Name: Optymalizacja mocowania ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystych do przędz elektroprzędzonych z poli(ε-kaprolaktonu) (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-04-10T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 50 s
Description: Poznaj metody optymalizacji mocowania ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystych do przędz elektroprzędzonych z poli(ε-kaprolaktonu) w inżynierii tkankowej. Badanie porównuje warunki statyczne i dynamiczne.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Autorzy chcieliby podziękować i podziękować Radzie Badań Medycznych za sfinansowanie tych badań - kod grantu MRC-DPFS G1000788-98812.

1.Produkcja i sterylizacja rusztowań
<ol>
	<li>Rozpuścić PCL w 1,1,1,3,3,3–heksafluoroizopropanolu, aby uzyskać stężenie 10% w/v. Jak opisano w Bosworth i wsp.9, roztworu polimerowego należy elektrowirować (parametry: 20 kV, 1 ml/h, 20 cm) i zbierać wyrównane włókna na krawędzi obracającego się trzpienia (600 obr./min). Za pomocą skalpela usuń wstęgę zebranego włókna, a następnie pokrój na krótsze odcinki - 3 cm (w przypadku koryt i naczyń obrotowych) i 4 cm (w przypadku wkładek do hodowli komórkowych).</li>
	<li>Za pomocą cienkich kleszczyków zanurz poszczególne paski w wodzie destylowanej i usuń.</li>
	<li>Trzymając oba końce między kciukiem a palcem wskazującym; ręcznie przekręć pasek, aż będzie przypominał nić.</li>
	<li>Zanurz na krótko to nitkowate rusztowanie w wodzie destylowanej i umieść na czystej, niewłóknistej kartonie do wyschnięcia.</li>
	<li>Po wyschnięciu umieścić pojedynczo w czystych probówkach do mikrowirówek i dodać 1 ml etanolu o stężeniu 50% v/v w wodzie destylowanej. Zamknij pokrywki i pozostaw na 24 godziny. 
	Uwaga: Wykonaj następujące czynności przy przepływie laminarnym:</li>
	<li>Umieść probówki do mikrowirówek w komorze z przepływem laminarnym i odessaj roztwór o stężeniu 50% v/v. Zastąp 1 ml etanolu o stężeniu 70% v/v w wodzie destylowanej, zamknij pokrywki i pozostaw na 24 godziny.</li>
	<li>Powtórzyć dla 90% i 100% v/v etanolu w wodzie destylowanej (objętość 1 ml).</li>
	<li>Rusztowania należy umyć dwukrotnie roztworem soli fizjologicznej buforowanym fosforanem (PBS), 24 godziny na mycie (2 x 1 ml).</li>
	<li>Usunąć PBS i zastąpić 1 ml pożywki do hodowli komórkowych. Uwaga: Rusztowania są gotowe do użytku po 24 godzinach.</li>
</ol>
2 . Określanie powierzchni rusztowania i liczby komórek
<ol>
	<li>Za pomocą mikroskopu świetlnego i oprogramowania do obrazowania zmierz średnicę przędzy elektroprzędzonej wzdłuż jej długości, aby określić wartość średnią.</li>
	<li>Załóżmy, że przędza jest cylindrycznym prętem i przybliż pole powierzchni za pomocą:</li>
	<li>Gdzie A = pole powierzchni, r = promień, a h = długość 
	Uwaga: Powierzchnia została obliczona na 18 902 800 μm2. Ponadto należy zauważyć, że rzeczywista powierzchnia będzie większa niż to obliczenie, ponieważ przędza składa się z setek drobnych włókien, co zwiększy powierzchnię. W związku z tym większa liczba komórek powinna być w stanie przymocować się do rusztowania. Nie ma to jednak wpływu na bezpośrednie porównanie między grupami testowymi.</li>
	<li>Określ maksymalną liczbę komórek, które mogą przyłączyć się do odsłoniętej powierzchni rusztowania poprzez: 
	Uwaga: Za pomocą mikroskopu świetlnego i oprogramowania do obrazowania określono średnicę ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystych na 20 μm (przy założeniu, że komórki są okrągłe), więc w tym przypadku liczba komórek = 60 200.</li>
</ol>
3. Ustawienie rusztowania – wkładki do hodowli komórkowych (Rysunek 1A)
<ol>
	<li>Pod wpływem przepływu laminarnego otwórz sterylne 6-dołkowe wkładki do hodowli komórkowych i oddziel krótsze pierścienie z zębami od szerszych ciał z pierścieniami.</li>
	<li>Weź pierścień z zębami skierowanymi do góry. Ułóż jedno z 4-centymetrowych rusztowań na środku pierścienia, upewniając się, że zachodzi na siebie po obu stronach. Weź korpus z pierścieniem i umieść go na pierścieniu zębatym i rusztowaniu, a następnie popchnij w dół, upewniając się, że rusztowanie pozostaje na swoim miejscu i przechodzi przez środek wkładki do hodowli komórkowej.</li>
	<li>Umieść wkładkę do hodowli komórkowej z rusztowaniem w studzience 6-dołkowej płytki o niskim stopniu wiązania.</li>
	<li>Dodać 10 ml pożywki hodowlanej do rusztowania.</li>
</ol>
4. Ustawienie rusztowania – koryto (Rysunek 1B)
<ol>
	<li>Pod przepływem laminarnym umieścić koryta z poli(tetrafluoroetylenu) (PTFE) na indywidualnych szalkach Petriego i dodać do koryta 10 ml pożywki hodowlanej.</li>
	<li>Za pomocą kleszczy włóż jedno z 3 cm rusztowań do koryta, upewniając się, że jego długość leży równolegle do dłuższej krawędzi koryta.</li>
</ol>
5. Ustawienie rusztowania – zbiornik bioreaktora (Rysunek 1C)
<ol>
	<li>Przy przepływie laminarnym należy przelać 10 ml sterylnego PBS przez główny port zbiornika bioreaktora i pozostawić na 10 minut.</li>
	<li>Usunąć PBS i zastąpić go 8 ml pożywki hodowlanej.</li>
	<li>Za pomocą kleszczy włóż jedno z 3 cm rusztowań do naczynia przez port główny.</li>
	<li>Zamknij główny port.</li>
</ol>
6. Liczenie komórek
<ol>
	<li>Hodowla ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystych (hMSC) pochodzących ze szpiku kostnego zgodnie z protokołem producenta do pasażu 4 przed pobraniem.</li>
	<li>Odessać pożywkę z kolby o średnicy 75cm2 zawierającej hMSC pochodzące ze szpiku kostnego (pasaż 4, zlewność 80%).</li>
	<li>Przemyć komórki 10 ml sterylnego PBS i aspiratu.</li>
	<li>Dodać 3 ml trypsyny i inkubować kolbę w temperaturze 5% CO2 °C w temperaturze 37 °C, aż komórki oderwą się od powierzchni kolby.</li>
	<li>Dodać 7 ml pożywki hodowlanej w celu dezaktywacji enzymu i przenieść tę całkowitą objętość (10 ml) do probówki wirówkowej.</li>
	<li>Zawiesić zawiesinę komórek, kilkakrotnie pipetując w górę i w dół, aby uzyskać jednorodne rozproszenie komórek w pożywce i ograniczenie aglomeratów komórkowych (pipeta 10 ml).</li>
