Multimodalna platforma obrazowania i spektroskopii mikroendoskopii z wiązkami włókien do nieinwazyjnej analizy tkanek in vivo

Ogólnym celem tej procedury jest funkcjonalna charakterystyka tkanek in vivo poprzez połączenie informacji strukturalnych o wysokiej rozdzielczości z ilościowymi danymi spektralnymi. Metoda ta może być wykorzystana do odpowiedzi na kluczowe pytania z zakresu biologii nowotworów, takie jak ilościowe określenie wpływu terapii na mikrostrukturę tkanek i perfuzję. Główną zaletą tej techniki jest to, że za pomocą jednej sondy można zbierać zarówno dane obrazowe, jak i spektroskopowe z tego samego miejsca.

Implikacje tej techniki rozciągają się na terapię raka przewodu pokarmowego, ponieważ sonda jest kompatybilna z konwencjonalnymi technikami endoskopii. Ogólnie rzecz biorąc, osoby, które dopiero zaczynają korzystać z tej metody, będą miały problemy, ponieważ niewielkie nieprawidłowości w umieszczeniu sondy mogą znacząco wpłynąć na dokładność danych. Po raz pierwszy wpadliśmy na pomysł tej metody, gdy zdaliśmy sobie sprawę z tego, jak ważne jest połączenie techniki obrazowania o wysokiej rozdzielczości z metodą spektroskopii ilościowej.

Wizualna demonstracja tej metody ma kluczowe znaczenie, ponieważ etapy przygotowania są trudne do nauczenia się ze względu na złożoność zarówno konstrukcji, jak i kalibracji. Aby rozpocząć montaż mikroskopii fluorescencyjnej o wysokiej rozdzielczości multimodalnego mikroendoskopu, zamontuj 470-nanometrowe zwierciadło dichroiczne w 30-milimetrowym sześcianie klatkowym. Przymocuj pręty montażowe klatki do przedniej, prawej i lewej strony kostki klatki.

Przymocuj beznaprężeniowy pierścień ustalający do gwintowanej płyty klatki i wkręć rurkę obiektywu w pierścień ustalający. Przymocuj kolejną płytkę klatkową do tubusu obiektywu wyrównaną z pierwszą płytą klatki. Następnie zabezpiecz aluminiowe lustro wzmocnione promieniowaniem UV w uchwycie lusterka pod kątem prostym.

Przymocuj cztery pręty z przodu mocowania lusterka i dwa pręty po przekątnej po prawej stronie uchwytu. Wsuń zespół tubusu obiektywu na lewą stronę kostki klatki. Podłącz prawą stronę zespołu mocowania lusterka do zespołu tubusu obiektywu.

Wsuń uchwyt translacyjny osi Z po prawej stronie zespołu. Przymocuj achromatyczną soczewkę obiektywową 10x do mocowania translacyjnego. Następnie przymocuj płytkę adaptera światłowodowego do mocowania obiektywu translacyjnego osi XY.

Wsuń mocowanie na zespół przed soczewką obiektywu. Za pomocą pierścieni ustalających zabezpiecz odpowiedni filtr wzbudzenia i filtr emisyjny w tubusach obiektywów. Wkręć rurkę soczewki filtra wzbudzenia z przodu kostki klatki.

I tubus soczewki z filtrem emisyjnym z przodu mocowania lustra pod kątem prostym. Używając żywicy epoksydowej, przymocuj diodę LED 455 nm do płyty klatki przed filtrem wzbudzenia. Wsuń płytkę klatkową przed każdą rurką soczewki filtra.

Za pomocą pierścienia ustalającego przymocuj achromatyczną soczewkę rurki podwójnej do innego tubusu obiektywu tak, aby strzałka na zewnątrz obiektywu była skierowana w stronę gwintowanej zewnętrznie tubusu obiektywu. Przymocuj soczewkę rurki do lewej płyty klatki, umieść kolejną płytkę klatki przed soczewką tubusu. Za pomocą bezstresowego pierścienia ustalającego przymocuj monochromatyczną kamerę USB do płyty klatki.

Aby rozpocząć montaż modalności spektroskopii odbicia subdyfuzyjnego, przymocuj gwintowaną płytkę klatkową z przodu wolframowego halogenowego źródła światła z żywicą epoksydową. Włóż cztery pręty montażowe koszyka do płyty klatki i wsuń mocowanie translacyjne osi Z na pręty. Wkręć achromatyczną soczewkę obiektywową 20x do mocowania translacyjnego osi Z.

Podłącz płytkę adaptera światłowodowego do mocowania translacyjnego osi XY i wsuń uchwyt na zespół przed soczewką obiektywu. Na koniec przymocuj oba zespoły do stołu optycznego blisko siebie za pomocą odpowiednich urządzeń montażowych. Aby rozpocząć konstruowanie urządzenia przełączającego separację detektora źródła, przykręć zewnętrznie gwintowaną płytkę adaptera światłowodowego SMA do aluminiowego ramienia silnika.

Przymocuj adapter ramienia silnika z tyłu ramienia silnika. Następnie wkręć silnik krokowy w aluminiową obudowę silnika. Nakręć zespół ramienia silnika na pręt silnika i dokręć blokującą.

Następnie przykręć trzy płytki adaptera światłowodowego do przełącznika optycznego, a następnie przykręć płytę czołową do przełącznika optycznego. Przełóż pręt silnika krokowego przez środkowy otwór przełącznika optycznego. Umieść sterownik silnika krokowego w poprzek linii środkowej czerwonej tablicy bez wilgoci.

