Charakterystyka zwapnień przy użyciu technik mikroskopii optycznej i elektronowej na żywo w rurowcu morskim

Ogólnym celem tej procedury jest określenie lokalizacji i struktury zdarzenia zwapnienia poprzez wykonanie kombinacji metod mikroskopii optycznej i elektronowej. Osiąga się to poprzez monitorowanie żywej larwy rurkowca podczas metamorfozy, etapu życia odpowiedzialnego za zwapnienie, które można wykryć za pomocą wskaźników fluorescencyjnych czułych na wewnątrzkomórkowe sygnały pH i wapnia. Wewnątrzkomórkowe obrazowanie pH pozwala nam badać stężenie protonów do i z cytoplazmy w procesie zwapnienia.

Aby rozpocząć, wewnątrzkomórkowe obrazowanie pH u larw robaka rurki morskiej, właściwe pływające larwy są barwione wewnątrzkomórkowym barwnikiem wskaźnikowym pH, SNARF-1 AM. Larwy są następnie przenoszone do naczynia IBMX zawierającego wodę morską z cienkim szklanym okienkiem obserwacyjnym i umieszczane w mikroskopie fluorescencyjnym, gdzie są uderzane światłem o długości fali 488 nanometrów, które jest pochłaniane przez barwnik. Z barwnika zbierane są emisje o długości 580 nanometrów i 640 nanometrów. Wartości pH wewnątrzkomórkowego można obliczyć ze stosunku tych wartości.

Mikroskopia optyczna pozwala nam zidentyfikować czas i region tkanki związany z wyższym poziomem pH. Jest to pierwszy krok do określenia interesujących punktów czasowych do dalszej analizy. W drugim kroku należy zakonserwować rurkę za pomocą utrwalaczy w odpowiednich punktach czasowych do mikroskopii elektronowej.

Nowo mineralizujący się etap życia jest identyfikowany za pomocą mapowania SEM-EDS dla sygnału wapniowego. Następnie obszary o wysokim sygnale wapnia są badane za pomocą SEM/EBSD, identyfikując obecność minerału krystalicznego. Na koniec, za pomocą skupionej wiązki jonów, minerał jest wycinany, przygotowywany jest cienki przekrój do obserwacji TEM.

Ta sekcja służy do uzyskania selektywnego wzoru dyfrakcji obszarowej. Główną zaletą tej techniki lub konwencjonalnych metod testowych, takich jak spektroskopia dyfrakcji rentgenowskiej, jest to, że zapewnia ona bezpośrednią obserwację określonych struktur, które zostały zaobserwowane metodami mikroskopii optycznej i elektronowej, dzięki czemu dyskretne zdarzenia zwapnienia można badać bezpośrednio zarówno na poziomie czasowym, jak i przestrzennym. Kiedy zwapnienie jest badane za pomocą wapnia i wewnątrzkomórkowych wskaźników pH, możemy określić skalę czasową tych istotnych zdarzeń fizjologicznych.

Zachowanie próbki we właściwym czasie ma kluczowe znaczenie dla owocnej analizy SEM. Szukając pierwszego przypadku zwapnienia biologicznego, SEM/EDX można wykorzystać do badań przesiewowych rozkładu pierwiastków wapnia. Miejsce, w którym jest więcej wapnia, może wskazywać na obecność węglanu wapnia, jednak tylko obecność wzoru dyfrakcji rentgenowskiej może potwierdzić, że istnieje struktura krystaliczna.

Takie informacje można uzyskać za pomocą EBSD i TEM. Dyfrakcja rozpraszania wstecznego elektronów to technika charakterystyki krystalograficznej służąca do identyfikacji materiału krystalicznego lub polikrystalicznego, o ile mikrostruktura i kąt REM elektronów spełniają warunek dyfrakcji Bragga. Zazwyczaj elektrony rozproszone wstecznie są zbierane pod kątem 70 stopni na wypolerowanej próbce z mapami orientacji ziaren lub kryształów.

