Samoorganizacja złożonych dwuwymiarowych kształtów z jednoniciowych płytek DNA

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest utworzenie złożonych nanostruktur DNA z jednoniciowymi płytkami. Osiąga się to poprzez mieszanie starannie zaprojektowanych syntetycznych nici DNA w pożądanym roztworze buforowym w celu utworzenia pożądanej nanostruktury DNA w drugim etapie. Próbka jest klęcząca, podczas której odbywa się samomontaż konstrukcji.

Następnie przeprowadza się natywną elektroforezę w żelu agros i obrazowanie mikroskopem sił atomowych w celu sprawdzenia pomyślnego powstania nanostruktur. Wyniki pokazują, że nanostruktury DNA samoorganizują się w oparciu o natywne agros, elektroforezę żelową i obrazowanie mikroskopem sił atomowych. Ogólnie rzecz biorąc, osoby nowe w tej metodzie będą miały trudności, ponieważ przygotowanie próbki do takiej samoorganizacji wydawało się skomplikowane: Przed rozpoczęciem tej procedury uzyskano nici składowe DNA o określonych sekwencjach rozpuszczonych w RNA, wolnej wodzie od producenta oligonukleotydów od producenta oligonukleotydów w Vbo 96 dołków, pipetować po jednym mikrolitrze z każdej z 362 studzienek dla 24 helis o 28 obrotów.

Prostokąt dodaj 100 mikromolów na pasmo do dwumililitrowej probówki. Następnie dodaj 138 mikrolitrów destylowanej wody dejonizowanej do probówki, aby uzyskać roztwór podstawowy. W stężeniu 200 nano molowców na pasmo.

Dodać 50 mikrolitrów 200-milimetrowego roztworu podstawowego ano. 10 mikrolitrów 10 x bufor do wyżarzania A i 40 mikrolitrów destylowanej wody dejonizowanej do 0,2 mililitra probówki PCR. Następnie należy pobrać próbkę przez 17 godzin w termocyklerze schładzającym od 90 do 25 stopni Celsjusza.

Po przygotowaniu natywnego żelu 2%agros wstępnie zabarwionego bezpiecznym SYBR, uruchom go na dwie godziny pod napięciem 100 woltów w lodowatej kąpieli wodnej. Po zakończeniu zobrazuj żel za pomocą skanera żelowego z odpowiednim filtrem dla bezpiecznego barwnika SYBR na niebieskim świetle Transluminator wytnij dominujące pasmo o podobnej ruchliwości do pasma 1 500 par zasad jednej drabiny DNA Kilobase za pomocą ostrej, czystej żyletki. Umieść żądane kawałki żelu w kolumnie wirowej, a następnie zmiażdż żel na drobne kawałki za pomocą mikroprobówki Pele, a następnie odwiruj w temperaturze 438 G przez trzy minuty w temperaturze czterech stopni Celsjusza.

Po odwirowaniu. Zmierz stężenie DNA za pomocą spektrofotometru ultrafioletowego o długości 260 nanometrów. W tym momencie odklej MICA przymocowany do metalowego krążka próbki za pomocą taśmy klejącej, aby uzyskać płaską powierzchnię i umieść krążek z próbką na stoliku do obrazowania mikroskopu.

Dodać 40 mikrolitrów jednego x i klęczącego buforu A, a następnie pięć mikrolitrów oczyszczonej próbki 24 HELOC o 28 obrotów prostokątem do świeżo rozszczepionej powierzchni Micah. Pozostaw mieszaninę na około dwie minuty, aby się uspokoiła. Zainstaluj chip wspornikowy z azotynu krzemu FM na uchwycie wspornikowym, zobrazuj próbkę w trybie gwintowania płynu, używając rozmiaru skanu dwóch mikrometrów 1024 linii dla rozdzielczości.

I szybkość skanowania od 0,5 do jednego herca dla wewnętrznego etykietowania dołączonego do trzech pierwszych 17 segmentów nukleotydowych do ośmiu wewnętrznych płytek i sześciu płytek granicznych prostokąta. Wymieszaj 28 pasm z uchwytami z pozostałymi pasmami składowymi 24 HELOC o 28 zwojów prostokąta, aby uzyskać roztwór podstawowy 200 NANOMOLÓW do etykietowania granic. Wymieszaj 14 pasm z uchwytami z pozostałymi pasmami składowymi 24 mórz piętowych o prostokąt o 28 zwojach, aby uzyskać roztwór podstawowy o stężeniu 200 nanomolów do etykietowania wewnętrznego.

Do oznaczania granic dodać 50 mikrolitrów 200 nanomolowego roztworu podstawowego. 60 mikrolitrów 100 mikromolowych nici anty biotyny modyfikowanych biotyną. 10 mikrolitrów 10 x bufor do wyżarzania A i 34 mikrolitry destylowanej wody dejonizowanej do probówki A.

