Name: Wizualny zapis potencjału wywołanego w szczurzym modelu eksperymentalnej demielinizacji nerwu wzrokowego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-07-29T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 49 s
Description: Poznaj metodę rejestracji potencjałów wywołanych wzrokowo u szczurów z implantowanymi elektrodami czaszkowymi w celu monitorowania demielinizacji nerwu wzrokowego in vivo. Protokół umożliwia ocenę funkcjonalną zmian patologicznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

To badanie było wspierane przez Ophthalmic Research Institute of Australia (ORIA). Dziękujemy prof. Algisowi Vingrysowi i dr. Bang Bui z Uniwersytetu w Melbourne za początkową pomoc w opracowaniu techniki nagrywania VEP.

Oświadczenie etyczne: Wszystkie procedury z udziałem zwierząt zostały przeprowadzone zgodnie z Australijskim Kodeksem Postępowania w Opiece i Wykorzystywaniu Zwierząt do Celów Naukowych oraz wytycznymi Oświadczenia ARVO dotyczącymi Wykorzystania Zwierząt w Badaniach Okulistycznych i Wzrokowych, i zostały zatwierdzone przez Komitet Etyki Zwierząt Uniwersytetu Macquarie.
1. Implantacja elektrody VEP
<ol>
	<li>Znieczulić zwierzę dootrzewnowym wstrzyknięciem ketaminy (75 mg/kg) i medetomidyny (0,5 mg/kg). 
	Uwaga: Po indukcji znieczulenia należy obserwować odruchy odstawienia (próba szczypania, odruch rogówkowy i powiekowy itp.) oraz ich brak jako wskazanie do rozpoczęcia operacji. Stale monitoruj zwierzęta przez cały czas trwania operacji i podawaj dodatkowy lek znieczulający (10% początkowej dawki ketaminy na uzupełnienie), jeśli występują odruchy. W eksperymentach wykorzystuje się dorosłe szczury (>12 tygodni).</li>
	<li>Ogolić skórę w obszarze operacyjnym. Umieść zwierzę na podkładce rozgrzewającej (37 °C), aby utrzymać temperaturę ciała podczas zabiegu. Przygotuj skórę poprzez miejscowe stosowanie jodu powidonu. Zastosuj obłożenie chirurgiczne. Stosować miejscowo maść okulistyczną, aby zapobiec wysuszeniu rogówki w znieczuleniu ogólnym. Utrzymuj aseptykę za pomocą sterylnych narzędzi.</li>
	<li>Wykonaj podłużne nacięcie skóry na linii środkowej skóry głowy. Oczyść tkankę łączną, aby uzyskać dobrą odsłonę czaszki.</li>
	<li>Ostrożnie wywierć małe otwory w zadziorach ręcznie za pomocą mikro wiertarki ręcznej na wysokości 7 mm za bregmą i 3 mm z boku do linii środkowej.</li>
	<li>Implant wkręca elektrody przez czaszkę do kory mózgowej (obszar 17), wnikając w korę na głębokość około 0,5 mm. Wszczepić referencyjną elektrodę śrubową na linii środkowej 3 mm rostral do bregma. Nałóż cement dentystyczny, aby otoczyć i przykręcić (nie zawsze jest to wymagane).</li>
	<li>Zszyj skórę głowy, nałóż maść z antybiotykiem na skórę i pozwól zwierzęciu dojść do siebie po znieczuleniu na podkładce rozgrzewającej. 
	Uwaga: Alternatywnie, elektrody mogą pozostać odsłonięte, dzięki czemu skóra nie musi być ponownie otwierana przy każdym nagraniu. Natychmiast po zaprzestaniu operacji, ale przed rekonwalescencją anestezjologiczną, należy podać niesteroidowy lek przeciwzapalny (NLPZ) (jeśli nie został podany przed operacją) lub opioidowy lek przeciwbólowy. Należy stale monitorować zwierzęta, aż do pełnego wyzdrowienia po znieczuleniu i pełnego chodzenia.</li>
	<li>Należy odczekać co najmniej 1 tydzień, aby zwierzęta doszły do siebie po operacji przed rejestracją VEP.</li>
</ol>
2. Iniekcja nerwu wzrokowego
<ol>
	<li>Znieczulić zwierzę, przygotować skórę i nałożyć drapowanie jak powyżej (1.1 i 1.2).</li>
	<li>Wykonaj od 1 do 1,5 cm nacięcia w skórze powyżej oczodołu losowo wybranego oka. Otwórz tkankę podskórną, aby dotrzeć do jamy oczodołu za pomocą cienkich nożyczek do tęczówki. Otwórz spojówkę i przednią torebkę czopa pod mikroskopem operacyjnym.</li>
