Optymalizacja mocowania ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystych do przędz elektroprzędzonych z poli(ε-kaprolaktonu)

W tej procedurze rusztowania PCL przędzone elektrycznie są ustawiane na różne sposoby, aby określić optymalną konfigurację wysiewu komórek. Po pierwsze, sterylne rusztowania są umieszczane w różnych badanych konfiguracjach, w tym we wkładkach do kultur komórkowych, korytach i naczyniach obrotowych bioreaktorów. Po umieszczeniu na miejscu, znana liczba komórek jest wysiewana na rusztowanie, a następnie pozostawiana w spokoju przez 20 minut.

Następnie wszystkie próbki są ostrożnie przenoszone do inkubatora, ustawiane w temperaturze 5% dwutlenku węgla i 37 stopni Celsjusza i poddawane warunkom statycznym lub dynamicznym przed godzinami. Po tym czasie hodowli liczba komórek, które przyczepiły się do rusztowania, jest określana za pomocą testu DNA A w celu ilościowego określenia ilości komórek w pożywce rusztowania i frakcjach studzienek. Ostatecznie osiąga się to poprzez ilościowe określenie DNA obecnego na rusztowaniu, studni i w otaczających pożywkach w celu obejrzenia przyczepienia komórek do rusztowań Stosuje się skaningową mikroskopię elektronową lub SEM.

Po raz pierwszy wpadliśmy na pomysł tego badania, gdy wiedzieliśmy, że nasze rusztowania nie pokrywają całej podstawy płyty studziennej, co oznaczało, że istniała możliwość, że nie wszystkie komórki będą stykać się z rusztowaniem, a tym samym będą w stanie się przymocować. Na początek ustaw wkładki do hodowli komórkowych pod przepływem blaszki, otwierając sterylne sześciodołkowe wkładki do hodowli komórkowych i oddzielając krótsze pierścienie z zębami od szerszych ciał z pierścieniami. Następnie weź pierścień z zębami skierowanymi do góry i ułóż jedno z czterocentymetrowych rusztowań na środku pierścienia, upewniając się, że zachodzi na siebie po obu stronach.

Weź zaobrączkowany korpus i umieść go na pierścieniu zęba i rusztowaniu. Następnie popchnij w dół, upewniając się, że rusztowanie pozostaje na swoim miejscu i leży przez środek kultury komórkowej. Wstawiać. Umieścić wkładkę do hodowli komórkowej z rusztowaniem w studzience sześciodołkowej płytki o niskim wiązaniu i dodać 10 mililitrów pożywki hodowlanej do rusztowania.

Następnie umieść koryta z politetrafluoroetylenu na indywidualnych szalkach Petriego i dodaj do koryta 10 mililitrów pożywki hodowlanej. Za pomocą kleszczy włóż jedno z trzycentymetrowych rusztowań do koryta, upewniając się, że jego długość leży równolegle do dłuższej krawędzi koryta. Aby ustawić naczynie bioreaktora pod przepływem blaszki, należy dozować 10 mililitrów sterylnego roztworu soli fizjologicznej buforowanej fosforanami lub PBS przez główny port zbiornika bioreaktora.

Po 10 minutach usuń PBS i zastąp ośmioma mililitrami pożywki hodowlanej za pomocą kleszczy. Włóż jedno z trzycentymetrowych rusztowań do statku przez port główny. Następnie odejdź od głównego portu.

Po przeprowadzeniu liczenia ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystych zgodnie z opisem w protokole tekstowym, należy odessać pożywkę z probówki wirówkowej opuszczającej osad komórkowy i zastąpić ją obliczoną objętością pożywki. Resus zawiesić komórki i pożywkę, aby uzyskać równomierne wymieszanie. Za pomocą pipety P 200 Gilson powoli dozuj 200 mikrolitrów zawiesiny komórek do każdego rusztowania, przesuwając końcówkę pipety wzdłuż rusztowania i poniżej powierzchni płynu w podłożu.

Pozostaw w spokoju na 20 minut, w przeciwnym razie naczynia bioreaktora dozują 200 mikrolitrów zawiesiny ogniw przez główny port. Uzupełnij pozostałe dwa mililitry pożywki hodowlanej przez porty strzykawki, aby uzyskać całkowitą objętość 10 mililitrów. Następnie przenieś naczynia bioreaktora do bioreaktora z naczyniem obrotowym i ustaw na obrót.

Przy dziewięciu obr./min przenieść płytki dołkowe z wkładkami do hodowli komórkowych i korytkami do wytrząsarki i ustawić tak, aby obracały się z prędkością 30 obr./min w inkubatorze z 5% dwutlenkiem węgla o temperaturze 37 stopni Celsjusza lub w kulturze statycznej. Przenieść płytki studzienkowe z wkładkami i korytami do hodowli komórkowych na półkę inkubatora do hodowli komórkowych. Ustawiony na 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla.

Po czterech godzinach wyjąć próbki z inkubatora i umieścić je pod blaszką strumieniową. Następnie usuń frakcje pożywki ze wszystkich próbek i umieść je w oddzielnie oznakowanych probówkach wirówkowych. Po odwirowaniu przez pięć minut w temperaturze 241 razy G, usuń supinat przed dodaniem trzech mililitrów wiru buforowego do lizy, roztworu do rozbicia osadu komórkowego rusztowania przechowywane we wkładkach do hodowli komórkowych Najpierw uwolnij rusztowanie, przecinając rusztowanie blisko krawędzi wkładek za pomocą rusztowania.

