Name: Charakterystyka zwapnień przy użyciu technik mikroskopii optycznej i elektronowej na żywo w rurowcu morskim (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-02-28T14:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 39 s
Description: Poznaj metody mikroskopii optycznej i elektronowej do badania procesu biomineralizacji u rurowca morskiego Hydroides elegans. Techniki te pozwalają obserwować zwapnienie w czasie rzeczywistym.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy chcieliby bardzo podziękować Clemson Broadcast Productions, nagranie audio J. Brighta, narracja A. D. McQuiston, słodzenie dźwięku, K. Murphy, filmowanie G. Spake, grafika T. Messervy, montaż wideo T. Messervy i E. Rodgers. Pomoc techniczna i doradztwo naukowe zostały zainspirowane radami S. Kawady, S. Kubo, J. Hudsona, T. Darroudiego, D. Mulwee, H. Qian, Y. W. Lama, M. B. Johnstone'a, C. Campanati, A. C. Lane'a i R. Dineshrama. Badanie to zostało sfinansowane z trzech grantów GRF z HKSAR-RGC (numery grantów: 705511P, 705112P i 17304914).

<ol><li>Aizenberg, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skeleton+of+Euplectella+sp.%3A+structural+hierarchy+from+the+nanoscale+to+the+macroscale%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Skeleton of Euplectella sp.: structural hierarchy from the nanoscale to the macroscale.</a> Science. 309 (5732), 275-278 (2005).</li>
<li>de Nooijer, L. J., Toyofuku, T., Oguri, K., Nomaki, H., Kitazato, H. <a target="_blank" href="http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.4319/lom.2008.6.610/abstract">Intracellular pH distribution in foraminifera determined by the fluorescent probe HPTS.</a> Limnol Oceanogr Methods. 6 (11), 610-618 (2008).</li>
<li>de Nooijer, L. J., Langer, G., Nehrke, G., Bijma, J. <a target="_blank" href="http://www.biogeosciences.net/6/2669/2009/">Physiological controls on seawater uptake and calcification in the benthic foraminifer Ammonia tepida.</a> Biogeosciences. 6 (11), 2669-2675 (2009).</li>
<li>Smith, A. M., Riedi, M. A., Winter, D. J. <a target="_blank" href="http://link.springer.com/article/10.1007/s00227-013-2210-z">Temperate reefs in a changing ocean: skeletal carbonate mineralogy of serpulids.</a> Mar Biol. 160 (9), 1-14 (2013).</li>
<li>Carpizo-Ituarte, E., Hadfield, M. <a target="_blank" href="https://www.jstor.org/stable/1542509?seq=1#page_scan_tab_contents">Stimulation of metamorphosis in the polychaete Hydroides elegans Haswell (Serpulidae).</a> Biol. Bull. 194 (1), 14(1998).</li>
<li>Bryan, P. J., Kreider, J. L., Qian, P. Y. <a target="_blank" href="http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0022098197001056">Settlement of the serpulid polychaete Hydroides elegans (Haswell) on the arborescent bryozoan Bugula neritina (L.): evidence of a chemically mediated relationship.</a> J Exp Mar Biol Ecol. 220, 171-190 (1998).</li>
<li>Chan, V. B. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+of+compositional+and+ultrastructural+shifts+during+the+development+of+calcareous+tubes+in+the+biofouling+tubeworm%2C+Hydroides+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Struct.+Biol%22%5BJournal%5D)">Evidence of compositional and ultrastructural shifts during the development of calcareous tubes in the biofouling tubeworm, Hydroides elegans.</a> J. Struct. Biol. 189 (3), 230-237 (2015).</li>
<li>DOE. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Handbook+of+methods+for+the+analysis+of+the+various+parameters+of+the+carbon+dioxide+system+in+sea+water.+Version+2%22">Handbook of methods for the analysis of the various parameters of the carbon dioxide system in sea water. Version 2</a>. Dickson, A. G., Goyet, C. , ORNL/CDIAC-74 (1994).</li>
<li>Chan, V. B. S., et al. <a target="_blank" href="https://www.openaire.eu/search/publication?articleId=frontiers___::60dc3ff1cf8480f5672e61caa159856d">Direct deposition of crystalline aragonite in the controlled biomineralization of the calcareous tubeworm.</a> Front Mar Sci. 2, 97(2015).</li>
<li>Bond, J., Varley, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+flow+cytometry+and+SNARF+to+calibrate+and+measure+intracellular+pH+in+NS0+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">Use of flow cytometry and SNARF to calibrate and measure intracellular pH in NS0 cells.</a> Cytometry A. 64, 43-50 (2005).</li>
<li>Lloyd, G. E. <a target="_blank" href="https://www.researchgate.net/publication/249849686_Atomic_Number_and_Crystallographic_Contrast_Images_with_the_SEM_A_Review_of_Backscattered_Electron_Techniques">Atomic number and crystallographic contrast images with the SEM: a review of backscattered electron techniques.</a> Mineral Mag. 51, 3-19 (1987).</li>
<li>Perez-Huerta, A., Dauphin, Y., Cuif, J. P., Cusack, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+resolution+electron+backscatter+diffraction+%28EBSD%29+data+from+calcite+biominerals+in+recent+gastropod+shells%5BTitle%5D)+AND+%22Micron%22%5BJournal%5D)">High resolution electron backscatter diffraction (EBSD) data from calcite biominerals in recent gastropod shells.</a> Micron. 42 (3), 246-251 (2011).</li>
<li>Bandli, B. R., Gunter, M. E. <a target="_blank" href="http://ammin.geoscienceworld.org/content/97/8-9/1269">Electron backscatter diffraction from unpolished particulate specimens: examples of particle identification and application to inhalable mineral particulate identification.</a> Am. Mineral. 97, 1269-1273 (2012).</li>
<li>Hayat, M. A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHayat%2C+MA+%22Principles+and+techniques+of+electron+microscopy%3A+biological+applications%22">Principles and techniques of electron microscopy: biological applications</a>. , Cambridge University Press. (2000).</li>
<li>Wirth, R. <a target="_blank" href="http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0009254108001940">Focused Ion Beam (FIB) combined with SEM and TEM: Advanced analytical tools for studies of chemical composition, microstructure and crystal structure in geomaterials on a nanometre scale.</a> Chem Geo. 261, 217-229 (2009).</li>
<li>Volkert, C. A., Minor, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Focused+ion+beam+microscopy+and+micromachining%5BTitle%5D)+AND+%22MRS+Bull%22%5BJournal%5D)">Focused ion beam microscopy and micromachining.</a> MRS Bull. 32, 389-399 (2007).</li>
<li>Kudo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microtexture+of+larval+shell+of+oyster%2C+Crassostrea+nippona%3A+A+FIB-TEM+study%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Struct.+Biol%22%5BJournal%5D)">Microtexture of larval shell of oyster, Crassostrea nippona: A FIB-TEM study.</a> J. Struct. Biol. 169 (1), 1-5 (2009).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Obrazowanie optyczne na żywo jest przydatną metodą obserwacji zdarzeń komórkowych w organizmie wielokomórkowym. W tym przypadku wykorzystano wewnętrzne wskaźniki pH i jonów wapnia do pomiaru strumienia jonów w miejscach mineralizacji. W tych regionach wymagane jest aktywne pompowanie jonów w celu podniesienia pH i stężenia Ca2+, aby umożliwić zwapnienie 2,3. Podczas stosowania cząsteczek fluorescencyjnych do badania organizmu ważne jest, aby upewnić si...

