Multimodalna platforma obrazowania i spektroskopii mikroendoskopii z wiązkami włókien do nieinwazyjnej analizy tkanek in vivo
17 października 2016
Opisano montaż i użycie multimodalnego mikroendoskopu, który może rejestrować dane obrazu tkanek powierzchownych z parametrami fizjologicznymi tkanek, w tym stężeniem hemoglobiny, stężeniem melaniny i nasyceniem tlenem. Technika ta może być przydatna do oceny struktury tkanki i perfuzji oraz może być zoptymalizowana pod kątem indywidualnych potrzeb badacza.
Ogólnym celem tej procedury jest funkcjonalna charakterystyka tkanek in vivo poprzez połączenie wysokorozdzielczych informacji strukturalnych z ilościowymi danymi widmowymi. Metodę tę można wykorzystać do odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie biologii nowotworów, takie jak ilościowe określenie wpływu terapii na mikrostrukturę i perfuzję tkanki. Główną zaletą tej techniki jest możliwość wykorzystania pojedynczej sondy do zbierania zarówno obrazów, jak i danych spektroskopowych z tego samego miejsca.
Zastosowania tej techniki obejmują terapię nowotworów przewodu pokarmowego, ponieważ sonda jest kompatybilna z konwencjonalnymi technikami endoskopowymi. Zazwyczaj osoby rozpoczynające pracę z tą metodą mogą napotkać trudności, gdyż niewielkie nieścisłości w rozmieszczeniu sondy mogą znacząco wpłynąć na dokładność danych. Pomysł na tę metodę pojawił się u nas w momencie, gdy zdaliśmy sobie sprawę z wagi połączenia techniki obrazowania o wysokiej rozdzielczości z ilościową metodą spektroskopową.
Wizualna demonstracja tej metody jest kluczowa, ponieważ etapy przygotowania są trudne do opanowania ze względu na złożoność zarówno konstrukcji, jak i kalibracji. Aby rozpocząć montaż modułu mikroskopii fluorescencyjnej o wysokiej rozdzielczości w multimodalnym mikroendoskopie, zamontuj lustro dichroiczne 470 nanometrów w kostce klatkowej 30 milimetrów. Przymocuj pręty montażowe klatki do przedniej, prawej i lewej strony kostki klatkowej.
Zamocuj pierścień zabezpieczający bez naprężeń do gwintowanej płyty klatkowej i wkręć tubus soczewkowy w pierścień zabezpieczający. Do tubusu soczewkowego przymocuj drugą płytę klatkową, wyrównując ją z pierwszą płytą. Następnie umieść lustro aluminiowe z powłoką UV w uchwycie lustra kątowego.
Przymocuj cztery pręty do przedniej części uchwytu lustra oraz dwa pręty przekątnie do prawej strony uchwytu. Wsuń zespół rury obiektywu na lewą stronę kostki klatkowej. Połącz prawą stronę zespołu uchwytu lustra z zespołem rury obiektywu.
Wsuń uchwyt translacyjny osi Z na prawą stronę zespołu. Przymocuj achromatyczny obiektyw 10x do uchwytu translacyjnego. Następnie przytwierdź płytkę adaptera światłowodowego do uchwytu translacyjnego soczewki w osi XY.
Wsuń uchwyt na zespół przed obiektywem. Za pomocą pierścieni mocujących zamocuj odpowiedni filtr wzbudzenia i filtr emisji w tubusach soczewkowych. Wkręć tubus z filtrem wzbudzenia do przedniej części kostki klatki.
Następnie wsuń tubus soczewki filtra emisyjnego do przedniej części uchwytu lustra kątowego. Używając żywicy epoksydowej, przymocuj diodę LED 455 nanometr do płytki klatki przed filtrem wzbudzenia. Wsuń płytkę klatki przed każdy tubus soczewki filtra.