	<li>Wycofaj mięśnie zewnątrzgałkowe i śródobitalne gruczoły łzowe, aby odsłonić nerw wzrokowy o długości około 3 mm. Otwórz warstwy opony twardej i pajęczynówki wokół nerwu wzrokowego wzdłużnie za pomocą ostrza okulistycznego.</li>
	<li>Włożyć szklaną pipetę do nerwu wzrokowego w odległości 2 mm za gałką oczną. Szklana mikropipeta jest dołączona do strzykawki Hamiltona.</li>
	<li>Wstrzyknij 1% lizolecytyny (0,4 - 1,0 μl, z 0,02% Evan's Blue, który nie ma wpływu na mielinizację) powoli do nerwu przez około 30 sekund.</li>
	<li>Zszyj nacięcie skóry. Zastosuj maść z antybiotykiem, aby zapobiec infekcji. Oczy innych kolegów mogą służyć jako wewnętrzna kontrola zapisów elektrofizjologicznych.</li>
	<li>Umieść zwierzęta na podkładce rozgrzewającej, aby wyzdrowiały po znieczuleniu.</li>
</ol>
3. Nagrywanie VEP
<ol>
	<li>Znieczulić zwierzę i przygotować skórę jako 1,1 i 1,2. 
	Uwaga: Do zapisu elektrofizjologicznego można zastosować niższą dawkę środków znieczulających (ketamina 40 mg/kg i medetomidyna 0,25 mg/kg).</li>
	<li>Umieść szczura w ciemnym pomieszczeniu i pozwól mu przystosować się do ciemności przez 5 - 30 minut. W niektórych przypadkach szczury mogą być odpowiednio przystosowane do ciemności, O/N do skotopowych lub jasne przystosowane do fotopowych zapisów VEP8.</li>
	<li>Utrzymuj temperaturę ciała na poziomie 37 ± 0,5 °C za pomocą systemu homeotermicznych z sondą termometru doodbytniczego.</li>
	<li>Rozszerz źrenice za pomocą 1,0% kropli do oczu z tropikamidu. Otwórz skórę nad czaszką, aby uzyskać dostęp do wstępnie umieszczonych elektrod śrubowych in situ.</li>
	<li>Podłącz nad przeciwległą korą wzrokową stymulowanego oka i odniesienia do amplifier. Włóż elektrodę igłową do ogona jako masę. Zmierz i utrzymuj impedancję elektrody poniżej 5 kΩ.</li>
	<li>Umieść mini-stymulator Ganzfelda bezpośrednio na skórze wokół powiek, aby zapewnić lepszą izolację oczu7. Oświetlenie stymulatora należy wcześniej skalibrować za pomocą fotometru.</li>
	<li>Dostarczaj stymulację fototyczną poprzez błyski światła 100 razy z częstotliwością 1 Hz, z ustawieniami filtra pasmowoprzepustowego o niskim i wysokim poziomie odpowiednio 1 i 100 Hz. Częstotliwość próbkowania sygnału wynosi 5 kHz. 
	Uwaga: Sygnały powinny być próbkowane co najmniej z częstotliwością około 250–300 Hz, aby zapewnić pobranie więcej niż dwóch próbek podczas każdego cyklu.</li>
	<li>Zszyj skórę z powrotem i trzymaj zwierzęta na podkładce rozgrzewającej, aby dojść do siebie po znieczuleniu. Zapis może być wielokrotnie nagrywany na poszczególnych zwierzętach w celu monitorowania zmian funkcjonalnych w danym okresie czasu.</li>
	<li>W punkcie końcowym należy podać wstrzyknięcie pentobarbitonu sodu (100 mg/kg, i.p.) w celu eutanazji zwierzęcia. Potwierdzić eutanazję przez zatrzymanie akcji serca, zatrzymanie oddechu i obniżenie temperatury ciała.</li>
</ol>
4. Przygotowanie tkanek i histologia
<ol>
	<li>Usuń nerwy wzrokowe od zwierząt poddanych eutanazji pod mikroskopem i utrwal tkankę w 1% paraformaldehydzie O/N.</li>
	<li>Dokładnie umyj chusteczkę solą fizjologiczną. Potraktuj tkankę w automatycznym procesorze tkanek i zanurz w parafinie. Ciąć odcinki (5 - 10 μm) za pomocą mikrotomu obrotowego. 
	Uwaga: W celu badania immunohistochemicznego utrwalić tkankę w 1% paraformaldehydzie, przemyć solą fizjologiczną i inkubować z 30% sacharozą O / N. Zanurz tkankę w pożywce do zatapiania OCT i wykonaj kriosekcje za pomocą kriostatu.</li>
	<li>Inkubować skrawki w 0,1% szybkim niebieskim roztworze, takim jak Luxol (w 95% etanolu) O/N w temperaturze 56 °C. Różnicować skrawki w 0,05% węglanie litu przez 30 sekund, a następnie w 70% etanolu przez kolejne 30 sekund. Na koniec przed montażem sekcji należy zabarwić przeciwbarwnie w 0,1% roztworze fioletu krezylowego przez 30 sekund. Użyj szybkiego barwienia na niebiesko, aby zidentyfikować mielinę w nerwie wzrokowym5.</li>
</ol>

