Name: Protokół transdukcji lentiwirusowej i dalszej analizy organoidów jelitowych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-04-20T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 58 s
Description: Poznaj metodę transdukcji lentiwirusowej organoidów jelitowych myszy z analizą RT-qPCR, mikromacierzą RNA i immunohistochemią. Technika umożliwia stabilną modyfikację genetyczną in vitro.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

J. Heijmans jest wspierany przez stypendium Holenderskiej Fundacji Walki z Rakiem (KFW). G.R. van den Brink jest wspierany przez fundusze Europejskiej Rady ds. Badań Naukowych w ramach Siódmego Programu Ramowego Wspólnoty Europejskiej (FP7/2007-2013)/umowy o grant Europejskiej Rady ds. Badań Naukowych numer 241344 oraz przez grant VIDI z Holenderskiej Organizacji Badań Naukowych (GvdB).

1. Przygotowanie polietylenininy (PEI) jako odczynnika do transfekcji
<ol>
	<li>Rozpuścić około 150 mg PEI w 100 mlH2O.</li>
	<li>Dostosuj roztwór do pH 7,4, dodając HCl, aż roztwór stanie się klarowny i mieszaj aż do całkowitego rozpuszczenia. Może to trwać od 10 do 60 minut i dodać wodę do końcowego stężenia 1 mg/ml.</li>
	<li>Po złożeniu klarownym przefiltrować roztwór PEI przez sterylny filtr 0,22 μm i przechowywać w zamrażarce o temperaturze -80 °C w porcjach 5 ml.</li>
</ol>
2. Produkcja cząsteczek lentiwirusowych
Dzień 1:
<ol>
	<li>Podziel HEK293T komórki do 60%-80% zbiegu w kolbie o średnicy 162cm2 lub dużej szalce Petriego w pożywce do hodowli linii komórkowych (DMEM uzupełniony 10% FCS, 1% penicyliny/streptomycyny i 2 mM suplementu glutaminy).</li>
</ol>
Dzień 2:
<ol start="2">
	<li>Przygotować roztwór do transfekcji DNA zawierający 45 μg całkowitego plazmidowego DNA, dodając do siebie lentiwirusowe wektory pakujące (7 μg pVSVg; 5 μg pRSV rev; 13 μg pMDL) i 20 μg plazmidu lentiwirusowego kodującego interesujący nas gen lub shRNA. Dostosować do objętości 1 ml za pomocą DMEM.</li>
	<li>Przygotować roztwór do transfekcji PEI, dodając 90 μl 1 mg/ml PEI do 930 μl DMEM i inkubować przez 5 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Dodaj roztwór do transfekcji DNA do roztworu PEI. Wirować lub odwracać kilka razy i inkubować przez 5 minut w temperaturze pokojowej w celu uzyskania roztworu do transfekcji DNA.</li>
	<li>Wlać 2 ml roztworu do transfekcji DNA na HEK293T komórki i inkubować przez 4 godziny w wilgotnym inkubatorze do hodowli komórkowych w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Po 4 godzinach odśwież pożywkę hodowlaną, aby usunąć PEI. Nie ma potrzeby mycia komórek przed dodaniem nowego podłoża. 
	UWAGA: PEI jest cytotoksyczny, a czas inkubacji dłuższy niż 4 godziny może spowodować uszkodzenie komórek HEK293T.</li>
</ol>
Dzień 4:
<ol start="7">
	<li>Zastąp supernatant nową pożywką hodowlaną. Przechowywać supernatant (zawierający wirusa); Zostanie to użyte w kroku 2.10.</li>
	<li>Umieścić supernatant w kolbie o pojemności 15 ml. Aby usunąć martwe komórki, wirować przez 5 minut przy 500 x g.</li>
	<li>Przepchnąć supernatant przez filtr 0,45 μm za pomocą dużej strzykawki o pojemności 60 ml. Przechowywać przez noc w temperaturze 4 °C.</li>
</ol>
Dzień 5:
<ol start="10">
	<li>Zebrać drugą partię supernatantu, odwirować i przefiltrować jak w krokach 2.8-2.9.</li>
	<li>Zebrać supernatanty z etapów 2.9 i 2.10 w probówkach ultrawirówek i odwirować przy 50 000 x g w ultrawirówce przez 90 minut.</li>
	<li>Bardzo ostrożnie wyjmij kapsułki zawierające probówki do ultrawirówek i włóż je do okapu z przepływem laminarnym, pamiętając o orientacji rurki wewnątrz wirówki.</li>
	<li>Ostrożnie otwórz kapsułkę z probówką ultrawirówkową i zdekantuj pożywkę w taki sposób, aby osad znajdował się na górnej stronie probówki. Ponieważ granulki wirusa mogą być trudne do wizualizacji, pamiętaj, po której stronie rurki utworzy się granulka. Weź mikropipetę i usuń ostatnią część pożywki, uważając, aby nie poruszyć nieprzezroczystego brązowego osadu, który jest widoczny z boku dna probówki do ultrawirówki.</li>
	<li>Zawiesić ten osad w 500 μl organoidowej pożywki hodowlanej uzupełnionej 10 mM nikotynamidu, 10 μM Chir99021, 10 μM Y27632 i 8 μg/ml polibrenu. Ponowne zawieszenie w tej pożywce jest ważne, ponieważ wirus wysokiego miana jest używany do bezpośredniej transdukcji organoidów.</li>
	<li>Fakultatywnie: zamrozić wirusa w tym podłożu w dwóch partiach po 250 μl w temperaturze -80 °C.</li>
</ol>
3. Transdukcja organoidów w lentiwirusach
Dzień 0:
<ol>
	<li>Na dwa dni przed transdukcją do nowego dołka należy rozłupać pełną studzienkę organoidów o średnicy 0,95 cm2, mając na celu uzyskanie około 50 małych organoidów. Podziel organoidy zgodnie z wcześniej opublikowanym protokołem1 (ryc. 3A, B).</li>
	<li>Uzupełnij pożywkę do hodowli organoidów 10 μM Chir99021 i 10 mM nikotynamidu, aby otrzymać torbielowate krypty hiperproliferacyjne (ryc. 3C). 
	UWAGA: Krypty torbielowate rozwijają się najlepiej, gdy świeżo rozszczepione organoidy są hodowane w obecności Chir99021.</li>
</ol>
Dzień 2:
<ol start="3">
	<li>Organoidy należy zebrać, pipetując w górę i w dół matrycę i pożywkę, rozbijając w ten sposób mieszaninę za pomocą mikropipety p1000. Umieść mieszaninę w probówce o pojemności 15 ml.</li>
	<li>Dalsze zakłócenia za pomocą pipety Pasteura, w której dystalny otwór został zmniejszony przez stopienie. Odwirować organoidy do osadzania przez 5 minut w temperaturze 100 x g. 
	UWAGA: W zależności od wielkości wirówki należy użyć innej prędkości wirówki. Konieczne jest znalezienie dokładnej prędkości, z jaką uszkodzone organoidy są oddzielane od mieszaniny.</li>
	<li>Usuń supernatant i dodaj 500 μl wstępnie podgrzanej 1x trypsyny (podobnie jak 0,25% trypsyny). Zawiesić organoidy w trypsynie i inkubować przez 3 minuty w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Dezaktywuj trypsynę, dodając 3,5 ml pożywki do hodowli linii komórkowych (DMEM uzupełniony 10% FCS, 1% penicyliny/streptomycyny i glutaminy). Wirować przez 5 minut przy 500 x g.</li>