	<li>Usunąć 20 μl zawiesiny komórek i przenieść do hemocytometru.</li>
	<li>Umieść hemocytometr pod mikroskopem świetlnym i zobrazuj obiektyw x10.</li>
	<li>Skoncentruj się na liniach siatki i policz liczbę komórek w kwadratach 4 x 4 w każdym rogu siatki, które mieszczą się w kwadracie i tych, które przecinają prawą lub dolną linię granicy. Policz dla każdego zestawu 4 x 4 kwadraty (4 zliczenia na siatkę).</li>
	<li>Powtórzyć ponowne zawieszenie i zliczanie komórek trzy razy (kroki 6.6-6.9).</li>
	<li>Obliczyć średnią liczbę komórek i określić objętość pożywki wymaganą do ponownego zawieszenia komórek (stężenie komórek 60 200 w 200 μl). Na przykład określ średnią liczbę komórek na podstawie hemocytometru, a następnie określ ogólną średnią liczbę komórek z trzech oddzielnych zliczeń. Pomnóż to przez 1 x 104, aby uzyskać liczbę komórek na ml, a następnie pomnóż przez całkowitą objętość zawiesiny komórek, aby uzyskać całkowitą liczbę komórek. Użyj następującego równania, aby określić objętość pożywki wymaganą do ponownego zawieszenia:</li>
	<li>Odwirować zawiesinę komórkową o sile 241 x g przez 5 min.</li>
</ol>
7. Sadzenie komórek
<ol>
	<li>Zassać pożywkę z probówki wirówki, pozostawiając osad komórkowy i zastąpić obliczoną objętością pożywki.</li>
	<li>Ponownie zawieś ogniwa i pożywkę, aby uzyskać równomierne wymieszanie.</li>
	<li>Za pomocą pipety Gilson P200 powoli dozuj 200 μl zawiesiny komórek na każde rusztowanie, przesuwając końcówkę pipety wzdłuż rusztowania i poniżej powierzchni płynu podłoża. Pozostaw w spokoju na 20 minut.</li>
	<li>W przypadku zbiorników bioreaktorów należy dozować 200 μl zawiesiny komórek przez port główny. Uzupełnić pozostałe 2 ml pożywki hodowlanej przez porty strzykawki, aby uzyskać całkowitą objętość 10 ml.</li>
</ol>
8. Eksperymentalny start
<ol>
	<li>Przenieś naczynia bioreaktora do bioreaktora RCCS-4DQ i ustaw tak, aby obracały się z prędkością 9 obr./min.</li>
	<li>Przenieść płytki studzienkowe z wkładkami do hodowli komórkowych i korytkami na płytkę wytrząsającą i ustawić tak, aby obracały się z prędkością 30 obr./min.</li>
	<li>Płytki studzienkowe z wkładkami do hodowli komórkowych i korytami przenieść na półkę inkubatora komórkowego ustawionego w temperaturze 37 °C, 5% CO2 (hodowla statyczna).</li>
</ol>
9. Test DNA
<ol>
	<li>Przygotuj roztwory – bufor do lizy, 1x bufor TE, wzorce DNA i roztwór roboczy DNA komórki - zgodnie z instrukcją producenta.</li>
	<li>Po 4 godzinach wyjąć próbki z inkubatora i umieścić je pod przepływem laminarnym.</li>
	<li>Usunąć frakcje pożywki ze wszystkich próbek i umieścić w oddzielnie oznakowanych probówkach wirówkowych. Odwirować probówki 241 x g . Usunąć sklarowany osad i dodać 3 ml buforu do lizy. Ponownie zawiesić roztwór, aby rozbić osad komórkowy.</li>
	<li>Za pomocą kleszczy należy usunąć rusztowania i umieścić je w probówkach wirówkowych zawierających 3 ml buforu do lizy (w przypadku rusztowań w zbiornikach bioreaktora należy usunąć rusztowanie przed zasysaniem pożywki). W przypadku rusztowań utrzymywanych we wkładkach do hodowli komórkowych należy najpierw uwolnić rusztowanie, przecinając rusztowanie blisko krawędzi wkładki za pomocą skalpela.</li>
	<li>Dodać 3 ml buforu do lizy do każdego pojemnika rusztowania i zeskrobać powierzchnię (energicznie zamieszać do zbiorników bioreaktora). Usunąć bufor do lizy i umieścić w oddzielnie oznakowanych probówkach wirówkowych.</li>
	<li>Wirować każdą probówkę wirówkową przez około 1 minutę, aby zapewnić wystarczające wymieszanie komórek i buforu oraz pobudzić lizę błony komórkowej.</li>
	<li>Na czarną 96-dołkową płytkę dodać 100 μl buforu do lizy dla każdej frakcji próbki – rusztowania, pożywki i studzienki (duplikatu).</li>
	<li>W ciemności dodać 100 μl roztworu DNA komórkowego do wszystkich studzienek zawierających bufor do lizy i delikatnie wymieszać.</li>
	<li>Dołączyć studzienki z buforem do lizy niezawierającym roztworu DNA i DNA komórki, aby zapewnić negatywną i pozytywną kontrolę płytki studzienki.</li>
	<li>Za pomocą czytnika płytek fluorescencyjnych zmierz absorbancję studzienek przy wzbudzeniu 485 nm i emisji 520 nm.</li>
	<li>Porównaj dane z krzywą standardową wygenerowaną na podstawie wzorców DNA zgodnie z instrukcjami producenta.</li>
</ol>
10. Utrwalenie za pomocą skaningowego mikroskopu elektronowego (SEM)
<ol>
	<li>Wykonaj następujące czynności przy przepływie laminarnym: Po 4 godzinach usuń wszystkie rusztowania z ich pojemników i umieść je w nowej płytce 6-dołkowej (oddzielne studzienki).</li>
	<li>Umyj rusztowania dwukrotnie za pomocą PBS.</li>
	<li>Wykonaj następujące czynności na otwartej ławce: Do każdej studzienki dodaj 2 ml 1,5% v/v aldehydu glutarowego w PBS, aby zapewnić całkowite pokrycie rusztowania.</li>
	<li>Pozostawić płytkę na co najmniej 30 minut w temperaturze 4 °C w celu utrwalenia komórek.</li>
	<li>Usunąć roztwór utrwalający i umyć rusztowania dwukrotnie PBS.</li>
	<li>Odwodnić rusztowania zwiększając stężenie etanolu w wodzie destylowanej, zaczynając od 50% v/v, a następnie 70% v/v i 90% v/v. Dla każdego stężenia całkowicie zanurzyć rusztowania w roztworze (2 ml) i pozostawić na 3 minuty. Wyrzuć roztwór i powtórz.</li>
	<li>Odwodnić w 100% etanolu, całkowicie zanurzając rusztowania w roztworze (2 ml) i pozostawiając na 5 minut. Wyrzuć roztwór i powtórz czynność.</li>
	<li>Wysuszyć chemicznie rusztowania za pomocą heksametyldisilazanu (HMDS) w dygestorium. Zanurz rusztowania w HMDS (2 ml) i pozostaw na 5 minut. Wyjmij gogle HMDS i powtórz czynność.</li>
	<li>Zdejmij gogle HMDS i poczekaj, aż rusztowania wyschną. Rusztowania należy montować na dostępnych na rynku króćcach SEM (w tym przypadku króćce ze stali nierdzewnej z samoprzylepnymi zakładkami węglowymi).</li>
	<li>Aby ułatwić przeglądanie w SEM, należy pokryć próbki za pomocą napylarki złotej przez 2 minuty, aby zapewnić cienkie i równomierne pokrycie.</li>
	<li>Umieść próbki w SEM i zwizualizuj rusztowania wysiane z komórek za pomocą wiązki elektronów o napięciu 5 KeV.</li>
</ol>