<ol><li>Balcer, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+practice.+Optic+neuritis%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Clinical practice. Optic neuritis.</a> N Engl J Med. 354 (12), 1273-1280 (2006).</li>
<li>Lassmann, H. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLassmann%2C+H+%22Multiple+sclerosis+as+a+neuronal+disease%22">Multiple sclerosis as a neuronal disease</a>. Waxman, S. G. , Elsevier. 153-164 (2005).</li>
<li>Fahle, M., Bach, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aFahle%2C+M+%22Principles+and+practice+of+clinical+electrophysiology+of+vision%22">Principles and practice of clinical electrophysiology of vision</a>. Heckenlively, J., Arden, G. , MIT Press. 207-234 (2006).</li>
<li>Halliday, A. M., McDonald, W. I., Mushin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Delayed+visual+evoked+response+in+optic+neuritis%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Delayed visual evoked response in optic neuritis.</a> Lancet. 1, 982-985 (1972).</li>
<li>You, Y., Klistorner, A., Thie, J., Graham, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Latency+delay+of+visual+evoked+potential+is+a+real+measurement+of+demyelination+in+a+rat+model+of+optic+neuritis%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Latency delay of visual evoked potential is a real measurement of demyelination in a rat model of optic neuritis.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 52 (9), 6911-6918 (2011).</li>
<li>You, Y., Klistorner, A., Thie, J., Gupta, V. K., Graham, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Axonal+loss+in+a+rat+model+of+optic+neuritis+is+closely+correlated+with+visual+evoked+potential+amplitudes+using+electroencephalogram+based+scaling%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Axonal loss in a rat model of optic neuritis is closely correlated with visual evoked potential amplitudes using electroencephalogram based scaling.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 53, 3662(2012).</li>
<li>You, Y., Klistorner, A., Thie, J., Graham, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improving+reproducibility+of+VEP+recording+in+rats%3A+electrodes%2C+stimulus+source+and+peak+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Doc+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">Improving reproducibility of VEP recording in rats: electrodes, stimulus source and peak analysis.</a> Doc Ophthalmol. 123 (2), 109-119 (2011).</li>
<li>Heiduschka, P., Schraermeyer, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+visual+function+in+pigmented+and+albino+rats+by+electroretinography+and+visual+evoked+potentials%5BTitle%5D)+AND+%22Graefes+Arch+Clin+Exp+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">Comparison of visual function in pigmented and albino rats by electroretinography and visual evoked potentials.</a> Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol. 246 (11), 1559-1573 (2008).</li>
<li>You, Y., Thie, J., Klistorner, A., Gupta, V. K., Graham, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Normalization+of+visual+evoked+potentials+using+underlying+electroencephalogram+levels+improves+amplitude+reproducibility+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Normalization of visual evoked potentials using underlying electroencephalogram levels improves amplitude reproducibility in rats.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 53 (3), 1473-1478 (2012).</li>
<li>Levkovitch-Verbin, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+models+of+optic+nerve+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Eye+%28Lond%29%22%5BJournal%5D)">Animal models of optic nerve diseases.</a> Eye (Lond). 18 (11), 1066-1074 (2004).</li>
<li>Henry, K. R., Rhoades, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Relation+of+albinism+and+drugs+to+the+visual+evoked+potential+of+the+mouse%29%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Physiol+Psychol%22%5BJournal%5D)">Relation of albinism and drugs to the visual evoked potential of the mouse).</a> J Comp Physiol Psychol. 92 (2), 271-279 (1978).</li>
<li>Murrell, J. C., Waters, D., Johnson, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+effects+of+halothane%2C+isoflurane%2C+sevoflurane+and+desflurane+on+the+electroencephalogram+of+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Anim%22%5BJournal%5D)">Comparative effects of halothane, isoflurane, sevoflurane and desflurane on the electroencephalogram of the rat.</a> Lab Anim. 42 (2), 161-170 (2008).</li>
<li>Makela, K., Hartikainen, K., Rorarius, M., Jantti, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Suppression+of+F-VEP+during+isoflurane-induced+EEG+suppression%5BTitle%5D)+AND+%22Electroencephalogr+Clin+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Suppression of F-VEP during isoflurane-induced EEG suppression.</a> Electroencephalogr Clin Neurophysiol. 100 (3), 269-272 (1996).</li>
<li>Boyes, W. K., Padilla, S., Dyer, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Body+temperature-dependent+and+independent+actions+of+chlordimeform+on+visual+evoked+potentials+and+axonal+transport+in+optic+system+of+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Neuropharmacology%22%5BJournal%5D)">Body temperature-dependent and independent actions of chlordimeform on visual evoked potentials and axonal transport in optic system of rat.</a> Neuropharmacology. 24 (8), 743-749 (1985).</li>
<li>Hetzler, B. E., Boyes, W. K., Creason, J. P., Dyer, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temperature-dependent+changes+in+visual+evoked+potentials+of+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Electroencephalogr+Clin+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Temperature-dependent changes in visual evoked potentials of rats.</a> Electroencephalogr Clin Neurophysiol. 70 (2), 137-154 (1988).</li>
<li>Mitchell, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effects+of+lysolecithin+on+non-myelinated+axons+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathol%22%5BJournal%5D)">The effects of lysolecithin on non-myelinated axons in vitro.</a> Acta Neuropathol. 58 (4), 243-248 (1982).</li>
<li>Meyer, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acute+neuronal+apoptosis+in+a+rat+model+of+multiple+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Acute neuronal apoptosis in a rat model of multiple sclerosis.</a> J Neurosci. 21 (16), 6214-6220 (2001).</li>
<li>Lachapelle, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Failure+of+remyelination+in+the+nonhuman+primate+optic+nerve%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Pathol%22%5BJournal%5D)">Failure of remyelination in the nonhuman primate optic nerve.</a> Brain Pathol. 15 (3), 198-207 (2005).</li>
</ol>

