Wykorzystanie organoidów jelitowych człowieka do zrozumienia nabłonka jelita cienkiego na poziomie transkrypcji pojedynczej komórki

Integrujemy transkryptomikę pojedynczych komórek i technologię organoidów, aby lepiej zrozumieć biologię jelita cienkiego. Technologie te pozwalają nam na głębszy wgląd w niejednorodność komórkową, która istnieje w tej tkance. Narzędzia, które poprawiają przepustowość, czułość i rozdzielczość, są kluczami, które naprzód badania w tej dziedzinie.

Niektóre przykłady to ulepszone metody obliczeniowe i innowacje technologiczne. Duży nacisk kładziony jest również na redukcję kosztów. Proces przygotowania i sekwencjonowania bibliotek lub próbek może powodować różnice w transkrypcji, co jest jednym z wyzwań.

W przypadku organoidów konkretne wyzwania obejmują ograniczony kontekst przestrzenny lub informacje na temat dynamiki czasowej. Analiza pojedynczych komórek ludzkich organoidów jelitowych dostarcza wcześniej nieosiągalnych informacji na temat typów komórek tworzących nabłonek jelitowy. To w ten sposób otwiera okno na krajobraz transkrypcyjny tych komórek.

Wykorzystujemy te technologie do identyfikacji biomarkerów i mechanizmów chorób jelit człowieka. Te biomarkery i mechanizmy zwiększą naszą zdolność do wykorzystywania spersonalizowanych podejść opartych na medycynie do leczenia chorób ludzkich i ogólnej poprawy zdrowia ludzkiego. Na początek rozmrażaj enzymatyczny odczynnik do trawienia komórek w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 30 minut.

Pod mikroskopem jasnego pola przy 10-krotnym powiększeniu obserwuj zróżnicowane trójwymiarowe organoidy jelitowe człowieka, aby zapewnić zdrowie komórek. Zastąp pożywkę z dołków 24-dołkowej płytki zawierającej zróżnicowane organoidy 500 mikrolitrami roztworu do odzyskiwania zimnych komórek. Pipetuj w górę i w dół, aby uwolnić komórki z błony podstawnej.

Przenieś zawiesinę komórek do 1,5-mililitrowej probówki do mikrowirówki. Inkubować probówkę na lodzie przez 10 minut, pipetując w górę i w dół co pięć minut. Odwirować zawiesinę komórkową o masie 400 g przez trzy minuty w temperaturze czterech stopni Celsjusza.

Usunąć supernatant z probówki, nie naruszając osadu. Zawiesić osad w 500 mikrolitrach wstępnie podgrzanego odczynnika enzymatycznego do trawienia komórek, pipetując w górę iw dół 10 razy. Umieść organoidy na 30 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza w inkubatorze dwutlenku węgla.

Co 10 minut odpipetuj całą objętość 10 razy za pomocą pipety P1000, aby pomóc w dysocjacji komórek. Odwirować zawiesinę komórkową o wadze 400 g przez trzy minuty w temperaturze czterech stopni Celsjusza i ponownie zawiesić osad w jednym mililitrze pożywki różnicującej. Szybko pipetuj komórki w górę i w dół 50 razy na lodzie, aby zdysocjować organoidy na pojedyncze komórki.

Przefiltruj całą objętość przez sitko z końcówką o średnicy 70 mikronów i zbierz eluat w świeżej probówce o pojemności 1,5 mililitra. Następnie przefiltruj uzyskany eluat przez sitko o średnicy 70 mikronów na sitku z końcówką o średnicy 40 mikronów. Dodaj pięć mikrolitrów 0,4% błękitu trypanowego do pięciu mikrolitrów zawiesiny komórek i policz żywotne pojedyncze komórki przy użyciu wykluczenia błękitu trypanowego.

Rozcieńczyć próbkę pożywką do hodowli komórkowych, aby uzyskać 1 000 komórek na mikrolitr. W sumie wyizolowano 4 402 pojedyncze komórki ze zróżnicowanych trójwymiarowych organoidów jelitowych jelita krętego reprezentujących oczekiwane typy komórek, w tym enterocyty absorpcyjne i komórki wydzielnicze. Na początek umieść 15-mililitrową probówkę zawierającą wstępnie podgrzany odczynnik do enzymatycznego trawienia komórek w inkubatorze o temperaturze 37 stopni Celsjusza do czasu użycia.