<ol><li>Jauregui, H. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+adhesion+to+biomaterials.+The+role+of+several+extracellular+matrix+components+in+the+attachment+of+non-transformed+fibroblasts+and+parenchymal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22ASAIO+transactions%2FAmerican+Society+for+Artificial+Internal+Organs%22%5BJournal%5D)">Cell adhesion to biomaterials. The role of several extracellular matrix components in the attachment of non-transformed fibroblasts and parenchymal cells.</a> ASAIO transactions/American Society for Artificial Internal Organs. 33 (2), 66-74 (1986).</li>
<li>Puca, A., Russo, G., Giordano, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Properties+of+Mechano-Transduction+via+Simulated+Microgravity+and+its+Effects+on+Intracellular+Trafficking+of+VEGFR%27s%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">Properties of Mechano-Transduction via Simulated Microgravity and its Effects on Intracellular Trafficking of VEGFR's.</a> Oncotarget. 3 (4), 426(2012).</li>
<li>Vincent, L., Avancena, P., Cheng, J., Rafii, S., Rabbany, S. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simulated+microgravity+impairs+leukemic+cell+survival+through+altering+VEGFR-2%2FVEGF-A+signaling+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+biomedical+engineering%22%5BJournal%5D)">Simulated microgravity impairs leukemic cell survival through altering VEGFR-2/VEGF-A signaling pathway.</a> Annals of biomedical engineering. 33 (10), 1405-1410 (2005).</li>
<li>Rungarunlert, S., Klincumhom, N., Tharasanit, T., Techakumphu, M., Pirity, M. K., Dinnyes, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Slow+Turning+Lateral+Vessel+Bioreactor+Improves+Embryoid+Body+Formation+and+Cardiogenic+Differentiation+of+Mouse+Embryonic+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+Reprogramming%22%5BJournal%5D)">Slow Turning Lateral Vessel Bioreactor Improves Embryoid Body Formation and Cardiogenic Differentiation of Mouse Embryonic Stem Cells.</a> Cellular Reprogramming. 15 (5), 443-458 (2013).</li>
<li>Wu, X., Li, S. H., Lou, L. M., Chen, Z. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Effect+of+the+Microgravity+Rotating+Culture+System+on+the+Chondrogenic+Differentiation+of+Bone+Marrow+Mesenchymal+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+biotechnology%22%5BJournal%5D)">The Effect of the Microgravity Rotating Culture System on the Chondrogenic Differentiation of Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells.</a> Molecular biotechnology. 54 (2), 331-336 (2013).</li>
<li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rotating+Microgravity-Bioreactor+Cultivation+Enhances+the+Hepatic+Differentiation+of+Mouse+Embryonic+Stem+Cells+on+Biodegradable+Polymer+Scaffolds%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering+Part+A%22%5BJournal%5D)">Rotating Microgravity-Bioreactor Cultivation Enhances the Hepatic Differentiation of Mouse Embryonic Stem Cells on Biodegradable Polymer Scaffolds.</a> Tissue Engineering Part A. 18 (21-22), 2376-2385 (2012).</li>
<li>Lv, Q., Deng, M., Ulery, B. D., Nair, L. S., Laurencin, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nano-ceramic+Composite+Scaffolds+for+Bioreactor-based+Bone+Engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Orthopaedics+and+Related+Research%22%5BJournal%5D)">Nano-ceramic Composite Scaffolds for Bioreactor-based Bone Engineering.</a> Clinical Orthopaedics and Related Research. 471 (8), 2422-2433 (2013).</li>
<li>Hammond, T. G., Hammond, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+suspension+culture%3A+the+rotating-wall+vessel%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-Renal+Physiology%22%5BJournal%5D)">Optimized suspension culture: the rotating-wall vessel.</a> American Journal of Physiology-Renal Physiology. 281 (1), F12-F25 (2001).</li>
<li>Bosworth, L. A., Alam, N., Wong, J. K., Downes, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Investigation+of+2D+and+3D+electrospun+scaffolds+intended+for+tendon+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Materials+Science%3A+Materials+in+Medicine%22%5BJournal%5D)">Investigation of 2D and 3D electrospun scaffolds intended for tendon repair.</a> Journal of Materials Science: Materials in Medicine. 24 (6), 1605-1614 (2011).</li>
<li>Dormer, N. H., Qiu, Y., Lydick, A. M., Allen, N. D., Mohan, N., Berkland, C. J., Detamore, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osteogenic+differentiation+of+human+bone+marrow+stromal+cells+in+hydroxyapatite-loaded+microsphere-based+scaffolds.%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering+Part+A%22%5BJournal%5D)">Osteogenic differentiation of human bone marrow stromal cells in hydroxyapatite-loaded microsphere-based scaffolds.</a> Tissue Engineering Part A. 18 (7-8), 757-767 (2011).</li>
<li>Rayatpisheh, S., Heath, D. E., Shakouri, A., Rujitanaroj, P. O., Chew, S. Y., Chan-Park, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combining+cell+sheet+technology+and+electrospun+scaffolding+for+engineered+tubular%2C+aligned%2C+and+contractile+blood+vessels%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Combining cell sheet technology and electrospun scaffolding for engineered tubular, aligned, and contractile blood vessels.</a> Biomaterials. 35 (9), 2713-2719 (2014).</li>
<li>Wismer, N., Grad, S., Fortunato, G., Ferguson, S. J., Alini, M., Eglin, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biodegradable+electrospun+scaffolds+for+annulus+fibrosus+tissue+engineering%3A+effect+of+scaffold+structure+and+composition+on+annulus+fibrosus+cells+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering+Part+A%22%5BJournal%5D)">Biodegradable electrospun scaffolds for annulus fibrosus tissue engineering: effect of scaffold structure and composition on annulus fibrosus cells in vitro.</a> Tissue Engineering Part A. (3-4), 672-682 (2014).</li>
<li>Yavin, E., Yavin, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Attachment+and+culture+of+dissociated+cells+from+rat+embryo+cerebral+hemispheres+on+polylysine-coated+surface%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+cell+biology%22%5BJournal%5D)">Attachment and culture of dissociated cells from rat embryo cerebral hemispheres on polylysine-coated surface.</a> The Journal of cell biology. 62 (2), 540-546 (1974).</li>
<li>Chen, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Guan%2C+of+focal+adhesion+kinase+with+its+potential+substrate+phosphatidylinositol+3-kinase%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Guan, of focal adhesion kinase with its potential substrate phosphatidylinositol 3-kinase.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 91 (21), 10148-10152 (1994).</li>
<li>Grant, D. S., Tashiro, K. -I., Segui-Real, B., Yamada, Y., Martin, G. R., Kleinman, H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+different+laminin+domains+mediate+the+differentiation+of+human+endothelial+cells+into+capillary-like+structures+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Two different laminin domains mediate the differentiation of human endothelial cells into capillary-like structures in vitro.</a> Cell. 58 (5), 933-943 (1989).</li>
<li>Carrier, R. L., Papadaki, M., Rupnick, M., Schoen, F. J., Bursac, N., Langer, R., Freed, L. E., Vunkaj-Novakovic, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+tissue+engineering%3A+cell+seeding%2C+cultivation+parameters%2C+and+tissue+construct+characterization%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+and+bioengineering%22%5BJournal%5D)">Cardiac tissue engineering: cell seeding, cultivation parameters, and tissue construct characterization.</a> Biotechnology and bioengineering. 64 (5), 580-589 (1999).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Elektroprzędzione matryce z włókien wytwarzane z biopolimerów są regularnie używane do wspomagania przyłączania i proliferacji komórek w zastosowaniach związanych z biomateriałami i/lub inżynierią tkankową11,12. W takich przypadkach matryce są często cienkimi arkuszami włókien, które z łatwością pokrywają całą podstawę płytki studzienki do hodowli komórkowej, a tym samym są w pełnym kontakcie z wysiewanymi komórkami, co poprawia przyczepianie komórek. Jeśli jednak rusztowanie z biomateriału nie pokrywa w pełni podstawy płytki studzienki, istnieje duże prawdopodobieństwo, że duża część wysianych komórek nie pozostanie w kontakcie z rusztowaniem i ostatecznie nie będzie w stanie się przyczepić. W badaniu tym zbadano kilka różnych metod wysiewu komórek na rusztowaniach, które nie pokrywają podstawy płytki studziennej, w celu określenia zoptymalizowanej techniki, która może być zalecana dla przyszłych eksperymentów opartych na komórkach.
Zbadano pięć różnych konfiguracji (ryc. 1): rusztowania (przędza elektroprzędzona) utrzymywane za pomocą wkładek do hodowli komórkowych w płytkach studzienkowych o niskim poziomie wiązania i utrzymywane w warunkach statycznych lub wytrząsane z prędkością 30 obr./min; rusztowania umieszczone w wąskich korytach z PTFE i utrzymywane w stanie statycznym lub wstrząsanym z prędkością 30 obr./min; oraz rusztowania umieszczone w zbiornikach bioreaktora obracających się z prędkością 9 obr./min. Określenie liczby komórek, które przylgnęły do przędz elektroprzędzonych za pomocą testu DNA, wykazało niski procent przyłączenia dla wszystkich konfiguracji wysiewu (ryc. 2); Zostało to dodatkowo potwierdzone za pomocą skaningowych mikrofotografii elektronowych (SEM) (ryc. 3). Największe przywiązanie komórek – 30% lub ~ 18 060 komórek – zaobserwowano w przypadku przędz, które były trzymane we wkładkach do hodowli komórkowych i poddawane ciągłemu ruchowi. Co ciekawe, najniższe przyłączanie komórek (15%) osiągnięto w przypadku przędz utrzymywanych przez wkładki do hodowli komórkowych, ale utrzymywanych w warunkach statycznych, co sugerowałoby, że włączenie ruchu promieniowego ma pozytywny wpływ na utrzymanie komórek w kontakcie z rusztowaniem. Należy jednak zauważyć, że ciągłe krążenie przepływu pożywki może być odpowiedzialne za aglomeraty komórkowe obserwowane na obrazach SEM. Płyta wytrząsająca została ustawiona na najniższe ustawienie – 30 obr./min – co może być ograniczeniem dla tej konfiguracji. Stosowanie wolniejszego ruchu promieniowego może pomóc w zapobieganiu lub zmniejszaniu aglomeracji komórek, a także może poprawić przyczepianie komórek, ponieważ komórki będą odczuwać mniejszą siłę. Przyszłe eksperymenty powinny koncentrować się na optymalizacji idealnej prędkości wytrząsarki w celu lepszego mocowania komórek. Włączenie ruchu do przędzy utrzymywanej w korytach nie spowodowało podobnego trendu, przy czym oba scenariusze dały 18% przyłączenia (~ 10 836 komórek); Chociaż może to być spowodowane częściowym unoszeniem się rusztowań w korytach (obserwowane w przypadku koryt umieszczonych na płycie wytrząsarki), ponieważ nie były one zakotwiczone w podstawie. Częściowe unoszenie rusztowania zapobiegnie kontaktowi i przyleganiu komórek, które opadły na dno koryta, do materiału i przylegania. W przypadku tej konkretnej konfiguracji koryto umieszczono na szalce Petriego i dodano łączną objętość pożywki 10 ml. Małe wymiary koryta oznaczają, że większość pożywki znajduje się na szalce Petriego, a jeśli nastąpi jakikolwiek ruch, komórki mogą odpłynąć od koryta do szalki Petriego i pozostać całkowicie poza zasięgiem rusztowania. Aby przezwyciężyć te ograniczenia, dalsze eksperymenty powinny obejmować dodatkowy krok w protokole, w którym końce rusztowań są przypinane do podstawy koryt za pomocą sterylnych cienkich igieł, ponieważ powinno to zapobiec ich unoszeniu się i przemieszczaniu (szczególnie w przypadku rusztowań narażonych na ruch promieniowy), co ostatecznie powinno prowadzić do zwiększenia liczby komórek przyczepiających się do rusztowania. 16% komórek przyczepiło się do przędzy obecnej w naczyniach obrotowych. Pomimo tego, że jest to dobrze znana technika hodowli 3D, pojawiły się problemy z usuwaniem rusztowań z głównego portu statku, co mogło spowodować utratę luźno przymocowanych komórek. Statki, które można w pełni otworzyć, wyeliminowałyby ten problem; Są one dostępne do zakupu, ale są znacznie droższe niż naczynia jednorazowe użyte w tym badaniu.
Badanie to pokazuje obecne problemy z rusztowaniami wysiewającymi, które nie pokrywają całej podstawy standardowych płytek studzienkowych do hodowli komórkowych. Wysiew znanej liczby komórek powodował, że mniej niż jedna trzecia przyczepiała się do rusztowania, mimo że powierzchnia rusztowania pozwalała na przyleganie wszystkich komórek. Może to mieć szkodliwe konsekwencje w innych testach komórkowych, które mogą oceniać biokompatybilność i zachowanie materiału komórkowego / komórka-komórka oraz interakcje z rusztowaniem jako potencjalnym przyszłym wyrobem medycznym. Dalsze ograniczenia badania mogą obejmować 4-godzinny punkt czasowy – pomimo tego, że jest wystarczająco długi, aby zapewnić początkowe wysiewanie komórek (wykazano, że komórki mocno przyczepiają się do substratów w ciągu trzydziestu minut13,14,15), rozsądne może być zbadanie późniejszych punktów czasowych, pod warunkiem, że komórki nie proliferują w dłuższym przedziale czasu, ponieważ w przeciwnym razie wypaczyłoby to początkową liczbę komórek. Zmniejszenie objętości pożywki, w tym przypadku 10 ml, może również poprawić kontakt między komórkami a rusztowaniem i ostatecznie zwiększyć przyczepienie komórek. Przyszłe badania powinny również uwzględniać żywotność komórek, ponieważ proces wysiewu komórek może powodować uszkodzenie komórek i/lub śmierć komórek16. Testy DNA komórkowego nie rozróżniają komórek żywotnych i niezdolnych do życia, ponieważ taki test żywy/martwy, na przykład, podkreśliłby poziom żywotności.
To badanie podnosi świadomość na temat rzeczywistej liczby komórek, które przyczepiają się do rusztowania pomimo wysiewu znanej ilości. W przypadku badań, które opierają się na początkowej liczbie komórek, bardzo ważne jest, aby naukowcy dokładnie wiedzieli, ile z tej liczby faktycznie przylega do interesującego nas substratu.