Biomineralizacja to złożona seria zdarzeń, która łączy w sobie szereg aktywności komórkowych, w wyniku których powstają doskonale uporządkowane minerały1. Wyzwanie polega na scharakteryzowaniu zarówno dynamicznego procesu komórkowego, jak i wyrafinowanych struktur mineralnych przy użyciu kombinacji metod mikroskopii optycznej i elektronowej. Podwyższenie wewnątrzkomórkowego pH sprzyja tworzeniu się kryształów CaCO3, stąd identyfikacja etapu życia, który ma podwyższone pH, ujawnia czas, w którym prawdopodobnie wystąpi zwapnienie2,3.
Rureczki z rodziny Serpulidae są powszechnymi kalcyfikatorami w oceanie4. Jest to również popularny model bezkręgowców do badań morskich, zwłaszcza w biofoulingu5,6. W niniejszej pracy obserwuje się proces zwapnienia w komorach mineralizujących podczas biomineralizacji. Szybki proces metamorfozy obejmuje pojawienie się struktur węglanu wapnia7,8.
Pokazujemy, jak można przeprowadzić wewnętrzne pomiary pH na rureczniku oraz jak można badać etapy życia i tkanki istotne dla zwapnienia. Po zidentyfikowaniu interesującego etapu życia tkankę odpowiedzialną za zwapnienie można scharakteryzować w wyższej rozdzielczości za pomocą metod mikroskopii elektronowej. Za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej określamy czas potrzebny do pojawienia się węglanu wapnia po indukcji metamorficznej. Podobny etap życia został następnie zwizualizowany za pomocą SEM-EDS w celu dystrybucji składu pierwiastkowego, a zdeponowany minerał przeanalizowano przy użyciu dwóch różnych metod mikroskopii elektronowej, w szczególności SEM-EBSD i FIB-TEM.

