Protokół transdukcji lentiwirusowej i dalszej analizy organoidów jelitowych

W tym protokole wideo krok po kroku wyjaśniamy transdukcję lentiwirusową w organoidach pierwotnego nabłonka jelitowego oraz przetwarzanie i dalszą analizę tych kultur za pomocą ilościowego RT-PCR, RNA-mikromacierzy i immunohistochemii.

Ogólnym celem tej procedury jest wygenerowanie stabilnie transdukowanych organoidów z pierwotnego nabłonka jelitowego myszy do dalszej analizy organoidów jelitowych. Osiąga się to poprzez pierwszą transekcję limfocytów T HEC 2 93 z wektorami pakowania lentiwirusa i plazmidem lentiwirusowym, kodującym gen będący przedmiotem zainteresowania w celu wytworzenia cząstek lentiwirusa o wysokim mianie. Drugim krokiem jest wstępne potraktowanie hodowanych organoidów jelitowych myszy wieloma czynnikami wzrostu w celu uzyskania torbielowatych krypt hiperproliferacyjnych.

Następnie transdukować organoidy lentiwirusem o wysokim mianie i inkubować transdukowane organoidy w matrigelu. Ostatnim krokiem jest osadzenie w pełni rozwiniętych transdukowanych organoidów w parafinie w celu dalszej analizy immunohistochemicznej. Ostatecznie transdukcja organoidów lentiwirusowych jest wykorzystywana do generowania zmian genetycznych w modelu nabłonka jelitowego in vitro, który jest wiarygodny, powtarzalny i szybki.

Główną przewagą tej techniki nad istniejącymi metodami, takimi jak linie komórek rakowych, jest to, że organoidy są niezmutowaną, przemieszczoną hierarchią komórek macierzystych. W polaryzacji komórkowej tekstu może różnicować się we wszystkie różne typy komórek nabłonka jelita cienkiego. Ponadto transdukowane organoidy mogą być wykorzystywane do badania określonych elementów genetycznych, przewyższając w ten sposób wykorzystanie myszy transgenicznych oraz aspekty związane z kosztami i szybkością.

Produkcja cząstek lentiwirusa to pięciodniowy protokół, który rozpoczyna się od rozszczepienia limfocytów T HEC 2 93 do płynności od 60 do 80% co w kolbie o powierzchni 162 centymetrów kwadratowych w pożywce do hodowli komórkowych. Następnego dnia inkubować komórki przez noc w wilgotnym inkubatorze do hodowli komórkowych w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Przygotować roztwór do transfekcji DNA i roztwór do transfekcji polietylenoaminy lub PEI zgodnie z opisem w tekście protokołu.

Dodać roztwór do transfekcji DNA do roztworu PEI, wirować lub odwrócić kilka razy i inkubować przez pięć minut. W temperaturze pokojowej. Wlej dwa mililitry roztworu DNA TRANSFECTION plus PEI na limfocyty T HEC 2 93 i inkubuj przez cztery godziny w temperaturze 37 stopni Celsjusza po czterech godzinach.

Odśwież pożywkę hodowlaną. Aby usunąć PEI, inkubuj komórki przez dwa dni w temperaturze 37 stopni Celsjusza czwartego dnia, zbierz supernatant w probówce o pojemności 50 mililitrów. Dodać nową pożywkę hodowlaną do komórek i umieścić kolbę z powrotem w inkubatorze, odwirować zebrany supernatant w temperaturze 500 G przez pięć minut.

Aby usunąć martwe komórki, użyj dużej strzykawki o pojemności 60 mililitrów, aby przepchnąć SUPERNAT przez filtr 0,45 mikrometra. Następnego dnia przechowuj przefiltrowany supernat przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Zebrać wirówkę i przefiltrować drugą partię supernatantu, jak pokazano dla pierwszej partii.

Zebrać dwie partie supernatantu w probówkach do ultra wirówek. Wirować przy 50 000 GS przez 90 minut. Po zakończeniu wirowania bardzo ostrożnie wyjmij kapsułki zawierające probówki ultra wirówkowe i włóż je do okapu z przepływem laminarnym.

Otwórz kapsułkę zawierającą probówkę wirówkową ultra i ostrożnie zdekantuj pożywkę za pomocą osadu po górnej stronie probówki. Ważne jest, aby pamiętać, po której stronie rurki uformowałyby się appellate, ponieważ granulki wirusa mogą być trudne do wizualizacji. Następnie użyj mikropipety, aby usunąć ostatnią część pożywki, uważając, aby nie poruszyć nieprzezroczystego brązowego granulatu, który jest widoczny z boku dna probówki ultrawirówkowej.

Ponownie zawiesić tę osadkę w 500 mikrolitrach pożywki do hodowli organoidów uzupełnionej inhibitorami kinazy nikotynamidowej i resusem poli mózgu. Zawiesina w tej pożywce jest ważna, ponieważ wirus wysokiego miana będzie używany bezpośrednio do transdukcji organoidów na dwa dni przed transdukcją. Podziel pełną studzienkę organoidów o powierzchni 0,95 centymetra kwadratowego do nowej studzienki z 48-dołkową płytką.

Zgodnie z wcześniej opublikowanym protokołem. Dążyć do uzyskania około 50 małych organoidów w hodowli organoidów. Pożywka uzupełniona inhibitorem kinazy syntazy glikogenu i nikotynamidem.

