Name: Wytwarzanie i manipulowanie organoidami jelitowymi szczurów (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-06-23T12:55:00.000+00:00
Duration: 9 min 49 s
Description: Poznaj metody wytwarzania i manipulacji genetycznej organoidów jelitowych szczurów przy użyciu infekcji lentiwirusowej i transfekcji przejściowej. Model ten umożliwia długoterminową hodowlę komórkową i badania biologii jelitowej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy członkom laboratoriów Sumigray i Ameen za ich wnikliwe dyskusje. Praca ta była wspierana przez grant na zdrowie dzieci Fundacji Charlesa H. Hooda oraz grant Fundacji Mukowiscydozy (004741P222) dla KS oraz przez National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases of the National Institutes of Health dla NA pod numerem nagrody 2R01DK077065-12.

Rat Intestinal Crypts Isolation and Intestinal Organoids Generation

<ol><li>Beumer, J., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+fate+specification+and+differentiation+in+the+adult+mammalian+intestine%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Molecular+Cell+BiologyI%22%5BJournal%5D)">Cell fate specification and differentiation in the adult mammalian intestine.</a> Nature Reviews. Molecular Cell BiologyI. 22 (1), 39-53 (2021).</li>
<li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+Lgr5+stem+cells+build+crypt-villus+structures+in+vitro+without+a+mesenchymal+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche.</a> Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).</li>
<li>Yin, Y. -B., de Jonge, H. R., Wu, X., Yin, Y. -L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enteroids+for+nutritional+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Nutrition+%26+Food+Research%22%5BJournal%5D)">Enteroids for nutritional studies.</a> Molecular Nutrition & Food Research. 63 (16), 1801143(2019).</li>
<li>Cai, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+six+common+dietary+nutrients+on+murine+intestinal+organoid+growth%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Effects of six common dietary nutrients on murine intestinal organoid growth.</a> PLoS One. 13 (2), e0191517(2018).</li>
<li>Davoudi, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gut+Organoid+as+a+new+platform+to+study+alginate+and+chitosan+mediated+PLGA+nanoparticles+for+drug+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Marine+Drugs%22%5BJournal%5D)">Gut Organoid as a new platform to study alginate and chitosan mediated PLGA nanoparticles for drug delivery.</a> Marine Drugs. 19 (5), 282(2021).</li>
<li>Vlachogiannis, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patient-derived+organoids+model+treatment+response+of+metastatic+gastrointestinal+cancers%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Patient-derived organoids model treatment response of metastatic gastrointestinal cancers.</a> Science. 359 (6378), 920-926 (2018).</li>
<li>Yin, Y. B., de Jonge, H. R., Wu, X., Yin, Y. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mini-gut%3A+a+promising+model+for+drug+development%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Discovery+Today%22%5BJournal%5D)">Mini-gut: a promising model for drug development.</a> Drug Discovery Today. 24 (9), 1784-1794 (2019).</li>
<li>Zietek, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organoids+to+study+intestinal+nutrient+transport%2C+drug+uptake+and+metabolism+-+update+to+the+human+model+and+expansion+of+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Bioengineering+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Organoids to study intestinal nutrient transport, drug uptake and metabolism - update to the human model and expansion of applications.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 577656(2020).</li>
<li>Gunther, C., Winner, B., Neurath, M. F., Stappenbeck, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organoids+in+gastrointestinal+diseases%3A+from+experimental+models+to+clinical+translation%5BTitle%5D)+AND+%22Gut%22%5BJournal%5D)">Organoids in gastrointestinal diseases: from experimental models to clinical translation.</a> Gut. 71 (9), 1892-1908 (2022).</li>
<li>Pleguezuelos-Manzano, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+and+culture+of+human+intestinal+organoids+derived+from+adult+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Establishment and culture of human intestinal organoids derived from adult stem cells.</a> Current Protocols in Immunology. 130 (1), 106(2020).</li>
<li>Zhao, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Methods+Primers%22%5BJournal%5D)">Organoids.</a> Nature Reviews Methods Primers. 2 (1), 94(2022).</li>
<li>Powell, R. H., Behnke, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((WRN+conditioned+media+is+sufficient+for+in+vitro+propagation+of+intestinal+organoids+from+large+farm+and+small+companion+animals%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+Open%22%5BJournal%5D)">WRN conditioned media is sufficient for in vitro propagation of intestinal organoids from large farm and small companion animals.</a> Biology Open. 6 (5), 698-705 (2017).</li>
<li>Fagerholm, U., Johansson, M., Lennernas, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+between+permeability+coefficients+in+rat+and+human+jejunum%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmaceutical+Research%22%5BJournal%5D)">Comparison between permeability coefficients in rat and human jejunum.</a> Pharmaceutical Research. 13 (9), 1336-1342 (1996).</li>
<li>Dubbelboer, I. R., Dahlgren, D., Sjogren, E., Lennernas, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rat+intestinal+drug+permeability%3A+A+status+report+and+summary+of+repeated+determinations%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Pharmaceutics+and+Biopharmaceutics%22%5BJournal%5D)">Rat intestinal drug permeability: A status report and summary of repeated determinations.</a> European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 142, 364-376 (2019).</li>
<li>Bryda, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Mighty+Mouse%3A+the+impact+of+rodents+on+advances+in+biomedical+research%5BTitle%5D)+AND+%22Missouri+Medicine%22%5BJournal%5D)">The Mighty Mouse: the impact of rodents on advances in biomedical research.</a> Missouri Medicine. 110 (3), 207-211 (2013).</li>
<li>Zhang, Z., Carriero, N., Gerstein, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+analysis+of+processed+pseudogenes+in+the+mouse+and+human+genomes%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Genetics%22%5BJournal%5D)">Comparative analysis of processed pseudogenes in the mouse and human genomes.</a> Trends in Genetics. 20 (2), 62-67 (2004).</li>
<li>Lambracht-Washington, D., Fischer Lindahl, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Active+MHC+class+Ib+genes+in+rat+are+pseudogenes+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Immunogenetics%22%5BJournal%5D)">Active MHC class Ib genes in rat are pseudogenes in the mouse.</a> Immunogenetics. 56 (2), 118-121 (2004).</li>
<li>Busslinger, G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+gastrointestinal+epithelia+of+the+esophagus%2C+stomach%2C+and+duodenum+resolved+at+single-cell+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Human gastrointestinal epithelia of the esophagus, stomach, and duodenum resolved at single-cell resolution.</a> Cell Reports. 34 (10), 108819(2021).</li>
<li>Burclaff, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+proximal-to-distal+survey+of+healthy+adult+human+small+intestine+and+colon+epithelium+by+single-cell+transcriptomics%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+Molecular+Gastroenterology+and+Hepatology%22%5BJournal%5D)">A proximal-to-distal survey of healthy adult human small intestine and colon epithelium by single-cell transcriptomics.</a> Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 13 (5), 1554-1589 (2022).</li>
<li>Haber, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+single-cell+survey+of+the+small+intestinal+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A single-cell survey of the small intestinal epithelium.</a> Nature. 551 (7680), 333-339 (2017).</li>
<li>Olivier, A. K., Gibson-Corley, K. N., Meyerholz, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+models+of+gastrointestinal+and+liver+diseases.+Animal+models+of+cystic+fibrosis%3A+gastrointestinal%2C+pancreatic%2C+and+hepatobiliary+disease+and+pathophysiology%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology.+Gastrointestinal+and+Liver+Physiology%22%5BJournal%5D)">Animal models of gastrointestinal and liver diseases. Animal models of cystic fibrosis: gastrointestinal, pancreatic, and hepatobiliary disease and pathophysiology.</a> American Journal of Physiology. Gastrointestinal and Liver Physiology. 308 (6), G459-G471 (2015).</li>
<li>Lu, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+models+of+gastrointestinal+and+liver+diseases.+Animal+models+of+necrotizing+enterocolitis%3A+pathophysiology%2C+translational+relevance%2C+and+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology.+Gastrointestinal+and+Liver+Physiology%22%5BJournal%5D)">Animal models of gastrointestinal and liver diseases. Animal models of necrotizing enterocolitis: pathophysiology, translational relevance, and challenges.</a> American Journal of Physiology. Gastrointestinal and Liver Physiology. 306 (11), G917-G928 (2014).</li>
<li>Fujii, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+intestinal+organoids+maintain+self-renewal+capacity+and+cellular+diversity+in+niche-inspired+culture+condition%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Human intestinal organoids maintain self-renewal capacity and cellular diversity in niche-inspired culture condition.</a> Cell Stem Cell. 23 (6), 787-793 (2018).</li>
<li>Hedrich, W. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+characterization+of+rat+duodenal+organoids+for+ADME+and+toxicology+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicology%22%5BJournal%5D)">Development and characterization of rat duodenal organoids for ADME and toxicology applications.</a> Toxicology. 446, 152614(2020).</li>
<li>How to Cryopreserve Intestinal Organoids. STEMCELL. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.stemcell.com/technical-resources/area-of-interest/organoid-research/intestinal-research/tech-tips-protocols/how-to-cryopreserve-intestinal-organoids.html">https://www.stemcell.com/technical-resources/area-of-interest/organoid-research/intestinal-research/tech-tips-protocols/how-to-cryopreserve-intestinal-organoids.html</a> (2023).</li>
<li>How to Thaw Intestinal Organoids. STEMCELL. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.stemcell.com/technical-resources/educational-materials/protocols/how-to-thaw-intestinal-organoids.html">https://www.stemcell.com/technical-resources/educational-materials/protocols/how-to-thaw-intestinal-organoids.html</a> (2023).</li>
<li>Sancak, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Rag+GTPases+bind+raptor+and+mediate+amino+acid+signaling+to+mTORC1%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The Rag GTPases bind raptor and mediate amino acid signaling to mTORC1.</a> Science. 320 (5882), 1496-1501 (2008).</li>
<li>Van Lidth de Jeude, J. F., Vermeulen, J. L., Montenegro-Miranda, P. S., Vanden Brink, G. R., Heijmans, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+protocol+for+lentiviral+transduction+and+downstream+analysis+of+intestinal+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">A protocol for lentiviral transduction and downstream analysis of intestinal organoids.</a> Journal of Visualized Experiments. (98), e52531(2015).</li>
<li>Boj, S. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Forskolin-induced+swelling+in+intestinal+organoids%3A+an+in+vitro+assay+for+assessing+drug+response+in+cystic+fibrosis+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Forskolin-induced swelling in intestinal organoids: an in vitro assay for assessing drug response in cystic fibrosis patients.</a> Journal of Visualized Experiments. (120), e55159(2017).</li>
<li>Regent, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nicotinamide+promotes+formation+of+retinal+organoids+from+human+pluripotent+stem+cells+via+enhanced+neural+cell+fate+commitment%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cellular+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Nicotinamide promotes formation of retinal organoids from human pluripotent stem cells via enhanced neural cell fate commitment.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 16, 878351(2022).</li>
<li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+expansion+of+epithelial+organoids+from+human+colon%2C+adenoma%2C+adenocarcinoma%2C+and+Barrett%27s+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium.</a> Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).</li>
<li>Breau, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+transgenesis+and+homology-directed+gene+targeting+in+monolayers+of+primary+human+small+intestinal+and+colonic+epithelial+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Efficient transgenesis and homology-directed gene targeting in monolayers of primary human small intestinal and colonic epithelial stem cells.</a> Stem Cell Reports. 17 (6), 1493-1506 (2022).</li>
<li>Berkers, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rectal+organoids+enable+personalized+treatment+of+cystic+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Rectal organoids enable personalized treatment of cystic fibrosis.</a> Cell Reports. 26 (7), 1701-1708 (2019).</li>
<li>deWinter-de Groot, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Forskolin-induced+swelling+of+intestinal+organoids+correlates+with+disease+severity+in+adults+with+cystic+fibrosis+and+homozygous+F508del+mutations%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cystic+Fibrosis%22%5BJournal%5D)">Forskolin-induced swelling of intestinal organoids correlates with disease severity in adults with cystic fibrosis and homozygous F508del mutations.</a> Journal of Cystic Fibrosis. 19 (4), 614-619 (2020).</li>
<li>Dekkers, J. F., vander Ent, C. K., Beekman, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+opportunities+for+CFTR-targeting+drug+development+using+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Rare+Diseases%22%5BJournal%5D)">Novel opportunities for CFTR-targeting drug development using organoids.</a> Rare Diseases. 1, 27112(2013).</li>
<li>Dekkers, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+functional+CFTR+assay+using+primary+cystic+fibrosis+intestinal+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">A functional CFTR assay using primary cystic fibrosis intestinal organoids.</a> Nature Medicine. 19 (7), 939-945 (2013).</li>
<li>van Mourik, P., Beekman, J. M., vander Ent, C. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestinal+organoids+to+model+cystic+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22European+Respiratory+Journal%22%5BJournal%5D)">Intestinal organoids to model cystic fibrosis.</a> European Respiratory Journal. 54 (1), 1802379(2019).</li>
<li>Tong, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transport+of+artificial+virus-like+nanocarriers+through+intestinal+monolayers+via+microfold+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nanoscale%22%5BJournal%5D)">Transport of artificial virus-like nanocarriers through intestinal monolayers via microfold cells.</a> Nanoscale. 12 (30), 16339-16347 (2020).</li>
<li>Miyoshi, H., Stappenbeck, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+expansion+and+genetic+modification+of+gastrointestinal+stem+cells+in+spheroid+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">In vitro expansion and genetic modification of gastrointestinal stem cells in spheroid culture.</a> Nature Protocols. 8 (12), 2471-2482 (2013).</li>
<li>Ootani, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sustained+in+vitro+intestinal+epithelial+culture+within+a+Wnt-dependent+stem+cell+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Sustained in vitro intestinal epithelial culture within a Wnt-dependent stem cell niche.</a> Nature Medicine. 15 (6), 701-706 (2009).</li>
<li>Xu, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vascular+development+in+the+retina+and+inner+ear%3A+control+by+Norrin+and+Frizzled-4%2C+a+high-affinity+ligand-receptor+pair%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Vascular development in the retina and inner ear: control by Norrin and Frizzled-4, a high-affinity ligand-receptor pair.</a> Cell. 116 (6), 883-895 (2004).</li>
<li>Jabaji, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Type+I+collagen+as+an+extracellular+matrix+for+the+in+vitro+growth+of+human+small+intestinal+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Type I collagen as an extracellular matrix for the in vitro growth of human small intestinal epithelium.</a> PLoS One. 9 (9), e107814(2014).</li>
<li>Sachs, N., Tsukamoto, Y., Kujala, P., Peters, P. J., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestinal+epithelial+organoids+fuse+to+form+self-organizing+tubes+in+floating+collagen+gels%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Intestinal epithelial organoids fuse to form self-organizing tubes in floating collagen gels.</a> Development. 144 (6), 1107-1112 (2017).</li>
<li>Aisenbrey, E. A., Murphy, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthetic+alternatives+to+Matrigel%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Materials%22%5BJournal%5D)">Synthetic alternatives to Matrigel.</a> Nature Reviews Materials. 5 (7), 539-551 (2020).</li>
</ol>

