Name: Sortowanie komórek aktywowane fluorescencją w celu izolacji populacji komórek skleraktynów (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-31T12:30:00.000+00:00
Duration: 4 min 32 s
Description: Poznaj metodę sortowania komórek koralowców aktywowaną fluorescencją w celu izolacji żywych populacji skleraktynów. Technika ta umożliwia uzyskanie wysokiej czystości i żywotności komórek do badań funkcjonalnych oraz profilowania transkryptomicznego.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

NTK pragnie podziękować Nagrodom Badawczym Uniwersytetu Miami w dziedzinie nauk przyrodniczych i inżynierii za sfinansowanie tych badań. BR pragnie podziękować Alexowi i Ann Lauterbach za sfinansowanie Laboratorium Immunologii Porównawczej i Ewolucyjnej. Prace BR były wspierane przez Izraelską Fundację Naukową (ISF) o numerach: 1416/19 i 2841/19 oraz HFSP Research Grant, RGY0085/2019. Chcielibyśmy podziękować Zhannie Kozhekbaevej i Mike'owi Connelly'emu za pomoc techniczną. Chcielibyśmy również podziękować Uniwersytetowi w Miami, Miller School of Medicine's Flow Cytometry Shared Resource w Sylvester Comprehensive Cancer Center za dostęp do cytometru FACS oraz Shannon Saigh za wsparcie techniczne.

