Name: Wykorzystanie organoidów jelitowych człowieka do zrozumienia nabłonka jelita cienkiego na poziomie transkrypcji pojedynczej komórki (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-06-28T13:20:00.000+00:00
Duration: 8 min 23 s
Description: Odkryj analizę transkryptomiczną pojedynczych komórek w ludzkich organoidach jelitowych. Ta metoda umożliwia badanie heterogeniczności komórkowej nabłonka jelita cienkiego i identyfikację biomarkerów chorób jelitowych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy przyjmują do wiadomości U19 AI157984, U01 DK103168, U19 AI144297, P30 DK56338, P01 AI057788, U19 AI116497 granty oraz NASA Cooperative Agreement Notice/TRISH NNX16AO69A.

Integrating Single-Cell Transcriptomics with Human Intestinal Organoids

<ol><li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+expansion+of+epithelial+organoids+from+human+colon%2C+adenoma%2C+adenocarcinoma%2C+and+Barrett%27s+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium.</a> Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).</li>
<li>Blutt, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gastrointestinal+microphysiological+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Biol+Med%22%5BJournal%5D)">Gastrointestinal microphysiological systems.</a> Exp Biol Med. 242 (16), 1633-1642 (2017).</li>
<li>VanDussen, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+an+enhanced+human+gastrointestinal+epithelial+culture+system+to+facilitate+patient-based+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Gut%22%5BJournal%5D)">Development of an enhanced human gastrointestinal epithelial culture system to facilitate patient-based assays.</a> Gut. 64 (6), 911-920 (2015).</li>
<li>Elmentaite, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cells+of+the+human+intestinal+tract+mapped+across+space+and+time%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cells of the human intestinal tract mapped across space and time.</a> Nature. 597 (7875), 250-255 (2021).</li>
<li>Hickey, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organization+of+the+human+intestine+at+single-cell+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Organization of the human intestine at single-cell resolution.</a> Nature. 619 (7970), 572-584 (2023).</li>
<li>Burclaff, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+proximal-to-distal+survey+of+healthy+adult+human+small+intestine+and+colon+epithelium+by+single-cell+transcriptomics%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Mol+Gastroenterol+Hepatol%22%5BJournal%5D)">A proximal-to-distal survey of healthy adult human small intestine and colon epithelium by single-cell transcriptomics.</a> Cell Mol Gastroenterol Hepatol. 13 (5), 1554-1589 (2022).</li>
<li>Triana, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+transcriptomics+reveals+immune+response+of+intestinal+cell+types+to+viral+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Syst+Biol%22%5BJournal%5D)">Single-cell transcriptomics reveals immune response of intestinal cell types to viral infection.</a> Mol Syst Biol. 17 (7), e9833(2021).</li>
<li>Triana, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+analyses+reveal+SARS-CoV-2+interference+with+intrinsic+immune+response+in+the+human+gut%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Syst+Biol%22%5BJournal%5D)">Single-cell analyses reveal SARS-CoV-2 interference with intrinsic immune response in the human gut.</a> Mol Syst Biol. 17 (4), e10232(2021).</li>
<li>Fujii, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+intestinal+organoids+maintain+self-renewal+capacity+and+cellular+diversity+in+niche-inspired+culture+condition%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Human intestinal organoids maintain self-renewal capacity and cellular diversity in niche-inspired culture condition.</a> Cell Stem Cell. 23 (6), 787-793 (2021).</li>
<li>Beumer, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BMP+gradient+along+the+intestinal+villus+axis+controls+zonated+enterocyte+and+goblet+cell+states%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">BMP gradient along the intestinal villus axis controls zonated enterocyte and goblet cell states.</a> Cell Rep. 38 (9), 110438(2022).</li>
<li>Beumer, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+mRNA+and+secretome+atlas+of+human+enteroendocrine+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">High-resolution mRNA and secretome atlas of human enteroendocrine cells.</a> Cell. 182 (4), 1062-1064 (2020).</li>
<li>Busslinger, G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+gastrointestinal+epithelia+of+the+esophagus%2C+stomach%2C+and+duodenum+resolved+at+single-cell+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Human gastrointestinal epithelia of the esophagus, stomach, and duodenum resolved at single-cell resolution.</a> Cell Rep. 34 (10), 108819(2021).</li>
<li>Luecken, M. D., Theis, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+best+practices+in+single-cell+RNA-seq+analysis%3A+a+tutorial%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Syst+Biol%22%5BJournal%5D)">Current best practices in single-cell RNA-seq analysis: a tutorial.</a> Mol Syst Biol. 15 (6), e8746(2019).</li>
<li>Heumos, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Best+practices+for+single-cell+analysis+across+modalities%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Best practices for single-cell analysis across modalities.</a> Nat Rev Genet. 24 (8), 550-572 (2023).</li>
</ol>

Autorzy nie pozostają w konflikcie interesów.