Opracowanie modelu organoidów jelitowych szczura pozwala zachować ważne cechy funkcjonalne występujące w narządzie in vivo i jest obiecującym narzędziem do badań przedklinicznych, badań przesiewowych leków i testów funkcjonalnych. Ten model in vitro może być stosowany równolegle z przedklinicznymi badaniami gastroenterologicznymi in vivo , w których szczury są często preferowanym modelem ze względu na większy rozmiar jelita, wspólne aspekty fizjologiczne z ludźmi, a w niektórych przypadkach są lepszymi modelami choroby38. W tym miejscu przedstawiono solidny protokół krok po kroku dotyczący izolacji krypt jelitowych szczurów, generowania i długotrwałej hodowli organoidów jelitowych szczurów, a także dalszych zastosowań, w tym funkcjonalnych testów obrzęku forskoliny, immunofluorescencji całej góry, hodowli jednowarstwowej 2D i manipulacji genetycznych lentiwirusów. Organoidy jelitowe szczurów mogą być istotne w wielu kontekstach chorobowych, w których patofizjologia modeli mysich jest nieodpowiednia i mogą stanowić lepszy model fizjologii jelit człowieka w porównaniu z organoidami jelitowymi myszy.
Aby stworzyć długowieczne kultury organoidów, które mogą być pasażowane i namnażane, konieczne jest zidentyfikowanie kluczowych czynników wzrostu wymaganych do utrzymania proliferacji nabłonka jelitowego. Organoidy myszy są najczęściej hodowane w prostym koktajlu EGF, R-spondyny i Noggin, chociaż doniesiono, że Noggin nie jest niezbędny do hodowli organoidów jelitowych39. Kondycjonowane pożywki mogą zastąpić rekombinowane czynniki wzrostu, a najczęściej stosowanymi liniami komórkowymi są L-WRN, który wydziela komórki Wnt3a, Rspondin-3 i Noggin39, L-Wnt3a i HA-Rspondin1-Fc 293T40. Pożywka kondycjonowana L-WRN jest wystarczająca do wspierania nie tylko wzrostu organoidów39 w jelicie myszy, ale także wzrostu organoidów jelitowych od kilku zwierząt gospodarskich i towarzyszących, w tym psów, kotów, kurczaków, koni, krów, owiec i świń12. Jednak ludzkie organoidy jelitowe bardzo różnią się pod względem wymagań dotyczących czynników wzrostu, ponieważ wymagają odrębnych preparatów pożywek dla ich fazy wzrostu ekspansji (tj. progresji od małych do dużych sferoidów) w porównaniu z fazą różnicowania (tj. wytwarzaniem i dojrzewaniem zróżnicowanych typów komórek)10. Wymagania dotyczące pożywek organoidów jelitowych szczurów ściśle odzwierciedlają wymagania pożywki ekspansywnej dla organoidów jelitowych ludzkich, ale w szczególności organoidy szczurów są zdolne zarówno do wzrostu, jak i różnicowania w tym środowisku pożywki, co znacznie upraszcza ich wymagania dotyczące hodowli. Podczas gdy nasze początkowe próby koncentrowały się na ustaleniu i hodowli organoidów jelitowych szczurów w pożywkach kondycjonowanych L-WRN, długoterminowa hodowla była wątła, a linie organoidów jelitowych szczurów cierpiały na brak odporności (dane nie pokazane). Może to być spowodowane tym, że linie komórkowe L-WRN są zmodyfikowane do wydzielania R-spondyny 3, podczas gdy zalecana tutaj linia komórkowa 293T-Rspo1 jest zmodyfikowana do wydzielania R-spondyny 1. Możliwe, że organoidy szczurów i ludzi preferują R-spondynę 1, co może odpowiadać za niewydolność linii organoidowych szczurów w pożywkach kondycjonowanych L-WRN.
Aby jak najdokładniej podsumować warunki in vivo , ważne jest opracowanie warunków hodowli organoidów, które pozwalają na przeżycie, utrzymanie i proliferację komórek macierzystych, a także mogą utrzymać obrót komórkowy i jednoczesne różnicowanie się w odrębne typy komórek. W związku z tym stężenia białek rekombinowanych i/lub białek w kondycjonowanych pożywkach muszą być ściśle miareczkowane i kontrolowane, aby osiągnąć tę idealną równowagę. W szczególności optymalne poziomy Wnt są niezbędne, aby uniknąć utraty kultur organoidów jelitowych. Zbyt mała ilość Wnt w kondycjonowanych pożywkach nie będzie w stanie wspierać wzrostu, co prowadzi do utraty komórek macierzystych, a następnie śmierci organoidów; nadmierna aktywacja Wnt spowoduje, że organoidy będą torbielowate i niezróżnicowane10. Chociaż nie jest to tutaj wyszczególnione, zdecydowanie zaleca się przetestowanie każdej partii pożywek kondycjonowanych L-Wnt3a i 293T-Rspo1 za pomocą testu lucyferazy reporterowej Wnt, takiego jak linia komórkowa Topflash41. Wcześniejsze badania opisywały, że optymalna partia pożywek L-Wnt3a powinna skutkować 15-krotnym wzrostem sygnału przy 12,5% i 300-krotnym wzrostem sygnału przy 50%, w porównaniu do 1% L-Wnt3a10. Ponieważ organoidy szczurów są bardziej wrażliwe niż organoidy myszy na wymagania hodowlane, w szczególności poziomy aktywacji Wnt, te dodatkowe etapy kontroli jakości znacznie pomagają w ułatwieniu solidności i niezawodności kultur organoidów szczurów. Ponieważ podobna linia reporterowa nie jest dostępna do testowania aktywności Bmp i względnych stężeń Noggin w pożywkach kondycjonowanych przez Noggin, zaleca się stosowanie rekombinowanego Noggin, gdy tylko jest to możliwe, w celu precyzyjnej kontroli poziomów Noggin. Podczas gdy organoidy jelitowe myszy mogą być hodowane i utrzymywane pod nieobecność Noggin39, nie próbowano tego robić w przypadku kultur organoidów jelitowych szczurów.
Poza wymaganiami dotyczącymi hodowli komórkowych, pomyślne początkowe ustanowienie linii organoidów szczurów zależy w decydującym stopniu od skutecznego zubożenia zróżnicowanych kosmków podczas izolacji krypty. Wysoki poziom zanieczyszczenia villarem powoduje śmierć krypt, przypuszczalnie z powodu sygnałów z umierających komórek lub sekwestracji istotnych czynników. Aby precyzyjnie i konsekwentnie zubożyć te zróżnicowane kosmki z preparatów nabłonkowych, zaleca się wykonanie izolacji nabłonka za pomocą stereoskopu. Oględziny uwalnianego nabłonka dostarczają wyraźnej wskazówki, kiedy należy wyrzucić PBS i wymienić go na inną stronę (ryc. 1). Krypt nie należy zbierać, dopóki nie nastąpi wystarczające wyczerpanie kosmków. Komórki Villar są nieuleczalnie zróżnicowane i nie mogą wytwarzać organoidów w hodowli. Dodatkowo, późniejsze pasażowanie organoidów jelitowych szczurów i ich wykorzystanie do wszelkich dalszych zastosowań wymaga delikatnej pielęgnacji. Inkubacja w odczynnikach dysocjacyjnych przez dłuższy czas (10 minut) powoduje znaczną śmierć komórki i utratę linii organoidowej.
Tutaj opisano prosty i szybki protokół generowania monowarstw jelitowych z organoidów szczurów. Substraty EME i kolagenu I mają różny wpływ na nabłonek, który można wykorzystać w zależności od celu badania. EME pozwala na szybką i wydajną adhezję pojedynczych komórek oraz tworzenie wypustek komórkowych. Natomiast pokrycie powierzchni kolagenem I opóźnia te procesy. Gdy monowarstwy osiągną około 80% konfluencji, komórki wyhodowane na EME zaczynają ponownie generować struktury organoidowe 3D. Brakuje im jednak wystarczającego fizycznego i chemicznego wsparcia dla dalszego wzrostu. Temu powrotowi do stanu organoidów można zapobiec, utrzymując monowarstwy w EME na poziomie 50%-80%. Dodanie rozcieńczonego EME do wierzchołkowej powierzchni monowarstw sprzyja szybkiemu odzyskiwaniu i tworzeniu organoidów de novo, generując obszary konwergencji szybciej i łatwiej. Na powierzchni kolagenu I komórki mogą tworzyć jednolitą monowarstwę i generować małe skupiska. Jednak dodanie kolagenu I do monowarstw nie jest wystarczające do wywołania tworzenia organoidów. EME należy rozcieńczyć podczas dodawania do powierzchni jednowarstwowej, ponieważ powstający organoid będzie musiał pokonać większy opór mechaniczny. Jednak ten rozcieńczony EME nie pozwala na solidne tworzenie dużych organoidów. Wszelkie organoidy szczurów wytworzone de novo, które w naturalny sposób odrywają się od powierzchni, muszą zostać natychmiast usunięte i przeniesione do nierozcieńczonego EME, aby można było przywrócić wsparcie strukturalne i wzrost. Ze względu na mały rozmiar organoidów na tym etapie, nie zaleca się przechodzenia organoidów, dopóki nie zostanie ustalony silny wzrost. Biologiczne znaczenie tego, dlaczego EME może wspierać reformację organoidów, ale nie jest jasne, czy kolagen I może, czy nie. Istnieją jednak doniesienia, że komórki wyhodowane w kolagenie 3D nie mogą tworzyć pączkujących organoidów42,43 ani wspierać długotrwałej konserwacji. Dostępne na rynku produkty EME to niejednorodne mieszaniny białek zewnątrzkomórkowych, głównie lamininy i kolagenu IV44. Dlatego wyraźny skład białek i zdolność komórki nabłonkowej do angażowania się w macierz zewnątrzkomórkową przy użyciu różnych kompleksów komórkowych może pozwolić na przebudowę w EME, ale nie w kolagenie I. Nie przetestowano, czy monowarstwy kolagenu pochodzące z I można umieścić w EME w celu wspierania tworzenia i wzrostu organoidów.
Opisano tutaj manipulację genetyczną modelu organoidów jelitowych szczura oraz przedstawiono protokoły transdukcji lentiwirusowej organoidów 3D i transfekcji przejściowej monowarstw 2D. Aby przezwyciężyć niską skuteczność transdukcji organoidów lentiwirusowych, opracowano protokół przejściowej transfekcji monowarstw 2D. Płaska morfologia i odsłonięte domeny wierzchołkowe monowarstw zapewniają łatwiejszy dostęp do wirusów i kompleksów zawierających DNA. Do walidacji tej techniki wykorzystano ekspresję reportera EGFP przy użyciu wektora pLJM1-EGFP. Ekspresję reporterową GFP obserwowano po 24 godzinach i utrzymywała się ona przez 5-6 dni w monowarstwach. Przyszłe badania koncentrujące się na transdukcji lentiwirusowej monowarstw prawdopodobnie będą miały wyższą skuteczność niż transdukcja organoidów 3D. Korzystając z powyższych protokołów, organoidy 3D mogą być reformowane z zainfekowanych monowarstw 2D, aby ułatwić tworzenie stabilnych linii. Przy zachowaniu ostrożności linie organoidów jelitowych szczurów mogą być z powodzeniem utrzymywane przez ponad rok, pozostając stabilne przez wiele pasaży, kriokonserwowane, pomyślnie rozmrażane i genetycznie modyfikowane za pomocą transdukcji lentiwirusowej, zaspokajając w ten sposób potrzebę dostępnego i wykonalnego modelu organoidów jelitowych in vitro , który zachowuje fizjologiczne znaczenie dla ludzi.