	<li>Usunąć sklarowany osad i pozostawić osad w około 20 μl pożywki. Przenieść organoidy w tej ostatniej małej ilości pożywki do studzienki na 48-dołkowej płytce.</li>
	<li>Dodać lentiwirusa o wysokim mianie do pożywki transdukcyjnej, jak opisano w kroku 2.14, zawiesić ponownie i przejść do kroku 3.10. W przypadku niskiej skuteczności transdukcji można dodać krok 3.9. 
	UWAGA: Aby zapewnić wydajną transdukcję, zazwyczaj dodaje się jedną porcję 250 μl lentiwirusa o wysokim mianie do jednego dołka organoidów. Stanowi to 50% całego pozyskanego lentiwirusa z jednej produkcji, jak opisano w kroku 2 niniejszego protokołu.</li>
	<li>Opcjonalnie: w celu zwiększenia skuteczności transdukcji należy przeprowadzić spinokkulację, umieszczając 48-dołkową płytkę zawierającą organoidy we wstępnie ogrzanej wirówce w temperaturze 32 °C i obracając przy 600 x g przez 1 godzinę.</li>
	<li>Umieścić mieszaninę organoidów i wirusów w inkubatorze hodowlanym i inkubować przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C w inkubatorze hodowli, aby umożliwić transdukcję.</li>
	<li>Opcjonalnie: w celu dalszego zwiększenia skuteczności transdukcji należy inkubować organoidy przez dodatkowe 3 godziny w temperaturze 37 °C w inkubatorze hodowli.</li>
	<li>Dodać 1 ml pożywki do hodowli organoidów i ponownie zawiesić mieszaninę organoidów i wirusów, przenieść do probówki do mikrowirówki i odwirować w mikrowirówce przez 5 minut przy 850 x g w celu osadzenia organoidów.</li>
	<li>Usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad w 20 μl lodowatego matrygelu. Ponieważ materiał krzepnie, gdy staje się cieplejszy, należy używać końcówek do pipet, które są schładzane przez wielokrotne pipetowanie w górę i w dół lodowatego PBS.</li>
	<li>Umieścić kropelkę w środku studzienki na 48-dołkowej płytce i inkubować w inkubatorze kultur w temperaturze 37 °C przez 15 minut do zestalenia.</li>
	<li>Po 15 minutach ostrożnie dodać 250 μl pożywki do hodowli organoidów uzupełnionej 10 mM nikotynamidu, 10 μM Chir99021 i 10 μM Y27632. Małe uszkodzone fragmenty organoidów przekształcają się w małe organoidy torbielowate w ciągu 24 godzin.</li>
</ol>
Dzień 5:
<ol start="16">
	<li>Odświeżyć podłoże i uzupełnić wybranym antybiotykiem (dla puromycyny należy użyć 4 μg/ml).</li>
</ol>
Dzień 7:
<ol start="17">
	<li>Zastąp pożywkę standardową pożywką do hodowli organoidów, uzupełnioną antybiotykiem selekcyjnym. 
	UWAGA: Pączkowanie zostanie zakończone 2-3 tygodnie po wycofaniu Chir99021. Po selekcji organoidy mogą być hodowane bez antybiotyku selekcyjnego.</li>
</ol>
4. Przygotowanie organoidowego RNA do ilościowego RT-PCR lub mikromacierzy
<ol>
	<li>Do przygotowania RNA należy użyć zestawu komercyjnego zgodnie z protokołem producenta. Usunąć pożywkę z organoidów i dodać 350 μl buforu RLT, uzupełnionego β-merkaptoetanolem bezpośrednio na kopułę matrycy zawierającej organoidy. Zawiesić materiał w RLT, pipetując za pomocą mikropipety p1000.</li>
	<li>Wykonaj dalsze przygotowanie RNA zgodnie z protokołem producenta.</li>
	<li>Opcjonalnie: zwiększenie wydajności RNA poprzez amplifikację za pomocą systemu Ovation Pico WTA, wymagającego początkowego wprowadzenia 50 μg całkowitego RNA zgodnie z protokołem producenta.</li>
	<li>Opcjonalnie: w celu kontroli jakości przed mikromacierzą RNA, uruchom próbki na bioanalizatorze 2100 przy użyciu nano chipa całkowitego RNA eukariotów, dążąc do uzyskania liczby integralności RNA (RIN) 8,5 lub więcej (rysunek 5) zgodnie z protokołem producenta.</li>
</ol>
5. Przetwarzanie organoidów do zatapiania parafiny i immunohistochemii
<ol>
	<li>Przed rozpoczęciem osadzania organoidów należy wstępnie ogrzać aluminiowy blok z otworami pasującymi do szklanych probówek o średnicy 12 mm w inkubatorze w temperaturze 70 °C, aby utrzymać płynną parafinę.</li>
	<li>Weź pojedynczą studzienkę z w pełni rozwiniętymi organoidami i usuń podłoże, pozostawiając osadzone organoidy nienaruszone.</li>
	<li>Dodać 1 ml 4% paraformaldehydu z PBS bezpośrednio do studzienki i utrwalić w temperaturze 4 °C w dowolnym miejscu od 1 godziny do nocy.</li>
	<li>Zastąp paraformaldehyd 1 ml lodowatego PBS. 
	Fakultatywnie: po tym etapie organoidy należy przechowywać w PBS do 1 tygodnia w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Zawiesić utrwalone organoidy w 1 ml PBS i umieścić w szklanej fiolce.</li>
	<li>Pozwól organoidom opaść na dno na 1 minutę, zdekantuj PBS i zastąp 70% etanolem, w którym rozpuszczono kilka kropelek roztworu eozyny, aby umożliwić wizualizację organoidów podczas całego procesu osadzania.</li>
	<li>Pozostawić organoidy w 70% etanolu w temperaturze pokojowej. Po 30 minutach usuń 70% etanolu, ostrożnie dekantując, będąc w stanie uwidocznić organoidy na oko ze względu na lekki różowawy kolor eozyny. Zastąp roztwór do zatapiania 96% etanolem.</li>
	<li>Powtórz krok 5.7, za każdym razem zastępując roztwór do osadzania następnym. Następnie przepuścić organoidy przez następujące roztwory: 70% etanol, 90% etanol, 96% etanol, 100% etanol, 100% etanol, ksylen, ksylen.</li>
	<li>Zdekantować ostatnie płukanie ksylenem i wlać parafinę do probówki. Natychmiast umieścić probówkę w podgrzanym bloku aluminiowym w temperaturze 70 °C na 30 minut i zastąpić parafinę nową, czystą parafiną.</li>
	<li>Odlać parafinę i odpipetować organoidy do formy bloku parafiny za pomocą wstępnie podgrzanej pipety Pasteura z dużym otworem. Utrzymuj pipetę Pasteura w cieple za pomocą palnika Bunsena. Umieść wszystkie organoidy w formie bloku parafiny w małej warstwie płynnej parafiny.</li>
	<li>O ile to możliwe, staraj się manipulować wszystkimi organoidami w kierunku środka formy bloku parafiny za pomocą rozgrzanej igły preparcyjnej. Utrzymuj igłę preparacyjną w cieple za pomocą palnika Bunsena.</li>
	<li>Gdy lokalizacja organoidów w formie jest zadowalająca, należy lekko schłodzić pleśń, aby zestalić warstwę parafiny.</li>
	<li>Zakończ blok, wylewając więcej parafiny na wierzch i dodaj standardową kasetę do zatapiania histologicznego.</li>
</ol>