Korzystając z platform genomiki pojedynczej komórki, złożone systemy biologiczne, takie jak hodowle HIO pochodzące z tkanek, które modelują nabłonek jelitowy, mogą zostać rozbite w celu uzyskania indywidualnego wkładu komórkowego w ogólną odpowiedź biologiczną 4,5,6. Można również zidentyfikować i zbadać heterogeniczność komórkową i rzadkie populacje komórek. Wejście komórkowe musi zostać zoptymalizowane, aby zmaksymalizować wydajność przy użyciu platform opartych na transkryptomii pojedynczej komórki. W tym miejscu opisujemy protokoły, które pozwolą uzyskać wysoce żywotne i dobrej jakości zawiesiny pojedynczych komórek, które zwiększą prawdopodobieństwo uzyskania dalszych danych transkryptomicznych wysokiej jakości. Znajomość protokołu ma ogromne znaczenie i zaleca się wykonanie kilku prób przed przystąpieniem do przygotowania biblioteki. Sugeruje się powtarzalne osiągnięcie żywotnych zawiesin pojedynczych komórek przed użyciem komórek do przygotowania biblioteki. Szybkość, z jaką protokół jest wdrażany, ma ogromne znaczenie, ponieważ szybkość jest wprost proporcjonalna do wyników rentowności. Na tej podstawie zaleca się ograniczenie liczby próbek obsługiwanych jednocześnie. Zaleca się nawiązanie kontaktu z jednostką, która przygotuje biblioteki przed zainicjowaniem tych protokołów, w celu uzyskania pomocy w rozwiązywaniu problemów.
Żywotność HIO ma bezpośredni wpływ na bibliotekę DNA wysyłaną do sekwencjonowania. Żywotność komórek HIO zależy od kilku etapów przygotowania zawiesiny pojedynczej komórki, w tym dysocjacji, wirowania,, pipetowania i dokładności zliczania. Celem przygotowania HIO do platformy jest zrównoważenie utrzymania żywotności komórek z jakością próbki. Kluczowe znaczenie dla uzyskania wysokiej jakości danych ma minimalizacja agregatów komórkowych, martwych komórek, niekomórkowych kwasów nukleinowych i biochemicznych inhibitorów odwrotnej transkrypcji. Umierające komórki zwiększają szum kwasów nukleinowych i przyczyniają się do zlepiania się komórek, co prowadzi do awarii danych i platform 7,8,9,10,11,12. Filtrowanie przy użyciu odpowiedniego rozmiaru filtru może pomóc w usuwaniu dużych wartości zagregowanych i poprawie jakości danych.
Należy wziąć pod uwagę kilka czynników, aby zminimalizować śmierć komórek HIO podczas przygotowywania zawiesin pojedynczych komórek. Konieczne jest uzyskanie co najmniej 80% żywotnych komórek, a >90% żywotności jest jeszcze bardziej pożądane. Próbki z dużą liczbą komórek niezdolnych do życia można ulepszyć, stosując strategie usuwania martwych komórek, takie jak mikrogranulki kolumnowe, chociaż wymagają one większej liczby komórek początkowych i większych objętości próbek z powodu strat podczas przenoszenia. HIO są szczególnie wrażliwe na i ulegną śmierci komórki, jeśli zostaną pozostawione zbyt długo w RT w niektórych. Pożywki organoidowe powodują najmniejszą utratę komórek i tworzenie agregatów. Pipetowanie może również wpływać na żywotność HIO podczas dysocjacji. Końcówki z regularnymi otworami mogą ścinać organoidy, pomagając w dysocjacji na zawiesiny pojedynczych komórek; jednak zbyt szybkie pipetowanie za pomocą końcówki o zwykłym otworze może spowodować uszkodzenie ogniw HIO w wyniku działania sił ścinających. Powolne pipetowanie z końcówkami o szerokim otworze minimalizuje naprężenia w ogniwach HIO i znacznie poprawia liczbę żywotnych komórek w dalszej części procesu. Wirowanie, mycie i ponowne zawieszanie to inne czynniki, które mogą wpływać na jakość zawiesin jednokomórkowych HIO. Wirowanie z wahadłowym wiadrem powoduje łagodniejsze granulowanie komórek HIO, co skutkuje mniejszą liczbą martwych komórek przy jednoczesnej minimalizacji utraty komórek. Wreszcie, dokładność zliczania w celu określenia stężenia jest niezbędna, aby zapewnić, że maksymalna liczba komórek dotrze do platformy w celu syntezy bibliotecznej. Dbałość o te szczegóły zaowocuje zminimalizowaniem naprężeń na ogniwach HIO podczas procesu izolacji i zapewni najwyższe prawdopodobieństwo powrotu danych po przetworzeniu.
Chociaż transkryptomika pojedynczych komórek jest potężnym narzędziem do analizy profili biologicznych i odpowiedzi na poziomie pojedynczej komórki 4,5,6, istnieje kilka ograniczeń, które należy wziąć pod uwagę przy stosowaniu tej technologii do analizy kultur organoidów jelitowych człowieka. Po pierwsze, może wystąpić znaczna zmienność transkrypcji ze względu na zmienność techniczną wprowadzoną podczas przygotowywania i sekwencjonowania biblioteki lub ze względu na efekty wsadowe wynikające z przygotowania próbki. Ponadto sekwencjonowanie może powodować błąd systematyczny w zakresie pokrycia, w którym występuje nierówna głębokość sekwencjonowania w genach lub komórkach. Powoduje to wyzwania podczas wykrywania genów o niskiej ekspresji lub identyfikacji rzadkich populacji komórek. Po drugie, identyfikacja typów komórek może być trudna ze względu na niejednorodność komórkową i transkrypcyjną kultur organoidów oraz mniej zróżnicowany profil komórkowy w porównaniu z natywnym nabłonkiem jelitowym. Sprzężenie odpowiedzi transkrypcyjnych z funkcjonalnymi fenotypami jest również wyzwaniem i wymaga dodatkowej walidacji przy użyciu innych podejść lub testów. Po trzecie, podejście to nie obejmuje uwzględnienia kontekstu przestrzennego ani dynamiki czasowej komórek. Procedura dysocjacji usuwa możliwość wnioskowania o interakcjach komórka-komórka na podstawie danych transkrypcyjnych. Dostarcza tylko jednej migawki w czasie stanu komórkowego, a nie kontinuum biologicznego. Wreszcie, podejścia transkrypcyjne oparte na pojedynczych komórkach mogą być kosztowne i wymagać specjalistycznych narzędzi obliczeniowych oraz wiedzy bioinformatycznej. Jednak podejście to nadal pozostaje dominującym najnowocześniejszym narzędziem do zrozumienia heterogeniczności komórkowej i identyfikacji nowych typów komórek.