Za pomocą pierścienia zabezpieczającego zamocuj achromatyczną soczewkę tubusową typu doublet w innym tubusie soczewkowym w taki sposób, aby strzałka na zewnętrznej stronie soczewki była skierowana w stronę gwintu zewnętrznego tubusu. Przymocuj soczewkę tubusową do lewej płytki klatkowej, a przed soczewką tubusową umieść kolejną płytkę klatkową. Korzystając z beznaprężeniowego pierścienia zabezpieczającego, przymocuj monochromatyczną kamerę USB do płytki klatkowej.
Aby rozpocząć montaż modułu spektroskopii refleksyjnej podpowierzchniowej, przymocuj za pomocą epoksydu gwintowaną płytkę klatki (cage plate) do przodu źródła światła wolframowo-halogenowego. Włóż cztery pręty montażowe klatki do płytki i nasuń na pręty uchwyt translacyjny osi Z. Wkręć achromatyczny obiektyw 20x do uchwytu translacyjnego osi Z.
Podłącz płytkę adaptera światłowodowego do uchwytu translacyjnego w osiach XY, a następnie nasuń uchwyt na zespół przed obiektywem. Na koniec, przy użyciu odpowiednich urządzeń montażowych, przymocuj oba zespoły blisko siebie do stołu optycznego. Aby rozpocząć budowę urządzenia przełączającego separację detektora źródła, wkręć płytkę adaptera światłowodowego SMA z gwintem zewnętrznym do alumiennego ramienia silnika.
Przymocuj adapter ramienia silnika do tylnej części ramienia silnika. Następnie wkręć silnik krokowy do aluminiowej obudowy silnika. Nakręć zespół ramienia silnika na pręt silnika i mocno dokręć śrubę blokującą.
Następnie wkręć trzy płytki adapterów światłowodowych do przełącznika optycznego, a następnie przykręć przednią płytkę do przełącznika optycznego. Przełóż pręt silnika krokowego przez otwór centralny przełącznika optycznego. Umieść sterownik silnika krokowego w poprzek linii środkowej czerwonej płytki stykowej.
Podłącz sterownik do odpowiedniego zasilacza oraz do silnika krokowego. Przymocuj przełącznik optyczny do stołu optycznego. Do ramienia silnika podłącz kabel patch 0,22 na 550 mikrometrów.
Podłącz drugi koniec do spektrometru USB. Aby podłączyć sondę światłowodową, przymocuj centralny 1 milimetrowy kabel światłowodowy do obrazowania do zestawu modalności wysokorozdzielczej mikroskopii fluorescencyjnej. Przymocuj lewy 200 mikrometrów wielomodowy kabel do zestawu modalności spektroskopii odbicia podrozproszonego.
Kontynuując od lewej strony, podłącz pozostałe kable wielomodowe kolejno do lewego, środkowego i prawego adaptera urządzenia przełączającego sygnał optyczny. Aby rozpocząć kalibrację eksperymentu, podłącz wszystkie peryferia USB do komputera. Włącz całą aparaturę i upewnij się, że migawka lampy wolframowo-halogenowej jest otwarta.
Następnie wyłącz światła w pomieszczeniu i zasłoń inne źródła światła otoczenia. Uruchom oprogramowanie do akwizycji danych. Pozostaw urządzenie włączone przez 30 minut przed przystąpieniem do kalibracji.
Umieść wzorzec rozproszonego odbicia 20% w dolnej sekcji urządzenia kalibracyjnego. Wsuń sondę światłowodową do lewego gniazda urządzenia i ustaw zmotoryzowany przełącznik optyczny w pozycji lewej, aby wybrać ustawienie 374 mikrometer jako DS. W oprogramowaniu ustaw czas integracji na 500 milisekund.
Następnie kliknij acquire spectrum, aby rozpocząć pomiar RMAX dla tego SDS. Po zakończeniu pomiaru RMAX zapisz widmo w wyznaczonym folderze. Zamknij migawkę lampy wolframowo-halogenowej i wykonaj pomiar widma R dark dla tego SDS.