Porcję 500 mikrolitrów świeżo przygotowanego PBS EDTA do dołków 24-dołkowej płytki. Pod mikroskopem jasnego pola obserwuj wzrost zróżnicowanych trójwymiarowych organoidów jelitowych i transwelli. Przenieść wkładki do hodowli komórkowych z pożywki wzrostowej do roztworu PBS EDTA.

Usuń pożywkę hodowlaną od strony wierzchołkowej i zastąp ją 100 mikrolitrami PBS EDTA bez naruszania warstwy komórkowej. Po wyrzuceniu PBS EDTA wyjmij wkładkę ze studzienki, delikatnie osusz ją na krawędzi ręcznika papierowego i odwróć na blacie stołu. Za pomocą ostrego ostrza skalpela przeciąć wokół wewnętrznego obwodu membrany, aby usunąć membranę z wkładu.

Przenieś membranę za pomocą kleszczyków do 1,5-mililitrowej probówki zawierającej 200 mikrolitrów wstępnie podgrzanego odczynnika do trawienia komórek enzymatycznych. Umieść membranę na 30 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza w inkubatorze dwutlenku węgla. Co 10 minut odpipetować całą objętość pięć razy za pomocą pipety P200.

Przenieś od jednego do dwóch mikrolitrów zawiesiny komórek na szklane szkiełko co 10 minut, aby ocenić dysocjację poprzez jakościową ocenę procentu pojedynczych komórek. Po dysocjacji połącz trzy dołki replikowane na warunki w jednej 1,5-mililitrowej probówce do mikrowirówki. Dodać 400 mikrolitrów pożywki do różnicowania kultur komórkowych zawierającej 10 mikromolowy inhibitor ROCK i delikatnie wymieszać pipetując.

Przefiltruj całą objętość przez sitko z końcówką o średnicy 70 mikronów, zbierając przepływ w świeżej probówce o pojemności 1,5 mililitra. Następnie przefiltruj uzyskany przepływ przez sitko o średnicy 70 mikronów na sitku z końcówką o średnicy 40 mikronów. Dodaj pięć mikrolitrów 0,4% błękitu trypanowego do pięciu mikrolitrów zawiesiny komórek i policz żywotne pojedyncze komórki.

Rozcieńczyć próbkę pożywką wzrostową WRNE, aby uzyskać 1 000 komórek na mikrolitr. W sumie wyizolowano 5 623 pojedyncze komórki ze zróżnicowanych organoidów jelitowych jelita czczego wyhodowanych na wkładkach do hodowli komórek błonowych. Na początek przygotuj enzymatyczny odczynnik do trawienia komórek i PBS EDTA do trawienia ludzkich organoidów jelitowych.

Pod mikroskopem jasnego pola potwierdź wzrost zróżnicowanych trójwymiarowych organoidów jelitowych człowieka w postaci monowarstw. Wyrzuć pożywkę do hodowli komórkowych z hodowli jednowarstwowej i zastąp ją 100 mikrolitrami PBS EDTA. Po usunięciu PBS EDTA dodaj 100 mikrolitrów ciepłego odczynnika enzymatycznego do trawienia komórek do każdej studzienki.

Umieść płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza w inkubatorze z 5% dwutlenkiem węgla i pipetuj całą objętość pięć razy co 10 minut przez 20 do 30 minut. Przenoś od jednego do dwóch mikrolitrów zawiesiny komórek na szklane szkiełko co 10 minut, aby ocenić dysocjację, obserwując procentową zawartość pojedynczych komórek. Po dysocjacji połącz trzy dołki replikowane na warunki w jednej 1,5-mililitrowej probówce do mikrowirówki.

Dodać 700 mikrolitrów pożywki do różnicowania kultur komórkowych zawierającej 10 mikromolowy inhibitor RCOK i delikatnie wymieszać pipetując. Przefiltruj całą objętość przez sitko z końcówką o średnicy 70 mikronów, zbierając przepływ w świeżej probówce o pojemności 1,5 mililitra. Przefiltruj uzyskany przepływ przez sitko o średnicy 70 mikronów na sitku z końcówką o średnicy 40 mikronów.

Dodaj pięć mikrolitrów 0,4% błękitu trypanowego do pięciu mikrolitrów zawiesiny komórek i policz żywotne pojedyncze komórki. Rozcieńczyć próbkę pożywką do hodowli komórkowych zawierającą inhibitor RCOK, aby uzyskać 1 000 komórek na mikrolitr. W sumie wyizolowano 9 952 pojedyncze komórki ze zróżnicowanych organoidów jelitowych jelita czczego wyhodowanych na 96 płytkach dołkowych.