Wytwarzanie i manipulowanie organoidami jelitowymi szczurów

W tym badaniu ustaliliśmy model organoidów jelitowych szczurów, który jest solidny w długotrwałej hodowli komórkowej. Pokazujemy również pierwsze udane manipulacje genetyczne z wykorzystaniem zarówno infekcji lentiwirusowej, jak i transfekcji przejściowej. Model ten jest doskonałym narzędziem do manipulowania biologią jelit u szczurów, gdzie narzędzia genetyczne dostępne in vivo są ograniczone.

Organoidy jelitowe szczurów były wcześniej trudne do długoterminowej hodowli. Generując solidny, genetycznie modyfikowalny model organoidu szczura, zapewniamy naukowcom dodatkową elastyczność i możliwość wyboru modelu organoidowego najlepiej dopasowanego do ich konkretnej sytuacji. Organoidy jelitowe myszy są wykorzystywane do badania zachowania komórek macierzystych, losu komórek i fizjologii, ale mogą być modelem nieoptymalnym, ponieważ istnieją kluczowe różnice między biologią myszy i człowieka.

Z drugiej strony, ludzkie organoidy jelitowe mogą być trudne do uzyskania i mieć złożone wymagania dotyczące hodowli komórkowych. Opisywany przez nas model organoidów szczurów zachowuje kluczowe znaczenie fizjologiczne dla biologii człowieka, a jednocześnie jest znacznie łatwiejszy w dostępie i pielęgnacji niż organoidy jelitowe człowieka. Opracowanie i optymalizacja modelu organoidów jelitowych szczurów pozwala na manipulację genetyczną, leczenie farmakologiczne i bardziej przepustowe badania biologii jelit w dostępnym modelu o kluczowym znaczeniu fizjologicznym dla ludzi.

Ponadto te organoidy szczurów pozwolą na badanie specyficznej dla gatunku fizjologii, losów komórek i zmian fenotypowych w modelach chorób w jelicie. Na początek umieść uśpionego szczura na powierzchni sekcyjnej brzuszną stroną do góry. Ściśnij warstwę skóry sterylnymi kleszczami i wykonaj nacięcia na poziomie powierzchni, unikając uszkodzenia narządów wewnętrznych.

Używając dużych ostrych nożyczek do preparowania, wykonaj podłużne nacięcie na poziomie powierzchni pośrodku brzucha, a następnie wychodząc z tego cięcia, wykonaj dwa krótsze poziome cięcia, po jednym z każdej strony. Za pomocą kleszczy oderwij skórę, aby odsłonić jamę brzuszną. Przeciąć błonę otrzewną, aby w pełni odsłonić narządy wewnętrzne w jamie brzusznej z łatwym dostępem do jelita.

Za pomocą nożyczek i kleszczy zlokalizuj żołądek i zidentyfikuj dwunastnicę, około dwóch do trzech centymetrów dystalnie do niej, która pojawia się jako żółtawy segment. Bliższe jelito czcze znajduje się około czterech do pięciu centymetrów dystalnie od więzadła Treitza, punktu orientacyjnego między dwunastnicą a jelitem czczym. Umieść wyizolowany fragment jelita na 10-centymetrowej szalce Petriego.

Przepłucz żądany segment jelita 10 mililitrami lodowatego PBS, aż zostanie oczyszczony z zawartości światła. Na ręczniku papierowym pokrój odcinek jelitowy na dwucentymetrowe kawałki. Następnie otwórz każdy kawałek jelita wzdłużnie, aby odsłonić nabłonek.

Zeskrob odsłoniętą powierzchnię luminalną za pomocą szklanego szkiełka mikroskopowego, aby usunąć kosmki. Umieść kawałki jelita w roztworze EDTA na lodzie i obracaj w czterech stopniach Celsjusza przez 30 minut na rewolwerze rurowym ustawionym na 10 obr./min. Pod mikroskopem preparacyjnym wlej zawartość probówki do 10-centymetrowej szalki Petriego.

Dodaj dodatkowe pięć mililitrów lodowatego PBS. Za pomocą cienkich kleszczy przytrzymaj segment jelita i energicznie potrząśnij, aby obserwować, jak nabłonek uwalnia się do PBS. Początkowo PBS będzie zawierał głównie kosmki.

Ciągle potrząsaj fragmentami jelita. Okresowo wyrzucaj PBS zawierający kosmki i dodaj 10 mililitrów świeżego PBS do fragmentów jelita. Kontynuuj potrząsanie fragmentami i powtarzaj etap mycia PBS, aż kosmki przestaną być uwalniane do PBS, ale zamiast tego PBS zawiera głównie krypty.

Odrzuć pozostałe fragmenty jelita i wzbogać pozostały PBS na szalce Petriego w celu uzyskania krypt jelitowych. W kapturze do hodowli tkankowej zbierz krypty zawierające PBS i przefiltruj przez drenaż komórek o wielkości 70 mikronów. Odwirować filtrat o sile 250G przez pięć minut.