Otwórz migawkę, przesuń sondę do prawego gniazda w urządzeniu kalibracyjnym i ustaw zmotoryzowany przełącznik optyczny w pozycji środkowej dla ustawienia SDS 730 mikrometrów. Pozyskaj wartości RMAX i RDARK dla tego SDS, aby zakończyć kalibrację. Najpierw określ odpowiedni obszar skóry do zbierania danych.
Używając żółtego zakreślacza jako źródła pyraniny, delikatnie zabarw wybrany obszar. Aby rozpocząć wysokorozdzielczą mikroskopię fluorescencyjną, włącz diodę LED 455 nanometr i zamknij migawkę lampy wolframowo-halogenowej. Umieść sondę światłowodową w delikatnym kontakcie ze skórą.
Przesuń sondę nad tkankę barwioną pyraniną, aby zobrazować architekturę prądu apikalnego. W oprogramowaniu ustaw odpowiedni czas ekspozycji i wzmocnienie, aby uniknąć nasycenia obrazu. Następnie kliknij „acquire image”, aby uzyskać obraz statyczny.
Pozostaw sondę w miejscu w celu przeprowadzenia sub-dyfuzyjnej spektroskopii odbiciowej. Wyłącz diodę LED o długości fali 455 nanometrów i otwórz migawkę lampy wolframowo-halogenowej. Następnie przełącz urządzenie na ustawienie SDS 374 mikrometrów po lewej stronie.
Kliknij przycisk zbierania widm, aby uzyskać widmo tkanki R dla tego SDS. Następnie przełącz się na pozycję środkową i zbierz widmo tkanki R dla SDS o rozmiarze 730 mikrometrów. Otwórz oprogramowanie do postprocessingu i kliknij uruchom.
Po wyświetleniu odpowiedniego komunikatu wybierz widma kalibracyjne, widma in vivo oraz obraz fluorescencyjny o wysokiej rozdzielczości, aby uzyskać obraz tkanki. Modalność wysokorozdzielczej mikroskopii fluorescencyjnej zapewnia ostry obraz miejsca pobrania tkanki w wysokiej rozdzielczości. Barwienie pyraniną uwidacznia kontury poszczególnych keratynocytów.
Oprogramowanie do postprocesingu wykorzystuje dane z subdyfuzyjnej spektroskopii odbiciowej do obliczenia stężenia hemoglobiny, stężenia melaniny oraz wysycenia tkanek tlenem. Przy użyciu tego multimodalnego mikroendoskopu porównano łagodnego zniewienia melanocytowego z sąsiednią prawidłową tkanką skóry. Zniewienie melanocytowe wykazało nieco niższe stężenie hemoglobiny i nieco wyższe stężenie melaniny w porównaniu z tkanką prawidłową.
Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w czasie krótszym niż godzina, pod warunkiem prawidłowego przeprowadzenia procesu. Podczas realizacji tej procedury ważne jest, aby pozwolić lampie halogenowej z wolframem rozgrzać się przez 15 minut oraz skalibrować aparaturę za pomocą standardu odbiciowego przed rozpoczęciem zbierania danych. Po zastosowaniu tej procedury można wykorzystać inne techniki, takie jak mikroskopia konfokalna lub mikroskopia wielofotonowa, aby zbadać podkomórkowe zmiany w strukturze białek lub metabolizmie.
Po opracowaniu technika ta otworzyła badaczom drogę do analizy zależności między perfuzją tkankową a mikrostrukturą w odpowiedzi na chemioterapię. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze rozumieć, jak zbudować i używać hybrydowego urządzenia do mikroendoskopowego obrazowania i spektroskopii.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy artykuł przedstawia multimodalną technikę światłowodowej mikroendoskopii, która integruje wysokorozdzielcze obrazowanie fluorescencyjne ze spektroskopią odbiciową rozproszoną do analizy tkanek in vivo. Połączone podejście umożliwia jednoczesną wizualizację mikroarchitektury tkanki oraz ilościową ocenę parametrów fizjologicznych, co zaprezentowano tutaj na przykładzie ludzkiej skóry. Protokół szczegółowo opisuje konstrukcję sondy, kalibrację oraz akwizycję danych, stanowiąc kompleksowe narzędzie do funkcjonalnej charakterystyki tkanek.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Inżynieria biomedyczna
- Obrazowanie optyczne
- Spektroskopia
- Biologia nowotworów
Wstęp
- Tradycyjna mikroendoskopia wiązkowa umożliwia nieinwazyjną analizę tkanki in vivo z wykorzystaniem obrazowania lub spektroskopii.