Podłącz sterownik do odpowiedniego zasilacza i silnika krokowego. Przymocuj przełącznik optyczny do stołu optycznego. Podłącz krosowy 550 mikrometrów 0.22 na do ramienia silnika.

Podłącz drugi koniec do spektrometru USB. Aby podłączyć sondę światłowodową, podłącz centralny światłowodowy o średnicy 1 milimetra do zestawu modalności mikroskopii fluorescencyjnej o wysokiej rozdzielczości. Podłącz lewy wielomodowy o długości 200 mikrometrów do zespołu modalności spektroskopii odbicia subdyfuzyjnego.

Kontynuując od lewej strony, podłącz pozostałe wielomodowe w kolejności do lewego, środkowego i prawego adaptera optycznego urządzenia przełączającego. Aby rozpocząć kalibrację eksperymentu, podłącz wszystkie urządzenia peryferyjne USB do komputera. Włącz całe oprzyrządowanie i upewnij się, że żarówka lampy halogenowej wolframu jest otwarta.

Następnie wyłącz światła w pomieszczeniu i zamknij inne źródła światła otoczenia. Otwórz oprogramowanie do akwizycji danych. Pozwól urządzeniu pracować przez 30 minut przed przystąpieniem do kalibracji.

Umieść wzorzec odbicia rozproszonego 20% w dolnej części urządzenia kalibracyjnego. Włóż sondę światłowodową do lewego gniazda urządzenia i ustaw zmotoryzowany przełącznik optyczny w lewo, aby wybrać mikrometr 374 jako ustawienie DS. W oprogramowaniu ustaw czas integracji na 500 milisekund.

Następnie kliknij przycisk Uzyskaj widmo, aby rozpocząć pobieranie RMAX dla tej karty charakterystyki. Po zakończeniu akwizycji RMAX zapisz widmo w wyznaczonym folderze. Zamknij przesłonę wolframowej lampy halogenowej i uzyskaj ciemne widmo R dla tej karty charakterystyki.

Otwórz migawkę, przesuń sondę do prawego gniazda w urządzeniu kalibracyjnym i ustaw zmotoryzowany przełącznik optyczny w środkowej pozycji dla ustawienia SDS 730 mikrometrów. Uzyskaj RMAX i RDARK dla tej karty charakterystyki, aby zakończyć kalibrację. Najpierw określ odpowiedni obszar skóry do zbierania danych.

Używając żółtego rozświetlacza jako źródła piraniny, lekko zabarwij wybrany obszar. Aby rozpocząć mikroskopię fluorescencyjną o wysokiej rozdzielczości, włącz diodę LED 455 nanometrów i zamknij migawkę wolframowej lampy halogenowej. Umieść sondę światłowodową w delikatnym kontakcie ze skórą.

Przesuń sondę po tkance barwionej piraniną, aby wyświetlić architekturę wglądu w prąd wierzchołkowy. W oprogramowaniu ustaw odpowiedni czas naświetlania i wzmocnienie, aby uniknąć nasycenia obrazu. Następnie kliknij przycisk Pobierz obraz, aby uzyskać obraz statyczny.

Utrzymuj sondę na miejscu do subdyfuzyjnej spektroskopii odbicia. Wyłącz diodę LED 455 nm i otwórz przesłonę lampy halogenowej wolframu. Następnie przełącz się na ustawienie SDS 374 mikrometrów po lewej stronie.

Kliknij przycisk Uzyskaj widma, aby uzyskać widmo tkanki R dla tej karty charakterystyki. Następnie przełącz się na pozycję środkową i uzyskaj spektrum tkankowe SDS R o średnicy 730 mikrometrów. Otwórz oprogramowanie do przetwarzania końcowego i kliknij przycisk Uruchom.

Po wyświetleniu monitu wybierz widma kalibracyjne, widma in vivo i obraz fluorescencyjny o wysokiej rozdzielczości, aby uzyskać obraz tkanki. Mikroskopia fluorescencyjna o wysokiej rozdzielczości zapewnia ostry obraz miejsca tkanki o wysokiej rozdzielczości. Barwienie piraniną pokazuje indywidualne kontury keratynocytów.

Oprogramowanie do przetwarzania końcowego wykorzystuje dane ze spektroskopii odbicia subdyfuzyjnego do obliczenia stężenia hemoglobiny, stężenia melaniny i nasycenia tkanek tlenem. Łagodne znamię melanocytowe porównano z sąsiednią normalną tkanką skórną za pomocą tego multimodalnego mikroendoskopu. Znamię melanocytowe wykazywało nieco niższe stężenie hemoglobiny i nieznacznie podwyższone stężenie melaniny w porównaniu z normalną tkanką.

Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w mniej niż godzinę, jeśli zostanie wykonana prawidłowo. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby pozwolić wolframowej lampie halogenowej rozgrzać się przez 15 minut i skalibrować oprzyrządowanie za pomocą wzorca odbicia przed zebraniem danych. Po tej procedurze można zastosować inne techniki, takie jak mikroskopia konfokalna lub mikroskopia wielofotonowa, do zbadania subkomórkowych zmian w strukturze białka lub metabolizmie.

Po jej opracowaniu technika ta utorowała naukowcom drogę do zbadania związku między perfuzją tkanek a mikrostrukturą w odpowiedzi na chemioterapię. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak skonstruować i używać hybrydowego urządzenia do obrazowania i spektroskopii mikroendoskopowej.