Do etykietowania wewnętrznego dodać 50 mikrolitrów roztworu podstawowego o stężeniu 200 nanomolów. Trzy mikrolitry wewnętrznej nici modyfikowanej biotyną zapobiegającą uchwytowi o średnicy 100 mikromolów. 10 mikrolitrów 10 x bufor do wyżarzania A i 37 mikrolitrów destylowanej wody dejonizowanej do probówki PCR.

Następnie odważ 0,06 grama mrówczanu pisuaru w trzech mililitrach wody destylowanej. Aby przygotować 2% wodny roztwór plamy z mrówczanu pisuaru, przefiltruj roztwór plamy za pomocą filtra o pojemności 0,2 mikrolitra dołączonego do strzykawki. Dodaj pięć mikrolitrów pięciu normalnych wodorotlenków sodu do jednego mililitra przefiltrowanego roztworu barwienia.

Po krótkim wirowaniu roztworu odwirować przy żarzeniu 20 000 G. Rozładuj siatki pokryte węglem stroną powlekaną do góry, stosując następujące ustawienia: Po zakończeniu odpipetować 3,5 mikrolitra próbki na siatkę poddaną działaniu rozżarzenia. Po czterech minutach użyj kawałka bibuły filtracyjnej, aby odsączyć próbkę, doprowadzając bibułę filtracyjną do siatki z boku.

Następnie natychmiast dodaj 3,5 mikrolitra roztworu bejcy na siatkę. Po minucie odsiąć plamę i przytrzymać bibułę filtracyjną przy siatce przez jedną do dwóch minut. Przenieś siatkę do uchwytu na próbki TEM.

Obraz wykonany za pomocą A-J-E-O-L GM 1400, działającego przy napięciu 80 kilowoltów z powiększeniem w zakresie od 10 K do 80 K. Po zidentyfikowaniu kształtu wybierz pasma odpowiadające kształtowi na płótnie molekularnym. Zastąp odsłoniętą domenę segmentem poli T o długości od 10 do 11 nukleotydów lub dodaj osłonę krawędzi, która jest uzupełnieniem odsłoniętej domeny i zakończ ją segmentem poli T o długości od 10 do 11 nukleotydów. Aby zapobiec agregacji, utwórz bibliotekę nici dla 310-pikselowego płótna molekularnego, które zawiera gorset.

Zestaw jednej gwiazdki, zestaw dwugwiazdkowy, trzygwiazdkowy i zestaw czterogwiazdkowy, co daje w sumie 1 344 ochraniacze krawędzi. Po odwirowaniu 96-dołkowych płytek dla różnych zestawów, odpipetować jeden mikrolitr 206 pasm z zestawu rdzeniowego, zero z zestawu jedna gwiazdka zero z zestawu, dwie gwiazdy zero z zestawu, trzy gwiazdki i 24 nici z zestawu czterech gwiazdek do dwumililitrowej probówki wirówkowej. Dodaj 20 mikrolitrów destylowanej wody dejonizowanej do probówki, aby uzyskać 400 nanomolowy roztwór podstawowy nici DNA.

Następnie dodaj 50 mikrolitrów 400 nanomolowego roztworu podstawowego. 10 mikrolitrów 10 x bufor do wyżarzania B i 40 mikrolitrów destylowanej wody dejonizowanej do 0,2 mililitrowej probówki PCR i mieszaj mieszaninę w termocyklerze przez 17 godzin, jak opisano wcześniej. Po oczyszczeniu próbki i zmierzeniu obrazu stężenia DNA, próbka za pomocą FM w taki sam sposób, jak poprzednio, czwórka ostatecznie konstruuje prostokąty o różnych rozmiarach, po prostu zmieniając liczbę równoległych heoc i liczbę spiralnych zwojów.

Samoorganizacja jednoniciowych płytek da 24 HELOC na 28 zwojów, prostokątne sekwencje DNA dla różnych jednoniciowych płytek mogą być modyfikowane i optymalizowane, aby umożliwić podział paciorkowca i etykietowanie transformacji prostokąta w rurkę. Programowalny samomontaż jednopasmowych płytek w celu formowania rur i prostokątów o różnych rozmiarach oraz budowa dwuwymiarowych dowolnych kształtów przy użyciu projektu substytucji domen na płótnie molekularnym i projektu zabezpieczenia krawędzi zostały przetestowane jako rozwiązania do agregacji wzdłuż odsłoniętych domen o dowolnych kształtach. Obie konstrukcje mają porównywalną wydajność żelu i integralność strukturalną, ale konstrukcja osłony krawędzi jest bardziej opłacalna, ponieważ wymaga mniejszej liczby gatunków pomocniczych.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak tworzyć złożone nanostruktury DNA na podstawie jednoniciowych płytek.