Rusztowania są rutynowo opracowywane i badane pod kątem zastosowań w biomateriałach i inżynierii tkankowej. W związku z tym są one powszechnie obsiewane komórkami, a ich zachowanie in vitro jest charakteryzowane za pomocą testów, które określają na przykład proliferację komórek i liczbę komórek. W przypadku eksperymentów takich jak te konieczne jest, aby początkowa liczba komórek była znana, a badacze często podają stężenie wysiewu w kategoriach liczby komórek na ml lubcm2. Chociaż jest to dobra praktyka, zwłaszcza do celów zwiększania skali, nie uwzględnia ona rzeczywistej liczby komórek, które przylegają do powierzchni rusztowania (która jest również zależna od właściwości adhezyjnych powierzchni biomateriału1). Jest to szczególnie prawdziwe w przypadku rusztowań, które nie pokrywają całej podstawy płytki studzienki do hodowli komórkowej, ponieważ komórki mogą odpaść od konstruktu i, ze względu na często statyczny charakter eksperymentu, mogą nigdy nie zetknąć się ponownie z materiałem będącym przedmiotem zainteresowania. Przędze z włókien elektroprzędzonych są dobrym przykładem rusztowania, które nie zakrywa podstawy studni (rysunek 1A). W takim przypadku należy stosować płytki dołkowe o niskim stopniu wiązania, które nie zostały poddane obróbce powierzchniowej, aby zapobiec przyczepianiu się komórek do powierzchni płytki, a tym samym zniekształcaniu wyników wszelkich dobrze opartych testów.
Płytki dobrze używane są do wysiewania komórek na rusztowaniach, ale nie są jedyną dostępną metodą. Obrotowe systemy hodowli komórkowych, rodzaj bioreaktora opracowanego przez Wydział Nauk Przyrodniczych NASA pod koniec lat 80-tych, mogą być podobnie używane do sadzenia rusztowań w trójwymiarowym (3D) środowisku z symulowaną mikrograwitacją. Ten typ bioreaktora pozostaje popularnym wyborem wśród naukowców na całym świecie i został włączony do badań nad sygnalizacją komórkową2,3, komórkami macierzystymi4,5 i inżynierią tkankową6,7. Tym, co sprawia, że bioreaktor obrotowy jest lepszy od płytek studziennych, jest utrzymanie środowiska 3D, które pomaga zapobiegać dedyferencjacji zróżnicowanych komórek, jak to często ma miejsce w przypadku hodowli w konwencjonalnych warunkach 2D8.
Ten artykuł bada różne techniki wysiewu ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystych na przędzach z włókien poli(ε-kaprolaktonowych), jak to zostało wyprodukowane w Bosworth et al.,9, w celu maksymalizacji początkowej liczby komórek przyczepiających się do tych rusztowań w ciągu 4 godzin. W przypadku hodowli 2D przędze były bezpiecznie trzymane w płytkach studzienkowych lub wykonanych na zamówienie korytkach z poli(tetrafluoroetylenu) (PTFE) i utrzymywane w warunkach statycznych lub wstrząsane z prędkością 30 obr./min. W przypadku hodowli 3D przędze i komórki utrzymywano w naczyniach bioreaktora obracających się z prędkością 9 obr./min.