Architektura nabłonka jelita cienkiego człowieka i skład komórkowy są złożone, co odzwierciedla ich funkcje fizjologiczne. Podstawową rolą jelita cienkiego jest wchłanianie składników odżywczych z pożywienia przechodzącego przez jego lumen1. Aby zmaksymalizować tę funkcję, powierzchnia jelita jest zorganizowana w przypominające palce wypustki zwane kosmkami, które zwiększają powierzchnię absorpcyjną, oraz przypominające miseczki wgłębienia zwane kryptami, które mieszczą i izolują komórki macierzyste. W obrębie nabłonka generowane są różne wyspecjalizowane typy komórek absorpcyjnych i wydzielniczych, które pełnią różne funkcje1. Ze względu na tę złożoność trudno było modelować tkanki, takie jak jelito, w nieśmiertelnych, przekształconych liniach komórkowych o wysokim pasażowaniu. Jednak badania nad komórkami macierzystymi, zwłaszcza dorosłymi komórkami macierzystymi i mechanizmami ich różnicowania, pozwoliły na opracowanie hodowli organoidów jelitowych 3D. Wykorzystanie modeli organoidowych zmieniło tę dziedzinę, częściowo ze względu na ich rekapitulację niektórych składników architektonicznych i niejednorodność typów komórek znajdujących się w nienaruszonym jelicie. Organoidy jelitowe mogą być hodowane długoterminowo in vitro ze względu na utrzymanie aktywnej populacji komórek macierzystych2.
Organoidy jelitowe szybko stały się elastycznym modelem do badania biologii komórek macierzystych, fizjologii komórki, chorób genetycznych i żywienia3,4, a także narzędziem do opracowywania nowych metod dostarczania leków5. Ponadto organoidy pochodzące od pacjentów są wykorzystywane m.in. do modelowania chorób, odkrywania leków i spersonalizowanych badań przesiewowych leczenia6,7,8,9. Jednak ludzkie organoidy jelitowe nadal stanowią wyzwanie. Dostępność tkanek, wymagania dotyczące zatwierdzenia przez Instytucjonalną Komisję Rewizyjną oraz kwestie etyczne ograniczają powszechne stosowanie próbek od ludzi. Dodatkowo, ludzkie organoidy jelitowe generowane z krypt jelitowych wymagają dwóch odrębnych warunków hodowli w celu utrzymania niezróżnicowanych komórek macierzystych lub indukowania różnicowania typów dojrzałych komórek10. Kontrastuje to z in vivo, gdzie komórki macierzyste i dojrzałe zróżnicowane typy komórek są jednocześnie obecne i stale generowane/utrzymywane1. Z drugiej strony, organoidy jelitowe myszy, które są hodowane w mniej złożonym koktajlu czynników wzrostu, nie wymagają tej zmiany w składzie pożywki i mogą utrzymywać komórki macierzyste i komórki zróżnicowane w tym samym kontekście podłoża2,11. Jednak kluczowe różnice w jelicie myszy w porównaniu z ludźmi mogą w wielu przypadkach sprawić, że organoidy myszy będą nieoptymalnym modelem. Ogólnie rzecz biorąc, wiele organoidów jelitowych od większych ssaków, w tym koni, świń, owiec, krów, psów i kotów, zostało z powodzeniem wygenerowanych w warunkach hodowli bardziej zbliżonych do organoidów jelitowych myszy niż warunków hodowli organoidów jelitowych ludzkich12. Różnice w warunkach czynnika wzrostu między organoidami mysi i ludzi prawdopodobnie odzwierciedlają różnice w składzie nisz komórek macierzystych i różne wymagania dotyczące przeżycia, proliferacji i utrzymania komórek macierzystych. W związku z tym istnieje zapotrzebowanie na łatwo dostępny modelowy system organoidowy, który 1) bardzo przypomina skład komórek jelitowych człowieka, 2) zawiera komórki macierzyste o wymaganiach dotyczących czynnika wzrostu, takich jak organoidy jelitowe człowieka, oraz 3) jest zdolny do ciągłego utrzymywania niezróżnicowanych i zróżnicowanych przedziałów. Idealnie byłoby, gdyby system opierał się na powszechnie stosowanym przedklinicznym modelu zwierzęcym, tak aby eksperymenty in vivo i in vitro mogły być ze sobą skorelowane i stosowane w tandemie.
Szczury są powszechnie używanym modelem przedklinicznym do badań fizjologii jelit i farmakologii ze względu na ich bardzo podobne fizjologię i biochemię jelit do ludzi13, szczególnie w odniesieniu do przepuszczalności jelit14. Ich stosunkowo większy rozmiar w porównaniu do myszy sprawia, że są bardziej podatne na zabiegi chirurgiczne. Podczas gdy czasami używane są duże modele zwierzęce, w tym świnie, szczury są bardziej przystępnym cenowo modelem, wymagają mniej miejsca do hodowli i mają łatwo dostępne na rynku standardowe szczepy15. Wadą stosowania modeli szczurzych jest to, że zestaw narzędzi genetycznych do badań in vivo nie jest dobrze rozwinięty w porównaniu z myszami, a generowanie nowych linii szczurów, w tym knockoutów, knock-inów i transgeników, jest często zbyt kosztowne. Opracowanie i optymalizacja solidnego modelu organoidów jelitowych szczurów pozwoliłaby na manipulację genetyczną, leczenie farmakologiczne i badania o wyższej przepustowości w dostępnym modelu, który zachowuje kluczowe znaczenie fizjologiczne dla ludzi. Jednak zalety jednego modelu organoidów gryzoni w porównaniu z innym są w dużym stopniu zależne od konkretnego badanego procesu lub genu; Niektóre geny znalezione u ludzi mogą być pseudogenami u myszy, ale nie u szczurów16,17. Dodatkowo, specyficzne dla gatunku podtypy komórek są coraz częściej odkrywane przez jednokomórkowy RNAseq18,19,20. Wreszcie, modele chorób jelit szczurów i myszy często wykazują znaczne różnice w fenotypach21,22 tak, że model, który dokładniej podsumowuje objawy i proces chorobowy obserwowany u ludzi, musi zostać wybrany do dalszych prac. Stworzenie modelu organoidu jelita szczura zapewnia badaczom dodatkową elastyczność i wybór w wyborze systemu modelowego najbardziej odpowiedniego dla ich sytuacji. W tym przypadku istniejące protokoły23,24 są rozszerzone o generowanie organoidów jelitowych szczurów i przedstawiono protokół generowania i utrzymywania organoidów jelitowych szczurów z dwunastnicy lub jelita czczego. Ponadto opisano kilka dalszych zastosowań, w tym zakażenie lentiwirusowe, barwienie całej góry i testy obrzęku forskoliny.

