Ręczne badanie przesiewowe małych cząsteczek zbliżające się do wysokiej przepustowości przy użyciu zarodków danio pręgowanego

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest przeprowadzenie chemicznego badania przesiewowego na zarodkach danio pręgowanego przy użyciu ręcznego przetwarzania próbek. Osiąga się to poprzez umieszczenie na noc dorosłego danio pręgowanego w komorach godowych z przegrodą, a następnie usunięcie przegrody następnego ranka w celu zebrania zarodków. Kolejne grupy zarodków danio pręgowanego umieszcza się na 96-dołkowych płytkach, a następnie traktuje lekiem w pożądanym stadium rozwoju.

Następnie pozwala się zarodkom rozwijać utrwalone 4% paraldehydem i testować w celu oceny wpływu małych cząsteczek na proces rozwojowy będący przedmiotem zainteresowania. Wyniki pokazują zmiany rozwojowe, takie jak przyrost lub utrata domen ekspresji genów, które mogą wskazywać na zmiany w morfogenezie siarczanów lub tkanek spowodowane przez małe cząsteczki, które były badane. Implikacje tej techniki rozciągają się na kliniczne leczenie różnych chorób ze względu na możliwość identyfikacji potencjalnie terapeutycznych związków.

Ogólnie rzecz biorąc, osoby nowe w tej technice mogą mieć trudności, ponieważ muszą nabyć zręczność niezbędną do pracy z zarodkami, na przykład przenoszenie ich między płytkami wielodołkowymi bez uszkodzenia. Demonstracją tej procedury będę ja i Eric Donahue, badacz ze studiów licencjackich w laboratorium, aby ustawić kojarzenia danio zebry. Użyj komór godowych z przegrodami, umieść dorosłego samca zebry po jednej stronie przegrody, a dorosłe samice danio pręgowanego po drugiej stronie.

Na każdą 96-dołkową płytkę małych cząsteczek, które mają być badane. Ustaw 25 zbiorników łączących i pozostaw je na noc. Następnego dnia wyjmij komorę, która oddziela każdą parę ryb i po godzinie użyj sitka o drobnych oczkach, aby zebrać zarodki przed umieszczeniem ich na szalkach Petriego zawierających pożywkę E 3 za pomocą pipety transferowej.

Usuń zanieczyszczenia z płyt i pod stereoskopem. Obserwuj każdy lęg zarodków i usuń wszelkie niezapłodnione jaja. Zdekantować pożywkę E trzy i zastąpić ją świeżą E trzy.

Następnie umieść każdą miskę z zarodkami w inkubatorze o temperaturze 28,5 stopnia Celsjusza na dwie godziny. Sprawdź ponownie płytki i wyrzuć wszelkie dodatkowe niezapłodnione jaja. Kontynuuj inkubację zarodków do etapu 40%eely.

Wyjmij płytkę z biblioteki chemicznej z minus 80 stopni Celsjusza. Użyj folii aluminiowej, aby go przykryć i pozostawić do rozmrożenia w temperaturze pokojowej za pomocą ośmiokanałowej pipety. Dodać 99 mikrolitrów E trzy do kolumn od drugiej do 12 płytki 96-dołkowej.

Następnie dodać jeden mikrolitr odpowiednich związków do studzienek w kolumnach od drugiej do 11 tutaj, oznaczonych jako próbki doświadczalne Odpipetować jeden mikrolitr DMSO do kolumny kontrolnej tutaj zaprojektowanej jako kolumna 12. Użyj folii aluminiowej, aby przykryć płytkę rozcieńczającą i włóż podstawową bibliotekę chemiczną do zamrażarki. Następnie, po wybraniu szalki Petriego zawierającej zarodki w stadium 40%epi, użyj pipety transferowej, aby ostrożnie umieścić około 10 zarodków na studzienkę w kolumnach od drugiej do 12 z 96.

