralowców, po wybraniu interesującej populacji komórek w oprogramowaniu cytometru przepływowego, umieść jedną probówkę mikrowirówki zawierającą od 250 do 500 mikrolitrów odpowiedniego roztworu do pobrania w komorze zbiorczej cytometru dla każdej populacji do sortowania.
Po upływie odpowiedniej ilości czasu na wypłukanie gruzu rozpocznij sortowanie żądanej populacji, aby zebrać od 10 000 do kilku milionów komórek. Za każdym razem, gdy używany jest nowy barwnik, gatunek lub sortownik, należy posortować co najmniej 20 000 interesujących komórek w 500 mikrolitrach podłoża barwiącego, aby umożliwić przeprowadzenie kontroli czystości na populacji będącej przedmiotem zainteresowania i ponownie przeanalizować posortowane komórki, aby potwierdzić, że zdarzenia są odczytywane w bramce używanej do początkowego sortowania. W przypadku badań in vitro należy przechowywać posortowane komórki na lodzie do czasu przeniesienia ich do inkubatora lub wysterylizowanego środowiska.
Aby wprowadzić inne cząstki niekomórkowe, które nie mają takiego samego kształtu lub ziarnistości jak komórki koralowe, można je usunąć z analizy, tworząc wybór bramki na wykresie punktowym do przodu i z boku. Martwe komórki można wykluczyć, porównując sygnał DAPI niebarwionych i barwionych zawiesin komórkowych za pomocą histogramu i bramkując komórki o wysokiej ekspresji DAPI. Równolegle komórki, w których występuje symbiodeneazja autofluorescencji, mogą być usuwane poprzez bramkowanie względem komórek o wysokim sygnale w odległym kanale czerwonym.
Po tym iteracyjnym procesie bramkowania pozostałe komórki reprezentują nienaruszone żywe populacje komórek koralowych pozbawione symbiodeneazji. Komórki te można następnie zaklasyfikować do różnych subpopulacji komórkowych poprzez barwienie pod kątem takich cech, jak aktywność reaktywnych form tlenu i/lub zawartość lizosomów. Ważne jest, aby pamiętać, że niektóre komórki są bardziej delikatne niż inne i przeprowadzić ten proces tak ostrożnie, jak to możliwe.
Po wyizolowaniu określonych komórek można je wykorzystać do testów funkcjonalnych x-vivo, takich jak tworzenie kultur komórkowych i tworzenie profili transkryptomicznych.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejsze badanie odpowiada na potrzebę lepszego zrozumienia komórek koralowców, które są kluczowe dla różnorodności biologicznej w ekosystemach morskich. Autorzy przedstawiają nowy protokół izolacji i znakowania populacji komórek twardych koralowców, osiągając bezprecedensowy poziom specyficzności komórkowej.
Kluczowe elementy badania
Obszar badawczy
- Biologia koralowców
- Techniki izolacji komórek
- Bioróżnorodność ekosystemów
Wstęp
- Koralowce tworzą kluczowe ekosystemy dla organizmów morskich.
- Obecna wiedza na temat funkcji komórek koralowców jest ograniczona.
- Izolowanie konkretnych populacji komórek koralowców jest niezbędne dla dalszych badań.
Zastosowane metody
- Cytometria przepływowa do sortowania żywych komórek
- Koralowiec twardy jako organizm modelowy
- Strategia bramkowania w celu identyfikacji i izolacji konkretnych typów komórek
Główne wyniki
- Protokół umożliwia identyfikację i sortowanie żywych populacji komórek koralowców.
- Zapewnia czystość i żywotność posortowanych komórek do przyszłych analiz.
- Ułatwia badanie subpopulacji oraz ich funkcji.
Wnioski
- Badanie przedstawia niezawodną metodę izolacji komórek koralowców, co zwiększa potencjał badawczy.
- Wyniki dostarczają cennych informacji na temat biologii koralowców i stanu zdrowia ekosystemu.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Izolowanie specyficznych populacji komórek z złożonych tkanek pozostaje kluczowym wyzwaniem na wczesnym etapie walidacji celów terapeutycznych oraz minimalizowania ryzyka mechanistycznego. Sortowanie komórek aktywowane fluorescencją (FACS) umożliwia wysokorozdzielczą analizę komórkową, co zwiększa pewność prognostyczną w odniesieniu do odpowiedzi specyficznych dla danych szlaków. Możliwość ta znajduje bezpośrednie zastosowanie w procesach odkrywania leków w biofarmacji, wymagających precyzyjnych testów funkcjonalnych oraz profilowania transkrypcyjnego rzadkich lub delikatnych typów komórek.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia weryfikację hipotez terapeutycznych z rozdzielczością pojedynczych komórek poprzez izolowanie żywych populacji do walidacji funkcjonalnej.
