Multimodalna platforma obrazowania i spektroskopii mikroendoskopii z wiązkami włókien do nieinwazyjnej analizy tkanek in vivo
17 października 2016
Opisano montaż i użycie multimodalnego mikroendoskopu, który może rejestrować dane obrazu tkanek powierzchownych z parametrami fizjologicznymi tkanek, w tym stężeniem hemoglobiny, stężeniem melaniny i nasyceniem tlenem. Technika ta może być przydatna do oceny struktury tkanki i perfuzji oraz może być zoptymalizowana pod kątem indywidualnych potrzeb badacza.
Ogólnym celem tej procedury jest funkcjonalna charakterystyka tkanek in vivo poprzez połączenie informacji strukturalnych o wysokiej rozdzielczości z ilościowymi danymi spektralnymi. Metoda ta może być wykorzystana do odpowiedzi na kluczowe pytania z zakresu biologii nowotworów, takie jak ilościowe określenie wpływu terapii na mikrostrukturę tkanek i perfuzję. Główną zaletą tej techniki jest to, że za pomocą jednej sondy można zbierać zarówno dane obrazowe, jak i spektroskopowe z tego samego miejsca.
Implikacje tej techniki rozciągają się na terapię raka przewodu pokarmowego, ponieważ sonda jest kompatybilna z konwencjonalnymi technikami endoskopii. Ogólnie rzecz biorąc, osoby, które dopiero zaczynają korzystać z tej metody, będą miały problemy, ponieważ niewielkie nieprawidłowości w umieszczeniu sondy mogą znacząco wpłynąć na dokładność danych. Po raz pierwszy wpadliśmy na pomysł tej metody, gdy zdaliśmy sobie sprawę z tego, jak ważne jest połączenie techniki obrazowania o wysokiej rozdzielczości z metodą spektroskopii ilościowej.
Wizualna demonstracja tej metody ma kluczowe znaczenie, ponieważ etapy przygotowania są trudne do nauczenia się ze względu na złożoność zarówno konstrukcji, jak i kalibracji. Aby rozpocząć montaż mikroskopii fluorescencyjnej o wysokiej rozdzielczości multimodalnego mikroendoskopu, zamontuj 470-nanometrowe zwierciadło dichroiczne w 30-milimetrowym sześcianie klatkowym. Przymocuj pręty montażowe klatki do przedniej, prawej i lewej strony kostki klatki.
Przymocuj beznaprężeniowy pierścień ustalający do gwintowanej płyty klatki i wkręć rurkę obiektywu w pierścień ustalający. Przymocuj kolejną płytkę klatkową do tubusu obiektywu wyrównaną z pierwszą płytą klatki. Następnie zabezpiecz aluminiowe lustro wzmocnione promieniowaniem UV w uchwycie lusterka pod kątem prostym.
Przymocuj cztery pręty z przodu mocowania lusterka i dwa pręty po przekątnej po prawej stronie uchwytu. Wsuń zespół tubusu obiektywu na lewą stronę kostki klatki. Podłącz prawą stronę zespołu mocowania lusterka do zespołu tubusu obiektywu.
Wsuń uchwyt translacyjny osi Z po prawej stronie zespołu. Przymocuj achromatyczną soczewkę obiektywową 10x do mocowania translacyjnego. Następnie przymocuj płytkę adaptera światłowodowego do mocowania obiektywu translacyjnego osi XY.
Wsuń mocowanie na zespół przed soczewką obiektywu. Za pomocą pierścieni ustalających zabezpiecz odpowiedni filtr wzbudzenia i filtr emisyjny w tubusach obiektywów. Wkręć rurkę soczewki filtra wzbudzenia z przodu kostki klatki.
I tubus soczewki z filtrem emisyjnym z przodu mocowania lustra pod kątem prostym. Używając żywicy epoksydowej, przymocuj diodę LED 455 nm do płyty klatki przed filtrem wzbudzenia. Wsuń płytkę klatkową przed każdą rurką soczewki filtra.