1. Dysocjacja tkanek od szkieletu koralowca za pomocą aerografu i kompresora
UWAGA: Wykonuj kroki na lodzie i chroń ręce rękawiczkami.
<ol>
	<li>Zmontuj zestaw aerografu, podłączając sprężarkę powietrza, wąż i aerograf (<silna klasa="xfig">Rysunek 2). Ustaw manometr w zakresie 276−483 kPa. 
	UWAGA: Zalecana sprężarka i wąż powietrzny używane w tym badaniu zostały ustawione na maksymalne ciśnienie 393 kPa. Stosowanie poza tym zakresem 276-483 kPa może skutkować albo niewystarczającym usunięciem komórek ze szkieletu, albo pęknięciem błon komórkowych. Zakres ten może być różny dla każdego gatunku i może wymagać przeprowadzenia badania żywotności. Test żywotności można przeprowadzić z podzbiorem zawiesiny komórkowej za pomocą prostego hemocytometru i testu wykluczenia barwnika 4′,6-diamidino-2-fenyloindolowego (DAPI), uwidocznionego pod mikroskopem złożonym.</li>
	<li>Przygotować 100 ml pożywki do barwienia komórek w autoklawowanym, sterylnym szklanym pojemniku, dodając 33 ml 10x soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS; bez wapnia i magnezu) do końcowego stężenia 3,3x, 2 ml płodowej surowicy cielęcej (FCS; ciepło inaktywowane w temperaturze 56 °C przez 30 min) do 2% całkowitej objętości i 2 ml 1 M buforu HEPES do końcowego stężenia 20 mM. Następnie uzupełnić w 100 ml sterylną wodą. 
	UWAGA: Stężenie 3,3x PBS zostało wybrane tak, aby naśladować zasolenie wody morskiej, jak wykazano w Rosental et al.18. Stężenie to należy dostosować do gatunków występujących w innych środowiskach, aby naśladować ich zasolenie.</li>
	<li>Przenieś 10 ml pożywki do barwienia komórek do butelki aerografu (oznaczonej "F" w <silna klasa="xfig">Rysunek 2) i załóż pokrywę adaptera do złącza aerografu. 
	UWAGA: Większe fragmenty i gatunki z grubszymi warstwami tkanek mogą wymagać większej ilości pożywki do odpowiedniego usunięcia tkanek.</li>
	<li>W przypadku pokazanych tutaj rozgałęzionych gatunków koralowców, użyj noża do kości, aby przyciąć lub przeciąć fragment koralowca o długości około 3−5 cm lub powierzchni 4cm2. 
	UWAGA: Fragment musi być wolny od makroglonów i innych organizmów wielokomórkowych, ponieważ mogą one nie zostać usunięte z próbki znajdującej się za próbką i mogą zanieczyścić próbkę podczas procesów analizy i sortowania FACS. 1 cm fragment P. damicornis daje około 2−10 x 106 komórek po przefiltrowaniu, wybarwieniu i umyciu.</li>
	<li>Umieść fragment koralowca w plastikowej torbie do zbierania i użyj aerografu, aby rozpylić pożywkę do barwienia komórek na koralowiec (<silna klasa = "xfig" > Rysunek 2). Kontynuuj ten proces, aż większość szkieletu zostanie odsłonięta. Wyjmij pozostały szkielet z worka zbiorczego.</li>
</ol>
2. Dysocjacja komórek od tkanki koralowej
UWAGA: Wykonuj wszystkie kroki na lodzie i chroń ręce rękawiczkami.
<ol>
	<li>Przefiltrować zawiesinę komórek przez nylonowe sitko komórkowe o pojemności 40 μm do probówki wirówkowej o pojemności 50 ml w celu uzyskania zawiesiny jednokomórkowej. 
	UWAGA: Różne rozmiary oczek sitka komórkowego mogą być bardziej odpowiednie dla różnych gatunków. Jednak większe rozmiary mogą powodować niewystarczającą dysocjację tkanek z powodu przechodzenia zanieczyszczeń i grudek komórek.
	<ol>
		<li>W przypadku próbek z grubszymi warstwami śluzu użyj wysterylizowanego tłoka plastikowej strzykawki o pojemności 1 ml i delikatnie zmiel go o filtr, aby rozbić grudki i pomóc komórkom przejść przez sitko. Przepłukać sitko i tłok pożywką do barwienia komórek do probówki wirówkowej.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Granulować komórki przez odwirowanie w temperaturze 4 °C przy 450 x g przez 5 minut. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić komórki w 1 ml pożywki do barwienia komórek.</li>
</ol>
3. Barwienie komórek
UWAGA: Wykonuj wszystkie kroki na lodzie i chroń ręce rękawiczkami. Plamy przedstawione w tym protokole służą do celów reprezentacyjnych. Alternatywne barwienie będzie wymagało różnych stężeń i czasów inkubacji.
<ol>
	<li>Przenieść 500 μl zawieszonych komórek do probówki okrągłodennej o pojemności 5 ml i odłożyć na bok jako próbkę kontrolną. Nie dodawać plamy do tej podwielokrotności.</li>
	<li>Do pozostałej zawiesiny komórek dodać 0,42 μl 12 mM barwnika żywotności DAPI (tabela materiałów), 1 μl barwnika 5 μM reaktywnych form tlenu (ROS) (tabela materiałów) i 0,1 μl barwienia lizosomem 0,2 μM (tabela materiałów). Dobrze odpipetować do wymieszania i inkubować na lodzie przez 30 minut w ciemności, aby zapobiec fotowybielaniu. 
	UWAGA: DAPI jest używany w tym przykładzie do pracy jako barwnik DNA i barwnik żywotności do różnicowego bramkowania martwych komórek na maszynie FACS. Zakłada się, że DAPI przenika do umierających komórek ze względu na integralność błony. Barwienie ROS emituje światło w zakresie 520 nm (kolor zielony), natomiast marker lizosomalny emituje światło o długości około 668 nm (kolor czerwony).</li>
	<li>Osad 500 μl barwionych komórek przez odwirowanie w temperaturze 4 °C przy 450 x g przez 5 minut. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad w 500 μl pożywki do barwienia komórek. Przenieść do nowej probówki okrągłodennej o pojemności 5 ml i przechowywać na lodzie.</li>
</ol>
4. Uruchomienie FACS
UWAGA: Kroki mogą się różnić w zależności od marki i modelu cytometru ze względu na różnice w laserach i kanałach. Do tego protokołu użyto cytometru z laserami o długości fali 405, 488, 535 i 640 nm. Filtry zawarte w tym protokole służą do celów reprezentacyjnych. Alternatywne barwienie komórek może wymagać innego zestawu filtrów i laserów.
<ol>
	<li>Rozpocznij tworzenie nowego szablonu projektu w oprogramowaniu sortera i wybierz panel laserowy. Aby uzyskać reprezentowaną kombinację barwienia i naturalnej fluorescencji, wybierz wszystkie cztery lasery (405, 488, 535 i 640 nm).</li>
	<li>Wybierz odpowiednie filtry dla każdego oczekiwanego koloru reprezentowanego w eksperymencie.
	<ol>
		<li>Aby wykryć emisję DAPI i pomóc w oddzieleniu żywych i martwych komórek, użyj filtra o pasmie przepustowym (BP) 450/50 (zakres 425−475 nm), takiego jak filtr DAPI, Hoeschst lub Pacific Blue.</li>
		<li>Do wykrywania światła emitowanego przez zielony sygnał ROS należy użyć filtra o BP 530/30 (zakres długości fali 515-545 nm), takiego jak filtr izotiocyjanianu fluoresceiny (FITC) lub białka zielonej fluorescencji (GFP). Ten filtr zmierzy stężenie ROS w każdej komórce.</li>
		<li>Dodaj dodatkowy filtr o BP 670/30 (zakres 655−685 nm), taki jak filtr allofikocyjaninowy (APC) do wykrywania emisji plam lizosomalnych. 
		UWAGA: Kanał APC pozwoli na pomiar aktywności fagocytarnej. Kanał ten będzie również wykrywał autofluorescencję generowaną przez symbiotyczne algi koralowe z rodziny Symbiodiniaceae. Sygnał ten można jednak oddzielić za pomocą dodatkowego kanału, który ma dłuższą długość fali niż filtr APC.</li>
		<li>Dołącz filtr o BP 780/60 (zakres 750-810 nm), taki jak najczęściej stosowany filtr fikoerytryny, cyjaniny (APC-Cy7), który wykrywa emisję autofluorescencji dalekiej czerwieni z Symbiodiniaceae i pomaga w izolacji komórek aposymbiotycznych.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. Konfiguracja bramkowania FACS
UWAGA: Kroki mogą się różnić w zależności od marki i modelu cytometru oraz programu akwizycji sprzężonego z cytometrem.
<ol>
	<li>Na ekranie eksperymentalnym projektu w oprogramowaniu do cytometrii utwórz wykres punktowy i wybierz rozproszenie do przodu (FCS) jako metrykę dla osi X i rozproszenie boczne (SSC) dla osi Y. 
	UWAGA: FCS koreluje z rozmiarem komórki, a SSC koreluje z ziarnistością. Pozwoli to na usunięcie większości zanieczyszczeń, ponieważ większość z nich będzie mniejsza niż nienaruszone komórki.</li>
	<li>Ustaw osie na skalę logarytmiczną lub dwuwykładniczą, ponieważ rozmiary komórek i stopień szczegółowości mogą różnić się o kilka rzędów wielkości (<silna klasa = "xfig">Rysunek 3A), szczególnie w koralowcach.</li>
</ol>
6. Analiza FACS i izolacja komórek
UWAGA: Kroki mogą się różnić w zależności od marki i modelu cytometru oraz sprzężonego programu akwizycji.
<ol>
	<li>Umieścić kontrolę (tj. niebarwiony podzbiór komórek) w komorze próbki cytometru i rozpocząć proces odczytu. Gdy komputer zacznie odbierać dane z każdej komórki lub zdarzenia, na wykresie punktowym zaczną pojawiać się kropki. Aby usunąć wszelkie zanieczyszczenia pozostawione w komorach cytometru z poprzednich eksperymentów, odczekaj około 30 s przed rozpoczęciem analizy.</li>
	<li>Na wykresie punktowym dostosuj napięcie lampy fotopowielacza (PMT), aby wyśrodkować punkty. 
	UWAGA: Napięcie PMT służy do wzmacniania siły sygnału mierzonych fotonów; jeśli napięcie PMT jest zbyt słabe, odczytywanych zostanie mniej komórek, a jeśli napięcie PMT jest zbyt silne, ogniwa będą mierzone w pobliżu wartości maksymalnej, a różne typy ogniw będą nie do odróżnienia od siebie. Odpowiednie napięcie PMT zapewnia, że niezależnie rozróżnialne zdarzenia wypełnią wykres punktowy. Separacja zdarzeń jest łatwiejsza do wizualizacji dzięki rzutowaniu skal logarytmicznych lub dwuwykładniczych na wykresach punktowych FSC i SSC.</li>
	<li>Rozpocznij nagrywanie wydarzeń. Aby zachować próbkę, wstrzymaj pobieranie danych po odczytaniu około 15 000 zdarzeń. W większości przypadków będzie to wystarczające do wizualizacji ogólnych wzorców populacji komórek. Rejestruj więcej zdarzeń podczas analizowania i izolowania małych, wyspecjalizowanych populacji komórek.</li>
	<li>Na pierwszym wykresie FSC i SSC utwórz wybór lub bramkę komórek wokół znaku 102 i wyżej na osi X FSC. Wszystko, co znajduje się poniżej tego progu, jest prawdopodobnie szczątkami komórkowymi. Narysuj prostokątne bramki, co jest regularną opcją w programach do cytometrii przepływowej i jest dobre dla wyraźnych, wyraźnych populacji komórek. W przypadku populacji komórek, które przyjmują bardziej nieregularny kształt na wykresach punktowych, należy użyć opcji bramkowania wielokątnego. 
	UWAGA: Minimalna wartość odcięcia 102 na przednim rozproszeniu powinna wybierać najmniejsze komórki koralowca, ale może pozwolić na zanieczyszczenie szczątków. Aby to zmienić, zwiększ dolną granicę bramkowania, aby była bardziej konserwatywna.</li>
	<li>Utwórz nowy wykres punktowy przedstawiający filtr DAPI na osi X i filtr APC-Cy7 na osi Y. Aby to zrobić, wybierz bramkę dla nienaruszonych komórek utworzonych w kroku 6.4, kliknij prawym przyciskiem myszy i wybierz opcję utworzenia nowego wykresu punktowego. Dostosuj osie do skali logarytmicznej lub dwuwykładniczej. 
	UWAGA: Kroki potrzebne do utworzenia nowej działki mogą się różnić w zależności od oprogramowania.</li>
	<li>Teraz wyjmij próbkę kontrolną z komory cytometru i zastąp ją wybarwionymi komórkami. Odczekaj 30 sekund przed rozpoczęciem analizy i zapisaniem danych. Nagraj około 15 000 komórek przed wstrzymaniem. 
	UWAGA: Odrębne populacje na górnym końcu skali APC-Cy7 to te z wysoką czerwoną autofluorescencją z Symbiodiniaceae. Do wizualizacji tych podziałów populacji nie jest potrzebna żadna plama, można je również obejrzeć na nagraniu próbki kontrolnej (<silna klasa="xfig">Rysunek 3C). Wybierz dla populacji samych koralowców, te znajdujące się niżej na osi Y, w celu dalszego zróżnicowania.</li>
	<li>Utwórz nowy wykres punktowy komórek aposymbiotycznych, aby zobrazować stężenia ROS (filtr FITC) i komórki dodatnie dla lizosomów (filtr APC), ponownie wykorzystując skale logarytmiczne lub dwuwykładnicze. 
	UWAGA: Jeśli istnieje wiele odrębnych populacji komórek, które są aposymbiotyczne, każda z nich może być dalej rozróżniana na własnym wykresie punktowym (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 3C,D).</li>
	<li>Porównaj barwioną grupę próbek z kontrolnym, niebarwionym podzbiorem, korzystając z pierwszego zapisu próbki kontrolnej lub ponownie wprowadzając i uruchamiając grupę kontrolną. Bramkowanie zdarzeń, które są unikatowe dla poplamionej grupy próbek.</li>
</ol>
7. Sortowanie i zbieranie FACS
UWAGA: Kroki mogą się różnić w zależności od marki i modelu cytometru oraz programu akwizycji sprzężonego z cytometrem.
<ol>
	<li>Po wybraniu komórek wybranych do pobrania, umieść probówki do mikrowirówek (zawierające 250−500 μl pożywki do hodowli komórkowych lub buforu do lizy w zależności od liczby pobranych komórek i metody przechowywania) w komorze pobierania cytometru. 
	UWAGA: Reprezentowany cytometr przepływowy jest w stanie sortować jednocześnie cztery różne populacje, a maszyna może być skonfigurowana do przechowywania różnych urządzeń zbierających, w tym różnych probówek wirówkowych i płytek 96-dołkowych.</li>
	<li>Gdy cytometr zacznie odczytywać próbkę i minie odpowiednia ilość czasu na wypłukanie zanieczyszczeń, zacznij sortować żądane populacje i zbieraj od 20 000 komórek do kilku milionów.
	<ol>
		<li>W przypadku ponad 500 000 komórek dostosuj objętość pożywki do hodowli komórkowych lub buforu do lizy oraz objętość urządzenia do pobierania.</li>
		<li>W przypadku badań in vitro należy przechowywać komórki na lodzie do czasu umieszczenia w inkubatorze lub wysterylizowanym środowisku.</li>
		<li>W przypadku badań molekularnych należy natychmiast rozpocząć proces izolacji DNA/RNA/białka lub błyskawicznie zamrozić i przechowywać w temperaturze -80 °C do czasu ekstrakcji.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Za każdym razem, gdy używany jest nowy barwnik, gatunek lub sortownik, należy przeprowadzić kontrolę czystości populacji będącej przedmiotem zainteresowania, sortując co najmniej 20 000 komórek zainteresowania na 500 μl podłoża barwiącego, a następnie ponownie analizując posortowane komórki i potwierdzając, że komórki są odczytywane w bramce użytej do początkowego sortowania (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 4).</li>
</ol>