<table><tbody><tr><td>Heksametyldisilazan&nbsp;</td><td>Mikroskopia elektronowa Nauki</td><td>16700(EM)</td><td></td></tr><tr><td>Tetratlenek osmu 2% roztwór wodny</td><td>Mikroskopia elektronowa Nauki</td><td>19192</td><td></td></tr><tr><td>IBMX 3-izobutylo-1-metyloksantyna</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>PHZ1124</td><td></td></tr><tr><td>Nigerycyna, Wolny kwas</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>N7143-5MG</td><td></td></tr><tr><td>Średnica 35 mm, rozmiar otworu 27 mm, Szkło nr 0, Bez powłoki</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>D110400</td><td></td></tr><tr><td>5-(i-6)-karboksy-SNARF-1, ester acetoksymetylowy, octan</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>C-1271</td><td></td></tr><tr><td>BDH Chlorek potasu, klasa ACS</td><td>VWR</td><td>BDH0258-500G</td><td></td></tr><tr><td>Odczynnik paraformaldehydowy , krystaliczny</td><td>Sigma</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>1 M Kwas solny do analizy wolumetrycznej</td><td>Wako Pure Chemical Industries, Ltd</td><td>083-01095</td><td></td></tr><tr><td>0,05 M roztwór wodorotlenku sodu do analizy wolumetrycznej</td><td>Wako Pure Chemical Industries, Ltd</td><td>199-02185</td><td></td></tr><tr><td>Calcein</td><td>Sigma</td><td>C0875</td><td></td></tr><tr><td>FASW</td><td>Iwaki Co. Ltd.</td><td>Rei-sea Morskie</td><td></td></tr><tr><td>membrany estrowe z mieszanej celulozy; Średnica 47 mm, 0,45 &mikro; m</td><td>ADVANTEC</td><td>A045A047A</td><td></td></tr><tr><td>etanol</td><td>Wako Pure Chemical Industries, Ltd</td><td>051-00476</td><td></td></tr><tr><td>Sztuczna woda morska do</td><td></td><td></td><td>według SOP06 DOE (1994), cdiac.ornl.gov/ftp/cdiac74/sop06.pdf</td></tr><tr><td>Chlorek sodu</td><td>Wako Pure Chemical Industries, Ltd</td><td>191-01665</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek potasu</td><td>Wako Pure Chemical Industries, Ltd</td><td>163-03545</td><td></td></tr><tr><td>Sześciowodny chlorek magnezu</td><td>Wako Pure Chemical Industries, Ltd</td><td>135-00165</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek wapnia</td><td>Wako Pure Chemical Industries, Ltd</td><td>039-00475</td><td></td></tr><tr><td>Siarczan sodu</td><td>Wako Pure Chemical Industries, Ltd</td><td>197-03345</td><td></td></tr><tr><td>Kwas solny</td><td>Wako Pure Chemical Industries, Ltd</td><td>089-08415</td><td></td></tr><tr><td>2-amino-2-hydroksymetylo-1,3-propanodiol (tris)</td><td>Wako Pure Chemical Industries, Ltd</td><td>207-06275</td><td></td></tr><tr><td>2-aminopirydyna</td><td>Wako Pure Chemical Industries, Ltd</td><td>011-02775</td><td></td></tr><tr><td>Miernik pH Orion 5-gwiazdkowy Plus</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PrpHecT ROSS Micro Kombinowana elektroda pH 8220BNWP</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Axiovision, wersja 4.6, Axio Obserwator Z1</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>NIH, Bethesda, MD, USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HRTEM H500</td><td>Hitachi</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SU6600 VPSEM</td><td>System Hitachi</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NB5000 Focused Ion and Electron Beam (FIB-SEM)</td><td>Hitachi&nbsp;</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

charakterystyka zwapnień przy użyciu technik mikroskopii optycznej i elektronowej na żywo w rurowcu morskim

Characterization of Calcification Events Using Live Optical and Electron Microscopy Techniques in a Marine Tubeworm

Scharakteryzowanie pierwszego zdarzenia biologicznej produkcji węglanu wapnia wymaga połączenia podejść mikroskopowych. Po pierwsze, wewnątrzkomórkowy rozkład pH i jony wapnia można obserwować za pomocą mikroskopii na żywo w czasie. Pozwala to na identyfikację etapu życia i tkanki z cechą będącą przedmiotem zainteresowania dla dalszych badań mikroskopii elektronowej. Etap życia i tkanki będące przedmiotem zainteresowania mają zazwyczaj wyższe sygnały pH i Ca. 
Tutaj, używając H. elegans, prezentujemy protokół charakteryzujący obecność struktur węglanu wapnia w próbce biologicznej na skaningowym mikroskopie elektronowym (SEM), używając spektroskopii rentgenowskiej z dyspersją energii (EDS) do wizualizacji składu pierwiastkowego, używając dyfrakcji wstecznego rozpraszania elektronów (EBSD) do określenia obecności struktur krystalicznych, oraz używając transmisyjnej mikroskopii elektronowej (TEM) do analizy składu i struktury materiału. W tym protokole skupiona wiązka jonów (FIB) jest używana do izolowania próbek o wymiarze odpowiednim do analizy TEM. Ponieważ FIB jest techniką specyficzną dla danego miejsca, pokazujemy, w jaki sposób informacje z poprzednich technik można wykorzystać do identyfikacji obszaru zainteresowania, w którym sygnały Ca są najwyższe.