<table><tbody><tr><td>Macierz do hodowli 3D Kolagen szczurzy I</td><td>Cultrex/R& D Systems</td><td>3447-020-01</td><td></td></tr><tr><td>70 &mikro; m Sitko komórkowe</td><td>Corning/Falcon</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>Advanced DMEM/F12</td><td>Gibco/Thermo Fisher</td><td>12634010</td><td></td></tr><tr><td>Amfoterycyna B</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A2942-20ML</td><td></td></tr><tr><td>B-27 Suplement (50X), bez surowicy</td><td>Thermo Fisher</td><td>17504044</td><td></td></tr><tr><td>CHIR99021</td><td>Cayman Chemical</td><td>13122</td><td></td></tr><tr>Technologie komórek macierzystych<td>CryoStor</td><td></td><td>100-1061</td><td></td></tr><tr><td>Cultrex HA-Rspondin1-Fc Komórki 293T</td><td>R & D Systems</td><td>3710-001-01</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Gibco/Thermo Fisher</td><td>16-000-044</td><td></td></tr><tr><td>Gastrin I (człowiek)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G9145</td><td></td></tr><tr><td>Delikatny odczynnik do dysocjacji komórek</td><td>Technologie komórek macierzystych</td><td>100-0485</td><td></td></tr><tr><td>Glutamax</td><td>Thermo Fisher</td><td>35-050-061</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel o obniżonym współczynniku wzrostu, bez czerwieni fenolu</td><td>Corning</td><td></td><td></td>356231</tr><tr><td>HEPES</td><td>AmericanBio</td><td>AB06021</td><td></td></tr><tr><td>Lanolina</td><td>Beantown Chemical</td><td>144255-250G</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamina</td><td>Gibco/Thermo Fisher</td><td>A2916801</td><td></td></tr><tr><td>komórki L-Wnt3a</td><td>ATCC</td><td>CRL-2647</td><td></td></tr><tr><td>Suplement N-2 (100X)</td><td>Thermo Fisher</td><td>17502-048</td><td></td></tr><tr><td>N-acetylocysteina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A9165-5G</td><td></td></tr><tr><td>Amid kwasu nikotynowego&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>N0636</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM I Zredukowana Surowica Medium</td><td>Gibco/Thermo Fisher</td><td>31985070</td><td></td></tr><tr><td>Paraffin</td><td>Fisher Scientific</td><td>P31-500</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P7793</td><td>przezroczysta folia</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Thermo Fisher</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina/Streptomycyna</td><td>Gibco/Thermo Fisher</td><td></td><td></td>15140122</tr><tr><td>pLJM1-EGFP</td><td>Addgene</td><td>19319</td><td></td></tr><tr><td>Polybrene</td><td>Millipore</td><td>TR-1003-G</td><td></td></tr><tr><td>Chlorowodorek polietyleniniminy (PEI)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>764965</td><td></td></tr><tr><td>p-fenylenodiamina&nbsp;</td><td>Acros Organics/Thermo Fisher</td><td>417481000</td><td></td></tr><tr><td>Puromycin</td><td>VWR</td><td>J593-25mg</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinowane ludzkie białko FGF2</td><td>Peprotech</td><td>100-18B-250ug</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinowane ludzkie białko IGF-1</td><td>Biolegend</td><td>B356441</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinowane ludzkie białko Noggin</td><td>R & D Systems</td><td>6057-NG-100</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinowane mysie białko EGF</td><td>Thermo Fisher</td><td>PMG8041</td><td></td></tr><tr><td>Sprague Dawley rat</td><td>Charles River Laboratories</td><td>Szczep 001</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>American Bioanalytical</td><td>AB02025-00500</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE Express Enzyme</td><td>Gibco/Thermo Fisher</td><td>12604013</td><td></td></tr><tr><td>dichlorowodorek</td> <td>Y27632Sigma Aldrich</td><td>Y0503</td><td></td></tr></tbody></table>