<ol><li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+Lgr5+stem+cells+build+crypt-villus+structures+in+vitro+without+a+mesenchymal+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche.</a> Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).</li>
<li>Al-Nafussi, A. I., Wright, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+epidermal+growth+factor+%28EGF%29+on+cell+proliferation+of+the+gastrointestinal+mucosa+in+rodents%5BTitle%5D)+AND+%22Virchows+Archiv.+B%2C+Cell+Pathology+Including+Molecular+Pathology%22%5BJournal%5D)">The effect of epidermal growth factor (EGF) on cell proliferation of the gastrointestinal mucosa in rodents.</a> Virchows Archiv. B, Cell Pathology Including Molecular Pathology. 40 (1), 63-69 (1982).</li>
<li>Haramis, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((De+novo+crypt+formation+and+juvenile+polyposis+on+BMP+inhibition+in+mouse+intestine%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">De novo crypt formation and juvenile polyposis on BMP inhibition in mouse intestine.</a> Science. 303 (5664), 1684-1686 (2004).</li>
<li>Zhao, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((R-spondin1%2C+a+novel+intestinotrophic+mitogen%2C+ameliorates+experimental+colitis+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">R-spondin1, a novel intestinotrophic mitogen, ameliorates experimental colitis in mice.</a> Gastroenterology. 132 (4), 1331-1343 (2007).</li>
<li>Schwank, G., Andersson-Rolf, A., Koo, B. K., Sasaki, N., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+BAC+transgenic+epithelial+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Generation of BAC transgenic epithelial organoids.</a> PLoS One. 8 (10), e76871(2013).</li>
<li>Koo, B. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controlled+gene+expression+in+primary+Lgr5+organoid+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Controlled gene expression in primary Lgr5 organoid cultures.</a> Nature Methods. 9 (1), 81-83 (2012).</li>
<li>Heijmans, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ER+stress+causes+rapid+loss+of+intestinal+epithelial+stemness+through+activation+of+the+unfolded+protein+response%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">ER stress causes rapid loss of intestinal epithelial stemness through activation of the unfolded protein response.</a> Cell Rep. 3 (4), 1128-1139 (2013).</li>
<li>Roe, T., Reynolds, T. C., Yu, G., Brown, P. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integration+of+murine+leukemia+virus+DNA+depends+on+mitosis%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">Integration of murine leukemia virus DNA depends on mitosis.</a> The EMBO Journal. 12 (5), 2099-2108 (1993).</li>
<li>Lau, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lgr5+homologues+associate+with+Wnt+receptors+and+mediate+R-spondin+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Lgr5 homologues associate with Wnt receptors and mediate R-spondin signalling.</a> Nature. 476 (7360), 293-297 (2011).</li>
<li>Bahnson, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Centrifugal+enhancement+of+retroviral+mediated+gene+transfer%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+Of+Virological+Methods%22%5BJournal%5D)">Centrifugal enhancement of retroviral mediated gene transfer.</a> Journal Of Virological Methods. 54 (2-3), 131-143 (1995).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Obecny protokół wideo opisuje transdukcję lentiwirusową organoidów z pierwotnego nabłonka jelitowego i dalszą analizę tych organoidów przy użyciu ilościowych technik RNA i immunohistochemii.
Transdukcja lentiwirusowa jest często wykonywana w przylegających lub pływających komórkach na płytkach hodowlanych. Ponieważ trójwymiarowa struktura organoidów sprawia, że są one trudne do przeniknięcia przez cząsteczki wirusa, stosuje się szereg metod zwiększających skuteczność. Wstępna obróbka organoidó...