<ol><li>Bellwood, D. R., Hughes, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regional-scale+assembly+rules+and+biodiversity+of+coral+reefs%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Regional-scale assembly rules and biodiversity of coral reefs.</a> Science. 292 (5521), 1532-1535 (2001).</li>
<li>Ferrario, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effectiveness+of+coral+reefs+for+coastal+hazard+risk+reduction+and+adaptation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">The effectiveness of coral reefs for coastal hazard risk reduction and adaptation.</a> Nature Communications. 5 (3794), 1-9 (2014).</li>
<li>Wegley, L., Edwards, R., Rodriguez-Brito, B., Liu, H., Rohwer, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metagenomic+analysis+of+the+microbial+community+associated+with+the+coral+Porites+astreoides%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Metagenomic analysis of the microbial community associated with the coral Porites astreoides.</a> Environmental Microbiology. 9 (11), 2707-2719 (2007).</li>
<li>Gates, R. D., Bahdasarian, G., Muscatine, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temperature+stress+causes+host+cell+detachment+in+symbiotic+cnidarians%3A+implications+for+coral+bleaching%5BTitle%5D)+AND+%22Biological+Bulletin%22%5BJournal%5D)">Temperature stress causes host cell detachment in symbiotic cnidarians: implications for coral bleaching.</a> Biological Bulletin. 182 (3), 324-332 (1992).</li>
<li>Lesser, M. P., Bythell, J. C., Gates, R. D., Johnstone, R. W., Hoegh-Guldberg, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Are+infectious+diseases+really+killing+corals%3F+Alternative+interpretations+of+the+experimental+and+ecological+data%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Marine+Biology+and+Ecology%22%5BJournal%5D)">Are infectious diseases really killing corals? Alternative interpretations of the experimental and ecological data.</a> Journal of Experimental Marine Biology and Ecology. 346 (1), 36-44 (2007).</li>
<li>Miller, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coral+disease+following+massive+bleaching+in+2005+causes+60%25+decline+in+coral+cover+on+reefs+in+the+US+Virgin+Islands%5BTitle%5D)+AND+%22Coral+Reefs%22%5BJournal%5D)">Coral disease following massive bleaching in 2005 causes 60% decline in coral cover on reefs in the US Virgin Islands.</a> Coral Reefs. 28 (4), 925-937 (2009).</li>
<li>Hoegh-Guldberg, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coral+reefs+under+rapid+climate+change+and+ocean+acidification%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Coral reefs under rapid climate change and ocean acidification.</a> Science. 318 (5857), 1737-1742 (2007).</li>
<li>Berkelmans, R., Van Oppen, M. J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+zooxanthellae+in+the+thermal+tolerance+of+corals%3A+A+%22nugget+of+hope%22+for+coral+reefs+in+an+era+of+climate+change%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+Royal+Society+B%3A+Biological+Sciences%22%5BJournal%5D)">The role of zooxanthellae in the thermal tolerance of corals: A "nugget of hope" for coral reefs in an era of climate change.</a> Proceedings of the Royal Society B: Biological Sciences. 273 (1599), 2305-2312 (2006).</li>
<li>Cunning, R., Silverstein, R. N., Baker, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Investigating+the+causes+and+consequences+of+symbiont+shuffling+in+a+multi-partner+reef+coral+symbiosis+under+environmental+change%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+Royal+Society+B%3A+Biological+Sciences%22%5BJournal%5D)">Investigating the causes and consequences of symbiont shuffling in a multi-partner reef coral symbiosis under environmental change.</a> Proceedings of the Royal Society B: Biological Sciences. 282 (1809), 1-8 (2015).</li>
<li>Peters, E. C. Anatomy. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPeters%2C+EC+%22Diseases+of+Coral%22">Diseases of Coral</a>. Woodley, C. M., et al. , Wiley Blackwell. Boston, MA. 85-107 (2015).</li>
<li>Allemand, D., Tambutté, É, Zoccola, D., Tambutté, S. Coral calcification, cells to reefs. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAllemand%2C+D+%22Coral+Reefs%3A+An+Ecosystem+in+Transition%22">Coral Reefs: An Ecosystem in Transition</a>. Dubinsky, Z., Stambler, N. , Springer Netherlands. Dordrecht, Netherlands. 119-150 (2011).</li>
<li>Rinkevich, B., Loya, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Reproduction+of+the+Red+Sea+Coral+Stylophora+pistillata.+I.+Gonads+and+Planulae%5BTitle%5D)+AND+%22Marine+Ecology+Progress+Series%22%5BJournal%5D)">The Reproduction of the Red Sea Coral Stylophora pistillata. I. Gonads and Planulae.</a> Marine Ecology Progress Series. 1 (2), 133-144 (2007).</li>
<li>Palmer, C. V., Traylor-Knowles, N. G., Willis, B. L., Bythell, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Corals+use+similar+immune+cells+and+wound-healing+processes+as+those+of+higher+organisms%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Corals use similar immune cells and wound-healing processes as those of higher organisms.</a> PLoS ONE. 6 (8), e23992(2011).</li>
<li>Hayes, R. L., Bush, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microscopic+observations+of+recovery+in+the+reef-building+scleractinian+coral%2C+Montastrea+annularis%2C+after+bleaching+on+a+Cayman+reef%5BTitle%5D)+AND+%22Coral+Reefs%22%5BJournal%5D)">Microscopic observations of recovery in the reef-building scleractinian coral, Montastrea annularis, after bleaching on a Cayman reef.</a> Coral Reefs. 8 (4), 203-209 (1990).</li>
<li>Chapman, D. M. Cnidarian Histology. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aChapman%2C+DM+%22Coelenterate+Biology%22">Coelenterate Biology</a>. Muscatine, L., Lenhoff, H. M. , Academic Press. New York, NY. 1-43 (1974).</li>
<li>Traylor-Knowles, N., Rose, N. H., Palumbi, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cell+specificity+of+gene+expression+in+the+response+to+heat+stress+in+corals%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Experimental+Biology%22%5BJournal%5D)">The cell specificity of gene expression in the response to heat stress in corals.</a> The Journal of Experimental Biology. 220 (10), 1837-1845 (2017).</li>
<li>Traylor-Knowles, N., Palumbi, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translational+environmental+biology%3A+Cell+biology+informing+conservation%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Translational environmental biology: Cell biology informing conservation.</a> Trends in Cell Biology. 24 (5), 265-267 (2014).</li>
<li>Rosental, B., Kozhekbaeva, Z., Fernhoff, N., Tsai, J. M., Traylor-Knowles, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coral+cell+separation+and+isolation+by+fluorescence-activated+cell+sorting+%28FACS%29%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Coral cell separation and isolation by fluorescence-activated cell sorting (FACS).</a> BMC Cell Biology. 18 (1), 1-12 (2017).</li>
<li>Rosental, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complex+mammalian-like+haematopoietic+system+found+in+a+colonial+chordate%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Complex mammalian-like haematopoietic system found in a colonial chordate.</a> Nature. 564 (7736), 425-429 (2018).</li>
<li>Silva-Lima, A. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+Symbiodinium+Strains+Are+Hosted+by+the+Brazilian+Endemic+Corals+Mussismilia+spp%5BTitle%5D)+AND+%22Microbial+Ecology%22%5BJournal%5D)">Multiple Symbiodinium Strains Are Hosted by the Brazilian Endemic Corals Mussismilia spp.</a> Microbial Ecology. 70 (2), 301-310 (2015).</li>
<li>Yvan, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometric+enumeration+of+bacterial+in+the+coral+surface+mucus+layer%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microbiological+Methods%22%5BJournal%5D)">Flow cytometric enumeration of bacterial in the coral surface mucus layer.</a> Journal of Microbiological Methods. 128, 16-19 (2016).</li>
<li>Lee, C. S., Wilson Yeo, Y. S., Sin, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bleaching+response+of+Symbiodinium+%28zooxanthellae%29%3A+Determination+by+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+Part+A%22%5BJournal%5D)">Bleaching response of Symbiodinium (zooxanthellae): Determination by flow cytometry.</a> Cytometry Part A. 81 (10), 888-895 (2012).</li>
<li>Baumgarten, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+genome+of+Aiptasia%2C+a+sea+anemone+model+for+coral+symbiosis%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">The genome of Aiptasia, a sea anemone model for coral symbiosis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (38), 11893-11898 (2015).</li>
<li>Voolstra, C. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+analysis+of+the+genomes+of+Stylophora+pistillata+and+Acropora+digitifera+provides+evidence+for+extensive+differences+between+species+of+corals%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Comparative analysis of the genomes of Stylophora pistillata and Acropora digitifera provides evidence for extensive differences between species of corals.</a> Scientific Reports. 7 (1), 1-14 (2017).</li>
<li>Pavlov, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydraulic+control+of+tuna+fins%3A+A+role+for+the+lymphatic+system+in+vertebrate+locomotion%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Hydraulic control of tuna fins: A role for the lymphatic system in vertebrate locomotion.</a> Science. 357 (6348), 310-314 (2017).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Protokół ten został zaadaptowany z Rosental et al.18 i opracowany do identyfikacji i izolacji komórek P. damicornis . Metodologia koncentruje się na procesie filtrowania próbek w celu usunięcia zanieczyszczeń, komórek niezdolnych do życia i komórek gospodarzy Symbiodiniaceae poprzez badanie czynników wewnętrznych komórek, w tym względnej wielkości komórki, względnej ziarnistości komórki, autofluorescencji komórek i obecności nienaruszonych błon komórkowych. Techniki te można zastosować do...