Następnie za pomocą kleszczy usuń rusztowania i umieść w probówkach wirówkowych zawierających trzy mililitry buforu do lizy. Następnie dodaj trzy mililitry buforu do lizy do każdego pojemnika rusztowania i zeskrob powierzchnię. Usunąć bufor do lizy i umieścić w oddzielnie oznakowanych probówkach wirówkowych.

Wirować każdą probówkę wirówkową przez około jedną minutę, aby zapewnić wystarczające mieszanie i pobudzić lizę błony komórkowej. Na czarnej 96-dołkowej płytce dodaj 100 mikrolitrów buforu do lizy dla każdej frakcji próbki, a następnie w ciemności dodaj 100 mikrolitrów roztworu DNA komórki do wszystkich studzienek zawierających bufor do lizy i wymieszaj. Delikatnie włączyć studzienki z buforem do lizy niezawierającym roztworu DNA i DNA komórki, aby zapewnić negatywną i pozytywną kontrolę płytki studzienki.

Za pomocą czytnika płytek fluorescencyjnych zmierz absorbancję studzienek przy wzbudzeniu 485 nanometrów i emisji 520 nanometrów. Porównaj dane z krzywą wzorcową wygenerowaną na podstawie wzorców DNA zgodnie z instrukcjami producenta dotyczącymi wykonywania utrwalania SEM. Po czterech godzinach inkubacji usunąć wszystkie rusztowania z ich pojemników i umieścić w oddzielnych studzienkach nową płytkę sześciodołkową i przepływ blaszki.

Następnie umyj rusztowania dwukrotnie za pomocą PBS do każdego. Dobrze dodaj dwa mililitry 1,5% aldehydu glutarowego w PBS, aby zapewnić pełne pokrycie na rusztowaniu. Pozostaw płytkę na co najmniej 30 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza w celu utrwalenia celu.

Usunąć roztwór utrwalający i umyć rusztowania dwukrotnie PBS. Następnie przenieś rusztowania na nową płytę studzienną, aby je odwodnić za pomocą rosnących stężeń etanolu w wodzie destylowanej, zaczynając od 50% etanolu, następnie 70%, a następnie 90% dla każdego stężenia. Całkowicie zanurz rusztowania w roztworze i pozostaw na trzy minuty przed wyrzuceniem roztworu i powtórzeniem.

Po odwodnieniu rusztowań w 100% etanolu poprzez całkowite zanurzenie rusztowań w roztworze i pozostawienie na pięć minut, wylej roztwór i powtórz chemiczne suszenie rusztowań. Korzystanie z HMDS w dygestorium. Zanurz rusztowania w goglach HMDS i pozostaw na pięć minut przed wyjęciem gogli po jednokrotnym powtórzeniu.

Zdejmij gogle HMDS i poczekaj, aż rusztowania wyschną. Następnie zamontuj rusztowania na dostępnych na rynku klockach SEM, aby ułatwić przeglądanie w warstwie SEM, próbki ze złotą powłoką obserwacyjną przez dwie minuty, aby zapewnić cienkie i równomierne pokrycie. Na koniec umieść próbki w SEM i zwizualizuj rusztowania osadzone w komórce za pomocą wiązki elektronów o mocy pięciu kilogramów.

Wyniki podkreślają lokalizację komórek po czterech godzinach od wysiewu dla każdej badanej konfiguracji eksperymentalnej. Rysunek ten pokazuje procent komórek, które przyczepiły się do powierzchni rusztowania w tym czasie, w którym badano wszystkie konfiguracje wysiewu. Procent przyczepienia komórek jest stosunkowo niski, ale największe przyleganie komórek jest w przypadku rusztowań utrzymywanych we wkładkach do hodowli komórkowych i wytrząsanych z prędkością 30 obr./min.

Najniższe przestrzeganie zaleceń dotyczyło rusztowań utrzymywanych we wkładkach do hodowli komórkowych i utrzymywanych w warunkach statycznych. We frakcji pożywki obecna była duża liczba komórek, w szczególności w hodowli komórkowej. Wkładki utrzymywane w płytkach o niskim poziomie wiązania na poziomie 50% i naczynia obrotowe na poziomie 51%Rusztowania trzymane w korytach wykazywały zwiększoną liczbę komórek obecnych w samym zbiorniku.

48% w przypadku wytrząsarki korytowej i 50% w przypadku skanowania statycznego koryta. Elektromikroskopia pozwoliła na wizualną ocenę rusztowań zasianych w komórkach. Reprezentatywne obrazy uwypukliły ograniczoną obecność komórek na powierzchni włóknistej, niezależnie od konfiguracji wysiewu.

Jednak większa liczba komórek i aglomeratów komórkowych była obecna na rusztowaniach trzymanych we wkładkach do hodowli komórkowych i wstrząsanych w temperaturze 30 RP M. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, że wysiewanie znanej liczby komórek niekoniecznie równało się takiej liczbie komórek, które faktycznie przyczepiają się do rusztowania, szczególnie w przypadku rusztowań, które nie pokrywają całej podstawy dzikich płytek. W przypadku rusztowań takich jak te zaleca się, aby najpierw zoptymalizować różne konfiguracje wysiewu komórek, aby zmaksymalizować początkowe przyleganie komórek do rusztowania.