wytwarzanie i manipulowanie organoidami jelitowymi szczurów

Generation and Manipulation of Rat Intestinal Organoids

Podczas korzystania z organoidów do oceny fizjologii i decyzji dotyczących losu komórek, ważne jest, aby używać modelu, który dokładnie odzwierciedla konteksty in vivo. W związku z tym organoidy pochodzące od pacjentów są wykorzystywane do modelowania chorób, odkrywania leków i spersonalizowanych badań przesiewowych leczenia. Organoidy jelitowe myszy są powszechnie wykorzystywane do zrozumienia aspektów zarówno funkcji/fizjologii jelit, jak i dynamiki komórek macierzystych/decyzji dotyczących losu. Jednak w wielu kontekstach chorobowych szczury są często preferowane zamiast myszy jako model ze względu na ich większe podobieństwo fizjologiczne do ludzi pod względem patofizjologii choroby. Model szczurzy był ograniczony przez brak narzędzi genetycznych dostępnych in vivo, a organoidy jelitowe szczurów okazały się kruche i trudne do hodowli w dłuższej perspektywie. W tym przypadku opieramy się na wcześniej opublikowanych protokołach, aby solidnie wygenerować organoidy jelitowe szczura z dwunastnicy i jelita czczego. Przedstawiamy przegląd kilku dalszych zastosowań wykorzystujących organoidy jelitowe szczurów, w tym funkcjonalne testy obrzęku, barwienie całego mocowania, generowanie monowarstw enteroidów 2D i transdukcję lentiwirusową. Model organoidów szczurzych stanowi praktyczne rozwiązanie zapotrzebowania na model in vitro, który zachowuje fizjologiczne znaczenie dla ludzi, może być szybko manipulowany genetycznie i jest łatwo uzyskany bez barier związanych z pozyskiwaniem organoidów jelitowych ludzkich.