Za pomocą pierścienia ustalającego przymocuj achromatyczną soczewkę rurki podwójnej do innego tubusu obiektywu tak, aby strzałka na zewnątrz obiektywu była skierowana w stronę gwintowanej zewnętrznie tubusu obiektywu. Przymocuj soczewkę rurki do lewej płyty klatki, umieść kolejną płytkę klatki przed soczewką tubusu. Za pomocą bezstresowego pierścienia ustalającego przymocuj monochromatyczną kamerę USB do płyty klatki.
Aby rozpocząć montaż modalności spektroskopii odbicia subdyfuzyjnego, przymocuj gwintowaną płytkę klatkową z przodu wolframowego halogenowego źródła światła z żywicą epoksydową. Włóż cztery pręty montażowe koszyka do płyty klatki i wsuń mocowanie translacyjne osi Z na pręty. Wkręć achromatyczną soczewkę obiektywową 20x do mocowania translacyjnego osi Z.
Podłącz płytkę adaptera światłowodowego do mocowania translacyjnego osi XY i wsuń uchwyt na zespół przed soczewką obiektywu. Na koniec przymocuj oba zespoły do stołu optycznego blisko siebie za pomocą odpowiednich urządzeń montażowych. Aby rozpocząć konstruowanie urządzenia przełączającego separację detektora źródła, przykręć zewnętrznie gwintowaną płytkę adaptera światłowodowego SMA do aluminiowego ramienia silnika.
Przymocuj adapter ramienia silnika z tyłu ramienia silnika. Następnie wkręć silnik krokowy w aluminiową obudowę silnika. Nakręć zespół ramienia silnika na pręt silnika i dokręć blokującą.
Następnie przykręć trzy płytki adaptera światłowodowego do przełącznika optycznego, a następnie przykręć płytę czołową do przełącznika optycznego. Przełóż pręt silnika krokowego przez środkowy otwór przełącznika optycznego. Umieść sterownik silnika krokowego w poprzek linii środkowej czerwonej tablicy bez wilgoci.
Podłącz sterownik do odpowiedniego zasilacza i silnika krokowego. Przymocuj przełącznik optyczny do stołu optycznego. Podłącz krosowy 550 mikrometrów 0.22 na do ramienia silnika.
Podłącz drugi koniec do spektrometru USB. Aby podłączyć sondę światłowodową, podłącz centralny światłowodowy o średnicy 1 milimetra do zestawu modalności mikroskopii fluorescencyjnej o wysokiej rozdzielczości. Podłącz lewy wielomodowy o długości 200 mikrometrów do zespołu modalności spektroskopii odbicia subdyfuzyjnego.
Kontynuując od lewej strony, podłącz pozostałe wielomodowe w kolejności do lewego, środkowego i prawego adaptera optycznego urządzenia przełączającego. Aby rozpocząć kalibrację eksperymentu, podłącz wszystkie urządzenia peryferyjne USB do komputera. Włącz całe oprzyrządowanie i upewnij się, że żarówka lampy halogenowej wolframu jest otwarta.
Następnie wyłącz światła w pomieszczeniu i zamknij inne źródła światła otoczenia. Otwórz oprogramowanie do akwizycji danych. Pozwól urządzeniu pracować przez 30 minut przed przystąpieniem do kalibracji.
Umieść wzorzec odbicia rozproszonego 20% w dolnej części urządzenia kalibracyjnego. Włóż sondę światłowodową do lewego gniazda urządzenia i ustaw zmotoryzowany przełącznik optyczny w lewo, aby wybrać mikrometr 374 jako ustawienie DS. W oprogramowaniu ustaw czas integracji na 500 milisekund.
Następnie kliknij przycisk Uzyskaj widmo, aby rozpocząć pobieranie RMAX dla tej karty charakterystyki. Po zakończeniu akwizycji RMAX zapisz widmo w wyznaczonym folderze. Zamknij przesłonę wolframowej lampy halogenowej i uzyskaj ciemne widmo R dla tej karty charakterystyki.