Talerz studni. Za pomocą szklanej pipety transferowej usuń nadmiar E 3 z każdej studzienki i wyrzuć do pojemnika na odpady płynne. Aby poddać zarodki działaniu substancji chemicznej, należy przenieść 100 mikrolitrów każdego rozcieńczenia chemicznego z płytki 96-dołkowej do odpowiedniego dołka zarodków, aby utworzyć wilgotną komorę z ręcznikiem papierowym i umieścić ją w pojemniku wrażliwym na światło.

Wystarczająco duży, aby pomieścić płytkę 96-dołkową. Następnie użyj maty sufitowej, aby uszczelnić płytę. Umieść go w światłoczułym pojemniku i inkubuj w temperaturze 28,5 stopnia Celsjusza przez żądany czas.

Aby usunąć chemikalia, dodaj 300 mikrolitrów E trzy do każdego rzędu studzienek traktowanych lekami. Następnie odbierz pożywkę przed użyciem E trzy do trzykrotnego umycia zarodków w celu utrwalenia zarodków, przenieś je na cztery oznakowane płytki 24-dołkowe, umieszczając pipetę na ciemnym tle. Po każdym transferze studzienki w celu zidentyfikowania zarodków pozostawionych w pipecie i zapobieżenia krzyżowaniu się, należy usunąć wszelkie martwe zarodki.

Odrysuj E trzy, aby zarodki były ledwo zanurzone w płynie. Następnie użyj szklanej pipety, aby dodać dwie krople po 50 miligramów na mililitr pronazy do każdej. Dobrze inkubuj zarodki przez pięć minut, a następnie porusz studzienkami, aby spowodować rozpad Corianu.

Po dwukrotnym użyciu E 3 do umycia zarodków, należy pobrać i wyrzucić pozostałą ilość E trzy. Dodaj 4% P-F-A-P-B-S do każdego dołka i inkubuj zarodki przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Następnie wykonaj interesujące nas badanie przesiewowe, takie jak hybrydyzacja in situ z zamontowaniem w otworze lub życzenie, zgodnie z opisem w protokole tekstowym, aby ocenić zarodki z chemicznego ekranu.

Przenieś je na oznakowane płytki 12-dołkowe przed użyciem mikroskopu stereoskopowego do ich obserwacji, jak pokazano na tym schemacie. Praktyczne jest, aby jedna osoba przeprowadziła chemiczne badanie genetyczne na około 600 związkach w ciągu dziewięciu tygodni poświęconego wysiłku, a czas ten można skrócić do trzech tygodni, jeśli jest wykonywany przez trzy osoby. W ten sposób czas pracy przy stole przez jedną lub kilka osób może ominąć potrzebę stosowania sprzętu wymagającego dużej ilości zasobów, takiego jak zautomatyzowane systemy.

Jak pokazano tutaj, zarodki danio pręgowanego poddano działaniu pojedynczych związków z biblioteki bioaktywnej od 50% peopley do 24 HPF, a następnie testom według życzenia, używając koktajlu trzech sond rybo-owych w celu wykrycia segmentów nefronu. Na przykład, system klasyfikacji, związek, który spowodował dramatycznie powiększony kanalik proksymalny kręty lub PCT, zostanie sklasyfikowany jako klasa pierwsza, która reprezentuje klasę związaną z najpoważniejszą wadą i najwyższym poziomem zaufania do obserwowanego fenotypu. Związek byłby następnie oznaczony jako klasa jedna PCT.

Ponadto klasyfikacja ta zapewnia prosty i szybki sposób opisania małej cząsteczki będącej przedmiotem zainteresowania, w tym nasilenia jej wpływu na organizm, regionu, na który wpływa lek, oraz sposobu, w jaki region ten jest dotknięty. Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać o etapie rozwoju zarodków we właściwym momencie rozwoju. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak przeprowadzić ręczne badanie chemiczne na zarodkach danio pręgowanego.