Poniżej przedstawiono obserwacje procesu kalcyfikacji podczas metamorfozy rurkopława. Rysunek 1 pokazuje, że wartości pH w pobliżu regionu obrączki są wyższe niż w innych tkankach po metamorfozie. Rysunek 2i przedstawia rurkopława z jednorodnym rozkładem Ca, co sugeruje, że nie rozpoczęły się jeszcze istotne zdarzenia kalcyfikacyjne; Rysunek 2ii pokazuje rurkopława, u którego kalcyfikacja trwała dłużej, co sugeruje, że proces ten przekroc...

Pokazujemy użycie różnych metod mikroskopowych, które są przydatne do obserwacji zwapnienia tubeworma, Hydroides elegans, a także do lokalizowania i charakteryzowania pierwszego zwapniałego materiału. Mikroskopia na żywo i mikroskopia elektronowa są używane razem w celu dostarczenia informacji funkcjonalnych i materiałowych, które są ważne w badaniu biomineralizacji.

Charakterystyka zwapnień przy użyciu technik mikroskopii optycznej i elektronowej na żywo w rurowcu morskim

Characterizing the first event of biological production of calcium carbonate requires a combination of microscopy approaches. First, intracellular pH ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest określenie lokalizacji i struktury procesu kalcyfikacji poprzez zastosowanie kombinacji metod mikroskopii optycznej i elektronowej. Osiąga się to poprzez monitorowanie żywej larwy rurecznika podczas metamorfozy – etapu cyklu życiowego odpowiedzialnego za kalcyfikację, który można wykryć przy użyciu wskaźników fluorescencyjnych czułych na wewnątrzkomórkowe pH oraz sygnały wapniowe. Obrazowanie wewnątrzkomórkowego pH pozwala na badanie koncentracji protonów wchodzących do cytoplazmy i wychodzących z niej podczas procesu kalcyfikacji.Aby rozpocząć obrazowanie wewnątrzkomórkowego pH w larwach morskiego rurecznika, kompetentne pływające larwy barwi się wewnątrzkomórkowym barwnikiem wskaźnikowym pH, SNARF-1 AM. Larwy są następnie przenoszone do szalki z IBMX zawierającej wodę morską z cienkim szklanym okienkiem obserwacyjnym i umieszczane pod mikroskopem fluorescencyjnym, gdzie są naświetlane światłem o długości fali 488 nm, która jest absorbowana przez barwnik. Zbierane są emisje barwnika o długościach 580 nm oraz 640 nm. Wartości wewnątrzkomórkowego pH można obliczyć na podstawie stosunku tych wartości.Mikroskopia optyczna pozwala zidentyfikować czas i obszar tkanki powiązane z wyższym poziomem pH. Jest to pierwszy krok w celu określenia punktów czasowych istotnych dla dalszej analizy. W drugim kroku należy utrwalić rurkowca za pomocą utrwalaczy w odpowiednich punktach czasowych do analizy w mikroskopii elektronowej.Nowo mineralizujący etap życia identyfikuje się za pomocą mapowania SEM-EDS w celu wykrycia sygnału wapnia. Następnie obszary o wysokim sygnale wapnia są analizowane przy użyciu SEM/EBSD, aby potwierdzić obecność minerału krystalicznego. Na koniec, przy użyciu skupionej wiązki jonów, wycina się minerał i przygotowuje cienki przekrój do obserwacji w TEM.Niniejsza sekcja służy do uzyskania dyfrakcyjnego obrazu wybranego obszaru. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z konwencjonalnymi metodami badawczymi, takimi jak objętościowa spektroskopia dyfrakcji rentgenowskiej, jest możliwość bezpośredniej obserwacji konkretnych struktur zidentyfikowanych za pomocą metod mikroskopii optycznej i elektronowej; dzięki temu oddzielne zdarzenia wapnienia mogą być badane bezpośrednio zarówno w wymiarze czasowym, jak i przestrzennym. Podczas badania wapnienia z wykorzystaniem wskaźników wapnia i wewnątrzkomórkowego pH możemy określić skalę czasową tych istotnych zdarzeń fizjologicznych.Zabezpieczenie preparatu w odpowiednim