Otwórz migawkę, przesuń sondę do prawego gniazda w urządzeniu kalibracyjnym i ustaw zmotoryzowany przełącznik optyczny w środkowej pozycji dla ustawienia SDS 730 mikrometrów. Uzyskaj RMAX i RDARK dla tej karty charakterystyki, aby zakończyć kalibrację. Najpierw określ odpowiedni obszar skóry do zbierania danych.
Używając żółtego rozświetlacza jako źródła piraniny, lekko zabarwij wybrany obszar. Aby rozpocząć mikroskopię fluorescencyjną o wysokiej rozdzielczości, włącz diodę LED 455 nanometrów i zamknij migawkę wolframowej lampy halogenowej. Umieść sondę światłowodową w delikatnym kontakcie ze skórą.
Przesuń sondę po tkance barwionej piraniną, aby wyświetlić architekturę wglądu w prąd wierzchołkowy. W oprogramowaniu ustaw odpowiedni czas naświetlania i wzmocnienie, aby uniknąć nasycenia obrazu. Następnie kliknij przycisk Pobierz obraz, aby uzyskać obraz statyczny.
Utrzymuj sondę na miejscu do subdyfuzyjnej spektroskopii odbicia. Wyłącz diodę LED 455 nm i otwórz przesłonę lampy halogenowej wolframu. Następnie przełącz się na ustawienie SDS 374 mikrometrów po lewej stronie.
Kliknij przycisk Uzyskaj widma, aby uzyskać widmo tkanki R dla tej karty charakterystyki. Następnie przełącz się na pozycję środkową i uzyskaj spektrum tkankowe SDS R o średnicy 730 mikrometrów. Otwórz oprogramowanie do przetwarzania końcowego i kliknij przycisk Uruchom.
Po wyświetleniu monitu wybierz widma kalibracyjne, widma in vivo i obraz fluorescencyjny o wysokiej rozdzielczości, aby uzyskać obraz tkanki. Mikroskopia fluorescencyjna o wysokiej rozdzielczości zapewnia ostry obraz miejsca tkanki o wysokiej rozdzielczości. Barwienie piraniną pokazuje indywidualne kontury keratynocytów.
Oprogramowanie do przetwarzania końcowego wykorzystuje dane ze spektroskopii odbicia subdyfuzyjnego do obliczenia stężenia hemoglobiny, stężenia melaniny i nasycenia tkanek tlenem. Łagodne znamię melanocytowe porównano z sąsiednią normalną tkanką skórną za pomocą tego multimodalnego mikroendoskopu. Znamię melanocytowe wykazywało nieco niższe stężenie hemoglobiny i nieznacznie podwyższone stężenie melaniny w porównaniu z normalną tkanką.
Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w mniej niż godzinę, jeśli zostanie wykonana prawidłowo. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby pozwolić wolframowej lampie halogenowej rozgrzać się przez 15 minut i skalibrować oprzyrządowanie za pomocą wzorca odbicia przed zebraniem danych. Po tej procedurze można zastosować inne techniki, takie jak mikroskopia konfokalna lub mikroskopia wielofotonowa, do zbadania subkomórkowych zmian w strukturze białka lub metabolizmie.
Po jej opracowaniu technika ta utorowała naukowcom drogę do zbadania związku między perfuzją tkanek a mikrostrukturą w odpowiedzi na chemioterapię. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak skonstruować i używać hybrydowego urządzenia do obrazowania i spektroskopii mikroendoskopowej.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Overview
Ten artykuł opisuje multimodalny mikroendoskop, który współrejestruje dane obrazowe tkanek z parametrami fizjologicznymi, takimi jak stężenie hemoglobiny i melaniny. Ta technika jest przydatna do oceny struktury i perfuzji tkanek, szczególnie w biologii nowotworów.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauki
- Biologia
- Biologia nowotworów
Tło
- Metoda łączy wysokiej rozdzielczości obrazowanie z spektroskopią ilościową.
- Celem jest charakteryzacja funkcji tkanek in vivo.
- Może ilościowo określić efekty terapii na mikrostrukturze tkanek.