Organoidy dwunastnicy i jelita czczego szczura zostały wygenerowane zgodnie z protokołem opisanym w sekcji 2. Podczas etapów izolacji krypt bardzo ważne jest skuteczne usunięcie kosmków z PBS. Jeśli zbyt wiele kosmków zostanie wysianych do EME wraz z kryptami, może to doprowadzić do obumarcia całej hodowli i uniemożliwić ustanowienie linii organoidów. Z tego powodu pomocne jest izolowanie krypt pod mikroskopem stereoskopowym, co pozwala na wizualne potwierdzenie usunięcia kosmków. Rycina 1 przedstawia reprezentatywne fragmenty kosmków oraz krypty (Rycina 1A). Należy zwrócić uwagę na znacznie mniejszy rozmiar krypt w porównaniu do kosmków (Rycina 1B). Po wysianiu krypty w ciągu następnych kilku dni przekształcą się w sferoidy, a w dniach 4–7 zaczną pączkować i różnicować się (Rycina 2). Gdy organoidy osiągną etap intensywnego pączkowania, należy je pasażować. Podczas pasażowania ważne jest dostateczne rozbicie organoidów w celu rozdzielenia pączków krypt, co pozwala na zwiększenie liczby organoidów (Rycina 3B).
Skuteczna regeneracja organoidów po zamrożeniu w dużym stopniu zależy od stanu, w którym zostały one zamrożone. Organoidy w silnie proliferacyjnym stanie niedróżnicowanym regenerują się z najwyższą wydajnością. Dlatego zalecamy indukowanie stanu sferycznego i cystycznego zamiast stanu pączkującego i zróżnicowanego. Aby to osiągnąć, można hiperaktywować szlak Wnt poprzez zwiększenie ilości liganda Wnt R-spondin w pożywce oraz poprzez dodanie do pożywki nikotynamidu, który w kilku systemach hodowlanych wykazał działanie wspierające tworzenie organoidów i przeżywalność komórek30,31. Rysunek 3A przedstawia zdrową hodowlę organoidów zaledwie 2 dni po rozmrożeniu. Dodanie BSA do pożywki podczas rozmrażania pomogło również w przeżywalności hodowli organoidów jelitowych szczura, które okazały się bardziej delikatne niż organoidy jelitowe myszy.
Choć hodowla organoidów 3D jest często preferowana, ponieważ odzwierciedla ona pewne elementy naturalnej architektury jelita, sprawia ona, że inne podejścia, w tym obrazowanie na żywo, transfekcje i transdukcje lentiwirusowe, stają się bardziej wymagające technicznie. Zastosowanie monowarstw 2D generowanych z organoidów 3D32 (Rysunek 4) pozwala na bardziej efektywne wprowadzanie plazmidów. Mimo że trójwymiarowe organoidy jelitowe są tradycyjnie oporne na transfekcje przejściowe, plazmidy kodujące EGFP mogą być pomyślnie wprowadzane przy użyciu metod transfekcji opartych na lipidach. Najbardziej efektywne kosztowo podejście z wykorzystaniem PEI opisano w kroku 6.1 (Rysunek 5), jednak elektroporacja i dostępne komercyjnie odczynniki do transfekcji przyniosły również porównywalne wyniki (dane niepokazane). Przyszłe badania skupią się na tym, czy podejścia te mogą być wykorzystane do wprowadzania konstruktów CRISPR do monowarstw.
Kluczowe było umożliwienie ponownego formowania organoidów 3D z monowarstw 2D po transfekcji, aby można było je utrzymywać jako pasażowalną linię z elementami architektury 3D krypt. Co ciekawe, monowarstwy 2D wysiane na EME łatwo przekształcały się z powrotem w małe sferoidy po ponownym dodaniu EME na wierzch komórek, podczas gdy podłoże z kolagenu I nie było wystarczające do odtworzenia struktur 3D (Rysunek 6).
Chociaż transfekcje przejściowe są przydatne w wielu badaniach, często bardziej użyteczne jest tworzenie linii stabilnych, co wymaga wprowadzenia lentiwirusa do komórek. Organoidy jelita szczura zainfekowano lentiwirusem, modyfikując wcześniej opublikowane protokoły (Rysunek 7). Kluczowym krokiem w protokole jest rozbicie organoidów na małe agregaty lub klastry komórkowe. Jeśli kultury nie zostaną skutecznie rozbite i organoidy pozostaną nienaruszone, cząsteczki lentiwirusowe nie dostaną się do wnętrza komórek. Po infekcji organoidy muszą się zregenerować i odrosnąć. Opisany tutaj protokół pozwala na pobranie cząsteczek wirusowych przez 10%-48% (średnia: 19,4% ± 6,5%) komórek przed selekcją.
Barwienie całych organoidów może być utrudnione ze względu na niepełne usunięcie pozostałości EME lub niepełną penetrację przeciwciał. Przedstawiony tutaj protokół umożliwia skuteczne barwienie organoidów. Wizualizacja organoidów w mikroskopie konfokalnym może być również trudna, jeśli znajdują się one zbyt daleko od szkiełka nakrywki. Dzięki zastosowaniu VALAP tworzy się pewną wysokość w studzience, dzięki czemu organoidy nie są zgniatane przez szkiełko nakrywkowe, a jednocześnie mogą one osiąść blisko szkiełka, co ułatwia obrazowanie. Reprezentatywne barwienie na apikalny anionowy kanał regulator przewodnictwa błony komórkowej w mukowiscydozie (CFTR) oraz faloidyną w celu oznakowania aktyny F przedstawiono na Rysunku 8.
Wreszcie organoidy znajdują zastosowanie w testach funkcjonalnych. Organoidy pochodzące od pacjentów z mukowiscydozą były wykorzystywane do badania funkcji białka CFTR, ponieważ opracowanie z agonistą cAMP, forskoliną, indukuje silną zależną od CFTR sekrecję płynu, co prowadzi do obrzęku organoidu29,33-37. Jednym z celów niniejszej pracy było zidentyfikowanie i opracowanie modelu organoidów, który mógłby być stosowany równolegle z badaniami przedklinicznymi in vivo. W związku z tym dążyliśmy do ustalenia, czy jelitowe organoidy szczura ulegają obrzękowi indukowanemu forskoliną. Rzeczywiście, w ciągu 30 min od podania forskoliny organoidy szczura spęczniały, a maksymalny efekt zaobserwowano po 120 min (Rycina 9).
<img alt="Zdjęcia mikroskopowe komórek (A) wskazujące na oddziaływanie i (B) pokazujące izolowany organizm, z zaznaczonymi strzałkami." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65343/65343fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1: Fragmenty kosmków i krypt podczas izolacji nabłonka. (A) Reprezentatywne zdjęcie fragmentów kosmków w roztworze EDTA podczas protokołu izolacji krypt. Żółte groty strzałek zaznaczają fragmenty kosmków. Czerwone strzałki przedstawiają krypty przytwierdzone do fragmentu kosmka. Zwróć uwagę na różnicę w względnych rozmiarach. (B) Zdjęcie pojedynczej krypty (czerwona strzałka) przy większym powiększeniu, umożliwiające wizualizację morfologii. Paski skali: 100 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65343/65343fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Wzrost organoidów w ciągu 7 dni; obrazy mikroskopowe, różnicowanie komórek, hodowla 3D, badanie biologiczne." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65343/65343fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2: Progresja organoidów jelita szczura. Krypty jelita czczego szczura zostały wysiane w EME bezpośrednio po izolacji (A,B). W ciągu 2 dni krypty przekształciły się w sferoidy (C,D). Do 5. dnia zaczęły formować pączki krypt (E,F), które rozwijały się i rosły do 7. dnia (G). Paski skali: 100 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65343/65343fig02large.jpg" target="_blank">Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Mikroskopia kultur komórkowych wykazująca wzrost organoidów, porównanie 2 dni po rozmrożeniu i po pasażowaniu." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65343/65343fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3: Organoidy po rozmrożeniu i pasażowaniu. (A) Organoidy jelita czczego szczura po rozmrożeniu zgodnie z opisanymi protokołami po kriotransporcie. Zwróć uwagę na obecność zarówno sferoidów, jak i organoidów z pączkowaniem zaledwie 2 dni po rozmrożeniu. (B) Ta sama linia organoidów przedstawiona w A bezpośrednio po pasażowaniu zgodnie z opisanym protokołem. Zwróć uwagę na względną różnicę w wielkości struktur w A i B oraz obecność pojedynczych domen przypominających krypty w B. Paski skali: 100 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65343/65343fig03large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Proces wzrostu komórek w EME i Kolagenie I; obraz mikroskopowy kultur po 24 h, 48 h i 5 dniach." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65343/65343fig04.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 4"> 
Rysunek 4: Tworzenie dwuwymiarowej (2D) monowarstwy z trójwymiarowych (3D) organoidów. (A-C) Postęp tworzenia monowarstwy 2D na EME. (D-F) Postęp tworzenia monowarstwy 2D na kolagenie I. W 5. dniu w każdym wariancie osiągnięto konfluencję na poziomie ~80%. Paski skali: 100 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65343/65343fig04large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Obrazy z mikroskopii fluorescencyjnej wykazujące ekspresję pLJM1-EGFP w hodowlach komórkowych, analiza emisji." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65343/65343fig05.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 5"> 
Rycina 5: Przejściowa transfekcja monowarstwy 2D. Reprezentatywny obraz monowarstwy 2D hodowanej na EME, poddanej przejściowej transfekcji plazmidem pLJM1-EGFP przy użyciu PEI. (A) pole jasne, (B) fluorescencja (GFP), (C) nałożenie obrazów. Czerwona przerywana linia oznacza granicę monowarstwy. Paski skali: 100 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65343/65343fig05large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Obraz mikroskopowy struktur komórkowych w EME i Kolagenie I, podkreślający morfologię tkanki." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65343/65343fig06.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 6"> 
Rysunek 6: Ponowne formowanie organoidów 3D z monowarstw 2D na EME. (A) Powstawanie organoidów 3D z monowarstw 2D hodowanych na EME. Organoidy uformowały się efektywnie w ciągu 5 dni po dodaniu EME na powierzchnię apikalną monowarstwy. Zwróć uwagę na obfitość martwych komórek otaczających małe sferoidy 3D. (B) Przetrwanie monowarstw 2D 5 dni po dodaniu kolagenu I na powierzchnię apikalną monowarstw 2D hodowanych na kolagenie I. Paski skali: 100 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65343/65343fig06large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Ekspresja jądrowego GFP, obrazy z mikroskopii konfokalnej, badanie lokalizacji komórkowej, zielona fluorescencja." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65343/65343fig07.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 7"> 
Rycina 7: Infekcja lentiwirusem organoidów 3D. Organoidy jelita czczo szczura zostały zainfekowane lentiwirusem z jądrowym GFP zgodnie z opisanym protokołem. Po regeneracji i wzroście przez 5 dni organoidy utrwalono i przebarwiono DAPI. (A) DAPI: szary; nuclearGFP: zielony. (B) nuclearGFP: zielony. Czerwona przerywana linia wyznacza granicę organoidu. Paski skali: 50 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65343/65343fig07large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Wyniki mikroskopii fluorescencyjnej przedstawiające barwienie CFTR i faloidyną struktur komórkowych." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65343/65343fig08.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 8"> 
Rycina 8: Immunofluorescencja całych preparatów organoidów jelitowych szczura. (A) CFTR, (B) faloidyna oraz (C) nałożone obrazy immunofluorescencji całych preparatów organoidów jelita cienkiego (ciśniej) szczura. Zwróć uwagę na apikalne wzbogacenie barwienia CFTR w organoidach (szary kolor w A, magenta w C). Faloidyna znakuje aktynę F i wyraźnie barwi apikalne rąbka szczoteczkowe (szary kolor w B, cyjan w C). Paski skali: 25 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65343/65343fig08large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Obrazy z mikroskopii poklatkowej wzrostu komórek w ciągu 120 minut; analiza dynamiki proliferacji." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65343/65343fig09.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 9"> 
Rycina 9: Organoidy jelitowe szczura pęcznieją po stymulacji forskoliną. Reprezentatywny przebieg czasowy pęcznienia organoidu jelitowego szczura po dodaniu agonisty cAMP, forskoliny. Czas 0 min reprezentuje punkt czasowy bezpośrednio przed dodaniem 10 µM forskoliny. Obrazy przedstawiają ten sam organoid w odstępach 30 min. Maksymalne pęcznienie zaobserwowano w 120 min po dodaniu forskoliny. Czerwona przerywana linia wyznacza granicę organoidu. Ciemny materiał w środku światła organoidu składa się z martwych komórek. Paski skali: 100 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65343/65343fig09large.jpg" target="_blank">Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.</a>
Tabela 1: Skład pożywki AdDMEM+. Składniki do przygotowania standardowej pożywki AdDMEM+, która stanowi pożywkę podstawową we wszystkich opisanych tutaj metodach. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65343/Table1_Re.xlsx" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.</a>
Tabela 2: Skład pożywki do organoidów jelitowych szczura (rIOM). Szczegółowy skład standardowej pożywki do organoidów jelitowych szczura, obejmujący rozpuszczalnik oraz warunki przechowywania białek rekombinowanych. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65343/Table2_RE.xlsx" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.</a>
Tabela 3: Roztwory. Przepisy i instrukcje przygotowania pozostałych roztworów stosowanych w protokole. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65343/Table3_resub2_Re.xlsx" target="_blank">Prosimy kliknąć tutaj, aby pobrać tę tabelę.</a>
Tabela 4. Pożywka do organoidów jelita szczura dla hodowli monowarstw 2D (rIOM2D). Zmodyfikowany skład pożywek do hodowli organoidów, zoptymalizowany pod kątem wzrostu monowarstw w 2D. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65343/Table4_resub2_RE.xlsx" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.</a>