Rafy koralowe są jednym z najważniejszych ekosystemów na Ziemi. Ułatwiają one bioróżnorodność, zapewniając krytyczne siedliska dla ryb i bezkręgowców oraz mają kluczowe znaczenie dla utrzymania społeczności antropogenicznych, zapewniając żywność i środki do życia poprzez turystykę1. Jako kluczowy budowniczy raf koralowych, zwierzę koralowe (gromada: Cnidaria) pomaga również społecznościom przybrzeżnym, tworząc duże struktury z węglanu wapnia, które łagodzą uszkodzenia spowodowane przez fale i sztormy2.
Dorosłe koralowce to zwierzęta siedzące, które mają szeroki wachlarz endosymbiotycznych partnerów, w tym wirusy, archeony, bakterie, protisty, grzyby, a przede wszystkim członków rodziny bruzdnic glonów Symbiodiniaceae3. Zmiany w środowisku mogą powodować brak równowagi w tej społeczności, często prowadząc do wybuchów chorób i blaknięcia koralowców, w których symbiotyczne Symbiodiniaceae są wydalane z kolonii koralowców, eliminując w ten sposób główne źródło pożywienia koralowców. Oba te scenariusze często powodują śmierć koralowca host4,5,6. Skutki stresorów wywołanych przez antropogeny, takich jak gwałtowne zmiany klimatyczne, przyspieszają masową śmierć koralowców, prowadząc do globalnego spadku raf koralowych7.
Ostatnio opracowano wiele różnych metod, które pomagają złagodzić utratę raf koralowych. Metody te obejmują sadzenie koralowców na istniejących rafach, krzyżowanie genetyczne przy użyciu genotypów tolerancyjnych termicznie oraz manipulację komórkową społecznościami mikrobiologicznymi i symbiotycznymi hostowanymi w koralowcu8,9. Pomimo tych wysiłków, wiele pozostaje niewiadomych na temat różnorodności komórek koralowców i ich funkcji10,11,12,13. Dogłębne zrozumienie różnorodności typów komórek koralowych i funkcji komórek jest konieczne, aby zrozumieć, jak organizm koralowca zachowuje się w normatywnych i stresujących warunkach. Wysiłki mające na celu maksymalizację wydajności odbudowy i konserwacji skorzystają na lepszym zrozumieniu, w jaki sposób różnorodność komórek i funkcja genów są ze sobą sprzężone.
Poprzednie prace nad różnorodnością i funkcją komórek koncentrowały się głównie na badaniach histologicznych i pobieraniu próbek RNA z całych tkanek14,15,16,17. Aby uzyskać więcej szczegółów na temat funkcji określonych typów komórek w koralowcach, potrzebne są metody izolacji określonych populacji żywych komórek koralowców. Udało się to z powodzeniem osiągnąć w nieklasycznych organizmach modelowych za pomocą technologii cytometrii przepływowej sortowania komórek aktywowanych fluorescencją (FACS)18. FACS wykorzystuje kombinację laserów dostrojonych do różnych długości fal do pomiaru różnych endogennych właściwości komórkowych na poziomie pojedynczej komórki, takich jak względna wielkość komórki, ziarnistość komórki i autofluorescencja. Dodatkowo komórki mogą być oznaczone fluorescencyjnie znakowanymi związkami w celu zmierzenia określonych, pożądanych właściwości18,19.
Do tej pory zastosowanie cytometrii przepływowej do komórek koralowców polegało głównie na analizie symbiotycznych Symbiodiniaceae i innych populacji bakterii, wykorzystując ich silną, naturalną autofluorescencję20,21,22. FACS został również wykorzystany do oszacowania wielkości genomu koralowców za pomocą sygnału fluorescencyjnego markera DNA w porównaniu z komórkami organizmu modelu referencyjnego23,24. Efektywne zastosowanie FACS zapewnia trzy odrębne narzędzia, które są przydatne w badaniach biologii komórki: 1) morfologiczny i funkcjonalny opis pojedynczych komórek; 2) identyfikacja, separacja i izolacja określonych populacji komórek do dalszych badań; oraz 3) analiza testów funkcjonalnych na poziomie pojedynczej komórki.
Rozwój i zastosowanie różnych egzogennych markerów fluorescencyjnych do badania komórek koralowców pozostaje prawie niezbadane. Takie markery mogą obejmować znakowane białka, znakowane substraty dla enzymów lub reakcje fluorescencyjne na inne związki. Markery te można wykorzystać do identyfikacji typów komórek, które mają unikalne właściwości, takie jak podświetlanie komórek, które wytwarzają różne ilości określonej cechy przedziału komórkowego, takich jak lizosomy. Dodatkowym przykładem jest użycie fluorescencyjnie znakowanych kulek do funkcjonalnej identyfikacji komórek odpowiedzialnych za fagocytozę, czyli pochłonięcie docelowego patogenu25. Populacje komórek aktywnych w odpowiedziach immunologicznych można łatwo zidentyfikować za pomocą FACS po wchłonięciu tych egzogennie nałożonych kulek. Podczas gdy tradycyjne metody histologiczne wymagają zachowanej tkanki i wielu godzin, aby przybliżyć odsetek komórek dodatnich do pochłonięcia przez kulki, test funkcjonalny oparty na FACS na pochłanianie patogenów można przeprowadzić stosunkowo szybko na izolowanych żywych komórkach. Oprócz badania specyficznych dla komórek reakcji na stres, technologia ta ma potencjał, aby wyjaśnić ekspresję specyficzną dla genów i rzucić światło na historię ewolucyjną i rozwojową typów komórek całkowicie unikalnych dla parzydełkowców, takich jak kalikoblasty i parzydełka.
Ostatnio przeprowadziliśmy intensywne badania przesiewowe ponad 30 markerów komórkowych, które doprowadziły do zidentyfikowania 24, które są zdolne do oznaczania komórek koralowców, z których 16 jest przydatnych do rozróżniania unikalnych populacji18, tworząc z nich klastry różnicowania (CD). Tutaj opisujemy proces izolacji komórek koralowców w Pocillopora damicornis od usunięcia komórek ze szkieletu węglanu wapnia do identyfikacji i izolacji określonych populacji komórek za pomocą FACS (ryc. 1).