<table><tbody><tr><td>Woda destylowana</td><td>dostarczana we własnym zakresie</td><td>nie dotyczy</td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Merck</td><td>1117271000</td><td></td></tr><tr><td>Fosforanowy buforowany roztwór soli</td><td>Technologie życia</td><td>70013016</td><td></td></tr><tr><td>Ludzkie mezenchymalne komórki macierzyste</td><td>PromoCell GmbH</td><td>C-12974</td><td></td></tr><tr><td>Pożywka hodowlana MSC</td><td>PromoCell GmbH</td><td>C-28010B</td><td>Podgrzana do 37 oC przed użyciem</td></tr><tr><td>Mieszanka suplementów</td><td>PromoCell GmbH</td><td>C-39810</td><td>Dodaj do pożywki</td></tr><tr><td>Mieszanka antybiotykowo-przeciwmięśniowa</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5955</td><td>Dodaj do pożywki</td></tr><tr><td>Trypsyna (0,05%) EDTA (0,02%)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>59417C</td><td>Podgrzany do 37 &#176; C przed użyciem</td></tr><tr><td>Kolby do hodowli komórkowych (T75)</td><td>Becton Dickinson Ltd</td><td>353110</td><td></td></tr><tr><td>Płytki 6-dołkowe o niskim wiązaniu</td><td>Costar Corning</td><td>3471</td><td></td></tr><tr><td>6-dołkowe CellCrowns</td><td>Scaffdex</td><td>C00003S</td><td></td></tr><tr><td>szalka Petriego o głębokości 50 ml</td><td>Sterilin</td><td>124</td><td></td></tr><tr><td>Koryta PTFE</td> własnej <td>produkcji</td><td>nie dotyczy</td><td></td></tr><tr><td>Jednorazowe RCCS naczynia 10 ml</td><td>Bioreaktor Synthecon</td><td>D-410</td><td></td></tr><tr><td>4-naczyniowy obrotowy system hodowli komórek</td><td>Synthecon</td><td>RCCS-4DQ</td><td></td></tr><tr><td>Płytka wytrząsająca</td><td>Stuart</td><td>SSM1</td><td>Mini wytrząsarka orbitalna</td></tr><tr><td></td><td>Cyfrowy Bio</td><td>DHC-F01</td><td>Jednorazowa</td></tr><tr><td>probówka wirówkowa</td><td>C-Chip Deltalab</td><td>352096, 429901</td><td>15 ml i 50 ml</td></tr><tr><td>Wirówka</td><td>Hettich</td><td>Rotafix 32 A</td><td></td></tr><tr><td>Strzykawka 3 ml</td><td>Shield Medicare Ltd</td><td>3039820</td><td></td></tr><tr><td>Pipety</td><td>Sterilin</td><td>40305, 47310, 40125</td><td>5, 10 i 25 ml</td></tr><tr><td>Pipety Gilson</td><td>SLS</td><td>F144801, F144802, F123600, F123601, F123602</td><td>P2 - P1000</td></tr><tr><td>Końcówki do pipet</td><td>SLS</td><td>PIP7852, PIP7834, PIP7840</td><td></td></tr><tr><td>Mikroprobówka 1,5 ml</td><td>Eppendorf</td><td>30125.15</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>9002-93-1</td><td></td></tr><tr><td>Test PicoGreen</td><td>Invitrogen</td><td>P7589</td><td>Konfiguracja testu w ciemnej</td></tr><tr><td>czarnej 96-dołkowej płytce</td><td>Greiner Bio One</td><td>655086</td><td></td></tr><tr><td>Czytnik płytek fluorescencyjnych</td><td>BGM Labtech</td><td>FLUOstar Optima</td><td></td></tr><tr><td>Aldehyd glutarowy 25%</td><td>TAAB Laboratories</td><td>G002</td><td>Wykonane w stężeniu 1,5% v/v w PBS</td></tr><tr><td>Heksametyldisilazan (HMDS)</td><td>Sigma</td><td>999-97-3</td><td></td></tr><tr><td>Aluminiowe króćce (SEM)</td><td>Agar Scientific</td><td>G301</td><td></td></tr><tr><td>Zakładki węglowe (SEM)</td><td>Agar Scientific</td><td>G3347N</td><td></td></tr><tr><td>Napylarka do złota Skaningowy</td> mikroskop elektronowy <td>Edwards</td><td>S150B</td><td></td></tr><tr><td>(SEM)</td><td>Phenom World</td><td>Phenom Pro</td><td></td></tr></tbody></table>

optymalizacja mocowania ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystych do przędz elektroprzędzonych z poli(ε-kaprolaktonu)

Optimizing Attachment of Human Mesenchymal Stem Cells on Poly(&#949;-caprolactone) Electrospun Yarns