Tutaj prezentujemy protokół do generowania organoidów jelitowych szczurów i używania ich w kilku dalszych zastosowaniach. Szczury są często preferowanym modelem przedklinicznym, a solidny układ organoidów jelitowych wypełnia zapotrzebowanie na system in vitro towarzyszący badaniom in vivo.

Wytwarzanie i manipulowanie organoidami jelitowymi szczurów

When using organoids to assess physiology and cell fate decisions, it is important to use a model that closely recapitulates in vivo contexts. ...

W tym badaniu ustaliliśmy model organoidów jelitowych szczurów, który jest solidny w długotrwałej hodowli komórkowej. Pokazujemy również pierwsze udane manipulacje genetyczne z wykorzystaniem zarówno infekcji lentiwirusowej, jak i transfekcji przejściowej. Model ten jest doskonałym narzędziem do manipulowania biologią jelit u szczurów, gdzie narzędzia genetyczne dostępne in vivo są ograniczone.Organoidy jelitowe szczurów były wcześniej trudne do długoterminowej hodowli. Generując solidny, genetycznie modyfikowalny model organoidu szczura, zapewniamy naukowcom dodatkową elastyczność i możliwość wyboru modelu organoidowego najlepiej dopasowanego do ich konkretnej sytuacji. Organoidy jelitowe myszy są wykorzystywane do badania zachowania komórek macierzystych, losu komórek i fizjologii, ale mogą być modelem nieoptymalnym, ponieważ istnieją kluczowe różnice między biologią myszy i człowieka.Z drugiej strony, ludzkie organoidy jelitowe mogą być trudne do uzyskania i mieć złożone wymagania dotyczące hodowli komórkowych. Opisywany przez nas model organoidów szczurów zachowuje kluczowe znaczenie fizjologiczne dla biologii człowieka, a jednocześnie jest znacznie łatwiejszy w dostępie i pielęgnacji niż organoidy jelitowe człowieka. Opracowanie i optymalizacja modelu organoidów jelitowych szczurów pozwala na manipulację genetyczną, leczenie farmakologiczne i bardziej przepustowe badania biologii jelit w dostępnym modelu o kluczowym znaczeniu fizjologicznym dla ludzi.Ponadto te organoidy szczurów pozwolą na badanie specyficznej dla gatunku fizjologii, losów komórek i zmian fenotypowych w modelach chorób w jelicie. Na początek umieść uśpionego szczura na powierzchni sekcyjnej brzuszną stroną do góry. Ściśnij warstwę skóry sterylnymi kleszczami i wykonaj nacięcia na poziomie powierzchni, unikając uszkodzenia narządów wewnętrznych.Używając dużych ostrych nożyczek do preparowania, wykonaj podłużne nacięcie na poziomie powierzchni pośrodku brzucha, a następnie wychodząc z tego cięcia, wykonaj dwa krótsze poziome cięcia, po jednym z każdej strony. Za pomocą kleszczy oderwij skórę, aby odsłonić jamę brzuszną. Przeciąć błonę otrzewną, aby w pełni odsłonić narządy wewnętrzne w jamie brzusznej z łatwym dostępem do jelita.Za pomocą nożyczek i kleszczy zlokalizuj żołądek i zidentyfikuj dwunastnicę, około dwóch do trzech centymetrów dystalnie do niej, która pojawia się jako żółtawy segment. Bliższe jelito czcze znajduje się około czterech do pięciu centymetrów dystalnie od więzadła Treitza, punktu orientacyjnego między dwunastnicą a jelitem czczym. Umieść wyizolowany fragment jelita na 10-centymetrowej szalce Petriego.Przepłucz żądany segment jelita 10 mililitrami lodowatego PBS, aż zostanie oczyszczony z zawartości światła. Na ręczniku papierowym pokrój odcinek jelitowy na dwucentymetrowe kawałki. Następnie otwórz każdy kawałek jelita wzdłużnie, aby odsłonić nabłonek.Zeskrob odsłoniętą powierzchnię luminalną za pomocą szklanego szkiełka mikroskopowego, aby usunąć kosmki. Umieść kawałki jelita w roztworze EDTA na lodzie i obracaj w czterech stopniach Celsjusza przez 30 minut na rewolwerze rurowym ustawionym na 10 obr./min. Pod mikroskopem preparacyjnym wlej zawartość probówki do 10-centymetrowej szalki Petriego.Dodaj dodatkowe pięć mililitrów lodowatego PBS. Za pomocą cienkich kleszczy przytrzymaj segment jelita i energicznie potrząśnij, aby obserwować, jak nabłonek uwalnia się do PBS. Początkowo PBS będzie zawierał głównie kosmki.Ciągle potrząsaj fragmentami jelita. Okresowo wyrzucaj PBS zawierający kosmki i dodaj 10 mililitrów świeżego PBS do fragmentów jelita. Kontynuuj potrząsanie fragmentami i powtarzaj etap mycia PBS, aż kosmki przestaną być uwalniane do PBS, ale zamiast tego PBS zawiera głównie krypty.Odrzuć pozostałe fragmenty jelita i wzbogać pozostały PBS na szalce Petriego w celu uzyskania krypt jelitowych. W kapturze do hodowli tkankowej zbierz krypty zawierające PBS i przefiltruj przez drenaż komórek o wielkości 70 mikronów. Odwirować filtrat o sile 250G przez pięć minut.Następnie usuń ich supernatant i ponownie zawieś osad w pięciu milimetrach Advanced DMEM Plus. Ponownie odwirować przy 250G przez pięć minut i usunąć supernatant, pozostawiając 50 mikrolitrów pożywki z osadem. Zawiesić osad w pozostałym podłożu i dodać go do podwielokrotności ekstraktu z macierzy zewnątrzkomórkowej lub EME na lodzie.Delikatnie pipetuj w górę iw dół, aby zawiesić krypty równomiernie w całym EME, unikając tworzenia pęcherzyków. Umieść 50 mikrolitrów kopuł EME w 35-milimetrowym naczyniu do hodowli tkankowych. I inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla przez 20 minut.Po inkubacji dodać dwa mililitry pożywki organoidowej jelita szczura lub RIOM zawierającej po 10 mikromolowców Y27632 i CHIRA99021. Następnie, aby przejść organoidy jelitowe szczura, odessać pożywkę z płytki zawierającej organoidy i dodać jeden mililitr odczynnika dysocjacyjnego, aby uwolnić organoidy z kopuł EME. Przenieść odczynnik dysocjacyjny z rozdrobnionymi organoidami do stożkowej probówki o pojemności 15 mililitrów.Umyj płytkę hodowlaną dwoma mililitrami Advanced DMEM Plus i dodaj ją do 15-mililitrowej stożkowej probówki zawierającej rozdrobnione organoidy. Używając szklanej pipety Pasteura, delikatnie pipetuj w górę i w dół 15 do 20 razy, aby rozdrobnić organoidy. Odwirować organoidy w temperaturze 350G przez dwie minuty i dodać 50 mikrolitrów roztworu z dna probówki do EME.Po wymieszaniu roztworu, umieść 50 mikrolitrów kopuł EME w 35-milimetrowym naczyniu do hodowli tkankowych i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla przez 20 minut. Po inkubacji dodać dwa mililitry RIOM zawierające po 10 mikromolowców Y27632 i CHIRA99021. Pokazane są reprezentatywne wizerunki fragmentów villaru i krypt.Krypty są mniejsze w porównaniu do kosmków. Platerowane uchwyty rozszerzają się w ciągu następnych kilku dni i zaczynają pączkować i różnicować się w dniach od czterech do siedmiu dni. Po dwóch dniach rozmrażania zdrowa kultura organoidów wykazała obecność zarówno sferoidów, jak i pączkujących organoidów.Ta sama linia organoidów po zapakowaniu wykazała obecność pojedynczych domen podobnych do krypt. Aby pokryć płytkę EME, rozcieńczyć EME od 1 do 20 w zimnym Advanced DMEM Plus. W przypadku powlekania kolagenem rozcieńczyć pięć miligramów na mililitr kolagenu jeden w Advanced DMEM Plus do 100 mikrogramów na mililitr.Pokryj płytkę 200 mikrolitrami rozcieńczonego EME lub kolagenu, aby całkowicie pokryć powierzchnię studzienki, i inkubuj przez jedną do dwóch godzin w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Aby wygenerować monowarstwy, należy odessać pożywkę z 35-milimetrowej płytki zawierającej organoidy. Dodaj jeden mililitr PBS i rozerwij EME w studzienkach za pomocą końcówki P1000, pipetując w górę iw dół około 20 razy, aby poluzować cały EME.Przenieś zawartość do stożkowej probówki o pojemności 15 mililitrów. Dodaj jeden mililitr PBS do płytki, aby zebrać dodatkowe organoidy i przenieś je do tej samej stożkowej probówki. Odwirować próbkę o sile 350 G przez dwie minuty i usunąć supernatant, w tym wszelkie pozostałości EME.Następnie dodaj jeden mililitr roztworu trypsyny do osadu organoidowego i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez dwie minuty. Pipetuj w górę i w dół 10 razy za pomocą końcówki P1000 i dodaj dwa mililitry Advanced DMEM Plus, aby zneutralizować trypsynę. Wirować przy 350 G przez pięć minut i odessać supernatant przed ponownym zawieszeniem osadu w 4,8 mililitra RIOM 2D.Usuń nadmiar EME lub kolagenu w Advanced DMEM Plus z dołków. Następnie dodaj 200 mikrolitrów organoidów w RIOM 2D i 10 mikromolowych Y27632 do każdego wstępnie pokrytego dołka. Po czterech do 16 godzinach zebrać pożywkę i odwirować w temperaturze 1000G przez jedną minutę.Przenieść supernatant do nowej stożkowej probówki o pojemności 15 mililitrów i wyrzucić osad. Umyj każdą studzienkę 300 mikrolitrami PBS przed dodaniem 200 mikrolitrów odwirowanego RIOM 2D do każdej studzienki. Zmieniaj RIOM 2D co dwa do trzech dni, zawieszając stosowanie monowarstw Y27632.2D pokrytych na EME, które łatwo przekształcały się w małe sferoidy, gdy EME został dodany z powrotem do górnej części komórek.Natomiast jeden substrat kolagenowy był niewystarczający do zreformowania struktur 3D.