<table><tbody><tr><td>Zestaw aerografu i Sprężarka</td><td>TCP Global</td><td>ABD KIT-H-SET</td><td>Paasche H Series Zestaw aerografu syfonowego o pojedynczym działaniu z kompresorem Master TC-20 i Wąż powietrzny</td></tr><tr><td>BD FACSAria II</td><td>BD</td><td>644832</td><td></td></tr><tr><td>Obcinaki do kości</td><td>Bulk Reef Supply</td><td>205357</td><td>Oceans Wonders Coral Stony Bone</td></tr><tr><td>Cutter Cell Strainer</td><td>Corning</td><td>352340</td><td>40 um; BD Sokół; pakowane pojedynczo; sterylny; nylon</td></tr><tr><td>CellRox Green</td><td>Life Technologies</td><td>C10444</td><td>2,5 mM w DMSO; Wzbudzenie / emisja: 485/520 nm</td></tr><tr><td>Worek zbiorczy</td><td>Grainger</td><td>38UV35</td><td>Reloc Zippit 6 "L x 4" W Standardowa torebka foliowa wielokrotnego użytku z zamknięciem na zamek błyskawiczny, przezroczysta; 2 mil Grubość</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Invitrogen</td><td>D1306</td><td>10mg w H2O; Wzbudzenie / emisja: 358/461 nm</td></tr><tr><td>Surowica cielęca płodu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F2442-100ML</td><td>Inaktywowana termicznie w 57 & stopniach; C przez 30 minut</td></tr><tr><td>Hemacytometr</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z359629</td><td>Hemacytometr Bright-Line</td></tr><tr><td>Bufor HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H0887</td><td></td></tr><tr><td>LysoTracker Deep Red</td><td>Life Technologies</td><td>L12492</td><td>1mM w DMSO; Absorpcja/emisja: Probówki do mikrowirówek 647/668 nm</td></tr><tr><td></td><td>VWR</td><td>87003-294</td><td>1,7 ml</td></tr><tr><td>buforowanej soli fizjologicznej (PBS)</td><td>Gibco</td><td>70011-044</td><td>pH 7,4; 10X</td></tr><tr><td>Probówki okrągłodenne</td><td>VWR</td><td>352063</td><td>5 mL Polipropylenowa strzykawka z okrągłym dnem</td></tr><tr><td></td><td>BD</td><td>309628</td><td>1 mL BD Luer-Lok Strzykawka sterylna, poliwęglan jednorazowego użytku</td></tr></tbody></table>