Żaden z autorów nie ma sprzecznych interesów ani sprzecznych interesów.

Nerw wzrokowy jest bardzo podatny na uszkodzenia mechaniczne. Uszkodzenie nerwu wzrokowego w czasie 1 s może prowadzić do około 75% utraty RGC w okresie 2 tygodni10. Dlatego podczas wykonywania zabiegów chirurgicznych wymagana jest szczególna ostrożność. Zgodnie z doświadczeniem autorów, znacznie lepiej jest zastosować podejście preparacyjne, aby odsłonić i przebić się przez tkanki wokół nerwu wzrokowego wzdłuż orientacji nerwu, niż penetrować w orientacji prostopadłej do nerwu wzrokowego. Ponadto opona twarda...

Zapalenie nerwu wzrokowego jest jedną z najczęstszych form neuropatii nerwu wzrokowego, powodującą całkowitą lub częściową utratę wzroku1. Histologicznie charakteryzuje się demielinizacją zapalną, utratą aksonów komórek zwojowych siatkówki i różnym stopniem remielinizacji nerwu wzrokowego2. Zapalenie nerwu wzrokowego jest zwykle oczywistym początkiem stwardnienia rozsianego. Wzrokowy potencjał wywołany (VEP) jest nieinwazyjnym narzędziem do badania funkcji układu wzrokowego. Odzwierciedla funkcję zasiatkówkową od siatkówki do pierwotnej kory wzrokowej i jest dotknięta w wielu stanach związanych z chorobami nerwu wzrokowego3. VEP jest stosowany głównie u pacjentów z zapaleniem nerwu wzrokowego w celu oceny integralności drogi wzrokowej4. 
Opóźnienie VEP, które odzwierciedla prędkość przewodzenia sygnału wzdłuż ścieżki wzrokowej, jest uważane za dokładny pomiar poziomu zmian związanych z mieliną w nerwie wzrokowym5; podczas gdy amplituda VEP jest uważana za ściśle skorelowaną z aksonalnym uszkodzeniem komórek zwojowych siatkówki (RGC)6. Hipoteza ta została dość dobrze ugruntowana przy użyciu szczurzego modelu demielinizacji nerwu wzrokowegowywołanej lizolecytyną 5. 
Tutaj wyjaśniamy kompleksowy protokół techniki mikroiniekcji nerwu wzrokowego u gryzoni, który może zminimalizować związane z manipulacją chirurgiczną uszkodzenie nerwu per se, jak również sąsiednich tkanek, takich jak mięśnie zewnątrzgałkowe i naczynia krwionośne. Opisano również operację wszczepienia elektrody czaszki do rejestracji VEP u zwierząt7. Zapisy VEP mogą być wielokrotnie przeprowadzane na zwierzętach przez pewien okres czasu w celu oceny zmian związanych z demielinizacją/remielinizacją, a także wpływu na integralność aksonalną nerwu wzrokowego.

