Dekarboksylacja enzymatyczna sterowana światłem

Ogólnym celem tego eksperymentu jest wywołanie reakcji enzymatycznych za pomocą światła widzialnego. W tym podejściu światło jest wykorzystywane do przekształcania kwasów tłuszczowych w końcowe alkiny w łagodnych warunkach reakcji. Dekarboksylacja wymaga zerwania wiązań CC.

A to wiązanie jest bardzo stabilne, co sprawia, że jest to bardzo trudna reakcja. Wykorzystanie światła jest zrównoważonym podejściem do osiągnięcia tak trudnej reakcji. Po raz pierwszy wpadliśmy na pomysł tej metody, gdy próbowaliśmy dodać nadtlenek wodoru bezpośrednio do reakcji, co doprowadziło do inaktywacji enzymów.

Główną zaletą tej techniki jest to, że dostarcza stałą ilość nadtlenku wodoru. Najpierw użyliśmy oczyszczonego OleT do biokatalizy sterowanej światłem, aby scharakteryzować nasz enzym. Później testowaliśmy również ekstrakt surowy, który byłby ważny dla rozwoju zastosowań przemysłowych.

Po sklonowaniu syntetycznego genu OleT do wektora ekspresyjnego i przekształceniu plazmidu w E.Coli zgodnie z opisem w protokole tekstowym, zaszczepij komórki w dwóch probówkach zawierających trzy mililitry pożywki LB ze 100 mikrogramami na mililitr ampicyliny. Inkubuj kultury wstępne w shakerze przez 15 godzin. Rozcieńczyć dwa mililitry kultury w 200 mililitrach LB ampicyliną w dwóch jednolitrowych kolbach.

Inkubować kolby w wytrząsarce w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 180 obr./min, aż kultury osiągną gęstość optyczną w odległości 600 nanometrów między 0,6 a 0,8. Następnie dodaj 0,5 milimola kwasu aminolewulinowego delta do kultur. A następnie indukuj komórki, dodając tetracyklinę w dawce 0,2 mikrograma na mililitr do kolb.

Inkubuj kultury przez 15 godzin w temperaturze 20 stopni Celsjusza i 180 obr./min. Po indukcji zdekantować kultury do probówek wirówkowych i odwirować probówki w temperaturze 12000 razy G i czterech stopniach Celsjusza przez 20 minut. Odrzucić supernatant.

Zawiesić granulki przez pipetowanie w 50 mililitrach lodowatego buforu Tris i przenieść zawiesinę do stożkowej probówki wirówkowej. Kontynuuj wirowanie w temperaturze 4000 razy G i czterech stopniach Celsjusza przez 15 minut. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić każdą osadkę w trzech mililitrach buforu, powtarzając pipetowanie.

Lizuj komórki przez sonikację z trzema 30-sekundowymi cyklami, zatrzymując się na jedną minutę między cyklami. Następnie odwiruj lizat w temperaturze 15000 razy G i czterech stopniach Celsjusza przez 20 minut, a następnie ostrożnie pipetuj ekstrakt bez komórek do stożkowych probówek wirówkowych. Aby przygotować surowy ekstrakt do biokatalizy sterowanej światłem, przenieś trzy mililitry jednego ekstraktu bezkomórkowego do 10-kilodaltonowego filtra wirówkowego i odwiruj przy 4000 razy G w czterech stopniach Celsjusza w celu usunięcia małych cząsteczek.

Ponownie zawiesić białko w trzech mililitrach Tris. Aby scharakteryzować aktywność OleT w biokatalizie sterowanej światłem, białko musi zostać oczyszczone. Aby rozpocząć oczyszczanie białka, załaduj trzy mililitry ekstraktu bez komórek na zrównoważone kolumny wirowe NTA z niklu.

Uszczelnij kolumny dolnymi zaślepkami i nakrętkami. I lekko nimi potrząśnij, aż żywica zostanie równomiernie rozprowadzona. Kontynuuj, inkubując kolumny w wytrząsarce nad głową.