sortowanie komórek aktywowane fluorescencją w celu izolacji populacji komórek skleraktynów

Fluorescence-Activated Cell Sorting for the Isolation of Scleractinian Cell Populations

Rafy koralowe są zagrożone z powodu antropogenicznych czynników stresogennych. Biologiczna reakcja koralowców na te stresory może zachodzić na poziomie komórkowym, ale mechanizmy nie są dobrze poznane. Aby zbadać reakcję koralowców na stresory, potrzebujemy narzędzi do analizy odpowiedzi komórkowych. W szczególności potrzebujemy narzędzi, które ułatwią stosowanie testów funkcjonalnych, aby lepiej zrozumieć, w jaki sposób populacje komórek reagują na stres. W obecnym badaniu używamy sortowania komórek aktywowanego fluorescencją (FACS) do izolowania i oddzielania różnych populacji komórek w koralowcach kamiennych. Protokół ten obejmuje: (1) oddzielenie tkanek koralowców od szkieletu, (2) stworzenie zawiesiny pojedynczej komórki, (3) znakowanie komórek koralowców za pomocą różnych markerów cytometrii przepływowej oraz (4) strategie bramkowania i sortowania komórek. Metoda ta umożliwi naukowcom pracę na koralowcach na poziomie komórkowym w celu analizy, testów funkcjonalnych i badań ekspresji genów w różnych populacjach komórek.