<table><tbody><tr><td>Ketamina 100 mg / ml (Ketamil)</td> <td>Troy Laboratories</td><td>AC 116</td><td></td></tr><tr><td>Medetomidine 1 mg / ml (Domitor)</td> <td>Pfizer</td><td>sc-204073</td><td></td></tr><tr><td>Tropikamid 1,0% (Mydriacyl)</td> <td>Alcon</td><td>sc-202371</td><td></td></tr><tr><td>System homeotermicznych</td><td>Aparat Harvard</td><td>NC9203819</td><td></td></tr><tr><td>Miernik impedancji&nbsp;</td><td>Trawa</td><td>F-EZM5</td><td></td></tr><tr><td>Elektrody śrubowe&nbsp;</td><td>Mikro łączniki</td><td>M1.0 i razy; 3mm Csk Slot M/T 304 S/S</td><td></td></tr><tr><td>Podskórne elektrody igłowe&nbsp;</td><td>Trawa</td><td>F-E3M-72</td><td></td></tr><tr><td>Szybka naprawa&nbsp;</td><td>DeguDent GmbH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dioda elektroluminescencyjna&nbsp;</td><td>Biowzmacniacz Nichia</td><td>NSPG300A</td><td></td></tr><tr><td></td><td>CWE, Inc.</td>System <td>BMA-400</td><td></td></tr><tr><td>CED</td><td>Cambridge Electronic Design, Ltd.</td>Strzykawka <td>Power1401</td><td></td></tr><tr><td>Hamilton&nbsp;</td><td>Hamilton</td><td>87930</td><td></td></tr><tr><td>Lizolecytyna</td><td>Sigma</td><td>L4129</td><td></td></tr><tr><td>Evan' s niebieski&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>E2129</td><td></td></tr></tbody></table> powiedział:

wizualny zapis potencjału wywołanego w szczurzym modelu eksperymentalnej demielinizacji nerwu wzrokowego

Visual Evoked Potential Recording in a Rat Model of Experimental Optic Nerve Demyelination

Zapis wizualnego potencjału wywołanego (VEP) jest szeroko stosowany w praktyce klinicznej do oceny ciężkości zapalenia nerwu wzrokowego w jego ostrej fazie oraz do monitorowania przebiegu choroby w okresie obserwacji. Zmiany parametrów VEP ściśle korelują z patologicznym uszkodzeniem nerwu wzrokowego. Protokół ten zawiera szczegółowy opis modelu mikroiniekcji nerwu wzrokowego u gryzoni, w którym w nerwie wzrokowym wytwarzana jest częściowa zmiana demielinizacyjna. Omówiono również techniki nagrywania VEP. Za pomocą elektrod z wszczepioną czaszką jesteśmy w stanie uzyskać powtarzalne ślady VEP w trakcie sesji i między sesjami. VEP mogą być rejestrowane u poszczególnych zwierząt przez pewien okres czasu w celu oceny zmian funkcjonalnych w nerwie wzrokowym wzdłużnie. Model demielinizacji nerwu wzrokowego, w połączeniu z protokołem rejestracji VEP, stanowi narzędzie do badania procesów chorobowych związanych z demielinizacją i remielinizacją i może być potencjalnie wykorzystany do oceny skutków nowych leków remielinizacyjnych lub terapii neuroprotekcyjnych.