- Fluorescencyjna mikroendoskopia o wysokiej rozdzielczości pozwala na wizualizację mikroarchitektury tkanki i może w czasie rzeczywistym odróżnić tkankę nowotworową od nienowotworowej.
- Spektroskopia odbicia dyfuzyjnego umożliwia ilościowe określenie parametrów fizjologicznych, takich jak poziom hemoglobiny, melaniny oraz wysycenie tlenem.
- Połączenie tych metod w jednej sondzie zapewnia bardziej kompleksową ocenę stanu zdrowia tkanki.
Cel badania
- Opracowanie i zademonstrowanie hybrydowej sondy optycznej integrującej wysokorozdzielcze obrazowanie fluorescencyjne oraz spektroskopię odbicia rozproszonego.
- Umożliwienie współrejestrowanej analizy strukturalnej i funkcjonalnej tkanki in vivo.
- Przedstawienie protokołu konstrukcji, kalibracji i użytkowania multimodalnej sondy.
Zastosowane metody
- Konstrukcja sondy światłowodowej łączącej modalności mikroendoskopii fluorescencyjnej i spektroskopii odbiciowej rozproszonej.
- Montaż komponentów optycznych, w tym luster dichroicznych, obiektywów, filtrów, diod LED oraz spektrometrów.
- Kalibracja z wykorzystaniem wzorców odbicia rozproszonego i oprogramowania do akwizycji danych.
- Demonstracja in vivo na ludzkiej skórze z zastosowaniem barwienia pyraniną do obrazowania fluorescencyjnego oraz analizy spektralnej parametrów fizjologicznych.
Główne wyniki
- Sonda pomyślnie pozyskała obrazy o wysokiej rozdzielczości z keratynocytów naskórka warstwy rogowej i zarejestrowała je wraz z ilościowymi danymi spektralnymi.
- Z tego samego obszaru tkanki wyekstrahowano stężenie hemoglobiny, stężenie melaniny oraz wysycenie tlenem.
- Porównanie łagodnego znamienia melanocytowego ze zdrową skórą wykazało niższą zawartość hemoglobiny i wyższą zawartość melaniny w znamię.
- Technika ta, po opanowaniu, może być wykonana w czasie krótszym niż godzina i jest kompatybilna z procedurami endoskopowymi.
Wnioski
- Sonda multimodalna umożliwia kompleksową, zarejestrowaną wspólnie analizę strukturalną i funkcjonalną tkanki in vivo.
- Można ją dostosować do użytku ręcznego lub endoskopowego w różnych układach narządowych.
- Wymagane są dalsze badania kliniczne w celu potwierdzenia jej użyteczności w różnych stanach chorobowych nabłonka.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Zintegrowanie obrazowania fluorescencyjnego o wysokiej rozdzielczości ze spektroskopią odbiciową w ramach jednej platformy mikroendoskopowej z wiązką światłowodów umożliwia nieinwazyjną analizę tkanek in vivo, dostarczając zarówno informacji strukturalnych, jak i ilościowych wglądów fizjologicznych. To multimodalne podejście zwiększa pewność predykcyjną w charakteryzacji tkanek, wspierając wczesne odkrycia oraz punkty zwrotne w badaniach translacyjnych. Kompatybilność platformy z procedurami endoskopowymi sprawia, że może ona służyć jako wielokrotnie wykorzystywalne narzędzie do funkcjonalnej oceny tkanek w różnych układach narządowych.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Umożliwia funkcjonalną analizę mikrostruktury i perfuzji tkanki in vivo.
- Wspiera ograniczanie ryzyka biologicznego poprzez korejestrację danych mikroarchitektonicznych i fizjologicznych.