czasie jest kluczowe dla uzyskania owocnych wyników analizy SEM. W przypadku poszukiwania pierwszych zdarzeń wapnienia biologicznego, metoda SEM/EDX może zostać wykorzystana do przesiewowego badania rozkładu pierwiastkowego wapnia. Obszar o wyższym stężeniu wapnia może wskazywać na obecność węglanu wapnia, jednak tylko obecność dyfraktogramu rentgenowskiego może potwierdzić istnienie struktury krystalicznej.Takie informacje można uzyskać za pomocą EBSD i TEM. Dyfrakcja elektronów wstecznie rozproszonych jest techniką charakterystyki krystalograficznej służącą do identyfikacji materiałów krystalicznych lub polikrystalicznych, o ile mikrostruktura i kąt REM elektronów spełniają warunek dyfrakcji Bragga. Zazwyczaj elektrony wstecznie rozproszone są zbierane pod kątem nachylenia 70 stopni na polerowanej próbce w celu stworzenia map orientacji ziaren lub kryształów.W przypadku niepolerowanej próbki wygenerowanie takiej mapy z tych nierównych powierzchni jest trudne, ponieważ nie wszystkie serie powierzchni spełniają wymagania dotyczące kąta EBSD. Jednakże, w formie punktu IG, wzór dyfrakcyjny Cacucciego może zostać nadal zebrany z tych nierównych powierzchni, o ile wymaganie dotyczące kąta EBSD zostanie spełnione. Wzór dyfrakcyjny Cacucciego stanowi jednoznaczne potwierdzenie obecności minerału krystalicznego.Nasza metoda jest bezpośrednia i szybka i może zostać zastosowana w odniesieniu do innych tkanek mineralizujących. W niniejszej pracy do wykonania mikropróbki wykorzystano skupioną wiązkę jonów, co stanowi również bardzo bezpośrednią metodę przygotowania przekroju do TEM. W celu zbadania procesu metamorfozy rurcowce hodowano w warunkach laboratoryjnych przez około pięć dni.Kompetentne larwy będą pływać do przodu zamiast wykonywać ruchy okrężne. Oznacza to, że są one gotowe do przeobrażenia. Inkubuj kompetentne larwy w roztworze fluorescencyjnym w wodzie morskiej, przykryj pojemniki folią, aby zapobiec fotowybielaniu, i inkubuj zwierzęta przez noc.Larwy rureczników są płukane przeciwko nylonowej siatce, która zatrzyma larwy, ale pozwoli na przepływ roztworu. Larwy należy przepłukać filtrowaną wodą morską dwukrotnie, aby usunąć nadmiar roztworu barwnika. Przed zwolnieniem uścisku i wylaniem roztworu płuczącego, należy docisnąć sitko do szalki Petriego, aby zapewnić szczelne przyleganie.Należy uważać, aby nie wysuszyć larw. Następnie każdą z 10 do 20 larw należy umieścić w cienkiej szalkach z szklanym dnem zawierającej IBMX i przykryć szalkę do momentu obrazowania. W kolejnym kroku należy włożyć odpowiednie kostki filtrów z właściwymi lustrami dichroicznymi, aby wykryć sygnały fluorescencyjne.Zoptymalizuj czas naświetlania tak, aby był wystarczająco krótki do obrazowania żywego organizmu. Następnie wybierz parametry sekcjowania optycznego w opcji Z-Stack, przemieszczając stolik mikroskopu w górę i w dół, aby zdefiniować pozycję początkową i końcową akwizycji obrazów. Ustaw odległość 1 µm między warstwami.Po wykonaniu obrazowania wyeksportuj wszystkie dane jako pliki TIF w skali szarości. Można to zrobić, wybierając File, Export. Upewnij się, że typy plików są ustawione jako obrazy TIF, a następnie kliknij Start.Obraz w skali szarości dla każdego kanału, w każdej warstwie stosu Z (Z-Stack), znajdzie się w tym samym folderze obrazów, gotowy do analizy. Na koniec, przy użyciu programu ImageJ, wygeneruj obraz kompozytowy dla każdego z kanałów fluorescencyjnych. Poniższe filmy JoVE demonstrują, jak przeprowadzić kalibrację i pomiary pH wewnątrzkomórkowego.Utrwal rurkowce przechodzące metamorfozę za pomocą utrwalacza sieciującego, stosując