Nabłonek jelitowy jest jedną z najszybciej rozprzestrzeniających się tkanek ciała, co spowodowało, że wzbudził szerokie zainteresowanie wśród badań nad rakiem i komórkami macierzystymi. W 2009 r. opublikowano technikę generowania długotrwałych kultur krypt jelita cienkiego w matrigelu, zachowując trójwymiarową strukturę1. Struktury te, zwane organoidami jelitowymi, mogą być hodowane przy użyciu standardowych technik, z otaczającym podłożem uzupełnionym wieloma zdefiniowanymi czynnikami wzrostu, w tym noggin inhibitora szlaku sygnałowego Bmp (Nog), wzmacniaczem szlaku sygnałowego Wnt rspondyną 1 (Rspo1) i naskórkowym czynnikiem wzrostu (Egf), które zwiększają proliferację jelit2-4.
Organoidy przewyższają tradycyjne linie komórek rakowych pod tym względem, że nie są zmutowane, zachowały hierarchię komórek macierzystych, wykazują nienaruszoną polaryzację komórkową i wykazują różnicowanie do wszystkich linii komórkowych znajdujących się w powstającym nabłonku jelita cienkiego. Ponieważ mogą być transdukowane w celu przenoszenia transgenów lub konstruktów interferencyjnych RNA5, są one wykorzystywane do badania określonych elementów genetycznych, przewyższając eksperymenty z wykorzystaniem myszy transgenicznych pod względem kosztów i szybkości. Ekspresję transgeniczną w organoidach można przeprowadzić przy użyciu mysich wektorów retrowirusowych lub lentiwirusowych6,7. Ze względu na ograniczenia mysich retrowirusów, zdolnych do transdukcji wyłącznie komórek mitotycznych8, transdukcja lentiwirusowa jest częściej stosowana w przypadku komórek trudnych do zakażenia, takich jak organoidy.
Transdukowane wirusowo i stabilnie wyrażające organoidy transgeniczne mogą być używane do wielu dalszych analiz, w tym ilościowych analiz RNA i immunohistochemii. Podsumowując, hodowla organoidów z pierwotnych komórek nabłonka jelitowego przekształciła się w rutynową technikę, którą można łatwo wdrożyć bez szczególnych wymagań laboratoryjnych i stała się nowym standardem w hodowli komórkowej w badaniach nad nabłonkiem jelitowym.
Techniki transdukcji wirusa i późniejszej analizy w organoidach są żmudne do wykonania i aby wspomóc eksperymenty organoidowe, stworzyliśmy ten protokół wideo, pokazujący metody transdukcji lentiwirusowej hodowanych organoidów. Dodatkowo pokazujemy, w jaki sposób prawidłowe przetwarzanie organoidów może zwiększyć wydajność, a tym samym poprawić wydajność dalszej analizy przy użyciu technik RNA lub immunohistochemii. W protokole wykorzystano wyłącznie organoidy pochodzące z krypt jelita cienkiego, chociaż opisane techniki mogą być również stosowane do organoidów okrężnicy.

