Niestandardowa platforma mikroskopii wielofotonowej do obrazowania na żywo rogówki i spojówki myszy

Prezentowana tutaj jest wielofotonowa mikroskopijna platforma do obrazowania powierzchni oka myszy na żywo. Fluorescencyjna mysz transgeniczna umożliwia wizualizację jąder komórkowych, błon komórkowych, włókien nerwowych i naczyń włosowatych na powierzchni oka. Nieliniowe sygnały generujące drugą harmoniczną pochodzące ze struktur kolagenowych zapewniają obrazowanie bez znaczników dla architektur zrębowych.

Protokół ten wykorzystuje mikroskop wielofiltrowy do obrazowania na żywo całej struktury powierzchni oka myszy w podwójnym fluorescencyjnym transgenicznym modelu myszy. Połączenie niestandardowej wielofotonowej platformy mikroskopowej i podwójnie fluorescencyjnych myszy transgenicznych umożliwia wizualizację w czasie rzeczywistym i struktury powierzchni oka. Aby skonfigurować mikroskop wielofotonowy, wybierz obiektyw zanurzenie w wodzie 20X, 1.00 NA i ustaw laser Titanium Sapphire jako źródło wzbudzenia w mikroskopie pionowym.

Ustaw długość fali wyjściowej lasera na 880 nanometrów dla EGFP i 940 nanometrów dla tdTomato. Dołącz dwa lustra dichroiczne do separacji SHG EGFP i EGFP tdTomato i użyj filtrów pasmowych 434-17, 510-84 i 585-40 nanometrów, aby spektralnie oddzielić sygnały SHG EGFP i tdTomato. Aby ustawić uchwyt na oko, po potwierdzeniu braku reakcji na odruch pedałowania u znieczulonej myszy w wieku 8-12 tygodni, umieść mysz na podgrzewanym stoliku mikroskopu i włóż sondę monitorującą temperaturę.

Umieść mysz w niestandardowym stereotaktycznym uchwycie myszy i włóż nauszniki do zewnętrznego przewodu słuchowego. Użyj trzypunktowego mocowania, aby zabezpieczyć uchwyt głowy i nałóż 0,4% chlorowodorek oksybuprokainy i roztwór soli na powierzchnię oka. Zakryj końcówki pary kleszczy Dumonta numer pięć pętlą z rurki PE.

Po trzech minutach wykonaj ręczne cofnięcie powieki, aby potwierdzić wysunięcie gałki ocznej i ostrożnie umieść pętlę rurki z PE wzdłuż brzegu powieki, aby odsłonić powierzchnię oka. I użyj pokrętła uchwytu, aby ustabilizować gałkę oczną za pomocą kleszczy. Następnie pokryj powierzchnię rogówki żelem pod oczy o współczynniku załamania światła 1,338.

W przypadku obrazowania szeregowego powierzchni rogówki w technologii Z należy użyć źródła światła rtęciowego, aby zobrazować pole celownicze i otworzyć oprogramowanie mikroskopu. Wybierz odpowiedni mnożnik zdjęć i wzmocnienia cyfrowe do wizualizacji struktury komórkowej na powierzchni oka i ustaw pierwszy i ostatni slajd tak, aby umożliwić uzyskanie stosu obrazów. Ustaw rozdzielczość obrazu na 512 na 512 pikseli, a krok Z na jeden mikrometr.

Następnie kliknij start, aby zebrać obrazy szeregowe Z, uzyskując jeden obraz na żywo ze wzbudzeniem 880 nanometrów dla zbierania sygnału SHG EGFP i jeden obraz na żywo ze wzbudzeniem 940 nanometrów dla zbierania sygnału EGFP tdTomato w każdym obszarze. Przez cały obraz użyj zmotoryzowanego uchwytu stolika krokowego, aby obrócić gałkę oczną, aby umożliwić obrazowanie na całej powierzchni rogówki. Po pobraniu wszystkich obrazów załaduj obrazy szeregowe Z na Fidżi i wybierz wtyczkę filtra Median 3D.

Po usunięciu szumu tła wybierz pakiet filtrów maski wyostrzającej Fidżi, aby wyostrzyć obrazy i kliknij opcję Kontrast automatycznej jasności, aby automatycznie zoptymalizować jakość obrazów. Po przetworzeniu zapisz obrazy jako sekwencję obrazów szeregowych i wyeksportuj sekwencję obrazów do odpowiedniego programu do rekonstrukcji 3D. Na wszystkich obrazach z mikroskopii wielofotonowej należy przedstawić sygnały EGFP tdTomato i SHG odpowiednio w pseudo zielonym, czerwonym i cyjanowym kolorze przed przechwyceniem obrazów struktury 3D za pomocą migawki.

Mikroskopia wielofotonowa umożliwia wizualizację powierzchownych komórek skrzydeł i podstaw w nabłonku rogówki myszy transgenicznych o podwójnej fluorescencji. Pojedyncze komórki z warstwy podstawnej można odwzorować na warstwę powierzchowną, a także pojedyncze komórki powierzchowne w kształcie sześciokąta. Jak ujawnia cytoplazmatyczna ekspresja sygnału tdTomato, wewnątrzkomórkowy układ pęcherzykowy bogaty w białko błonowe, w tym aparat Golgiego i retikulum endoplazmatyczne, jest rozproszony w komórkach skrzydeł.

W obrębie zrębu kolagenowego kokosyty w kształcie gwiaździstym są zarysowane przez błonę skierowaną do fluorescencji EGFP u tych myszy. Koksynaty osadzone w zrębie collegen są luźniej rozmieszczone niż w komórkach śródbłonka. Ponadto cienkie rozgałęzione nerwy w zrębie rogówki można również uwidocznić za pomocą błony ukierunkowanej na sygnały tdTomato, a monowarstwy komórek śródbłonka rogówki wykazują stosunkowo jednorodny sześciokątny kształt połączony w wzór plastra miodu.

Nabłonek rąbka składa się z jednej do dwóch warstw komórek nabłonkowych. Dwufluorescencyjny transgeniczny szczep reporterowy umożliwia również obrazowanie naczyń włosowatych w obrębie spojówki, ułatwiając rekonstrukcję architektury 3D naczyń włosowatych zarysowujących śródbłonek naczyniowy. Stabilizacja gałki ocznej przy umiarkowanym nacisku bez obrażeń ma kluczowe znaczenie dla uzyskania dobrej jakości obrazów, ponieważ niewystarczający lub nadmierny nacisk może pogorszyć jakość obrazu.

Ta platforma obrazowania NVivo może być modyfikowana w celu wizualizacji struktur pod powierzchnią oka i może być stosowana do badań in situ różnych chorób okulistycznych.