- Wartość operacyjna: Redukuje niejednoznaczność mechanistyczną poprzez oddzielenie żywotnych subpopulacji komórek od debris, martwych komórek oraz sygnałów związanych z symbiontami.
- Wartość prognostyczna: Wspiera selekcję projektów badawczych poprzez generowanie oczyszczonych materiałów wejściowych do dalszych analiz, które wyjaśniają oddziaływanie na cel i modulację szlaków.
Przesiewy i opracowywanie testów
- Wartość naukowa: Pozwala na uzyskanie ustandaryzowanych, żywotnych zawiesin komórkowych, odpowiednich do odtwarzalnych testów funkcjonalnych i profilowania odpowiedzi na dawkę.
- Wartość operacyjna: Ustanawia strategie bramkowania, które zapewniają gotowość do analizy i minimalizują zmienność pomiędzy poszczególnymi seriami eksperymentalnymi.
- Skalowalność: Umożliwia zebranie odpowiedniej liczby komórek (od 10 000 do kilku milionów) na potrzeby przesiewania w płytkach wielodołkowych oraz zastosowań omicznych.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Ciągłość translacyjna: Łączy etapy odkryć i badań przedklinicznych, umożliwiając spójną izolację populacji komórek istotnych dla danej choroby w celu przeprowadzenia dalszych analiz mechanistycznych.
- Dopasowanie biomarkerów: Ułatwia barwienie markerów odpowiedzi stresowej (np. reaktywnych form tlenu, zawartości lizosomów), aby skorelować fenotypy komórkowe z efektami funkcjonalnymi.
- Postęp z uwzględnieniem ryzyka: Oczyszczone populacje poprawiają niezawodność danych w modelach przedklinicznych, redukując liczbę wyników fałszywie dodatnich wynikających z heterogeniczności próbek.
Integracja potoku i przepływu pracy
FACS integruje się z kontinuum odkryć – od testowania hipotez dotyczących celów, przez identyfikację związków wiodących, aż po walidację przedkliniczną – umożliwiając precyzyjne wprowadzanie danych komórkowych na każdym z tych etapów.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez poprzez izolację żywych populacji komórek koralowca (lub analogicznych komórek ssaków) w celu funkcjonalnej analizy konkretnych szlaków sygnałowych.
- Przesiewanie: Dostarcza zestandaryzowanych, wyselekcjonowanych populacji komórek, co zwiększa powtarzalność testów oraz niezawodność odczytów ilościowych.
- Analityka: Pozwala na uzyskanie próbek o wysokiej czystości, umożliwiając dokładne profilowanie transkrypcyjne, proteomiczne lub metaboliczne w celu porównania warunków doświadczalnych.
- Badania translacyjne: Łączy wczesną fazę odkryć z walidacją przedkliniczną dzięki spójnemu przygotowaniu żywotnych, reagujących na stres podzbiorów komórek.
- Wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Służy jako wielokrotnego użytku moduł platformy w projektach wymagających rozdzielczości subkomórkowej, niezależnie od zastosowanego systemu modelowego.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorstwowy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność predykcyjną poprzez redukcję szumów pochodzących z komórek nietarczowych oraz umożliwia mechanistyczną minimalizację ryzyka w odniesieniu do celów terapeutycznych.
- Wartość operacyjna: Standaryzuje przygotowanie próbek dzięki powtarzalnemu bramowaniu, sortowaniu pod niskim ciśnieniem oraz metodom pobierania zachowującym żywotność.
- Wartość strategiczna: Usprawnia podejmowanie decyzji go/no-go poprzez dostarczanie czystszych danych biologicznych, co zmniejsza ryzyko niepowodzenia na późnych etapach wynikające z błędnych założeń dotyczących celu.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia ustalanie priorytetów z uwzględnieniem ryzyka dzięki wiarygodnym danym specyficznym dla subpopulacji, które kształtują kryteria dalszego rozwoju.
Wskazówki dotyczące implementacji
- Wymaga wiedzy specjalistycznej w zakresie konfiguracji cytometrii przepływowej, w tym wyboru laserów, optymalizacji napięcia oraz bramkowania wykresów rozrzutu dla komórek kruchych.
- Zależne od aparatury umożliwiającej sortowanie przy niskim ciśnieniu oraz detekcję wieloparametrową (rozproszenie światła w przód i w bok, kanały fluorescencyjne).
- Wymaga standaryzacji protokołów barwienia, mediów do zbierania i progów bramkowania pomiędzy zespołami w celu zapewnienia powtarzalności.
- Należy uwzględnić zmienność kruchości komórek w zależności od gatunku lub warunków, co wymaga iteracyjnej optymalizacji naprężeń ścinających i czasu barwienia.
- Ograniczone przez jakość przygotowania próbek; dysocjacja enzymatyczna lub mechaniczna musi zachować integralność epitopów i żywotność komórek w celu zapewnienia dokładnego sortowania.