Nabłonek jelita cienkiego ma dwie odrębne strefy: kryptę, w której znajduje się komórka macierzysta jelita (ISC) i kosmki, które składają się ze zróżnicowanych komórek linii wydzielniczej i absorpcyjnej. Dodatkową złożonością jest regionalna specyfika nabłonka, która zapewnia unikalne właściwości funkcjonalne między regionami jelita cienkiego. Pionierskie prace pozwoliły stworzyć warunki hodowli, w których zarówno krypta ludzkiego jelita cienkiego, jak i strefy kosmków mogą być generowane ex vivo z tkanek chirurgicznych lub biopsji tkanek1. Kultury te wypełniają lukę między badaniami na zwierzętach a próbami klinicznymi i ujawniają wcześniej nierozpoznaną biologię komórki, biochemię i fizjologię przewodu pokarmowego. HIO są rozmnażane jako sferyczne struktury 3D przy użyciu pożywki z czynnikami wzrostu, które promują żywotność komórek macierzystych i zewnątrzkomórkowe matryce podporowe. Warunki te skutkują powstaniem przypominającego kryptę modelu HIO, który składa się głównie z komórek progenitorowych i komórek macierzystych. Usunięcie czynników wzrostu sprzyja różnicowaniu ISC (model podobny do kosmków) i wytwarzaniu dojrzałych komórek nabłonka jelitowego (kubkowego, enteroendokrynnego, kępkowego, enterocytowego) w odpowiednich proporcjach wraz z proliferacją i różnicowaniem komórek, polaryzacją, integralnością bariery, specyficznymi cechami regionu i odpowiednimi reakcjami fizjologicznymi2. Kultury HIO są stabilne genetycznie i mogą być rozmnażane w nieskończoność w stanie przypominającym kryptę. Łatwy dostęp do powierzchni wierzchołkowej tych kultur zapewniają warunki hodowli, które umożliwiają wzrost w formacie jednowarstwowym3. HIO pozwalają również na uwzględnienie w analizach biologicznych zmienności osobniczej gospodarza, takiej jak genetyka, wiek, płeć, pochodzenie etniczne i status choroby. Narzędzia analityczne i oceny funkcjonalnej są identyczne z tymi stosowanymi w podejściach skoncentrowanych na transformowanych liniach komórkowych i obejmują różne techniki molekularne, takie jak cytometria przepływowa, mikroskopia, transkryptomika, proteomika i metabolomika.
Transkryptomika pojedynczej komórki rewolucjonizuje nasze rozumienie biologii i fizjologii jelita cienkiego, dostarczając wglądu w indywidualny wkład każdego typu komórki w proces biologiczny. Pionierskie prace z wykorzystaniem tej technologii dostarczyły krajobrazu typów komórek obecnych w rodzimym jelicie ludzkim 4,5,6. Platformy profilowania transkrypcji pojedynczych komórek umożliwiają eksplorację krajobrazu transkrypcyjnego poszczególnych komórek, dzięki czemu heterogeniczność komórek może wysunąć się na pierwszy plan badań naukowych. W niektórych platformach profilowania transkrypcji pojedynczej komórki partycjonowanie mikroprzepływowe i kodowanie kreskowe są wykorzystywane do generowania bibliotek cDNA z komórkowych poliadenylowanych mRNA uzyskanych z maksymalnie 10 000 komórek na próbkę. Na tej platformie kropelki zawierające pojedyncze komórki, oligonukleotydy z kodem kreskowym, odczynniki odwrotnej transkrypcji i olej tworzą pęcherzyk reakcyjny, w wyniku którego wszystkie cDNA z jednej komórki mają ten sam kod kreskowy. Oznaczone kodami kreskowymi cDNA można następnie efektywnie sekwencjonować za pomocą sekwencjonowania nowej generacji. Wygenerowane dane mogą być przetwarzane za pomocą oprogramowania i narzędzi do wizualizacji, które przekształcają sekwencje kodów kreskowych w mapy wizualizacyjne i profile transkrypcyjne pojedynczych komórek. Populacje komórek można zidentyfikować za pomocą publicznie dostępnych baz danych ludzkiego nabłonka jelita cienkiego4,5,6. Chociaż w wielu badaniach wykorzystano tę platformę do badania mysich organoidów jelitowych na poziomie pojedynczej komórki, analiza odpowiedzi transkrypcyjnych pojedynczych komórek HIO pozostała w tyle7,8,9,10,11,12.
Tutaj udostępniamy przewodnik krok po kroku, jak izolować żywe komórki z HIO jelita cienkiego do przetwarzania na platformach profilowania transkrypcji pojedynczej komórki (<silna klasa="xfig">Rysunek 1). Zapewniamy wytyczne dotyczące hodowli i różnicowania wraz z komponentami pożywki, które zostały zoptymalizowane pod kątem różnicowania nabłonka. Przedstawiamy metody odzyskiwania komórek dla trzech różnych formatów hodowli: hodowli trójwymiarowych (3D) i jednowarstwowych na plastiku lub na membranowych wkładkach do hodowli komórkowych. Dostarczamy dane dotyczące grupowania próbek uzyskane za pomocą oprogramowania typu open source w celu uzyskania genów o zróżnicowanej ekspresji w każdym klastrze.