Powtarzalne zapisy VEP w obrębie jednej sesji przedstawiono na Rysunku 1; po wstrzyknięciu do nerwu wzrokowego widoczne jest znaczące opóźnienie latencji N1. Częściowe uszkodzenia odmielinowe nerwu wzrokowego można zaobserwować na przekrojach histologicznych przy użyciu barwienia Luxol fast blue5. Rysunek 2 przedstawia reprezentatywny przekrój z niewielką, ogniskową zmianą odmielinową w centrum nerwu wzrokowego. Należy zauważyć, że pojedynczy przekrój poprzeczny nie reprezentu...

Ogniskowa demienizacja jest indukowana w nerwie wzrokowym za pomocą mikroiniekcji lizolecytyny. Wzrokowe potencjały wywołane są rejestrowane za pomocą elektrod czaszkowych wszczepionych w korę wzrokową w celu zbadania przewodzenia sygnału wzdłuż szlaku wzrokowego in vivo. Protokół ten szczegółowo opisuje procedury chirurgiczne leżące u podstaw implantacji elektrod i mikroiniekcji nerwu wzrokowego.

Wizualny zapis potencjału wywołanego w szczurzym modelu eksperymentalnej demielinizacji nerwu wzrokowego

The visual evoked potential (VEP) recording is widely used in clinical practice to assess the severity of optic neuritis in its acute phase, and to ...