<table><tbody><tr><td>Polietylenomina</td><td>Polysciences</td><td>23966-2</td><td></td></tr><tr><td>DMEM medium</td><td>Lonza</td><td>BE12-614F</td><td></td></tr><tr><td>Surowica cielęca płodu</td><td>Lonza</td><td>DE14-801F</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina-streptomycyna</td><td>Invitrogen</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Glutamina</td><td>Invitrogen</td><td>25030-024</td><td></td></tr><tr><td>matrigel</td><td>BD</td><td>BD 356231</td><td></td></tr><tr><td>Zaawansowany DMEM-F12</td><td>Gibco</td><td>12634-010</td><td></td></tr><tr><td>N2</td><td>Invitrogen</td><td>17502-048</td><td></td></tr><tr><td>B27</td><td>Invitrogen</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>N-acetylocysteina</td><td>Mysz Sigma</td><td>A9165-1G</td><td></td></tr><tr><td>Egf</td><td>Invitrogen</td><td>PMG8045</td><td></td></tr><tr><td>Hepes 1 M</td><td>Invitrogen</td><td>15630-056</td><td></td></tr><tr><td>glutamax 100x</td><td>Invitrogen</td><td>35050-038</td><td></td></tr><tr><td>Chir 99021</td><td>Axon</td><td>1386</td><td></td></tr><tr><td>Y27632&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>Y0503-5MG</td><td></td></tr><tr><td>polibren</td><td>Sigma</td><td>107689</td><td></td></tr><tr><td>nikotynamid</td><td>Sigma</td><td>N0636</td><td></td></tr><tr><td>Trypsyna</td><td>Lonza</td><td>BE02-007E</td><td></td></tr><tr><td>puromycyna</td><td>Sigma</td><td>P 7255</td><td></td></tr><tr><td>Rneasy mini zestaw</td><td>Qiagen</td><td>74106</td><td></td></tr><tr><td>&#946;-merkaptoetanol</td><td>Merck</td><td>8,057,400,250</td><td></td></tr><tr><td>Ovation Pico WTA system</td><td>NuGen</td><td>3300-12</td><td></td></tr><tr><td>paraformaldehyd</td><td>Sigma</td><td>252549-1L</td><td></td></tr><tr><td>szklana fiolka stożkowa 12&nbsp; mm x 75&nbsp; mm 5&nbsp; ml</td><td>VWR</td><td>LSUKM12</td><td></td></tr><tr><td>Eozyna Żółtawy</td><td>VWR</td><td>1 159 350 025</td><td></td></tr></tbody></table>

protokół transdukcji lentiwirusowej i dalszej analizy organoidów jelitowych

A Protocol for Lentiviral Transduction and Downstream Analysis of Intestinal Organoids

Struktury kosmków jelitowych zwane organoidami, mogą być utrzymywane w długotrwałej hodowli trójwymiarowo, jeśli są uzupełnione odpowiednimi czynnikami wzrostu. Ponieważ organoidy są bardzo podobne do oryginalnej tkanki pod względem homeostatycznego różnicowania komórek macierzystych, polaryzacji komórek i obecności wszystkich terminalnie zróżnicowanych typów komórek znanych z nabłonka jelita dorosłego, służą one jako niezbędny zasób w badaniach eksperymentalnych nad nabłonkiem. Możliwość ekspresji transgenów lub interferującego RNA za pomocą wektorów lentiwirusowych lub retrowirusowych w organoidach zwiększyła możliwości analizy funkcjonalnej nabłonka jelitowego i jelitowych komórek macierzystych, przewyższając tradycyjne transgeniczne myszy pod względem szybkości i kosztów. W obecnym protokole wideo pokazujemy, jak wykorzystać transdukcję organoidów jelita cienkiego za pomocą wektorów lentiwirusowych, zilustrowanych za pomocą transgenów indukowanych doksycyliną lub indukowanego przez IPTG krótkiego RNA spinki do włosów w celu nadekspresji lub knockdownu genu. Ponadto, biorąc pod uwagę, że hodowla organoidów daje niewielką liczbę komórek, która może być nawet zmniejszona przez eksperymentalne traktowanie, wyjaśniamy, jak przetwarzać organoidy do dalszej analizy mającej na celu ilościowe RT-PCR, RNA-mikromacierz i immunohistochemię. Techniki, które umożliwiają ekspresję transgenów i knock down genów w organoidach jelitowych, przyczyniają się do zwiększenia potencjału badawczego, jaki posiadają te struktury nabłonka jelitowego, ustanawiając hodowlę organoidów jako nowy standard w hodowli komórkowej.

Transdukcja lentiwirusowa organoidów
Technika transdukcji organoidów za pomocą cząsteczek lentiwirusowych zależy od prawidłowej obsługi organoidów przed i w trakcie transdukcji. Organoidy (Rysunek 3A) zostały wyhodowane, a następnie rozdzielone na pojedyncze krypty (Rysunek 3B). Jak wykazano wcześniej, pojedyncze krypty hodowane w obecności inhibitora GSK3 Chir99021 przekształciły się w krypty torbielowate9 (Rysunek 3C). Na...

W tym protokole wideo krok po kroku wyjaśniamy transdukcję lentiwirusową w organoidach pierwotnego nabłonka jelitowego oraz przetwarzanie i dalszą analizę tych kultur za pomocą ilościowego RT-PCR, RNA-mikromacierzy i immunohistochemii.