<table><tbody><tr><td>[Leu15]-Gastrin I</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G9145</td><td>10 nM</td></tr><tr><td>0,05% Trypsyna-EDTA</td><td>Invitrogen</td><td>25300054</td><td></td></tr><tr><td>0,4% Błękit trypanowy</td><td>Millipore-Sigma</td><td>T8154</td><td></td></tr><tr><td>0,5 M EDTA</td><td>Corning</td><td>46-034-CI</td><td></td></tr><tr><td>1x PBS Ca- Mg-Corning</td><td></td> <td>21-040-CM</td><td></td></tr><tr><td>24 mm Transwell</td><td>Costar</td><td>3412</td><td></td></tr><tr><td>24-dołkowe naczynie do hodowli tkankowych Nunclon delta</td><td>Thermo Scientific</td><td>142475</td><td></td></tr><tr><td>40 i mikro; m sitko komórkowe</td><td>Falcon</td><td>352340</td><td></td></tr><tr><td>40 &micro; m Sitko do końcówek Flowmi</td><td>SP Bel-Art Labware</td><td>H13680-0040</td><td></td></tr><tr><td>70 &micro; m Sitko do końcówek Flowmi</td><td>SP Bel-Art Labware</td><td>H13680-0070</td><td></td></tr><tr><td>96-dołkowa płytka</td><td>Corning</td><td>3595</td><td></td></tr><tr><td>A-83-01</td><td>Tocris</td><td>2939</td><td>500 nM</td></tr><tr><td>Accutase</td><td>StemCell Technologies</td><td>7920</td><td></td></tr><tr><td>Advanced DMEM/F12</td><td>Suplement Invitrogen</td><td>12634-028</td><td></td></tr><tr><td>B27</td><td>Invitrogen</td><td>17504-044</td><td>1X</td></tr><tr><td>Chromium Next GEM Pojedyncza komórka 3' GEM, Biblioteka & Zestaw kulek żelowych v3.1</td><td>10x Genomics</td><td>PN-1000128</td><td></td></tr><tr><td>Kolagen IV</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C5533-5MG</td><td>33 &mikro; g/ml</td></tr><tr><td>Corning Cell Recovery Solution&nbsp;</td><td>VWR</td><td>354253</td><td></td></tr><tr><td>DPBS (Mg2-, Ca2-)</td><td>Invitrogen</td><td>14190-136</td><td>1X</td></tr><tr><td>GlutaMAX-I</td><td>Invitrogen</td><td>35050-061</td><td>2 mM</td></tr><tr><td>HEPES 1M</td><td>Invitrogen</td><td>15630-080</td><td>10 mM</td></tr><tr><td>L-WRN kondycjonowane media</td><td>ATCC</td><td>CRL-3276</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel, GFR, bez fenolu</td><td>Mysz Corning</td><td>356231</td><td></td></tr><tr><td> rekombinowany EGF</td><td>Invitrogen</td><td>PMG8043</td><td>50 ng/ml</td></tr><tr><td>suplement N2</td><td>Invitrogen</td><td>17502-048</td><td>1X</td></tr><tr><td>N-Acetylocysteina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9165-5G</td><td>500 &micro; M</td></tr><tr><td>Nikotynamid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N0636</td><td>10 mM</td></tr><tr><td>SB202190</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7067</td><td>10 &mikro; M</td></tr><tr><td>Transwell</td><td>Corning</td><td>3413</td><td></td></tr><tr><td>Y27632</td><td>Technologie komórek macierzystych</td><td>72308</td><td>10 i mikro; M</td></tr></tbody></table>

wykorzystanie organoidów jelitowych człowieka do zrozumienia nabłonka jelita cienkiego na poziomie transkrypcji pojedynczej komórki

Using Human Intestinal Organoids to Understand the Small Intestine Epithelium at the Single Cell Transcriptional Level

Transkryptomika pojedynczych komórek zrewolucjonizowała nasze rozumienie biologii komórki ludzkiego ciała. Najnowocześniejsze hodowle organoidów ludzkiego jelita cienkiego zapewniają systemy modelowe ex vivo, które wypełniają lukę między modelami zwierzęcymi a badaniami klinicznymi. Zastosowanie transkryptomiki pojedynczych komórek do modeli ludzkich organoidów jelitowych (HIO) ujawnia wcześniej nierozpoznaną biologię, biochemię i fizjologię przewodu pokarmowego. Zaawansowane platformy transkryptomiki pojedynczych komórek wykorzystują partycjonowanie mikroprzepływowe i kodowanie kreskowe do generowania bibliotek cDNA. Te oznaczone kodami kreskowymi cDNA mogą być łatwo sekwencjonowane przez platformy sekwencjonowania nowej generacji i wykorzystywane przez różne narzędzia wizualizacyjne do generowania map. W tym miejscu opisujemy metody hodowli i różnicowania ludzkich HIO w jelicie cienkim w różnych formatach i procedurach izolowania żywotnych komórek z tych formatów, które są odpowiednie do stosowania na platformach profilowania transkrypcji pojedynczych komórek. Te protokoły i procedury ułatwiają wykorzystanie HIO w jelicie cienkim w celu lepszego zrozumienia odpowiedzi komórkowej ludzkiego nabłonka jelitowego na poziomie transkrypcji w kontekście wielu różnych środowisk.