- Sonda jest kompatybilna z konwencjonalnymi technikami endoskopicznymi.
Cel badania
- Ocena struktury i perfuzji tkanek.
- Optymalizacja techniki dla indywidualnych potrzeb badacza.
- Rozwiążanie kluczowych pytań w biologii nowotworów.
Stosowane metody
- Mikroendoskopia multimodalna
- Współrejestracja danych obrazowych i spektroskopijnych
- Charakteryzacja tkanek in vivo
- Kompatybilność z technikami endoskopicznymi
Główne wyniki
- Jedna sonda zbierać może zarówno dane obrazowe, jak i spektroskopijne.
- Drobne nierówności w umieszczeniu sondy wpływają na dokładność danych.
- Technikę można zoptymalizować dla określonych potrzeb badawczych.
- Przydatna do oceny terapii raka przewodu pokarmowego.
Wnioski
- Technika zwiększa zrozumienie fizjologii tkanek.
- Zapewnia kompleksowe podejście do badania biologii nowotworów.
- Przyszłe zastosowania mogą poprawić strategie terapeutyczne.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Integrating high-resolution fluorescence imaging with diffuse reflectance spectroscopy in a single fiber-bundle microendoscopy platform enables non-invasive, in vivo tissue analysis with both structural and quantitative physiological insights. This multimodal approach enhances predictive confidence in tissue characterization, supporting early discovery and translational research inflection points. The platform's compatibility with endoscopic workflows positions it as a reusable capability for functional tissue assessment across diverse organ systems.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables functional interrogation of tissue microstructure and perfusion in vivo.
- Supports biological de-risking by co-registering micro-architectural and physiological data.
- Facilitates predictive confidence in distinguishing neoplastic from non-neoplastic tissue.
- Provides a foundation for mechanistic studies of therapy effects on tissue biology.
Screening & Assay Development
- Prepares validated tissue models for downstream compound evaluation by integrating imaging and spectroscopy outputs.
- Standardizes acquisition of quantitative physiological parameters such as hemoglobin and melanin concentration.
- Enables reproducible, site-matched data collection for assay development and screening readiness.
- Supports platform scalability for multi-organ or multi-site analysis.
Translational & Preclinical Research
- Aligns micro-architectural imaging with physiological biomarker quantification for disease-relevant models.
- Enables continuity from discovery through preclinical validation by supporting functional tissue assessment in vivo.
- Provides risk-adjusted data for advancement decisions in translational research pipelines.
- Facilitates exploration of tissue response to therapeutic interventions in preclinical models.
Pipeline & Workflow Integration
This multimodal platform bridges early discovery, lead identification, and preclinical research by enabling co-registered structural and functional tissue analysis in vivo.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by quantifying therapy effects on tissue microstructure and perfusion.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative outputs for assay standardization and compound evaluation.
- Analytics: Provides integrated imaging and spectral readouts for robust comparison of tissue conditions.
- Translational Research: Aligns with biomarker-driven studies and supports preclinical model validation.
- Enterprise Reuse: Offers a flexible, endoscopically-compatible platform adaptable to multiple organ systems and research needs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in tissue analysis.
- Operational Value: Enhances standardization, reproducibility, and scalability of in vivo tissue characterization.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision-making and capital efficiency by providing comprehensive tissue data early in the pipeline.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization and advancement of discovery and translational programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in optical imaging, spectroscopy, and probe calibration.
- Demands access to specialized instrumentation and analytical infrastructure.
- Necessitates rigorous cross-team standardization for data acquisition and analysis.
- Adaptable across tissue types and organ systems with appropriate calibration and validation.
- Probe placement precision and calibration are critical for data accuracy and reproducibility.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
1:14
Construction of the Fluorescence Microscopy and Reflectance Spectroscopy Modalities
4:16
Construction of the Multimodal Microendoscope
5:53
Sub-diffuse Reflectance Spectroscopy Modality Calibration
7:23
In Vivo Data Acquisition from Human Skin
8:52
Results: Co-registered Tissue Structural and Physiological Parameter Data
9:38
Conclusion