roztwór 4% paraformaldehydu w wodzie morskiej. Wystarczy zmieszać jedną część 16% paraformaldehydu z trzema częściami wody morskiej i pozostawić do utrwalenia na noc. Usunąć główny utrwalacz i ponownie utrwalić preparat przez 30 minut w wodnym roztworze 1% tetrautlenku osmu, aby dodatkowo ustabilizować struktury tkankowe.Należy pamiętać o pracy w dygestorium i zapewnieniu oddzielnych, wyraźnie oznakowanych butelek na odpady; przygotować formaldehydy oraz tetratlenek osmu. Następnie odwodnić próbki, stosując szereg roztworów etanolu o rosnącym stężeniu, zachowując pięciominutowe przerwy między kolejnymi etapami. Kolejnym krokiem jest odwodnienie próbek przy użyciu roztworu etanolu i HMDS w stosunku 1:1, w ilości wystarczającej do całkowitego przykrycia preparatu.Należy odczekać, aż preparat całkowicie odparuje w dygestorium, a następnie powtórzyć procedurę z zastosowaniem czystego HMDS. Aby stworzyć kontrolowane pęknięcie próbki, należy przesunąć ostrze diamentowe wzdłuż szalki, obejmując kilka osobników w celu wykonania cięcia w kształcie trójkąta. Przy przykrytej szalce Petri należy przyłożyć ją do aluminiowego stubu i delikatnie nacisnąć, aby uzyskać kontrolowane pęknięcie.Obserwując preparat pod mikroskopem stereomikroskopowym, ostrożnie pobierz fragment szczątków zawierający kilka nienaruszonych rurek wieloszczetów. Za pomocą farby srebrowej przytwierdź próbkę do uchwytu do SEM, a następnie pomaluj krawędzie farbą srebrową, aby zredukować efekty ładowania. Próbka jest teraz gotowa do obrazowania w celu analizy SEM-EDS.Włóż próbkę w uchwycie do mikroskopu. Zorientuj próbkę i umieść ją pod kolumną elektronową. Przeanalizuj próbkę w trybie VP SEM.Zoptymalizuj ostrość i astygmatyzm w razie potrzeby. Wybierz takie powiększenie, aby pojedynczy organizm wypełniał całe pole widzenia. Przeanalizuj rozkład pierwiastkowy wapnia w próbce poprzez wykonanie mapy całego pola widzenia; prowadź mapowanie przez 15 minut lub dłużej, aż dane wykażą wyraźną lokalizację wapnia wewnątrz organizmu.Aby uzyskać ilościową analizę punktową dla badanego obszaru, wybierz opcję Point ID za pomocą narzędzia Single Point. Kliknij w interesujący obszar, aby przeprowadzić skanowanie. Dokładnie zapisz lokalizację, wykonując serię obrazów przy stopniowo zmniejszaniu powiększenia.Aby przygotować próbki do analizy EBSD, należy wyjąć próbkę z płaskiego uchwytu SEM i przymocować ją do stubu z wstępnym nachyleniem 45 stopni za pomocą farby srebrnej. Korzystając z referencyjnych obrazów SEM, zlokalizuj interesujące zwierzę oraz dokładny obszar zwierzęcia, który ma zostać zbadany. Przechyl stoła o 25 stopni, tak aby powierzchnia próbki znajdowała się teraz pod kątem około 70 stopni względem wiązki elektronów.Podnieś stół. Wybierz tryb EBSD w oprogramowaniu AZtec. Jako fazy zainteresowania wybierz aragonit.Wprowadź kamerę EBSD i ustaw parametry kamery, aby uzyskać sygnał na poziomie około 90%. Wykorzystując szybkie rastrowanie wiązki, uzyskaj tło, a następnie wykonaj obraz w programie Aztec. Za pomocą narzędzia Spot Analysis kliknij w miejscu próbki, w którym odnotowano wyższy sygnał wapnia. Wykonaj skanowanie, aby sprawdzić, czy wykryto wzory Cacucciego.Jeśli zostaną wykryte wzorce zgodne z którąkolwiek z wybranych faz w bazie danych, zostaną one automatycznie zaindeksowane. Przed przejściem do przygotowania mikropróbki za pomocą wiązki jonowej, należy zabezpieczyć przygotowaną próbkę SEM warstwą platyny poprzez napylanie. Umieść próbkę w komorze FIB SEM, ustaw ją i uzyskaj obraz na żywo z wtórnych elektronów indukowanych jonami.Zlokalizuj obszar zainteresowania na obrazach