Aby uzyskać torbielowate krypty hiperproliferacyjne. Inkubować organoidy przez dwa dni w dniu transdukcji zebrać organoidy za pomocą mikropipety P 1000. Odpipetować żel matra i podłoże w górę iw dół, rozbijając w ten sposób mieszaninę.

Umieść mieszaninę w 15-mililitrowej tubce. Mieszaninę należy dalej rozbić za pomocą pipety PEs, w której dystalny otwór został zmniejszony przez stopienie Osadzaj organoidy, wirując w temperaturze 100 G przez pięć minut. Następnie usunąć supernatant w 500 mikrolitrach wstępnie podgrzanego x trypsyny i ponownie zawiesić organoidy, inkubować przez trzy minuty.

W łaźni wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza dezaktywuj trypsynę, dodając 3,5 mililitra wirówki do hodowli komórkowych przez pięć minut. Przy 500 Gs. Usuń super natan, aby pozostawić granulkę w około 20 mikrolitrach podłoża. Przenieś organoidy z tej ostatniej małej ilości pożywki do studzienki.

Na płytce 48-dołkowej. Dodać wcześniej przygotowany lentiwirus o wysokim mianie w pożywce transdukcyjnej do organoidów i ponownie zawiesić. Inkubować mieszaninę wirusa organoidowego przez godzinę w temperaturze 37 stopni Celsjusza w inkubatorze hodowli, aby umożliwić transdukcję po jednej godzinie, dodać jeden mililitr kultury organoidowej, pożywki do mieszaniny wirusa organoidowego, zawiesić ponownie i przenieść mieszaninę do wirówki z mikrowirówką w temperaturze 850 GS na pięć minut.

Aby osadzać organoidy, należy usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad. W 20 mikrolitrach lodowatego żelu matra umieść kropelkę na środku studzienki. W 48-dołkowej płytce i inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 15 minut.

Aby kropla zestaliła się po 15 minutach. Ostrożnie dodaj 250 mikrolitrów kultury organoidowej. Pożywka uzupełniona nikotynamidem i inhibitorami kinaz.

Rozgrzej aluminiowy blok w inkubatorze w temperaturze 70 stopni Celsjusza, aby utrzymać płynną parafinę. Usuń pożywkę z pojedynczej studzienki z w pełni rozwiniętymi organoidami, pozostawiając osadzone organoidy w stanie nienaruszonym i dodaj jeden mililitr 4% aldehydu Paraform w PBS bezpośrednio do studzienki. Zastąp aldehyd paraform jednym mililitrem PBS.

Zawiesić utrwalone organoidy w PBS i przenieść do szklanej fiolki. Pozwól organoidom opaść na dno na jedną minutę. Następnie odpipetować PBS i zastąpić go 70% etanolem, w którym rozpuszczono kilka kropelek roztworu eoiny.

Aby umożliwić wizualizację organoidów w całym procesie zatapiania, należy pozostawić organoidy w 70% etanolu w temperaturze pokojowej na 30 minut. Usunąć 70% etanol, ostrożnie pipetując. Organoidy można uwidocznić wzrokowo ze względu na różowawy kolor eoiny.

Zastąp roztwór do zatapiania 96% etanolem i pozostaw w ten sposób w temperaturze pokojowej na 30 minut. Następnie przepuść organoidy przez 70% etanol, 90% etanol, 96% etanol, 100% etanol, 100% etanol, ksylen i ksylen. Zdekantować ostatnie płukanie ksylenem i wlać parafinę do szklanej fiolki.

Natychmiast umieścić fiolkę w podgrzewanym aluminiowym bloku w temperaturze 70 stopni Celsjusza na 30 minut. Po 30 minutach zastąp parafinę nową czystą parafiną z podgrzewaną pianą, PE lub pipetą. Odlej parafinę i użyj rozgrzanego szkodnika lub pipety z dużym otworem, aby pipetować organoidy do formy bloku parafiny do warstwy ciekłej parafiny.

Ogrzej igłę preparacyjną za pomocą palnika Bunsena i manipuluj wszystkimi organoidami tak bardzo, jak to możliwe, w kierunku środka formy bloku parafiny. Gdy lokalizacja organoidów w formie jest zadowalająca, należy lekko schłodzić formę, aby zestalić warstwę parafiny. Zakończ blok, wylewając więcej parafiny na wierzch i dodaj standardową kasetę do zatapiania histologicznego.

W tym protokole organoidy nabłonka jelitowego zostały transdukowane lentiwirusami. Normalne organoidy rosną jako kosmkowe struktury krypty K z wieloma kryptami, które pochodzą ze wspólnej domeny kosmków. Po potraktowaniu tych organoidów inhibitorem GSK three B, CHIR 9 9 0 21, proliferacja wzrasta, a krypty stają się torbielowate po transdukcji organoidów.

Wykorzystując nadekspresję lentiwirusowego EGFP, organoidy wyrażają fluorescencyjne etapy wzmocnienia transdukcji EGFP, które można wykonać, gdy skuteczność transdukcji jest niska, takie jak inokulacja lub przedłużona inkubacja wirusa, nie są wymagane, ponieważ etapy te nie zwiększą i tak już wysokiej skuteczności. Następnie organoidy te są przetwarzane pod kątem technik RNA i immunohistochemii. Ten reprezentatywny obraz to wycinek organoidu jelitowego myszy, wybarwiony na obecność BRDU po inkubacji z BRDU przez godzinę przed utrwaleniem.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak transdukować organoidy z pierwotnego nabłonka jelitowego za pomocą cząstek lentiwirusowych lub retrowirusowych.