Badania nad biomateriałami i inżynierią tkankową często obejmują badania in vitro na komórkach, które wymagają wstępnej wiedzy na temat początkowej liczby komórek. Chociaż badacze często odwołują się do ich gęstości wysiewu, niekoniecznie wskazuje to na rzeczywistą liczbę komórek, które przylgnęły do danego materiału. Dotyczy to w szczególności materiałów lub rusztowań, które nie pokrywają podstawy standardowych płytek studzienkowych do hodowli komórkowych. W tym badaniu zbadano początkowe przyłączenie ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystych wysianych w znanej liczbie do przędzy poli(ε-kaprolaktonowej) przędzonej elektrolitycznie po 4 godzinach w hodowli. Przędze elektroprzędzone umieszczono w kilku różnych konfiguracjach, w tym w zbiornikach bioreaktora obracających się z prędkością 9 obr./min, wkładkach do hodowli komórkowych umieszczonych w płytkach dołków o niskiej zawartości wiązania oraz w korytkach z politetrafluoroetylenu (PTFE) umieszczonych na szalkach Petriego. Dwa ostatnie zostały poddane warunkom statycznym lub umieszczone na płycie wytrząsającej (30 rpm"). Po 4 godzinnej inkubacji w temperaturze 37 oC, 5% CO2 lokalizację wysianych komórek określono za pomocą testu DNA komórkowego. Rusztowania wyjęto z pojemników i umieszczono w buforze do lizy. W podobny sposób usunięto frakcję pożywki i odwirowano – supernatant wyrzucono, a osad rozdrobniono buforem do lizy. Bufor do lizy dodawano do każdego pojemnika lub studzienki i zeskrobywano, aby uwolnić wszelkie komórki, które mogą być obecne. Test DNA komórkowego określił procent komórek obecnych w rusztowaniu, pożywce i frakcjach studzienek. Przyczepienie komórek było niskie we wszystkich konfiguracjach eksperymentalnych, przy czym największe przywiązanie (30%) dotyczyło przędz utrzymywanych we wkładkach do hodowli komórkowych i poddanych ruchowi wstrząsającemu. Badanie to podnosi świadomość na temat rzeczywistej liczby komórek przyczepiających się do rusztowań, niezależnie od podanej gęstości wysiewu komórek.

Wyniki wskazują lokalizację komórek po 4 h od wysiewu dla każdego z badanych układów doświadczalnych. Rycina 2A przedstawia procent komórek, które przytwierdziły się do powierzchni rusztowania w tym czasie. Do przeliczenia zmierzonej zawartości DNA na liczbę komórek i tym samym ustalenia procentu komórek wykorzystano współczynnik konwersji 8,5 pg/cell10. Dla wszystkich badanych układów wysiewu procent przytwierdzania komórek jest stosunkowo niski, przy czym największa adhezja komórek (30%) wystąpiła dla rusztowań umieszczonych w insertach do hodowli komórkowej i wstrząsanych z prędkością 30 rpm (Insert Shaker). Najniższą adhezję (15%) odnotowano dla rusztowań umieszczonych w insertach do hodowli komórkowej i utrzymywanych w warunkach statycznych (Insert Static).
W frakcji medium obecna była duża liczba komórek (Rysunek 2B), co było szczególnie widoczne w przypadku wkładów do hodowli komórkowych umieszczonych w płytkach o niskim wiązaniu (Insert Static) oraz w naczyniach rotacyjnych, gdzie wartości te wynosiły odpowiednio 50% i 51%. Rusztowania umieszczone w korytkach wykazały zwiększoną liczbę komórek obecnych w samym uchwycie – 48% komórek dla Trough Shaker i 50% dla Trough Static.
Skaningowa mikroskopia elektronowa pozwoliła na wizualną ocenę rusztowań zasiedlonych komórkami (Rysunek 3). Reprezentatywne obrazy wykazały ograniczoną obecność komórek na włóknistej powierzchni, niezależnie od zastosowanego układu zasiewu. Jednak większa liczba komórek i aglomeratów komórkowych wystąpiła na rusztowaniach umieszczonych w insertach do hodowli komórkowej i wstrząsanych z prędkością 30 rpm (Insert Shaker).
<img alt="Układ hodowli komórkowej z przędzą elektroprzędzioną w płytce wielodołkowej, korytkiem z PTFE oraz naczyniem bioreaktora." src="/files/ftp_upload/52135/52135fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1. Układy eksperymentalne, w których przymocowano przędzę elektroprzędzioną: (A) wkładki do hodowli komórkowej i płytka wielodołkowa o niskim wiązaniu; (B) korytko z politetrafluoroetylenu (PTFE) i szalka Petriego; oraz (C) naczynie bioreaktora. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52135/52135fig1highres.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Wykresy wydajności wysiewu komórek; procent komórek na rusztowaniu, rozkład w zależności od układu, analiza diagramu." src="/files/ftp_upload/52135/52135fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2. Lokalizacja komórek 4 h po wysiewie na przędze z PCL otrzymane metodą elektroprzędzenia przy użyciu różnych układów wysiewu. (A) Przedstawia odsetek komórek, które przyczepiły się do rusztowania z PCL (średnia ± odchylenie standardowe); (B) przedstawia procentowy rozkład lokalizacji komórek w trzech frakcjach – medium, studzience i rusztowaniu (n = 4, dane przedstawione jako wartości średnie). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52135/52135fig2highres.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Mikrografie SEM, rusztowania tkankowe, acelularne, wytrząsarka, statyczne, naczynie, skala 100 µm, układ eksperymentalny." src="/files/ftp_upload/52135/52135fig3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 3">
Rycina 3. Reprezentatywne mikrografie z transmisyjnego mikroskopu elektronowego dla przęd {PCL} otrzymanych metodą elektroprzędzenia z ludzkimi mezenchymalnymi komórkami macierzystymi, 4 h po wstępnym zasiewie przy zastosowaniu różnych układów eksperymentalnych. (Wszystkie obrazy przy powiększeniu 1,000X, pasek skali = 130 µm.) <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52135/52135fig3highres.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>

Ten artykuł opisuje szereg ustawień do wysiewu ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystych na materiały, w tym przypadku przędze elektroprzędzone, które nie pokrywają podstawy standardowych płytek dołków hodowlanych, aby zmaksymalizować i określić ilościowo liczbę komórek, które początkowo się przyczepiają, w porównaniu do znanej gęstości wysiewu.

Optymalizacja mocowania ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystych do przędz elektroprzędzonych z poli(ε-kaprolaktonu)

Research into biomaterials and tissue engineering often includes cell-based in vitro investigations, which require initial knowledge of the starting cell ...