Ogólnie rzecz biorąc, niniejszy protokół jest użyteczny, ponieważ ułatwia identyfikację i pozyskiwanie żywych populacji komórek koralowca, które mogą być wykorzystane do analiz funkcjonalnych. Schemat postępowania rozpoczyna się od mechanicznego oddzielenia tkanek koralowca od leżącego pod nimi szkieletu z węglanu wapnia (Rycina 1). Jest to jeden z najważniejszych etapów wstępnych, ponieważ niewłaściwa technika prowadzi do wysokiej śmiertelności komórek i moż...

Koralowce tworzą bioróżnorodne ekosystemy ważne zarówno dla ludzi, jak i organizmów morskich. Jednak nadal nie rozumiemy pełnego potencjału i funkcji wielu komórek koralowców. W tym miejscu przedstawiamy protokół opracowany do izolacji, znakowania i rozdzielania populacji kamiennych komórek koralowców.

Sortowanie komórek aktywowane fluorescencją w celu izolacji populacji komórek skleraktynów

Coral reefs are under threat due to anthropogenic stressors. The biological response of coral to these stressors may occur at a cellular level, but the ...

Protokół ten ułatwia identyfikację i izolację żywych populacji komórek koralowców na poziomie opisowym, który wcześniej nie był możliwy. Główną zaletą tej techniki jest to, że umożliwia ona dostęp do poziomu swoistości komórek, który do tej pory był w większości nieosiągalny. Procedurę zademonstruje dr Shannon Saigh, pracownik naukowy z działu cytometrii przepływowej w Sylvester Comprehensive Cancer Center.Aby skonfigurować cytometr przepływowy do sortowania żywych komórek koralowców, otwórz nowy szablon projektu w oprogramowaniu cytometru przepływowego i wybierz odpowiednie lasery do analizy w panelu laserowym. Następnie utwórz boczny wykres punktowy i wykres punktowy do przodu na odpowiednich wykresach, aby skonfigurować strategię bramkowania i analizy. W celu analizy cytometrycznej przepływowej i sortowania żywych komórek koralowców, załaduj kontrolną niebarwioną próbkę komórek do komory na próbki cytometru i rozpocznij proces odczytu.Ponieważ komórki koralowców są szczególnie delikatne, utrzymuj niskie ciśnienie w cytometrze, aby zapobiec lizie komórek. Na wykresie punktowym dostosuj napięcie mnożnika zdjęć, aby wyśrodkować punkty i rozpocząć rejestrowanie zdarzeń. Na wykresie punktowym do przodu i z boku utwórz bramkę wokół komórek w odległości od około 10 do 4 znaku na osi x rozproszenia do przodu.Zastąp próbkę kontrolną pierwszą próbką barwionych komórek i zapisz około 10 000 komórek przed wstrzymaniem. Następnie bramkują zdarzenia, które są unikatowe dla barwionej grupy próbek. Aby posortować żywe komórki koralowców, po wybraniu interesującej populacji komórek w oprogramowaniu cytometru przepływowego, umieść jedną probówkę mikrowirówki zawierającą od 250 do 500 mikrolitrów odpowiedniego roztworu do pobrania w komorze zbiorczej cytometru dla każdej populacji do sortowania.Po upływie odpowiedniej ilości czasu na wypłukanie gruzu rozpocznij sortowanie żądanej populacji, aby zebrać od 10 000 do kilku milionów komórek. Za każdym razem, gdy używany jest nowy barwnik, gatunek lub sortownik, należy posortować co najmniej 20 000 interesujących komórek w 500 mikrolitrach podłoża barwiącego, aby umożliwić przeprowadzenie kontroli czystości na populacji będącej przedmiotem zainteresowania i ponownie przeanalizować posortowane komórki, aby potwierdzić, że zdarzenia są odczytywane w bramce używanej do początkowego sortowania. W przypadku badań in vitro należy przechowywać posortowane komórki na lodzie do czasu przeniesienia ich do inkubatora lub wysterylizowanego środowiska.Aby wprowadzić inne cząstki niekomórkowe, które nie mają takiego samego kształtu lub ziarnistości jak komórki koralowe, można je usunąć z analizy, tworząc wybór bramki na wykresie punktowym do przodu i z boku. Martwe komórki można wykluczyć, porównując sygnał DAPI niebarwionych i barwionych zawiesin komórkowych za pomocą histogramu i bramkując komórki o wysokiej ekspresji DAPI. Równolegle komórki, w których występuje symbiodeneazja autofluorescencji, mogą być usuwane poprzez bramkowanie względem komórek o wysokim sygnale w odległym kanale czerwonym.Po tym iteracyjnym procesie bramkowania pozostałe komórki reprezentują nienaruszone żywe populacje komórek koralowych pozbawione symbiodeneazji. Komórki te można następnie zaklasyfikować do różnych subpopulacji komórkowych poprzez barwienie pod kątem takich cech, jak aktywność reaktywnych form tlenu i/lub zawartość lizosomów. Ważne jest, aby pamiętać, że niektóre komórki są bardziej delikatne niż inne i przeprowadzić ten proces tak ostrożnie, jak to możliwe.Po wyizolowaniu określonych komórek można je wykorzystać do testów funkcjonalnych x-vivo, takich jak tworzenie kultur komórkowych i tworzenie profili transkryptomicznych.

fluorescence-activated-cell-sorting-for-isolation-scleractinian-cell

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Przedstawiono metodę izolacji specyficznych typów komórek z materiału roślinnego. Technika ta wykorzystuje transgeniczne linie markerowe wykazujące ekspresję białek fluorescencyjnych w określonych typach komórek, dysocjację komórkową oraz sortowanie komórek aktywowane fluorescencją (FACS). Dodatkowo opracowano układ hodowlany, który umożliwia poddanie siewek Arabidopsis thaliana obróbce przed sortowaniem komórek.