Zawiesiny pojedynczych komórek zebrano z 2-3 studzienek wkładki do hodowli komórek błonowych, monowarstwy oraz trójwymiarowych HIO, aby zapewnić odpowiednią liczbę komórek i zredukować zmienność między studzienkami. Biblioteki pojedynczych komórek przygotowano przy użyciu odczynników specyficznych dla platformy do profilowania transkrypcyjnego pojedynczych komórek, a następnie sekwencjonowano metodą odczytów par końcowych (paired end reads) na platformie sekwencjonowania nowej generacji, uzyskując 30 000 odczytów/komórkę. Odczyty zmapowano, przeliczono i przeanalizowano za pomocą narzędzi analitycznych dla genomiki pojedynczych komórek. Z analizy wykluczono komórki niskiej jakości z zawartością odczytów mitochondrialnych powyżej 20% lub liczbą policzonych genów poniżej 200. Aby ocenić jakość komórek, wykreślono liczbę genów, UMIs oraz procent odczytów mitochondrialnych na komórkę (Rysunek 3); komórki wysokiej jakości zawierają około 3500 genów, 15 000 UMIs i 10% odczytów mitochondrialnych. Po filtrowaniu uzyskano od 4000 do 9500 pojedynczych komórek, w zależności od formatu wzrostu HIO. Nienadzorowane grupowanie (unsupervised clustering) oraz redukcja wymiarowości UMAP pozwoliły zidentyfikować odrębne klastry reprezentujące oczekiwane typy komórek, w tym enterocyty chłonne i komórki wydzielnicze (Rysunek 4).
<img alt="Schemat dysocjacji organoidów, przygotowania cDNA z pojedynczych komórek, sekwencjonowania, analizy danych oraz konfiguracji hodowli komórkowej." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66749/66749fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1: Zarys etapów protokołu. Schematy przedstawiające główne etapy, od wysiewania HIO w różnych formatach po workflow analizy danych z pojedynczych komórek. Obraz został stworzony przy użyciu Biorender. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66749/66749fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Obrazy mikroskopowe hodowli komórkowej; analiza agregacji, konfluencji i fazy wzrostu; badania biologiczne." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66749/66749fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2: Obrazy w polu jasnym. HIO gotowe do obróbki obrazowano za pomocą mikroskopu w polu jasnym przy powiększeniu 5X. Po lewej: organoidy 3D; w środku: płytka 96-dołkowa; po prawej: transwell. Paski skali = 200 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66749/66749fig02large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Wykresy skrzypcowe liczby cech RNA, liczby całkowitej oraz procenta mitochondrialnego dla analizy monowarstwy." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66749/66749fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3: Kontrola jakości danych. Przykładowe metryki analizowanych pojedynczych komórek wyizolowanych z HIO jelita czczego hodowanych jako monowarstwy na płytkach 96-dołkowych. Wykresy skrzypcowe przedstawiają liczbę genów (nFeature_RNA), UMIs (nCount_RNA) oraz procent odczytów mitochondrialnych (percent.mt) na komórkę. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66749/66749fig03large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Diagram analizy UMAP typów komórek organoidów jelita czczego i krętego, pokazujący różnicowanie progenitorów." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66749/66749fig04.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 4"> 
Rysunek 4: Wykresy UMAP analizowanych pojedynczych komórek. (A) Łącznie wyizolowano 9952 pojedyncze komórki z zróżnicowanych HIO jelita czczego hodowanych na płytkach 96-dołkowych. (B) Łącznie wyizolowano 5623 pojedyncze komórki z zróżnicowanych HIO jelita czczego hodowanych na wkładkach do hodowli komórkowych na membranach. (C) Łącznie wyizolowano 4402 pojedyncze komórki z zróżnicowanych 3D HIO jelita krętego. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66749/66749fig04large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody >
		<tr >
			<td >Pożywka wzrostowa WRNE</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td >Pożywka różnicująca</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >Składnik</td>
			<td >Objętość</td>
			<td >Stężenie końcowe</td>
			<td >Pożywka WRNE bez kondycjonowanej pożywki L-WRN, nikotynamidu i SB202190</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >*Y-27632 (5 mM) opcjonalnie</td>
			<td >200 µL</td>
			<td >10 µM</td>
			<td ></td>
		</tr >
		<tr >
			<td >A 83-01 (500 µM)</td>
			<td >100 µL</td>
			<td >500 nM</td>
			<td ></td>
		</tr >
		<tr >
			<td >Advanced DMEM/F12</td>
			<td >45 mL</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
		</tr >
		<tr >
			<td >B27</td>
			<td >2 mL</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
		</tr >
		<tr >
			<td >EGF (50 µg/mL)</td>
			<td >100 µL</td>
			<td >50 ng/mL</td>
			<td ></td>
		</tr >
		<tr >
			<td >Gastryna (10 µM)</td>
			<td >100 µL</td>
			<td >10 nM</td>
			<td ></td>
		</tr >
		<tr >
			<td >GlutaMax (100X)</td>
			<td >1 mL</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
		</tr >
		<tr >
			<td >HEPES 1 M</td>
			<td >1 mL</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
		</tr >
		<tr >
			<td >Kondycjonowana pożywka L-WRN</td>
			<td >50 mL</td>
			<td >~50%</td>
			<td ></td>
		</tr >
		<tr >
			<td >N2</td>
			<td >1 mL</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
		</tr >
		<tr >
			<td >N-acetylocysteina (500 mM)</td>
			<td >100 µL</td>
			<td >500 µM</td>
			<td ></td>
		</tr >
		<tr >
			<td >Nikotynamid 1 M</td>
			<td >1 mL</td>
			<td >10 mM</td>
			<td ></td>
		</tr >
		<tr >
			<td >SB202190 (10 mM)</td>
			<td >100 µL</td>
			<td >10 µM</td>
			<td ></td>
		</tr >
		<tr >
			<td >Objętość całkowita</td>
			<td >100 mL</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
		</tr >
		<tr >
			<td >Pożywka CMGF</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td ></td>
		</tr >
		<tr >
			<td >Advanced DMEM/F12</td>
			<td >500 mL</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
		</tr >
		<tr >
			<td >Glutamax</td>
			<td >5 mL</td>
			<td >100X</td>
			<td ></td>
		</tr >
		<tr >
			<td >Hepes 1 M</td>
			<td >5 mL</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
		</tr >
	</tbody>
</table>
Tabela 1: Skład poszczególnych stosowanych pożywek.