W tej procedurze rusztowania PCL przędzone elektrycznie są ustawiane na różne sposoby, aby określić optymalną konfigurację wysiewu komórek. Po pierwsze, sterylne rusztowania są umieszczane w różnych badanych konfiguracjach, w tym we wkładkach do kultur komórkowych, korytach i naczyniach obrotowych bioreaktorów. Po umieszczeniu na miejscu, znana liczba komórek jest wysiewana na rusztowanie, a następnie pozostawiana w spokoju przez 20 minut.Następnie wszystkie próbki są ostrożnie przenoszone do inkubatora, ustawiane w temperaturze 5% dwutlenku węgla i 37 stopni Celsjusza i poddawane warunkom statycznym lub dynamicznym przed godzinami. Po tym czasie hodowli liczba komórek, które przyczepiły się do rusztowania, jest określana za pomocą testu DNA A w celu ilościowego określenia ilości komórek w pożywce rusztowania i frakcjach studzienek. Ostatecznie osiąga się to poprzez ilościowe określenie DNA obecnego na rusztowaniu, studni i w otaczających pożywkach w celu obejrzenia przyczepienia komórek do rusztowań Stosuje się skaningową mikroskopię elektronową lub SEM.Po raz pierwszy wpadliśmy na pomysł tego badania, gdy wiedzieliśmy, że nasze rusztowania nie pokrywają całej podstawy płyty studziennej, co oznaczało, że istniała możliwość, że nie wszystkie komórki będą stykać się z rusztowaniem, a tym samym będą w stanie się przymocować. Na początek ustaw wkładki do hodowli komórkowych pod przepływem blaszki, otwierając sterylne sześciodołkowe wkładki do hodowli komórkowych i oddzielając krótsze pierścienie z zębami od szerszych ciał z pierścieniami. Następnie weź pierścień z zębami skierowanymi do góry i ułóż jedno z czterocentymetrowych rusztowań na środku pierścienia, upewniając się, że zachodzi na siebie po obu stronach.Weź zaobrączkowany korpus i umieść go na pierścieniu zęba i rusztowaniu. Następnie popchnij w dół, upewniając się, że rusztowanie pozostaje na swoim miejscu i leży przez środek kultury komórkowej. Wstawiać. Umieścić wkładkę do hodowli komórkowej z rusztowaniem w studzience sześciodołkowej płytki o niskim wiązaniu i dodać 10 mililitrów pożywki hodowlanej do rusztowania.Następnie umieść koryta z politetrafluoroetylenu na indywidualnych szalkach Petriego i dodaj do koryta 10 mililitrów pożywki hodowlanej. Za pomocą kleszczy włóż jedno z trzycentymetrowych rusztowań do koryta, upewniając się, że jego długość leży równolegle do dłuższej krawędzi koryta. Aby ustawić naczynie bioreaktora pod przepływem blaszki, należy dozować 10 mililitrów sterylnego roztworu soli fizjologicznej buforowanej fosforanami lub PBS przez główny port zbiornika bioreaktora.Po 10 minutach usuń PBS i zastąp ośmioma mililitrami pożywki hodowlanej za pomocą kleszczy. Włóż jedno z trzycentymetrowych rusztowań do statku przez port główny. Następnie odejdź od głównego portu.Po przeprowadzeniu liczenia ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystych zgodnie z opisem w protokole tekstowym, należy odessać pożywkę z probówki wirówkowej opuszczającej osad komórkowy i zastąpić ją obliczoną objętością pożywki. Resus zawiesić komórki i pożywkę, aby uzyskać równomierne wymieszanie. Za pomocą pipety P 200 Gilson powoli dozuj 200 mikrolitrów zawiesiny komórek do każdego rusztowania, przesuwając końcówkę pipety wzdłuż rusztowania i poniżej powierzchni płynu w podłożu.Pozostaw w spokoju na 20 minut, w przeciwnym razie naczynia bioreaktora dozują 200 mikrolitrów zawiesiny ogniw przez główny port. Uzupełnij pozostałe dwa mililitry pożywki hodowlanej przez porty strzykawki, aby uzyskać całkowitą objętość 10 mililitrów. Następnie przenieś naczynia bioreaktora do bioreaktora z naczyniem obrotowym i ustaw na obrót.Przy dziewięciu obr./min przenieść płytki dołkowe z wkładkami do hodowli komórkowych i korytkami do wytrząsarki i ustawić tak, aby obracały się z prędkością 30 obr./min w inkubatorze z 5% dwutlenkiem węgla o temperaturze 37 stopni Celsjusza lub w kulturze statycznej. Przenieść płytki studzienkowe z wkładkami i korytami do hodowli komórkowych na półkę inkubatora do hodowli komórkowych. Ustawiony na 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla.Po czterech godzinach wyjąć próbki z inkubatora i umieścić je pod blaszką strumieniową. Następnie usuń frakcje pożywki ze wszystkich próbek i umieść je w oddzielnie oznakowanych probówkach wirówkowych. Po odwirowaniu przez pięć minut w temperaturze 241 razy G, usuń supinat przed dodaniem trzech mililitrów wiru buforowego do lizy, roztworu do rozbicia osadu komórkowego rusztowania przechowywane we wkładkach do hodowli komórkowych Najpierw uwolnij rusztowanie, przecinając rusztowanie blisko krawędzi wkładek za pomocą rusztowania.Następnie za pomocą kleszczy usuń rusztowania i umieść w probówkach wirówkowych zawierających trzy mililitry buforu do lizy. Następnie dodaj trzy mililitry buforu do lizy do każdego pojemnika rusztowania i zeskrob powierzchnię. Usunąć bufor do lizy i umieścić w oddzielnie oznakowanych probówkach wirówkowych.Wirować każdą probówkę wirówkową przez około jedną minutę, aby zapewnić wystarczające mieszanie i pobudzić lizę błony komórkowej. Na czarnej 96-dołkowej płytce dodaj 100 mikrolitrów buforu do lizy dla każdej frakcji próbki, a następnie w ciemności dodaj 100 mikrolitrów roztworu DNA komórki do wszystkich studzienek zawierających bufor do lizy i wymieszaj. Delikatnie włączyć studzienki z buforem do lizy niezawierającym roztworu DNA i DNA komórki, aby zapewnić negatywną i pozytywną kontrolę płytki studzienki.Za pomocą czytnika płytek fluorescencyjnych zmierz absorbancję studzienek przy wzbudzeniu 485 nanometrów i emisji 520 nanometrów. Porównaj dane z krzywą wzorcową wygenerowaną na podstawie wzorców DNA zgodnie z instrukcjami producenta dotyczącymi wykonywania utrwalania SEM. Po czterech godzinach inkubacji usunąć wszystkie rusztowania z ich pojemników i umieścić w oddzielnych studzienkach nową płytkę sześciodołkową i przepływ blaszki.Następnie umyj rusztowania dwukrotnie za pomocą PBS do każdego. Dobrze dodaj dwa mililitry 1,5% aldehydu glutarowego w PBS, aby zapewnić pełne pokrycie na rusztowaniu. Pozostaw płytkę na co najmniej 30 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza w celu utrwalenia celu.Usunąć roztwór utrwalający i umyć rusztowania dwukrotnie PBS. Następnie przenieś rusztowania na nową płytę studzienną, aby je odwodnić za pomocą rosnących stężeń etanolu w wodzie destylowanej, zaczynając od 50% etanolu, następnie 70%, a następnie 90% dla każdego stężenia. Całkowicie zanurz rusztowania w roztworze i pozostaw na trzy minuty przed wyrzuceniem roztworu i powtórzeniem.Po odwodnieniu rusztowań w 100% etanolu poprzez całkowite zanurzenie rusztowań w roztworze i pozostawienie na pięć minut, wylej roztwór i powtórz chemiczne suszenie rusztowań. Korzystanie z HMDS w dygestorium. Zanurz rusztowania w goglach HMDS i pozostaw na pięć minut przed wyjęciem gogli po jednokrotnym powtórzeniu.Zdejmij gogle HMDS i poczekaj, aż rusztowania wyschną. Następnie zamontuj rusztowania na dostępnych na rynku klockach SEM, aby ułatwić przeglądanie w warstwie SEM, próbki ze złotą powłoką obserwacyjną przez dwie minuty, aby zapewnić cienkie i równomierne pokrycie. Na koniec umieść próbki w SEM i zwizualizuj rusztowania osadzone w komórce za pomocą wiązki elektronów o mocy pięciu kilogramów.Wyniki podkreślają lokalizację komórek po czterech godzinach od wysiewu dla każdej badanej konfiguracji eksperymentalnej. Rysunek ten pokazuje procent komórek, które przyczepiły się do powierzchni rusztowania w tym czasie, w którym badano wszystkie konfiguracje wysiewu. Procent przyczepienia komórek jest stosunkowo niski, ale największe przyleganie komórek jest w przypadku rusztowań utrzymywanych we wkładkach do hodowli komórkowych i wytrząsanych z prędkością 30 obr./min.Najniższe przestrzeganie zaleceń dotyczyło rusztowań utrzymywanych we wkładkach do hodowli komórkowych i utrzymywanych w warunkach statycznych. We frakcji pożywki obecna była duża liczba komórek, w szczególności w hodowli komórkowej. Wkładki utrzymywane w płytkach o niskim poziomie wiązania na poziomie 50% i naczynia obrotowe na poziomie 51%Rusztowania trzymane w korytach wykazywały zwiększoną liczbę komórek obecnych w samym zbiorniku.48% w przypadku wytrząsarki korytowej i 50% w przypadku skanowania statycznego koryta. Elektromikroskopia pozwoliła na wizualną ocenę rusztowań zasianych w komórkach. Reprezentatywne obrazy uwypukliły ograniczoną obecność komórek na powierzchni włóknistej, niezależnie od konfiguracji wysiewu.Jednak większa liczba komórek i aglomeratów komórkowych była obecna na rusztowaniach trzymanych we wkładkach do hodowli komórkowych i wstrząsanych w temperaturze 30 RP M. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, że wysiewanie znanej liczby komórek niekoniecznie równało się takiej liczbie komórek, które faktycznie przyczepiają się do rusztowania, szczególnie w przypadku rusztowań, które nie pokrywają całej podstawy dzikich płytek. W przypadku rusztowań takich jak te zaleca się, aby najpierw zoptymalizować różne konfiguracje wysiewu komórek, aby zmaksymalizować początkowe przyleganie komórek do rusztowania.