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest monitorowanie demielinizacji w nerwie wzrokowym in vivo. Jest to realizowane poprzez wstępną implantację mikroelektrod nad korą wzrokową. W drugim kroku do nerwu wzrokowego wstrzykuje się mikrodozą lyinę, co indukuje ogniskową zmianę demielinizacyjną.Następnie można przeprowadzić rejestrację potencjałów wywołanych wzrokowo. Ostatecznie analiza regresji wykazuje silną korelację liniową między opóźnieniem latencji potencjału wywołanego wzrokowo a objętością. W niniejszym filmie zaprezentujemy naszą technikę rejestracji potencjałów wywołanych wzrokowo u szczurów.Wykorzystując wszczepione elektrody czaszkowe, zaprezentujemy również technikę ogniskowej demielinizacji nerwu wzrokowego z zastosowaniem mikroiniekcji. Wszystkie eksperymenty są przeprowadzane tutaj, w naszym laboratorium na Wydziale Medycyny Uniwersytetu Macquarie. Technikę zademonstruje Nitin Chichi, nasz student studiów doktoranckich. Aby rozpocząć, należy znieczulić dorosłego szczura w wieku powyżej 12 tygodni poprzez dostrzynową iniekcję ketaminy i ksylazyny przed rozpoczęciem operacji.Sprawdź brak odruchów cofania. Bądź w gotowości do podania dawek ketaminy 10% w razie potrzeby, aby opanować wszelkie odruchy, które mogą powrócić u zwierzęcia w trakcie operacji. Następnie wygol skórę w miejscu nacięcia chirurgicznego, a potem umieść zwierzę na podgrzewaczu, aby zakończyć przygotowania.Przetrzyj skórę jodopowidonom, obłóż zwierzę polem operacyjnym i nałóż maść oftalmiczną. Należy również zapewnić aseptykę, stosując sterylne instrumenty. Aby rozpocząć operację, wykonaj podłużne nacięcie skóry w linii środkowej głowy.Następnie należy usunąć tkankę łączną, aby uzyskać dobrą ekspozycję czaszki. Dalej, używając mikro wiertarki ręcznej, ostrożnie wykonuje się małe otwory wiertnicze, siedem milimetrów za bgma i trzy milimery bocznie od linii środkowej. Elektrody śrubowe implantuje się przez czaszkę, wprowadzając je na głębokość około 0,5 milimetra do kory.Następnie, w razie potrzeby, zaimplantuj referencyjną elektrodę śrubową w linii środkowej, 3 mm rostralnie od bgma. Nałóż cement dentystyczny, aby otoczyć i unieruchomić elektrody śrubowe. Na koniec zaszyj skórę.Elektrody mogą pozostać odsłonięte, aby uniknąć konieczności ponownego otwierania skóry przy każdym zapisie. Następnie, przed wybudzeniem zwierzęcia z anestezji, należy szybko podać niesteroidowy lek przeciwzapalny (NLPZ) lub opioidowy lek przeciwbólowy. Na koniec skórę należy przemyć maścią z antybiotykiem.Umieść zwierzę w klatce rekonwalescencyjnej z matą grzewczą i stale monitoruj je, aż odzyska pełną zdolność poruszania się. Następnie pozwól mu dojść do siebie przez co najmniej tydzień. Przed wykonaniem zapisów VEP przygotuj zwierzę do zabiegu zgodnie z wcześniejszym opisem, a następnie za pomocą precyzyjnych nożyczek irydowych wykonaj nacięcie skóry o długości od 1 do 1,5 centymetra nad oczodołem badanego oka.Otwórz tkankę podskórną i uzyskaj dostęp do jamy oczodołu. Następnie, korzystając ze stereomikroskopu, otwórz spojówkę oraz przednią torebkę ścięgnistą. Następnie odsunie mięśnie pozagałkowe i śródoczodołowe gruczoły łzowe.Aby odsłonić około trzech milimetrów nerwu wzrokowego, należy użyć skalpela okulistycznego do podłużnego otwarcia warstw opony twardej i opony pajęczynicy. Następnie należy wprowadzić do nerwu szklaną mikropipetę przymocowaną do strzykawki Hamiltona, dwa milimetry za gałką oczną. W ciągu 30 sekund wstrzyknij dawkę lyiny z barwnikiem, aby zakończyć procedurę.Zszyj nacięcie skóry. Nałóż maść z antybiotykiem, aby zapobiec infekcji. Przenieś zwierzę na podkładkę grzewczą i monitoruj jego stan do czasu wybudzenia.Po znieczuleniu zwierzęcia i przygotowaniu skóry w sposób opisany wcześniej, przenieś je do ciemnego pomieszczenia. Utrzymuj temperaturę jego ciała z dokładnością do połowy stopnia w zakresie 37°C, korzystając z systemu koca homeotermicznego i sondy temperaturowej podczas monitorowania w ciemności. Pozostaw zwierzę do adaptacji na okres od 5 do 30 minut.Po pół godzinie należy rozszerzyć źrenice za pomocą 1% kropli do oczu z tropikamidem. Następnie, używając nożyczek i pęsety, należy rozciąć skórę nad czaszką i odsłonić wcześniej umieszczone elektrody śrubowe NC two.Podłącz śruby do impedancjometru. Następnie zmierz impedancję elektrod i utrzymaj ją na poziomie poniżej 5 kΩ. Teraz podłącz śrubę nad przeciwległą korą wzrokową oka stymulowanego.Następnie wprowadź elektrodę igłową do ogona, aby uzyskać uziemienie. Teraz umieść skalibrowany mini stymulator ganzfeld na skórze wokół powiek, aby poprawić izolację oczu. Następnie zastosuj stymulację fotyczną, używając 100 błysków z częstotliwością 1 Hz, z filtrem dolnoprzepustowym ustawionym na 1 Hz oraz filtrem górnoprzepustowym.Filtruj przy 100 hertz. Po zakończeniu zaszyj skórę i pozostaw zwierzę na podgrzewaczce, aby wybudziło się z anestezji. Możliwe jest wykonywanie powtórnych pomiarów od kilku razy w tygodniu do jednego razu co kilka tygodni.W przeciwieństwie do tego, zapisy VEP wykazują istotne opóźnienie latencji fali N. Po wstrzyknięciu do nerwu wzrokowego codziennie wykonywano pomiary w celu wykazania powtarzalności. W przekrojach tkankowych barwionych luxol fast blue można było zaobserwować częściowe zmiany demielinizacyjne nerwu wzrokowego.Po pomiarze objętości zmiany widoczna stała się korelacja między opóźnieniem latencji a rozmiarem uszkodzenia. Technika ta może być wykorzystywana do wywoływania zmian w nerwie wzrokowym i korelowania tych uszkodzeń ze zmianami w VP; może służyć jako model ogniskowej demielinizacji. Ponieważ wywołany rozmiar zmiany jest dość zmienny, istotne jest potwierdzenie tych zmian histologicznie.

visual-evoked-potential-recording-rat-model-experimental-optic-nerve

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Komórki zwojowe siatkówki przekazują informacje wizualne z oka do mózgu za pomocą sekwencji potencjałów czynnościowych. W niniejszym materiale demonstrujemy sposób rejestracji potencjałów czynnościowych pojedynczych komórek zwojowych in vivo u znieczulonych szczurów.