Protokół transdukcji lentiwirusowej i dalszej analizy organoidów jelitowych

Intestinal crypt-villus structures termed organoids, can be kept in sustained culture three dimensionally when supplemented with the appropriate growth ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest wytworzenie stabilnie transdukowanych organoidów z pierwotnego nabłonka jelitowego myszy do dalszych analiz organoidów jelitowych. Osiąga się to najpierw poprzez transfekcję komórek HEC 2 93 T wektorami pakującymi lentiwirusowe oraz plazmidem lentiwirusowym kodującym badany gen w celu produkcji cząstek lentiwirusowych o wysokim mianie. Drugim krokiem jest wstępne potraktowanie hodowanych organoidów jelitowych myszy szeregiem czynników wzrostu w celu uzyskania cystycznych, hiperproliferacyjnych krypt.Następnie przeprowadź transdukcję organoidów za pomocą lentiwirusa o wysokim mianie i inkubuj transdukowane organoidy w matrigelu. Ostatnim krokiem jest zatopienie w pełni wyrośniętych, transdukowanych organoidów w parafinie w celu przeprowadzenia późniejszej analizy immunohistochemicznej. W rezultacie transdukcja lentiwirusowa organoidów jest wykorzystywana do wprowadzania zmian genetycznych w modelu in vitro nabłonka jelitowego, który jest wiarygodny, powtarzalny i szybki.Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak linie komórkowe nowotworu, jest fakt, że organoidy stanowią niezmutowaną, przemieszczoną hierarchię komórek macierzystych. W kontekście polaryzacji komórkowej mogą one różnicować się we wszystkie rodzaje komórek nabłonka jelita cienkiego. Ponadto transdukowane organoidy mogą być wykorzystywane do badania specyficznych elementów genetycznych, co daje im przewagę nad wykorzystaniem myszy transgenicznych pod względem kosztów i szybkości badań.Produkcja cząsteczek lentiwirusowych jest pięciodniowym protokołem, który rozpoczyna się od przesiewania komórek HEC 2 93 T do 60–80% konfluencji w kolbie o powierzchni 162 cm² w pożywce hodowlanej. Następnego dnia komórki należy inkubować przez noc w wilgotnym inkubatorze do hodowli komórkowych w temperaturze 37 °C. Należy przygotować roztwór DNA do transfekcji oraz roztwór polietylenopoliaminy (PEI) do transfekcji zgodnie z opisem w tekście protokołu.Dodaj roztwór do transfekcji DNA do roztworu PEI, wymieszaj w wstrząsaciu wirowym lub odwróć probówkę kilkakrotnie i inkubuj przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Nanieś kroplami 2 mL roztworu DNA do transfekcji z PEI na komórki HEK 293T i inkubuj przez cztery godziny w temperaturze 37 °C.Wymień pożywkę hodowlaną. Aby usunąć PEI, inkubuj komórki przez dwa dni w temperaturze 37 °C. W czwartym dniu zbierz nadsącz do probówki o pojemności 50 ml. Dodaj do komórek nową pożywkę hodowlaną i umieść kolbę z powrotem w inkubatorze; zgromadzony nadsącz odwiruj przy 500 ×g przez pięć minut.Aby usunąć martwe komórki, należy użyć dużej strzykawki o pojemności 60 ml, aby przepchnąć nadsącz przez filtr o wielkości porów 0,45 µm. Przefiltrowany nadsącz należy przechowywać przez noc w temperaturze 4 °C. Następnego dnia należy zebrać, odwirować i przefiltrować drugą partię nadsączu w sposób opisany dla pierwszej partii.Połącz dwie partie naddatku w probówkach do ultrawirówki. Wiruj przy 50 000 GS przez 90 minut. Po zakończeniu wirowania bardzo ostrożnie wyjmij koszyki zawierające probówki do ultrawirówki i umieść je w dygestorium z laminarnym przepływem powietrza.Otwórz kapsułę zawierającą probówkę do ultrawirówki i ostrożnie odlej medium, trzymając probówkę tak, aby osad znajdował się w górnej części. Ważne jest, aby zapamiętać, po której stronie probówki utworzył się osad, ponieważ osady wirusowe mogą być trudne do zwizualizowania. Następnie, używając mikropipety, usuń pozostałą niewielką ilość medium, dbając o to, aby nie wzburzyć nieprzezroczystego, brązowego osadu widocznego przy dolnej ściance probówki do ultrawirówki.Resuspenduj ten osad w 500 µL pożywki do hodowli organoidów uzupełnionej o inhibitory kinazy nikotynamidowej oraz poly brain resus. Zawieszenie w tym medium jest istotne, ponieważ wirus o wysokim mianie zostanie użyty bezpośrednio do transdukcji organoidów na dwa dni przed transdukcją. Przenieś zawartość pełnej studzienki o powierzchni 0,95 cm² z organoidami do nowej studzienki płytki 48-dołkowej.Zgodnie z wcześniej opublikowanym protokołem. Celem jest uzyskanie około 50 małych organoidów w hodowli organoidów. Pożywka uzupełniona o inhibitor kinazy syntazy glikogenu oraz nikotynamid.Aby uzyskać torbielowate, hiperproliferacyjne krypty, inkubować organoidy przez dwa dni. W dniu transdukcji zebrać organoidy za pomocą mikropipety P 1000. Pipetować Matrigel i pożywkę w górę i w dół, aby rozbić mieszaninę.Przenieś mieszaninę do probówki o pojemności 15 ml. Dalszą dysrupcję mieszaniny przeprowadź za pomocą pipety P20, której otwór dystalny został zwężony