optimizing-attachment-human-mesenchymal-stem-cells-on-poly

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

W niniejszym artykule omówiono proces elektroprzędzenia polimerów do inżynierii tkankowej i hodowli komórkowych. W szczególności opisano elektroprzędzenie makromerów fotoreaktywnych z dodatkowymi możliwościami przetwarzania w postaci fotopatronowania oraz elektroprzędzenia wielopolimerowego.

Elektroprzędzenie włóknistych rusztowań polimerowych do inżynierii tkankowej i hodowli komórkowych

Celem niniejszego badania było odtworzenie naturalnej, trójwarstwowej architektury ściany tętnicy. W tym celu zastosowano elektroprzędzenie z wykorzystaniem dyszy 3-1 (wejście-wyjście) oraz mieszanin polikaprolaktonu, elastyny i kolagenu.

Trójwarstwowe elektroprzędzenie w celu naśladowania natywnej architektury tętnicy z wykorzystaniem polikaprolaktonu, elastyny i kolagenu: badanie wstępne

Uporządkowane włókna otrzymane metodą elektroprzędzenia kierują wzrostem neuronów in vitro i stanowią potencjalny komponent rusztowań do regeneracji nerwów. Opisujemy procedurę przygotowania podłoży z włókien elektroprzędzionych oraz bezsurowiczą hodowlę pierwotnych neuronów sensorycznych (DRG) i ruchowych szczura w stadium E15. Uwzględniono również wizualizację neuronów za pomocą immunocytochemii.

Hodowla pierwotnych neuronów ruchowych i sensorycznych w zdefiniowanych mediach na rusztowaniach z nanowłókien z poli-L-laktydu otrzymanych metodą elektroprzędzenia

Techniki elektroprzędzenia pozwalają na tworzenie różnorodnych rusztowań nanowłóknistych do inżynierii tkankowej lub innych zastosowań. Opisujemy tutaj procedurę optymalizacji parametrów roztworu i aparatury do elektroprzędzenia w celu uzyskania włókien o pożądanej morfologii i orientacji. Przedstawiono również typowe problemy oraz techniki rozwiązywania problemów.

Podstawy elektroprzędzenia: optymalizacja parametrów roztworu i aparatury

Rusztowania otrzymane metodą elektroprzędzenia mogą być poddawane obróbce po produkcji w celu zastosowania ich w inżynierii tkankowej. W niniejszym opracowaniu opisujemy metody przędzenia złożonych rusztowań (poprzez przędzenie sekwencyjne), tworzenia rusztowań o większej grubości (poprzez nakładanie wielu warstw z wykorzystaniem wyżarzania termicznego lub parowego), zapewniania sterylności (produkcja aseptyczna lub sterylizacja po produkcji) oraz uzyskiwania odpowiednich właściwości...

Obróbka potransprodukcyjna włókien otrzymywanych metodą elektroprzędzenia do inżynierii tkankowej

Zgłoszono syntezę i wytwarzanie długich włókien elektroprzędzionych obejmujących większy obszar złoża za pomocą nowo zaprojektowanego kolektora z nowego biodegradowalnego polimeru o nazwie poli(dodekanian glicerolu) (PGD). Włókna były w stanie wspierać wzrost komórek pochodzących z pluripotencjalnych komórek macierzystych myszy.

Elektroprzędzone rusztowania włókniste z poli(dodekanodianu glicerolu) do inżynierii tkanek nerwowych z embrionalnych komórek macierzystych myszy

Tutaj prezentujemy protokół wytwarzania elektroprzędzonych rusztowań z nanowłókien o stopniowanej organizacji włókien i badamy ich zastosowania w regulacji morfologii/orientacji komórek. Gradienty w odniesieniu do właściwości fizycznych i chemicznych rusztowań z nanowłókien oferują szeroką gamę zastosowań w dziedzinie biomedycyny.

Rusztowania z nanowłókien elektroprzędzonych z gradacją w organizacji włókien

Dwu- i trójwymiarowe superhydrofobowe materiały polimerowe są przygotowywane przez elektroprzędzenie lub elektronatryskiwanie biodegradowalnych polimerów zmieszanych z polimerem o niższej energii powierzchniowej o podobnym składzie.

Wytwarzanie superhydrofobowych materiałów polimerowych do zastosowań biomedycznych

Ten protokół służy jako kompleksowa wytyczna do wytwarzania rusztowań za pomocą elektroprzędzenia z polimerami stopionymi w trybie bezpośredniego zapisu. Systematycznie nakreślamy proces i definiujemy odpowiednie ustawienia parametrów w celu osiągnięcia docelowych architektur rusztowań.

Zapis elektroprzędzenia ze stopu trójwymiarowych rusztowań poli(ε-kaprolaktonu) z kontrolowanymi morfologiami do zastosowań w inżynierii tkankowej

Ten manuskrypt opisuje procedurę wytwarzania i charakteryzowania włókien elektroprzędzonych z poli(kwasu mlekowo-ko-glikolowego) modyfikowanych przez Griffithsin, które wykazują silne działanie adhezyjne i przeciwwirusowe przeciwko zakażeniu ludzkim wirusem niedoboru odporności typu 1 in vitro. Opisano metody stosowane do syntezy, modyfikacji powierzchni i charakterystyki wynikowej morfologii, koniugacji i desorpcji Griffithsiny z włókien modyfikowanych powierzchniowo.

Wytwarzanie i charakterystyka rusztowań z włókien modyfikowanych przez Griffithsin w celu zapobiegania infekcjom przenoszonym drogą płciową

Poznaj metody optymalizacji mocowania ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystych do przędz elektroprzędzonych z poli(ε-kaprolaktonu) w inżynierii tkankowej. Badanie porównuje warunki statyczne i dynamiczne.

Optymalizacja mocowania ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystych do przędz elektroprzędzonych z poli(ε-kaprolaktonu)

Przeglądaj więcej filmów