Sortowanie komórek aktywowane fluorescencją w celu izolacji populacji komórek skleraktynów

Koralowce tworzą bioróżnorodne ekosystemy ważne zarówno dla ludzi, jak i organizmów morskich. Jednak nadal nie rozumiemy pełnego potencjału i funkcji wielu komórek koralowców. W tym miejscu przedstawiamy protokół opracowany do izolacji, znakowania i rozdzielania populacji kamiennych komórek koralowców.

Protokół ten ułatwia identyfikację i izolację żywych populacji komórek koralowców na poziomie opisowym, który wcześniej nie był możliwy. Główną zaletą tej techniki jest to, że umożliwia ona dostęp do poziomu swoistości komórek, który do tej pory był w większości nieosiągalny. Procedurę zademonstruje dr Shannon Saigh, pracownik naukowy z działu cytometrii przepływowej w Sylvester Comprehensive Cancer Center.

Aby skonfigurować cytometr przepływowy do sortowania żywych komórek koralowców, otwórz nowy szablon projektu w oprogramowaniu cytometru przepływowego i wybierz odpowiednie lasery do analizy w panelu laserowym. Następnie utwórz boczny wykres punktowy i wykres punktowy do przodu na odpowiednich wykresach, aby skonfigurować strategię bramkowania i analizy. W celu analizy cytometrycznej przepływowej i sortowania żywych komórek koralowców, załaduj kontrolną niebarwioną próbkę komórek do komory na próbki cytometru i rozpocznij proces odczytu.

Ponieważ komórki koralowców są szczególnie delikatne, utrzymuj niskie ciśnienie w cytometrze, aby zapobiec lizie komórek. Na wykresie punktowym dostosuj napięcie mnożnika zdjęć, aby wyśrodkować punkty i rozpocząć rejestrowanie zdarzeń. Na wykresie punktowym do przodu i z boku utwórz bramkę wokół komórek w odległości od około 10 do 4 znaku na osi x rozproszenia do przodu.

Zastąp próbkę kontrolną pierwszą próbką barwionych komórek i zapisz około 10 000 komórek przed wstrzymaniem. Następnie bramkują zdarzenia, które są unikatowe dla barwionej grupy próbek. Aby posortować żywe komórki koralowców, po wybraniu interesującej populacji komórek w oprogramowaniu cytometru przepływowego, umieść jedną probówkę mikrowirówki zawierającą od 250 do 500 mikrolitrów odpowiedniego roztworu do pobrania w komorze zbiorczej cytometru dla każdej populacji do sortowania.

Po upływie odpowiedniej ilości czasu na wypłukanie gruzu rozpocznij sortowanie żądanej populacji, aby zebrać od 10 000 do kilku milionów komórek. Za każdym razem, gdy używany jest nowy barwnik, gatunek lub sortownik, należy posortować co najmniej 20 000 interesujących komórek w 500 mikrolitrach podłoża barwiącego, aby umożliwić przeprowadzenie kontroli czystości na populacji będącej przedmiotem zainteresowania i ponownie przeanalizować posortowane komórki, aby potwierdzić, że zdarzenia są odczytywane w bramce używanej do początkowego sortowania. W przypadku badań in vitro należy przechowywać posortowane komórki na lodzie do czasu przeniesienia ich do inkubatora lub wysterylizowanego środowiska.

Aby wprowadzić inne cząstki niekomórkowe, które nie mają takiego samego kształtu lub ziarnistości jak komórki koralowe, można je usunąć z analizy, tworząc wybór bramki na wykresie punktowym do przodu i z boku. Martwe komórki można wykluczyć, porównując sygnał DAPI niebarwionych i barwionych zawiesin komórkowych za pomocą histogramu i bramkując komórki o wysokiej ekspresji DAPI. Równolegle komórki, w których występuje symbiodeneazja autofluorescencji, mogą być usuwane poprzez bramkowanie względem komórek o wysokim sygnale w odległym kanale czerwonym.

Po tym iteracyjnym procesie bramkowania pozostałe komórki reprezentują nienaruszone żywe populacje komórek koralowych pozbawione symbiodeneazji. Komórki te można następnie zaklasyfikować do różnych subpopulacji komórkowych poprzez barwienie pod kątem takich cech, jak aktywność reaktywnych form tlenu i/lub zawartość lizosomów. Ważne jest, aby pamiętać, że niektóre komórki są bardziej delikatne niż inne i przeprowadzić ten proces tak ostrożnie, jak to możliwe.

Po wyizolowaniu określonych komórek można je wykorzystać do testów funkcjonalnych x-vivo, takich jak tworzenie kultur komórkowych i tworzenie profili transkryptomicznych.