przez stopienie. Zgranuluj organoidy poprzez wirowanie przy 100 G przez pięć minut. Następnie usuń nadsącz, dodaj 500 µl podgrzanej trypsyny 1x i resuspenduj organoidy, inkubując je przez trzy minuty.W kąpieli wodnej o temperaturze 37 °C dezaktywuj trypsynę, dodając 3,5 ml pożywki do hodowli linii komórkowej, a następnie wiruj przez pięć minut przy 500 ×g. Usuń nadsącz, pozostawiając osad w około 20 µl pożywki. Przenieś organoidy wraz z tą niewielką ilością pożywki do dołka.Na płytce 48-dołkowej dodaj wcześniej przygotowanego lentiwirusa o wysokim mianie w medium do transdukcji do organoidów i resuspenduj. Inkubuj mieszaninę organoidów z wirusem przez jedną godzinę w temperaturze 37 °C w inkubatorze do kultur komórkowych, aby umożliwić transdukcję. Po godzinie dodaj 1 mL medium do hodowli organoidów do mieszaniny organoidów z wirusem, resuspenduj, a następnie przenieś mieszaninę do probówki do mikrocentryfugi i wiruj przy 850 ×g przez pięć minut.Aby odwirować organoidy, należy usunąć nadsącz i resuspendować osad. W 20 µL lodowatego Matrigelu należy umieścić kroplę na środku dołka w płytce 48-dołkowej i inkubować w temperaturze 37 °C przez 15 minut.Aby kropla stężała, odczekaj 15 minut. Ostrożnie dodaj 250 µL pożywki do hodowli organoidów uzupełnionej o nikotynamid i inhibitory kinaz.Podgrzej blok aluminiowy w inkubatorze do 70 °C, aby utrzymać parafina w stanie ciekłym. Usuń medium z pojedynczej studzienki zawierającej w pełni wyrośnięte organoidy, pozostawiając zatopione w nim organoidy nienaruszone, a następnie dodaj do studzienki 1 mL 4% paraformaldehydu w PBS. Zastąp paraformaldehyd 1 mL PBS.Resuspenduj utrwalone organoidy w PBS i przenieś je do szklanej fiolki. Pozostaw organoidy na minutę, aby opadły na dno. Następnie odessaj PBS pipetą i zastąp go 70% etanolem, w którym rozpuszczono kilka kropel roztworu eozy.Aby umożliwić wizualizację organoidów podczas całego procesu zatapiania, pozostawić organoidy w 70% ethanolu w temperaturze pokojowej na 30 minut. Usunąć 70% ethanol, ostrożnie odpipetowując go. Organoidy można zlokalizować gołym okiem dzięki różowemu zabarwieniu eozyną.Zastąp roztwór do zatapiania 96% etanolem i pozostaw w temperaturze pokojowej na 30 minut. Następnie przeprowadź organoidy przez następujące roztwory: 70% etanol, 90% etanol, 96% etanol, 100% etanol, 100% etanol, ksylen i ksylen. Odlej ostatnią porcję ksylenu i wlej parafinię do szklanej fiolki.Natychmiast umieść fiolkę w podgrzanym bloku aluminiowym w temperaturze 70 °C na 30 minut. Po 30 minutach wymień parafinę na nową, czystą parafinę, używając do tego podgrzanej pipety z końcówką PE lub zwykłej pipety. Odlej parafinę i za pomocą podgrzanej pipety z szerokim otworem przenieś organoidy do formy bloku parafinowego, wkładając je w warstwę ciekłej parafiny.Podgrzej igłę sekcyjną nad palnikiem Bunsena i przesuń wszystkie organoidy w miarę możliwości w stronę centrum formy z bloku parafiny. Gdy rozmieszczenie organoidów w formie będzie satysfakcjonujące, lekko schłodź formę, aby warstwa parafiny stężała. Dokończ przygotowanie bloku, wlewając na wierzch więcej parafiny i dodając standardową kasetkę do zatapiania histologicznego.W niniejszym protokole organoidy nabłonka jelitowego zostały transdukowane lentiwirusami. Normalne organoidy rosną jako struktury kryptowo-kosmkowe z liczbą krypt wywodzących się ze wspólnej domeny kosmków. Po potraktowaniu tych organoidów inhibitorem GSK 3&#916; CHIR 99021 proliferacja wzrasta, a krypty stają się torbielowate po transdukcji organoidów.Dzięki lentiwirusowej nadekspresji EGFP, organoidy wykazują fluorescencję; kroki zwiększające wydajność transdukcji EGFP, które mogą być wykonywane w przypadku niskiej efektywności, takie jak inokulacja czy przedłużona inkubacja z wirusem, nie są wymagane, ponieważ nie zwiększyłyby one i tak już wysokiej wydajności. Następnie organoidy te są przetwarzane w celu przeprowadzenia analiz RNA oraz immunohistochemii. Ten reprezentatywny obraz przedstawia przekrój organoidu jelitowego myszy, barwiony na BRDU po godzinnej inkubacji z BRDU przed utrwaleniem.Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać gruntowną wiedzę na temat transdukcji organoidów z pierwotnego nabłonka jelitowego przy użyciu cząsteczek lentiwirusowych lub retrowirusowych.

a-protocol-for-lentiviral-transduction-downstream-analysis-intestinal

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Protokół przeprowadzania transdukcji lentiwirusowej oraz analizy bieżącej organoidalnych struktur jelitowych

Source: Van Lidth de Jeude, J. F., et al. A Protocol for Lentiviral Transduction and Downstream Analysis of Intestinal Organoids. J. Vis. Exp. (2015).This video demonstrates the processing of lentivirus-transduced mouse intestinal organoids for paraffin embedding, to enable their downstream analysis for assessing gene expression.