Protokół łączy technologię organoidów jelitowych człowieka z analizą transkryptomiczną pojedynczej komórki, aby zapewnić znaczący wgląd w wcześniej niezbadaną biologię jelit.

Wykorzystanie organoidów jelitowych człowieka do zrozumienia nabłonka jelita cienkiego na poziomie transkrypcji pojedynczej komórki

Single cell transcriptomics has revolutionized our understanding of the cell biology of the human body. State-of-the-art human small intestinal organoid ...

Integrujemy transkryptomikę pojedynczych komórek i technologię organoidów, aby lepiej zrozumieć biologię jelita cienkiego. Technologie te pozwalają nam na głębszy wgląd w niejednorodność komórkową, która istnieje w tej tkance. Narzędzia, które poprawiają przepustowość, czułość i rozdzielczość, są kluczami, które naprzód badania w tej dziedzinie.Niektóre przykłady to ulepszone metody obliczeniowe i innowacje technologiczne. Duży nacisk kładziony jest również na redukcję kosztów. Proces przygotowania i sekwencjonowania bibliotek lub próbek może powodować różnice w transkrypcji, co jest jednym z wyzwań.W przypadku organoidów konkretne wyzwania obejmują ograniczony kontekst przestrzenny lub informacje na temat dynamiki czasowej. Analiza pojedynczych komórek ludzkich organoidów jelitowych dostarcza wcześniej nieosiągalnych informacji na temat typów komórek tworzących nabłonek jelitowy. To w ten sposób otwiera okno na krajobraz transkrypcyjny tych komórek.Wykorzystujemy te technologie do identyfikacji biomarkerów i mechanizmów chorób jelit człowieka. Te biomarkery i mechanizmy zwiększą naszą zdolność do wykorzystywania spersonalizowanych podejść opartych na medycynie do leczenia chorób ludzkich i ogólnej poprawy zdrowia ludzkiego. Na początek rozmrażaj enzymatyczny odczynnik do trawienia komórek w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 30 minut.Pod mikroskopem jasnego pola przy 10-krotnym powiększeniu obserwuj zróżnicowane trójwymiarowe organoidy jelitowe człowieka, aby zapewnić zdrowie komórek. Zastąp pożywkę z dołków 24-dołkowej płytki zawierającej zróżnicowane organoidy 500 mikrolitrami roztworu do odzyskiwania zimnych komórek. Pipetuj w górę i w dół, aby uwolnić komórki z błony podstawnej.Przenieś zawiesinę komórek do 1,5-mililitrowej probówki do mikrowirówki. Inkubować probówkę na lodzie przez 10 minut, pipetując w górę i w dół co pięć minut. Odwirować zawiesinę komórkową o masie 400 g przez trzy minuty w temperaturze czterech stopni Celsjusza.Usunąć supernatant z probówki, nie naruszając osadu. Zawiesić osad w 500 mikrolitrach wstępnie podgrzanego odczynnika enzymatycznego do trawienia komórek, pipetując w górę iw dół 10 razy. Umieść organoidy na 30 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza w inkubatorze dwutlenku węgla.Co 10 minut odpipetuj całą objętość 10 razy za pomocą pipety P1000, aby pomóc w dysocjacji komórek. Odwirować zawiesinę komórkową o wadze 400 g przez trzy minuty w temperaturze czterech stopni Celsjusza i ponownie zawiesić osad w jednym mililitrze pożywki różnicującej. Szybko pipetuj komórki w górę i w dół 50 razy na lodzie, aby zdysocjować organoidy na pojedyncze komórki.Przefiltruj całą objętość przez sitko z końcówką o średnicy 70 mikronów i zbierz eluat w świeżej probówce o pojemności 1,5 mililitra. Następnie przefiltruj uzyskany eluat przez sitko o średnicy 70 mikronów na sitku z końcówką o średnicy 40 mikronów. Dodaj pięć mikrolitrów 0,4% błękitu trypanowego do pięciu mikrolitrów zawiesiny komórek i policz żywotne pojedyncze komórki przy użyciu wykluczenia błękitu trypanowego.Rozcieńczyć próbkę pożywką do hodowli komórkowych, aby uzyskać 1 000 komórek na mikrolitr. W sumie wyizolowano 4 402 pojedyncze komórki ze zróżnicowanych trójwymiarowych organoidów jelitowych jelita krętego reprezentujących oczekiwane typy komórek, w tym enterocyty absorpcyjne i komórki wydzielnicze. Na początek umieść 15-mililitrową probówkę zawierającą wstępnie podgrzany odczynnik do enzymatycznego trawienia komórek w inkubatorze o temperaturze 37 stopni Celsjusza do czasu użycia.Porcję 500 mikrolitrów świeżo przygotowanego PBS EDTA do