Dla nieoszlifowanej próbki wygenerowanie takiej mapy z tych nierównych powierzchni jest trudne, ponieważ nie wszystkie serie serwisowe spełniają wymagania dotyczące kąta EBSD. Jednak w postaci punktu IG z tych nierównych powierzchni można nadal zbierać wzór dyfrakcyjny Cacucciego, o ile spełnione są wymagania dotyczące kąta EBSD. Wzór dyfrakcyjny Cacucci stanowi jednoznaczne potwierdzenie, że krystaliczny minerał jest obecny.

Nasza metoda jest bezpośrednia i szybka, i może być stosowana do innych tkanek mineralizujących. W tym przypadku skupiona wiązka jonów jest używana do wytwarzania mikropróbki, co jest również bardzo bezpośrednią metodą przygotowania sekcji TEM. Aby zbadać proces metamorfozy, rurki hodowano w laboratorium przez około pięć dni.

Właściwe larwy będą pływać w kierunku do przodu zamiast ruchu okrężnego. Oznacza to, że są gotowe na metamorfozę. Inkubować właściwe larwy w roztworze fluorescencyjnym w wodzie morskiej, przykryć pojemniki folią, aby zapobiec fotobieleniu i inkubować zwierzęta przez noc.

Larwy robaków rurkowych są myte na nylonowej siatce, która zatrzymuje larwy, ale pozwala na przejście roztworu. Umyj larwy przefiltrowaną wodą morską dwa razy, aby usunąć nadmiar roztworu barwnika. Dociśnij sitko do szalki Petriego, aby uzyskać szczelne uszczelnienie, zanim zwolnisz uszczelkę w celu wyrzucenia roztworu myjącego.

Uważaj, aby nie wysuszyć larw. Następnie umieść każdą z 10 do 20 larw w cienkim naczyniu ze szklanym dnem z IBMX i przykryj naczynie do czasu obrazowania. Następnie włóż odpowiednie kostki filtrujące z odpowiednimi lustrami dichroicznymi, aby wykryć sygnały fluorescencyjne.

Zoptymalizuj czas otwarcia migawki, aby był wystarczająco szybki, aby uchwycić obrazy dla żywego organizmu. Następnie wybierz parametry przekroju optycznego w opcji Z-Stack, przesuń stolik mikroskopowy w górę i w dół, aby określić pozycję początkową i końcową akwizycji obrazu. Ustaw odległość między warstwami wynoszącą jeden mikrometr.

Po zobrazowaniu wyeksportuj wszystkie dane jako pliki TIF w skali szarości. Można to zrobić, wybierając Plik, Eksportuj. Upewnij się, że typy plików są wyświetlane jako obrazy TIF, a następnie kliknij przycisk Start.

Obraz w skali szarości w każdym kanale, w każdej warstwie Z-Stack będzie w tym samym folderze obrazu gotowy do analizy obrazu. Na koniec wygeneruj obraz kompozytowy dla każdego z kanałów fluorescencyjnych za pomocą ImageJ. Poniższe filmy JoVE pokazują, jak przeprowadzać kalibrację i pomiary wewnątrzkomórkowego pH.

Zachowaj rurki przechodzące metamorfozę za pomocą utrwalacza sieciującego, używając roztworu 4% paraformaldehydu w wodzie morskiej. Po prostu wymieszaj jedną część 16% paraformaldehydu z trzema częściami wody morskiej i pozwól na utrwalenie przez noc. Usunąć główny utrwalacz i ponownie utrwalić próbkę przez 30 minut w wodnym roztworze 1% tetratlenku osmu, aby jeszcze bardziej ustabilizować struktury tkankowe.

Pamiętaj, aby pracować pod wyciągiem i mieć oddzielne butelki na odpady, które są wyraźnie oznaczone, przygotuj formaldehydy i tetratlenek osmu. Następnie odwodnić próbki za pomocą serii stopniowanego etanolu, pozostawiając pięć minut między zmianami. Następnym krokiem jest odwodnienie próbek roztworem etanolu i HMDS w stosunku 1:1, tylko tyle, aby pokryć próbkę.