- Zwiększa pewność prognostyczną w odróżnianiu tkanki nowotworowej od nienowotworowej.
- Stanowi podstawę do badań mechanistycznych nad wpływem terapii na biologię tkanki.
Przesiewy i opracowywanie testów
- Przygotowuje zwalidowane modele tkanek do późniejszej oceny związków poprzez integrację wyników obrazowania i spektroskopii.
- Standaryzuje pozyskiwanie ilościowych parametrów fizjologicznych, takich jak stężenie hemoglobiny i melaniny.
- Umożliwia powtarzalne gromadzenie danych z dopasowanych obszarów w celu opracowania testów i przygotowania do screeningu.
- Wspiera skalowalność platformy w przypadku analizy wieloorganowej lub wieloområbowej.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Łączy obrazowanie mikroarchitektoniczne z ilościowym oznaczaniem biomarkerów fizjologicznych w modelach istotnych dla przebiegu choroby.
- Zapewnia ciągłość od etapu odkryć po walidację przedkliniczną, umożliwiając funkcjonalną ocenę tkanek in vivo.
- Dostarcza danych skorygowanych o ryzyko, niezbędnych do podejmowania decyzji o dalszych etapach w potokach badań translacyjnych.
- Ułatwia badanie reakcji tkanek na interwencje terapeutyczne w modelach przedklinicznych.
Integracja potoku i przepływu pracy
Ta multimodalna platforma łączy wczesną fazę odkryć, identyfikację wiodących związków oraz badania przedkliniczne, umożliwiając współrejestrowaną analizę strukturalną i funkcjonalną tkanek in vivo.
- Biologia odkrywcza: Wspiera weryfikację hipotez i wyjaśnianie szlaków poprzez ilościowe określanie wpływu terapii na mikrostrukturę i perfuzję tkanek.
- Przesiew: Dostarcza powtarzalnych, ilościowych wyników służących do standaryzacji testów i oceny związków.
- Analityka: Zapewnia zintegrowane odczyty obrazowe i spektralne dla wiarygodnego porównywania stanów tkanek.
- Badania translacyjne: Jest zgodna z badaniami opartymi na biomarkerach i wspiera walidację modeli przedklinicznych.
- Zastosowanie w skali przedsiębiorstwa: Oferuje elastyczną, kompatybilną z endoskopią platformę, którą można dostosować do wielu układów organów i potrzeb badawczych.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną i redukuje niejednoznaczność mechaniczną w analizie tkanek.
- Wartość operacyjna: Poprawia standaryzację, powtarzalność i skalowalność charakterystyki tkanek in vivo.
- Wartość strategiczna: Usprawnia podejmowanie decyzji o kontynuacji lub przerwaniu badań (go/no-go) oraz efektywność kapitałową dzięki dostarczeniu kompleksowych danych tkankowych na wczesnym etapie procesu.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację dostosowaną do ryzyka oraz rozwój programów odkrywczych i translacyjnych.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w zakresie obrazowania optycznego, spektroskopii i kalibracji sond.
- Wymaga dostępu do specjalistycznej aparatury i infrastruktury analitycznej.
- Konieczna jest rygorystyczna standaryzacja międzyzespołowa w zakresie akwizycji i analizy danych.
- Metoda jest adaptowalna dla różnych typów tkanek i układów organów przy odpowiedniej kalibracji i walidacji.
- Precyzja rozmieszczenia sond oraz ich kalibracja są krytyczne dla dokładności i powtarzalności danych.
Najczęściej zadawane pytania dotyczące biofarmacji
Chapters in this video
0:05
Title
1:14
Construction of the Fluorescence Microscopy and Reflectance Spectroscopy Modalities
4:16
Construction of the Multimodal Microendoscope
5:53
Sub-diffuse Reflectance Spectroscopy Modality Calibration
7:23
In Vivo Data Acquisition from Human Skin
8:52
Results: Co-registered Tissue Structural and Physiological Parameter Data
9:38
Conclusion