Processing of Lentivirus-Transduced Mouse Intestinal Organoids for Immunohistochemical Analysis

Ten protokół wyjaśnia pierwotną hodowlę organoidów z dodatnim Lgr5 i późniejszą transdukcję retrowirusową. Umożliwia to indukowaną przez Cre nadekspresję lub knockdown dostarczonego transgenu i umożliwia prowadzenie badań funkcjonalnych w nowym systemie modeli organotypowych in vitro.

Protokół wideo infekcji retrowirusowej w pierwotnej hodowli organoidów jelitowych

Hodowle organoidów jelitowych są tworzone z całych krypt i nie pozwalają na analizę samoodnowy i różnicowania w sposób specyficzny dla komórki. Protokół ten opisuje rekonstrukcję posortowanych komórek macierzystych (Lgr5+) i niszowych (Paneth), które dają początek organoidom, umożliwiając jednocześnie ich wcześniejszą modyfikację biochemiczną i genetyczną oraz analizę funkcjonalną.

Test rekonstytucji organoidów (ORA) do analizy funkcjonalnej jelitowych komórek macierzystych i niszowych

Opisujemy instrukcje krok po kroku, aby: 1) efektywnie konstruować organoidy jelitowe za pomocą nanocząsteczek magnetycznych do transdukcji soczewicowacej lub retrowirusowej, oraz 2) generować zamrożone skrawki z zmodyfikowanych organoidów. Podejście to zapewnia potężne narzędzie do efektywnej zmiany ekspresji genów w organoidach w celu zbadania dalszych efektów.

Inżynieria genetyczna pierwotnych organoidów jelitowych myszy z wykorzystaniem wektorów wirusowych transdukcji nanocząstek magnetycznych do zamrożonego cięcia

Ten protokół opisuje, jak infekować ludzkie organoidy jelitowe od ich wierzchołkowej lub podstawno-bocznej strony, aby scharakteryzować interakcje gospodarz/patogen na poziomie pojedynczej komórki za pomocą technologii sekwencjonowania RNA pojedynczej komórki (scRNAseq).

Adaptacja organoidów przewodu pokarmowego do zakażenia patogenami i sekwencjonowania pojedynczych komórek w warunkach 3. poziomu bezpieczeństwa biologicznego (BSL-3)

Ten protokół oferuje szczegółowe instrukcje dotyczące tworzenia mysich organoidów jelita cienkiego, izolowania wrodzonych komórek limfoidalnych typu 1 od mysiej blaszki jelita cienkiego oraz ustanawiania trójwymiarowych (3D) kokultur między oboma typami komórek w celu zbadania dwukierunkowych interakcji między komórkami nabłonka jelitowego a wrodzonymi komórkami limfoidalnymi typu 1.

Współhodowla organoidów nabłonkowych mysiego jelita cienkiego z wrodzonymi komórkami limfoidalnymi

Tutaj prezentujemy protokół do generowania organoidów jelitowych szczurów i używania ich w kilku dalszych zastosowaniach. Szczury są często preferowanym modelem przedklinicznym, a solidny układ organoidów jelitowych wypełnia zapotrzebowanie na system in vitro towarzyszący badaniom in vivo.

Wytwarzanie i manipulowanie organoidami jelitowymi szczurów

Ten protokół opisuje podejście do wykonywania obrazowania wapnia w zakażonych wirusem ludzkich organoidach jelitowych i oferuje podejście do analizy.

Obrazowanie na żywo wapnia zakażonych wirusem monowarstw organoidów jelitowych ludzkich przy użyciu genetycznie kodowanych wskaźników wapnia

Protokół łączy technologię organoidów jelitowych człowieka z analizą transkryptomiczną pojedynczej komórki, aby zapewnić znaczący wgląd w wcześniej niezbadaną biologię jelit.

Wykorzystanie organoidów jelitowych człowieka do zrozumienia nabłonka jelita cienkiego na poziomie transkrypcji pojedynczej komórki

Niniejszy artykuł opisuje nowy protokół oraz zestaw odczynników opracowanych do czułego pomiaru efektów neurotoksyczności związków i metod leczenia w kokulturach neuronów i astrocytów z wykorzystaniem analizy wysokotreściowej (high content analysis). Wyniki wskazują, że analiza wysokotreściowa stanowi obiecującą, nową technologię w ocenie neurotoksyczności.

Test kokultury neuronów i astrocytów do wysokoprzepustowej analizy treści (high content analysis) w badaniach neurotoksyczności

Poznaj metodę transdukcji lentiwirusowej organoidów jelitowych myszy z analizą RT-qPCR, mikromacierzą RNA i immunohistochemią. Technika umożliwia stabilną modyfikację genetyczną in vitro.

Protokół transdukcji lentiwirusowej i dalszej analizy organoidów jelitowych

Przeglądaj więcej filmów