Rejestracja pojedynczych jednostek In vivo z skrzyżowania wzrokowego szczura

Ten film pokazuje przygotowanie modelu szczura do badania zdrowia siatkówki i integralności szlaku wzrokowego. Wizualny potencjał wywołany i elektrody referencyjne i aktywne elektroretinografii są podłączone do szczura, a następnie wyrównuje platformę ze szczurem przed misą Ganzfelda, aby uzyskać równomierne oświetlenie siatkówki i zamyka klatkę Faradaya, aby uniknąć zakłóceń zewnętrznych.

Przygotowanie modelu szczura do oceny integralności ścieżki wzrokowej przy użyciu konfiguracji elektrofizjologicznej

Ten film demonstruje proces pomiaru wzrokowych potencjałów wywołanych lub VEP u przystosowanego do ciemności, znieczulonego szczura z wszczepionymi elektrodami czaszkowymi, które rejestrują sygnały elektryczne z kory wzrokowej mózgu w odpowiedzi na bodźce świetlne.

Rejestracja wizualnych potencjałów wywołanych za pomocą elektrod czaszkowych w modelu szczurzym

Ten film pokazuje, jak rejestrować elektroretinogram (ERG) i wizualny potencjał wywołany (VEP) u przytomnego szczura. Szczur, z chirurgicznie wszczepionymi elektrodami, jest najpierw przystosowany do ciemności. Po zastosowaniu kropli rozszerzających zwierzę umieszcza się w unieruchomieniu i umieszcza w misce Ganzfelda. Następnie rejestrowane są sygnały ERG i VEP.

Zapis elektroretinogramu i wizualnego potencjału wywołanego u szczura

Ten film demonstruje procedurę chirurgicznego dostępu do nerwu wzrokowego u znieczulonego zwierzęcia i precyzyjnego dostarczania lizolecytyny w celu wywołania ogniskowej demielinizacji, tworząc warunki neuropatologiczne do dalszych badań.

Indukowanie miejscowej demielinizacji w nerwie wzrokowym za pomocą lizolecytyny

Ten protokół opisuje jednoczesny pomiar elektroretinogramu i wzrokowych potencjałów wywołanych u znieczulonych szczurów.

Jednoczesna rejestracja elektroretinografii i wzrokowych potencjałów wywołanych u znieczulonych szczurów

Pokazujemy chirurgiczne implanty i procedury rejestrujące do pomiaru wizualnych sygnałów elektrofizjologicznych z oka (elektroretinogram) i mózgu (wizualny potencjał wywołany) u przytomnych szczurów, co jest bardziej analogiczne do stanu ludzkiego, gdzie nagrania są prowadzone bez zakłóceń znieczulenia.

Implantacja i rejestracja bezprzewodowego elektroretinogramu i wizualnego potencjału wywołanego u świadomych szczurów

Zaprojektowaliśmy 16-kanałowy czujnik EEG typu suchego, który jest nieinwazyjny, odkształcalny i wielokrotnego użytku. W artykule opisano cały proces od wytworzenia proponowanej elektrody EEG do przetwarzania sygnałów wizualnego potencjału wywołanego (VEP) mierzonych na skórze głowy myszy za pomocą suchego, nieinwazyjnego wielokanałowego czujnika EEG.

Wizualne zapisy potencjału wywołanego u myszy za pomocą suchego, nieinwazyjnego wielokanałowego czujnika EEG skóry głowy

Tutaj demonstrujemy kilka testów in vivo (potencjał wywołany w trybie wizualnym flash, elektroretinogram wzorcowy i koherentna tomografia optyczna) u kóz i makaków rezusów, aby zrozumieć strukturę i funkcję nerwu wzrokowego i jego neuronów.

In vivo (in vivo) Metody oceny funkcji i struktury komórek zwojowych siatkówki oraz nerwu wzrokowego u dużych zwierząt

Ten artykuł przedstawia szczegółowe instrukcje dotyczące wykonywania zmiażdżenia nerwu wzrokowego w modelu królika przy użyciu standardowych technik chirurgii okulistycznej.

Chirurgiczne podejście do zmiażdżenia nerwu wzrokowego w modelu królika

Poznaj metodę rejestracji potencjałów wywołanych wzrokowo u szczurów z implantowanymi elektrodami czaszkowymi w celu monitorowania demielinizacji nerwu wzrokowego in vivo. Protokół umożliwia ocenę funkcjonalną zmian patologicznych.

Wizualny zapis potencjału wywołanego w szczurzym modelu eksperymentalnej demielinizacji nerwu wzrokowego

Przeglądaj więcej filmów