Poczekaj, aż próbka wyparuje do sucha w dygestorium, a następnie powtórz procedurę z czystym HMDS. Aby stworzyć kontrolowane pęknięcie próbki, przyłóż diamentową tarczę do naczynia, otaczając kilka osób, aby wykonać trójkątne cięcie. Po przykryciu szalki Petriego umieść szalkę hodowlaną na aluminiowym klocku, delikatnie dociśnij, aby uzyskać kontrolowane pęknięcie.

Obserwuj za pomocą mikroskopu preparacyjnego, ostrożnie podnieś pęknięty fragment, który zawiera kilka nienaruszonych robaków rurkowych. Za pomocą srebrnej farby przyklej próbkę do uchwytu na próbki SEM, pomaluj krawędzie srebrną farbą, aby zmniejszyć ładowanie. Próbka jest teraz gotowa do zobrazowania do analizy SEM-EDS.

Włóż próbkę z uchwytu do mikroskopu. Ustawić próbkę w odpowiedniej orientacji i umieścić ją pod kolumną elektronów. Przeanalizuj próbkę w trybie VP SEM.

W razie potrzeby zoptymalizuj ostrość i astygmatyzm. Wybierz powiększenie tak, aby pojedynczy organizm wypełniał całe pole widzenia. Przeanalizuj rozkład pierwiastkowy wapnia w próbce, uzyskując mapę całego pola widzenia, uruchom mapę przez 15 minut lub dłużej lub do momentu, gdy dane pokażą wyraźną lokalizację wapnia w organizmie

Aby uzyskać kwantyfikację punktów dla obszaru zainteresowania, wybierz opcję Identyfikator punktu za pomocą narzędzia Pojedynczy punkt. Kliknij obszar zainteresowania, aby wykonać skanowanie. Uważnie zapisz lokalizację, wykonując serię zdjęć ze zmniejszającymi się powiększeniami.

Aby przygotować próbki do EBSD, wyjmij próbkę z płaskiego uchwytu SEM i przyklej ją do klocka nachylonego pod kątem 45 stopni za pomocą srebrnej farby. Korzystając z referencyjnych obrazów SEM, zlokalizuj interesujące zwierzę i dokładny region zwierzęcia, które ma być badane. Przechyl stolik o 25 stopni, tak aby powierzchnia próbki znajdowała się teraz pod kątem około 70 stopni w stosunku do wiązki elektronów.

Podnieś scenę. Wybierz tryb EBSD w oprogramowaniu AZtec. Wybierz aragonit jako interesujące Cię fazy.

Włóż kamerę EBSD, ustaw warunki kamery, aby uzyskać sygnał około 90%Korzystając z rastra o szybkiej wiązce, uzyskaj tło, a następnie uchwyć obraz w języku Aztec. Korzystając z narzędzia do analizy punktowej, kliknij lokalizację próbki, która wykazała wyższy sygnał wapnia. Zeskanuj, aby sprawdzić, czy wykryto wzory Cacucciego.

Jeśli wzorce są obecne i pasują do którejkolwiek z wybranych faz w bazie danych, zostaną one automatycznie zindeksowane. Przygotować próbkę SEM należy zabezpieczyć warstwą platyny poprzez napylanie przed przystąpieniem do przygotowania mikropróbki przy użyciu skupionej wiązki jonów. Włóż próbkę do komory FIB SEM, ustaw próbkę i uzyskaj żywy, indukowany jonami obraz elektronów wtórnych.

Zlokalizuj obszar zainteresowania na obrazach, do których istnieją odniesienia, zgodnie z wcześniejszymi ustaleniami za pomocą mapowania EDS w EBSD. W razie potrzeby obróć stolik, aby ustawić interesujące Cię cechy w jednej linii z ramą okna, dostosuj powiększenie, aby pokazać obszar, aby pomieścić interesujące Cię cechy, a następnie zdefiniuj pole do osadzania węgla i wolframu. Zrób migawkę FIB, a następnie narysuj wzór czterech pól wokół wolframowej nasadki, aby określić miejsce mikropróbkowania.