dołków 24-dołkowej płytki. Pod mikroskopem jasnego pola obserwuj wzrost zróżnicowanych trójwymiarowych organoidów jelitowych i transwelli. Przenieść wkładki do hodowli komórkowych z pożywki wzrostowej do roztworu PBS EDTA.Usuń pożywkę hodowlaną od strony wierzchołkowej i zastąp ją 100 mikrolitrami PBS EDTA bez naruszania warstwy komórkowej. Po wyrzuceniu PBS EDTA wyjmij wkładkę ze studzienki, delikatnie osusz ją na krawędzi ręcznika papierowego i odwróć na blacie stołu. Za pomocą ostrego ostrza skalpela przeciąć wokół wewnętrznego obwodu membrany, aby usunąć membranę z wkładu.Przenieś membranę za pomocą kleszczyków do 1,5-mililitrowej probówki zawierającej 200 mikrolitrów wstępnie podgrzanego odczynnika do trawienia komórek enzymatycznych. Umieść membranę na 30 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza w inkubatorze dwutlenku węgla. Co 10 minut odpipetować całą objętość pięć razy za pomocą pipety P200.Przenieś od jednego do dwóch mikrolitrów zawiesiny komórek na szklane szkiełko co 10 minut, aby ocenić dysocjację poprzez jakościową ocenę procentu pojedynczych komórek. Po dysocjacji połącz trzy dołki replikowane na warunki w jednej 1,5-mililitrowej probówce do mikrowirówki. Dodać 400 mikrolitrów pożywki do różnicowania kultur komórkowych zawierającej 10 mikromolowy inhibitor ROCK i delikatnie wymieszać pipetując.Przefiltruj całą objętość przez sitko z końcówką o średnicy 70 mikronów, zbierając przepływ w świeżej probówce o pojemności 1,5 mililitra. Następnie przefiltruj uzyskany przepływ przez sitko o średnicy 70 mikronów na sitku z końcówką o średnicy 40 mikronów. Dodaj pięć mikrolitrów 0,4% błękitu trypanowego do pięciu mikrolitrów zawiesiny komórek i policz żywotne pojedyncze komórki.Rozcieńczyć próbkę pożywką wzrostową WRNE, aby uzyskać 1 000 komórek na mikrolitr. W sumie wyizolowano 5 623 pojedyncze komórki ze zróżnicowanych organoidów jelitowych jelita czczego wyhodowanych na wkładkach do hodowli komórek błonowych. Na początek przygotuj enzymatyczny odczynnik do trawienia komórek i PBS EDTA do trawienia ludzkich organoidów jelitowych.Pod mikroskopem jasnego pola potwierdź wzrost zróżnicowanych trójwymiarowych organoidów jelitowych człowieka w postaci monowarstw. Wyrzuć pożywkę do hodowli komórkowych z hodowli jednowarstwowej i zastąp ją 100 mikrolitrami PBS EDTA. Po usunięciu PBS EDTA dodaj 100 mikrolitrów ciepłego odczynnika enzymatycznego do trawienia komórek do każdej studzienki.Umieść płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza w inkubatorze z 5% dwutlenkiem węgla i pipetuj całą objętość pięć razy co 10 minut przez 20 do 30 minut. Przenoś od jednego do dwóch mikrolitrów zawiesiny komórek na szklane szkiełko co 10 minut, aby ocenić dysocjację, obserwując procentową zawartość pojedynczych komórek. Po dysocjacji połącz trzy dołki replikowane na warunki w jednej 1,5-mililitrowej probówce do mikrowirówki.Dodać 700 mikrolitrów pożywki do różnicowania kultur komórkowych zawierającej 10 mikromolowy inhibitor RCOK i delikatnie wymieszać pipetując. Przefiltruj całą objętość przez sitko z końcówką o średnicy 70 mikronów, zbierając przepływ w świeżej probówce o pojemności 1,5 mililitra. Przefiltruj uzyskany przepływ przez sitko o średnicy 70 mikronów na sitku z końcówką o średnicy 40 mikronów.Dodaj pięć mikrolitrów 0,4% błękitu trypanowego do pięciu mikrolitrów zawiesiny komórek i policz żywotne pojedyncze komórki. Rozcieńczyć próbkę pożywką do hodowli komórkowych zawierającą inhibitor RCOK, aby uzyskać 1 000 komórek na mikrolitr. W sumie wyizolowano 9 952 pojedyncze komórki ze zróżnicowanych organoidów jelitowych jelita czczego wyhodowanych na 96 płytkach dołkowych.

using-human-intestinal-organoids-to-understand-small-intestine

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Opisujemy metodę tworzenia ludzkich enteroidów z krypt jelita cienkiego i kolonoidów z krypt jelita grubego pobranych zarówno z tkanek chirurgicznych, jak i z biopsji. W tym artykule metodologicznym przedstawiamy metody hodowli, które są niezbędne do pomyślnego wzrostu i utrzymania ludzkich enteroidów i okronoidów.