referencyjnych, ustalony wcześniej podczas mapowania EDS w EBSD. Obróć stolik w razie potrzeby, aby ustawić interesujące cechy w linii z ramką okna, dostosuj powiększenie, aby obszar obejmował interesujące cechy, a następnie wyznacz obszar osadzania węgla i wolframu. Wykonaj zrzut ekranu FIB, a następnie narysuj wzór czterech prostokątów wokół osłony wolframowej, aby zdefiniować miejsce mikropróbkowania.Następnie nachyl stolik pod kątem 58 stopni i przetnij dno mikropróbki. Przywróć nachylenie stolika do zera, włóż wolframową sondę do mikropróbkowania, a następnie opuść ją, aż zetknie się z próbką. Połącz sondę wolframową z próbką poprzez osadzenie wolframu pomiędzy końcówką sondy a powłoką wolframową, wykonaj końcowe cięcie, oddziel mikropróbkę od reszty wyspy i unieś sondę wraz z przymocowaną mikropróbką.Umieść miedzianą półsiatkę TEM w uchwycie z bocznym wlotem, a następnie obniż sondę wolframową, aż mikropróbka zetknie się z siatką TEM. Mikropróbkę należy dalej trawić do momentu, aż stanie się ona przezroczysta dla elektronów. Przed analizą TEM napełnij oba naczynia typu dewar ciekłym azotem i ustaw napięcie przyspieszające na 300 kilowoltów.Umieść połówkę siatki z przymocowanymi lamelkami w standardowym uchwycie TEM. Wycentruj wiązkę na ekranie fluorescencyjnym, zwęż i rozszerz wiązkę oraz upewnij się, że wszystkie ruchy wiązki są koncentryczne. Użyj pokręteł ruchu stolika, aby nawigować i zlokalizować próbkę, zwiększ powiększenie próbki i dostosuj wysokość Z (Z-Height), aż próbka zostanie ustawiona w ostrości.W razie potrzeby należy użyć okularów optycznych. Wstawić kamerę i usunąć ekran fluorescencyjny. Rozszerzyć wiązkę w razie potrzeby, aby uniknąć przesycenia kamery.Dostrój ostrość oraz parametry kamery, aby wykonać zdjęcie. W celu uzyskania wzoru dyfrakcyjnego wycentruj interesujący obszar, wyjmij przysłonę obiektywu i włóż przysłonę dyfrakcyjną. Przełącz urządzenie w tryb soczewki dyfrakcyjnej (Diffraction Lens mode).Wstaw przesłonę, aby zapobiec wypaleniu środka wzoru dyfrakcyjnego na kamerze lub ekranie fosforowym. Wykonaj obraz wzoru do analizy krystalograficznej. Poniżej przedstawiono niektóre obserwacje procesu kalcyfikacji podczas metamorfozy rurecznika.Wartości pH rureczników wzrosły po stymulacji metamorfozy za pomocą IBMX, a wewnątrzkomórkowe pH zaczęło przekraczać osiem w 31. godzinie. Tkanką istotną dla procesu kalcyfikacji jest obszar kołnierza. Mapa sygnałów SEM-EDS wykazuje, że rurecznik w pierwszym dniu miał jednorodny rozkład wapnia, co wskazuje, że proces kalcyfikacji jeszcze się nie rozpoczął.Dwa dni po stymulacji metamorfozy niektóre rurkowce uległy już zbyt silnej kalcyfikacji i nie nadają się do obserwacji nowo powstałych materiałów zwapniałych. W przypadku okazu rurkowca, takiego jak ten użyty w niniejszym przykładzie, kalcyfikacja znajduje się wciąż we wczesnym stadium, zatem ilościowe oznaczenie wapnia pomogło wyznaczyć obszar zainteresowania w celu scharakteryzowania obecności minerałów. Badanie za pomocą SEM-EBSD wykazało, że zlokalizowany obszar z silnym sygnałem wapnia posiadał również krystaliczną strukturę aragonitu.Przy użyciu skupionej wiązki jonów przygotowano próbkę do TEM, a następnie przeanalizowano wzór dyfrakcyjny minerału aragonitu w większych szczegółach krystalograficznych. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać dobrą wiedzę na temat tego, jak zlokalizować zdarzenie mineralizacji w organizmie wielokomórkowym. Dzięki jednoczesnemu zastosowaniu mikroskopii optycznej i elektronowej możemy uzyskać wysoki poziom zrozumienia fizjologicznego i materiałowego procesu kalcyfikacji.