Następnie przechyl stolik pod kątem 58 stopni i przetnij dno mikropróbki. Przechyl stolik z powrotem do zera, włóż wolframową sondę do mikropobierania próbek, a następnie opuść ją, aż zetknie się z próbką. Połącz sondę wolframową i próbkę, osadzając wolfram między końcówką sondy a powłoką wolframową, a następnie wykonaj ostatnie cięcie, odłącz mikropróbkę od reszty wyspy i podnieś sondę z dołączoną mikropróbką.

Umieść miedzianą połówkę siatki TEM w uchwycie z bocznym wejściem, opuść sondę wolframową, aż mikropróbka zetknie się z siatką TEM. Mikropróbka jest dalej mielona, aż stanie się przezroczysta dla elektronów. Przed analizą TEM napełnij oba dewary ciekłym azotem i ustaw napięcie przyspieszające na 300 kilowoltów.

Umieść połówkę kratki z dołączonymi lamelami w standardowym uchwycie TEM. Wyśrodkuj wiązkę na ekranie luminoforowym, napnij i rozszerz wiązkę i upewnij się, że cały ruch wiązki jest koncentryczny. Użyj pokręteł ruchu stage, aby nawigować i lokalizować próbkę, zwiększać powiększenie próbki i regulować wysokość Z, aż próbka będzie ostra.

W razie potrzeby użyj okularów optycznych. Włóż kamerę i wyjmij ekran luminoforowy. W razie potrzeby rozszerz wiązkę, aby uniknąć przesycenia kamery.

Dostosuj ostrość i parametry aparatu, aby uchwycić obraz. Aby uzyskać wzór dyfrakcyjny, wyśrodkuj interesujący Cię element, usuń aperturę obiektywu i włóż aperturę dyfrakcyjną. Zmień na tryb soczewki dyfrakcyjnej.

Włóż zaślepkacz, aby środek wzoru dyfrakcyjnego nie spalił aparatu lub ekranu luminoforowego. Uchwyć obraz wzoru do analizy krystalograficznej. Poniżej znajduje się kilka obserwacji procesu zwapnienia podczas metamorfozy rurkowca.

Wartości pH rurek wzrosły po stymulacji metamorfozy przez IBMX, a pH wewnątrzkomórkowe zaczęło wzrastać powyżej ośmiu po 31 godzinach. Tkanką istotną dla zwapnienia jest okolica kołnierza. Mapa sygnałów SEM-EDS pokazuje, że dzień pierwszy rurkowca miał jednorodny rozkład wapnia, co wskazuje, że proces zwapnienia jeszcze się nie rozpoczął.

Dwa dni po stymulacji metamorfozy niektóre rurkowce już zbyt mocno się zwapniły i nie nadają się już do obserwacji nowo zwapniałych materiałów. W próbce rurkowatości, takiej jak ta użyta w tym przykładzie, zwapnienie jest wciąż na wczesnym etapie, więc kwantyfikacja wapnia pomogła określić miejsce zainteresowania w celu scharakteryzowania obecności minerałów. Podczas badania za pomocą SEM-EBSD zlokalizowany obszar z silnym sygnałem wapniowym miał również krystaliczną strukturę aragonitu.

Za pomocą skupionej wiązki jonów próbkę przygotowano do TEM, a wzór dyfrakcyjny minerału aragonitowego przeanalizowano z większą szczegółowością krystalograficzną. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak zlokalizować zdarzenie mineralizacji w organizmie wielokomórkowym. Kiedy mikroskopia optyczna i elektronowa są używane razem, możemy uzyskać wysoki poziom fizjologicznego i materialnego zrozumienia procesu zwapnienia.