Następnie usuń ich supernatant i ponownie zawieś osad w pięciu milimetrach Advanced DMEM Plus. Ponownie odwirować przy 250G przez pięć minut i usunąć supernatant, pozostawiając 50 mikrolitrów pożywki z osadem. Zawiesić osad w pozostałym podłożu i dodać go do podwielokrotności ekstraktu z macierzy zewnątrzkomórkowej lub EME na lodzie.

Delikatnie pipetuj w górę iw dół, aby zawiesić krypty równomiernie w całym EME, unikając tworzenia pęcherzyków. Umieść 50 mikrolitrów kopuł EME w 35-milimetrowym naczyniu do hodowli tkankowych. I inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla przez 20 minut.

Po inkubacji dodać dwa mililitry pożywki organoidowej jelita szczura lub RIOM zawierającej po 10 mikromolowców Y27632 i CHIRA99021. Następnie, aby przejść organoidy jelitowe szczura, odessać pożywkę z płytki zawierającej organoidy i dodać jeden mililitr odczynnika dysocjacyjnego, aby uwolnić organoidy z kopuł EME. Przenieść odczynnik dysocjacyjny z rozdrobnionymi organoidami do stożkowej probówki o pojemności 15 mililitrów.

Umyj płytkę hodowlaną dwoma mililitrami Advanced DMEM Plus i dodaj ją do 15-mililitrowej stożkowej probówki zawierającej rozdrobnione organoidy. Używając szklanej pipety Pasteura, delikatnie pipetuj w górę i w dół 15 do 20 razy, aby rozdrobnić organoidy. Odwirować organoidy w temperaturze 350G przez dwie minuty i dodać 50 mikrolitrów roztworu z dna probówki do EME.

Po wymieszaniu roztworu, umieść 50 mikrolitrów kopuł EME w 35-milimetrowym naczyniu do hodowli tkankowych i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla przez 20 minut. Po inkubacji dodać dwa mililitry RIOM zawierające po 10 mikromolowców Y27632 i CHIRA99021. Pokazane są reprezentatywne wizerunki fragmentów villaru i krypt.

Krypty są mniejsze w porównaniu do kosmków. Platerowane uchwyty rozszerzają się w ciągu następnych kilku dni i zaczynają pączkować i różnicować się w dniach od czterech do siedmiu dni. Po dwóch dniach rozmrażania zdrowa kultura organoidów wykazała obecność zarówno sferoidów, jak i pączkujących organoidów.

Ta sama linia organoidów po zapakowaniu wykazała obecność pojedynczych domen podobnych do krypt. Aby pokryć płytkę EME, rozcieńczyć EME od 1 do 20 w zimnym Advanced DMEM Plus. W przypadku powlekania kolagenem rozcieńczyć pięć miligramów na mililitr kolagenu jeden w Advanced DMEM Plus do 100 mikrogramów na mililitr.

Pokryj płytkę 200 mikrolitrami rozcieńczonego EME lub kolagenu, aby całkowicie pokryć powierzchnię studzienki, i inkubuj przez jedną do dwóch godzin w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Aby wygenerować monowarstwy, należy odessać pożywkę z 35-milimetrowej płytki zawierającej organoidy. Dodaj jeden mililitr PBS i rozerwij EME w studzienkach za pomocą końcówki P1000, pipetując w górę iw dół około 20 razy, aby poluzować cały EME.

Przenieś zawartość do stożkowej probówki o pojemności 15 mililitrów. Dodaj jeden mililitr PBS do płytki, aby zebrać dodatkowe organoidy i przenieś je do tej samej stożkowej probówki. Odwirować próbkę o sile 350 G przez dwie minuty i usunąć supernatant, w tym wszelkie pozostałości EME.

Następnie dodaj jeden mililitr roztworu trypsyny do osadu organoidowego i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez dwie minuty. Pipetuj w górę i w dół 10 razy za pomocą końcówki P1000 i dodaj dwa mililitry Advanced DMEM Plus, aby zneutralizować trypsynę. Wirować przy 350 G przez pięć minut i odessać supernatant przed ponownym zawieszeniem osadu w 4,8 mililitra RIOM 2D.

Usuń nadmiar EME lub kolagenu w Advanced DMEM Plus z dołków. Następnie dodaj 200 mikrolitrów organoidów w RIOM 2D i 10 mikromolowych Y27632 do każdego wstępnie pokrytego dołka. Po czterech do 16 godzinach zebrać pożywkę i odwirować w temperaturze 1000G przez jedną minutę.

Przenieść supernatant do nowej stożkowej probówki o pojemności 15 mililitrów i wyrzucić osad. Umyj każdą studzienkę 300 mikrolitrami PBS przed dodaniem 200 mikrolitrów odwirowanego RIOM 2D do każdej studzienki. Zmieniaj RIOM 2D co dwa do trzech dni, zawieszając stosowanie monowarstw Y27632.2D pokrytych na EME, które łatwo przekształcały się w małe sferoidy, gdy EME został dodany z powrotem do górnej części komórek.

Natomiast jeden substrat kolagenowy był niewystarczający do zreformowania struktur 3D.