Ustalenie ludzkich enteroidów nabłonkowych i kolonoidów z całej tkanki i biopsja

W tym protokole wideo krok po kroku wyjaśniamy transdukcję lentiwirusową w organoidach pierwotnego nabłonka jelitowego oraz przetwarzanie i dalszą analizę tych kultur za pomocą ilościowego RT-PCR, RNA-mikromacierzy i immunohistochemii.

Protokół transdukcji lentiwirusowej i dalszej analizy organoidów jelitowych

Ten protokół opisuje pomiar przepuszczalności bariery nabłonkowej w czasie rzeczywistym po leczeniu farmakologicznym w organoidach jelitowych człowieka za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej i mikroskopii żywych komórek.

Pomiar przepuszczalności bariery nabłonkowej w organoidach jelitowych człowieka w czasie rzeczywistym

Ten protokół pozwala na różnicowanie ludzkich komórek pluripotencjalnych w organoidy jelitowe. Protokół naśladuje normalny rozwój człowieka poprzez różnicowanie komórek w populację ostatecznej endodermy, endodermy jelita tylnego, a następnie nabłonka jelitowego. To sprawia, że protokół nadaje się zarówno do badania rozwoju jelit, jak i zastosowań modelowania chorób.

Generowanie organoidów jelitowych pochodzących z hiPSC do zastosowań w modelowaniu rozwoju i choroby

Tutaj opisujemy przygotowanie monowarstw nabłonka jelitowego pochodzących od ludzkich organoidów do badania funkcji bariery jelitowej, przepuszczalności i transportu. Ponieważ organoidy reprezentują pierwotną reakcję tkanki nabłonkowej na bodźce zewnętrzne, modele te łączą zalety rozszerzalności linii komórkowych oraz znaczenie i złożoność tkanki pierwotnej.

Monowarstwa nabłonka pochodząca z organoidów: klinicznie istotny model in vitro dla funkcji bariery jelitowej

Organoidy jelitowe pochodzące z biopsji oraz technologie organ-on-a-chips są połączone w platformę mikrofizjologiczną, aby podsumować funkcjonalność jelit specyficzną dla regionu.

Połączenie ludzkich organoidów i technologii Organ-on-A-Chip w celu modelowania funkcjonalności specyficznej dla regionu jelitowego

Tutaj prezentujemy protokół do generowania organoidów jelitowych szczurów i używania ich w kilku dalszych zastosowaniach. Szczury są często preferowanym modelem przedklinicznym, a solidny układ organoidów jelitowych wypełnia zapotrzebowanie na system in vitro towarzyszący badaniom in vivo.

Wytwarzanie i manipulowanie organoidami jelitowymi szczurów

To badanie przedstawia protokół generowania monowarstw 2D organoidów wieprzowych pochodzących z jelita cienkiego i grubego. Wzrost tych monowarstw charakteryzuje się rosnącymi wartościami TEER, co wskazuje na solidną integralność nabłonka. Dodatkowo, te monowarstwy wykazują fizjologiczne reakcje wydzielnicze w eksperymentach w komorze Ussing po zastosowaniu forskoliny.

Dwuwymiarowe organoidy jelitowe świń odzwierciedlające fizjologiczne właściwości rodzimego jelita

Organoidy jelitowe człowieka muszą być unerwione, aby lepiej oddać strukturę i funkcję rodzimego ludzkiego jelita. W tym miejscu przedstawiamy jedną z metod włączania jelitowego układu nerwowego do tych konstruktów.

unerwienie ludzkich organoidów jelitowych

Przedstawiamy dwukolorowy test fluorescencyjny in vitro, służący do wizualizacji fuzji pojedynczych cząsteczek wirusa z płynną dwuwarstwą docelową. Poprzez znakowanie cząsteczek wirusowych fluoroforami, które różnicowo barwią błonę wirusa oraz jego wnętrze, jesteśmy w stanie monitorować kinetykę hemifuzji i tworzenia się porów.

Metoda pomiaru kinetyki fuzji wirusowej na poziomie pojedynczych cząsteczek

Odkryj analizę transkryptomiczną pojedynczych komórek w ludzkich organoidach jelitowych. Ta metoda umożliwia badanie heterogeniczności komórkowej nabłonka jelita cienkiego i identyfikację biomarkerów chorób jelitowych.

Wykorzystanie organoidów jelitowych człowieka do zrozumienia nabłonka jelita cienkiego na poziomie transkrypcji pojedynczej komórki (Wideo) | JoVE Journal

Wykorzystanie organoidów jelitowych człowieka do zrozumienia nabłonka jelita cienkiego na poziomie transkrypcji pojedynczej komórki

Przeglądaj więcej filmów