Sortowanie komórek protoplastów roślinnych metodą fluorescencyjnej aktywacji (FACS)

Fibroblasty związane z nowotworem (CAFs) wspomagają inicjację, wzrost i progresję guza poprzez sygnalizację promującą proliferację, angiogenezę i stan zapalny. W niniejszej pracy opisujemy metodę izolacji czystych populacji prawidłowych fibroblastów oraz CAFs z pobranych na świeżo tkanek mysich i ludzkich za pomocą sortowania komórek, wykorzystując PDGFRα jako marker powierzchniowy.

Izolacja fibroblastów prawidłowych i związanych z nowotworem z tkanek świeżych za pomocą sortowania komórek aktywowanego fluorescencją (FACS)

Celem tego protokołu jest wyizolowanie komórek śródbłonka limfatycznego, wyściełających ludzkie malformacje limfatyczne, torbielowate naczynia i napletki za pomocą sortowania komórek aktywowanego fluorescencją (FACS). Późniejsza hodowla komórkowa i ekspansja tych komórek pozwala na nowy poziom wyrafinowania eksperymentalnego w badaniach genetycznych, proteomicznych, funkcjonalnych i różnicowania komórek.

Izolacja ludzkich komórek śródbłonka limfatycznego za pomocą wieloparametrowego sortowania komórek aktywowanych fluorescencją

Ten protokół opisuje metodę izolowania pojedynczych komórek z zarodków danio pręgowanego, wzbogacania o interesujące komórki, przechwytywania komórek danio pręgowanego w mikroprzepływowych systemach multipleksów jednokomórkowych i oceny ekspresji genów z pojedynczych komórek.

Izolacja i charakterystyka pojedynczych komórek z zarodków danio pręgowanego

Idealnym modelem do badania biologii dorosłych komórek macierzystych jest mieszek włosowy myszy. W tym miejscu przedstawiamy protokół izolacji różnych populacji mieszków włosowych, komórek macierzystych i keratynocytów naskórka, wykorzystujący trawienie enzymatyczne skóry grzbietowej myszy, a następnie analizę FACS.

Izolowanie komórek macierzystych mieszków włosowych i keratynocytów naskórka z grzbietowej skóry myszy

Ten protokół opisuje konfigurowalną funkcjonalizację powierzchni systemu destiobiotyny, streptawidyny i APTES w celu wyizolowania określonych typów komórek. Ponadto w niniejszym manuskrypcie omówiono zastosowania, optymalizację i weryfikację tego procesu.

Metoda celowanej izolacji komórek poprzez funkcjonalizację powierzchni szkła

Zgłaszamy protokół wykorzystujący sortowanie komórek aktywowane fluorescencją do izolowania plazmocytoidalnych komórek dendrytycznych (pDC) o wysokiej czystości ze szpiku kostnego myszy podatnych na toczeń do badań funkcjonalnych pDC.

Sortowanie komórek aktywowane fluorescencją w celu oczyszczenia plazmocytoidalnych komórek dendrytycznych ze szpiku kostnego myszy

Cytometria przepływowa w połączeniu z wizualnym grupowaniem oferuje łatwą w użyciu i szybką metodę badania biofilmów wodnych. Może być stosowany do charakteryzowania biofilmu, wykrywania zmian w strukturze zbiorowiska biofilmu oraz wykrywania cząstek abiotycznych osadzonych w biofilmie.

Charakterystyka biofilmów wodnych za pomocą cytometrii przepływowej

Precyzyjna identyfikacja fibro-adipogennych komórek progenitorowych (FAP) i komórek macierzystych mięśni (MuSCs) jest kluczowa dla badania ich funkcji biologicznej w warunkach fizjologicznych i patologicznych. Protokół ten zawiera wytyczne dotyczące izolacji, oczyszczania i hodowli FAP i MuSC z mięśni dorosłych myszy.

FACS-Izolacja i hodowla włóknisto-adipogennych progenitorów i mięśniowych komórek macierzystych z niezakłóconych i uszkodzonych mięśni szkieletowych myszy

Ten protokół opisuje zastosowanie aktywowanego fluorescencją sortowania komórek ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystych przy użyciu metody sortowania pojedynczych komórek. W szczególności zastosowanie sortowania pojedynczych komórek może osiągnąć 99% czystość komórek immunofenotypowanych z niejednorodnej populacji w połączeniu z podejściem opartym na wieloparametrycznej cytometrii przepływowej.

Sortowanie jednokomórkowe immunofenotypowanych mezenchymalnych komórek macierzystych z ludzkich złuszczonych zębów mlecznych

Protokół ten zapewnia ustandaryzowaną metodę izolowania i wzbogacania pierwotnych mioblastów z mięśni szkieletowych dorosłych i noworodków myszy poprzez dysocjację tkanek, filtrację sekwencyjną, wstępne nakładanie oraz określone warunki hodowlane, umożliwiając tworzenie i utrzymanie hodowli mioblastów pochodzących z komórek satelitarnych do dalszych zastosowań eksperymentalnych.

Izolacja komórek satelitarnych mięśni szkieletowych do badań in vitro miogenezy

Poznaj metodę sortowania komórek koralowców aktywowaną fluorescencją w celu izolacji żywych populacji skleraktynów. Technika ta umożliwia uzyskanie wysokiej czystości i żywotności komórek do badań funkcjonalnych oraz profilowania transkryptomicznego.

Sortowanie komórek aktywowane fluorescencją w celu izolacji populacji komórek skleraktynów

Przeglądaj więcej filmów