generation-and-manipulation-of-rat-intestinal-organoids

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

W tym protokole wideo krok po kroku wyjaśniamy transdukcję lentiwirusową w organoidach pierwotnego nabłonka jelitowego oraz przetwarzanie i dalszą analizę tych kultur za pomocą ilościowego RT-PCR, RNA-mikromacierzy i immunohistochemii.

Protokół transdukcji lentiwirusowej i dalszej analizy organoidów jelitowych

Opisujemy instrukcje krok po kroku, aby: 1) efektywnie konstruować organoidy jelitowe za pomocą nanocząsteczek magnetycznych do transdukcji soczewicowacej lub retrowirusowej, oraz 2) generować zamrożone skrawki z zmodyfikowanych organoidów. Podejście to zapewnia potężne narzędzie do efektywnej zmiany ekspresji genów w organoidach w celu zbadania dalszych efektów.

Inżynieria genetyczna pierwotnych organoidów jelitowych myszy z wykorzystaniem wektorów wirusowych transdukcji nanocząstek magnetycznych do zamrożonego cięcia

Ten protokół pozwala na różnicowanie ludzkich komórek pluripotencjalnych w organoidy jelitowe. Protokół naśladuje normalny rozwój człowieka poprzez różnicowanie komórek w populację ostatecznej endodermy, endodermy jelita tylnego, a następnie nabłonka jelitowego. To sprawia, że protokół nadaje się zarówno do badania rozwoju jelit, jak i zastosowań modelowania chorób.

Generowanie organoidów jelitowych pochodzących z hiPSC do zastosowań w modelowaniu rozwoju i choroby

Tutaj prezentujemy dwa protokoły, które pozwalają na modelowanie interakcji specyficznych dla wierzchołka jelita. Monowarstwy jelitowe pochodzące z organoidów i kultury interfejsu powietrze-ciecz (ALI) ułatwiają wytwarzanie dobrze zróżnicowanego nabłonka dostępnego zarówno od strony luminalnej, jak i podstawnej, podczas gdy organoidy jelitowe z odwróconą polaryzacją odsłaniają swoją wierzchołkową stronę i są podatne na testy o wysokiej przepustowości.

Metody hodowli do badania interakcji specyficznych dla wierzchołka przy użyciu modeli organoidów jelitowych

W tym miejscu opisano szczegółowe metody generowania, utrzymywania i charakteryzowania ludzkich organoidów jelita cienkiego i okrężnicy pochodzących z pluripotencjalnych komórek macierzystych. Metody te mają na celu poprawę odtwarzalności, rozszerzenie skalowalności i skrócenie czasu pracy wymaganego do posiewu i pasażowania organoidów.

Wytwarzanie, utrzymanie i charakterystyka ludzkich organoidów jelitowych i okrężnicy pochodzących z pluripotencjalnych komórek macierzystych

Ten protokół opisuje model wierzchołkowego martwiczego zapalenia jelit (NEC) w naczyniu, wykorzystujący enteroidy jelita cienkiego z odwróconą polaryzacją, umożliwiającą dostęp do powierzchni wierzchołkowej. Zapewniamy protokół barwienia immunofluorescencyjnego w celu wykrycia przerwania nabłonka związanego z NEC oraz metodę określania żywotności enteroidów wierzchołkowych poddanych protokołowi NEC-in-a-dish.

In vitro Wierzchołkowy model enteroidalny martwiczego zapalenia jelit

Opisujemy protokół izolowania mysich krypt jelita cienkiego i hodowania organoidów 3D jelit z krypt. Dodatkowo opisujemy metodę generowania organoidów z pojedynczej jelitowej komórki macierzystej przy braku podnabłonkowej niszy komórkowej.

Hodowla 3D organoidów z krypt jelit mysich i pojedynczej komórki macierzystej do badań nad organoidami

To badanie przedstawia protokół generowania monowarstw 2D organoidów wieprzowych pochodzących z jelita cienkiego i grubego. Wzrost tych monowarstw charakteryzuje się rosnącymi wartościami TEER, co wskazuje na solidną integralność nabłonka. Dodatkowo, te monowarstwy wykazują fizjologiczne reakcje wydzielnicze w eksperymentach w komorze Ussing po zastosowaniu forskoliny.

Dwuwymiarowe organoidy jelitowe świń odzwierciedlające fizjologiczne właściwości rodzimego jelita

Tutaj opisujemy protokół generowania organoidów wierzchołkowych z jelit ze standardowych kultur organoidów osadzonych w matrycy. Przedstawiono również późniejsze włączenie EdU do aktywnie proliferujących komórek i półautomatyczną kwantyfikację komórek EdU-dodatnich.

Wytwarzanie wierzchołkowych organoidów jelitowych i ocena szybkości proliferacji organoidów za pomocą znakowania EdU

Opisujemy prosty protokół tworzenia organoidów nabłonkowych śluzowo-rzęskowych z głębokich komórek ektodermy wyizolowanych z zarodków Xenopus laevis. Multipotencjalne komórki progenitorowe regenerują prekursory nabłonkowych komórek kubkowych i umożliwiają śledzenie na żywo inicjacji i progresji przemian komórkowych na powierzchni organoidów.

Organoidy nabłonkowe śluzowo-rzęskowe z komórek embrionalnych Xendopus: generacja, hodowla i obrazowanie na żywo w wysokiej rozdzielczości

Poznaj metody wytwarzania i manipulacji genetycznej organoidów jelitowych szczurów przy użyciu infekcji lentiwirusowej i transfekcji przejściowej. Model ten umożliwia długoterminową hodowlę komórkową i badania biologii jelitowej.

Wytwarzanie i manipulowanie organoidami jelitowymi szczurów

Przeglądaj więcej filmów