characterization-calcification-events-using-live-optical-electron

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Ten film przedstawia koncepcje związane z obrazowaniem wapnia i zawiera przykładowy protokół obrazowania poklatkowego robaków znajdujących się w formowanych studzienkach agarozowych.

Obrazowanie wapnia: metoda wizualizacji aktywności neuronalnej u żywych C. elegans

Zintegrowany zestaw technik obrazowania został zastosowany do określenia morfologii polipów i struktury tkanek u karaibskich koralowców Montastraeaannularis i M. faveolata. Fluorescencja, szeregowa powierzchnia blokowa i dwufotonowa konfokalna laserowa mikroskopia skaningowa pozwoliły zidentyfikować strukturę płatów, ściany polipów oraz oszacować gęstości i rozkłady chromatoforów i zooksantelli.

Multimodalne metody mikroskopii optycznej ujawniają morfologię i strukturę tkanek polipowych w karaibskich koralowcach budujących rafy

Obrazowanie zachowania i aktywności neuronalnej w długich skalach czasowych bez unieruchomienia zwierzęcia jest warunkiem wstępnym do zrozumienia zachowania. Obrazowanie komór mikroprzepływowych z agarozą (AMI) może być wykorzystywane do obrazowania aktywności i zachowania neuronów na wszystkich etapach życia Caenorhabditis elegans.

Mikrokomory agarozowe do długoterminowego obrazowania wapnia Caenorhabditis elegans

Ten protokół opisuje użycie genetycznie kodowanych reporterów Ca2+ do rejestrowania zmian w aktywności neuronalnej u zachowujących się robaków Caenorhabditis elegans.

Ratiometryczne obrazowanie wapnia poszczególnych neuronów w zachowaniu Caenorhabditis elegans

W tym artykule demonstrujemy obrazowanie na żywo poszczególnych robaków za pomocą niestandardowego urządzenia mikroprzepływowego. W urządzeniu wiele robaków jest indywidualnie zamkniętych w oddzielnych komorach, co pozwala na wielokrotny nadzór podłużny nad różnymi procesami biologicznymi.

Platforma mikroprzepływowa do obrazowania podłużnego u Caenorhabditis elegans

Tutaj szczegółowo wyjaśnione są protokoły wykonywania obrazowania mikrofokusowego tomografii komputerowej (mikroCT) trzech morskich bezkręgowców. W tym badaniu opisano takie etapy, jak utrwalanie próbki, barwienie, montaż, skanowanie, rekonstrukcja obrazu i analiza danych. Podano również sugestie, w jaki sposób protokół może być dostosowany do różnych próbek.

Obrazowanie rentgenowskie tomografii komputerowej z mikroogniskowaniem (microCT) Actinia equina (Cnidaria), Harmothoe sp. (Annelida) i Xenoturbella japonica (Xenacoelomorpha)

Ta metoda umożliwia połączenie optogenetyki i genetycznie kodowanych czujników wapnia do obrazowania wyjściowego poziomu cytozolowego wapnia i zmian w wywołanych przejściowych stanach wapnia w mięśniach ściany ciała organizmu modelowego C. elegans.

Obrazowanie wapnia in vivo w mięśniach ściany ciała C. elegans

Zgłoszono tutaj system do obrazowania wapnia u swobodnie zachowujących się Caenorhabditis elegans z dobrze kontrolowanymi, niezlokalizowanymi wibracjami. System ten pozwala naukowcom na wywoływanie niezlokalizowanych wibracji o dobrze kontrolowanych właściwościach przy przemieszczeniu w skali nano oraz na ilościowe określenie prądów wapniowych podczas reakcji C. elegans na wibracje.

Obrazowanie wapnia u swobodnie zachowujących się Caenorhabditis elegans z dobrze kontrolowanymi, niezlokalizowanymi wibracjami

Szybki fluorometr powtarzalności (FRRf) jest korzystną metodą pomiaru fotofizjologii II fotosystemu i produktywności pierwotnej. W tym miejscu opisujemy protokół pomiaru fotofizjologii PSII alg epizoicznych, Colacium sp. na zooplanktonie substratowym za pomocą FRRf typu kuwetowego.

Pomiar fotofizjologii dołączonego stadium Colacium sp. za pomocą fluorometru kuwetowego o dużej częstotliwości powtarzania

Choroby układu krążenia są główną przyczyną zgonów na całym świecie. Zwapnienie naczyń krwionośnych w znacznym stopniu przyczynia się do obciążenia chorobowością i śmiertelnością z przyczyn sercowo-naczyniowych. Protokół ten opisuje prostą metodę ilościowego oznaczania wytrącania wapnia za pośrednictwem komórek mięśni gładkich naczyń krwionośnych in vitro za pomocą obrazowania fluorescencyjnego.

Półautomatyczna i powtarzalna metoda biologiczna do ilościowego oznaczania depozycji wapnia in vitro

Tutaj prezentujemy protokoły i narzędzia do wizualizacji wapnia podczas zapłodnienia i wczesnej embriogenezy za pomocą genetycznie kodowanego reportera wapnia wyrażonego w linii zarodkowej modelowego nicienia C. elegans.

Wizualizacja in vivo stanów przejściowych wapnia podczas nawożenia i wczesnego rozwoju C. elegans

Poznaj metody mikroskopii optycznej i elektronowej do badania procesu biomineralizacji u rurowca morskiego Hydroides elegans. Techniki te pozwalają obserwować zwapnienie w czasie rzeczywistym.

Charakterystyka zwapnień przy użyciu technik mikroskopii optycznej i elektronowej na żywo w rurowcu morskim

Przeglądaj więcej filmów