Następnie odwirować kolumnę. Następnie przemyć kolumny, dodając jeden mililitr buforu płuczącego i odwirowując je w temperaturze 700 razy G przez dwie minuty. Powtórz pranie jeszcze dwa razy.

Po umyciu umieść kolumny w stożkowych probówkach wirówkowych i dodaj jeden mililitr buforu elucyjnego do każdej kolumny. Odwirować probówki o temperaturze 700 razy G przez dwie minuty i powtórzyć elucję jeszcze dwa razy. Dodać połączone ekstrakty kolumnowe do 10-kilodaltonowego filtra wirówkowego i odwirować go w temperaturze 4000 razy G i czterech stopniach Celsjusza, aby oddzielić imidazol używany do elucji od enzymu.

Na koniec określić czystość i stężenie białka, jak wskazano w protokole tekstowym. Aby rozpocząć procedurę biotransformacji, najpierw dodaj 10% środka powierzchniowo czynnego, takiego jak tergitol i 28,4 miligrama kwasu stearynowego do wody destylowanej, aby uzyskać 10 mililitrów 10-milimolowego roztworu podstawowego. Podgrzej roztwór w komorze grzewczej w temperaturze 60 stopni Celsjusza, aż kwas stearynowy całkowicie się rozpuści.

Użyj tego roztworu, aby przygotować mieszaninę reakcyjną zgodnie z następnym protokołem. Dodaj FMN, EDTA, bufor i kwas stearynowy do dwóch przezroczystych szklanych probówek i wymieszaj w łaźni wodnej o temperaturze 25 stopni Celsjusza. Kontynuuj, dodając do probówek 200 mikrogramów na mililitr oczyszczonego enzymu lub surowego ekstraktu.

I oświetl je przezroczystą żarówką LED w odległości dwóch centymetrów. Następnie pobierz 200 mikrolitrów próbek w określonych punktach czasowych w probówkach wypełnionych 20 mikrolitrami 37% kwasu solnego, aby zatrzymać reakcje. Następnie dodaj pięć mikrolitrów 10-milimolowego roztworu kwasu mirystynowego do każdej próbki jako wzorzec wewnętrzny.

Aby przeanalizować produkty reakcji, dwukrotnie dodaj 500 mikrolitrów octanu etylu do probówek. Odwróć probówki, aby je wymieszać i odwirować przez jedną minutę w temperaturze 13 000 razy G. Następnie przenieś 400 mikrolitrów supernatantów do probówek mikrowirówek i całkowicie je odparuj, delikatnie na probówki sprężonym powietrzem. Dodaj 200 mikrolitrów MSTFA do probówek.

I inkubować mieszaninę w temperaturze 60 stopni Celsjusza przez 30 minut, aby uzyskać próbki przed analizą. Analizować produkty reakcji, wstrzykując próbkę o objętości czterech mikrolitrów do chromatografu gazowego wyposażonego w detektor płomieniowo-jonizacyjny, stosując profil temperatury opisany w protokole tekstowym. Następnie oznaczyć stosunek jednego heptadekanu i beta hydroksykwasu utworzonych w każdej próbce reakcyjnej za pomocą chromatografu gazowego sprzężonego ze spektrometrem masowym.

Użyj ustawień temperatury pieca i spektrometru masowego zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Wstrzyknąć jeden mikrolitr każdej próbki do chromatografu gazowego i zapisać chromatogram. Na koniec należy monitorować chromatogramy GCMS dla każdej próbki i analizować je zgodnie z protokołem producenta.

Masy cząsteczkowe produktów reakcji enzymatycznych oznaczono za pomocą chromatografu gazowego sprzężonego ze spektrometrem masowym. W przypadku kwasów tłuszczowych o dłuższych łańcuchach acylowych enzym OleT preferencyjnie katalizuje ich dekarboksylację do olefin o różnej długości. Próbki z reakcji biotransformacji analizowano za pomocą chromatografu gazowego wyposażonego w detektor płomieniowo-jonizacyjny

Wykazano, że dekarboksylacja kwasu stearynowego zachodzi trzy razy szybciej niż reakcja hydroksylacji, w której 99% kwasu stearynowego przekształca się w mieszaninę 3,3:1 jednego heptadekanu do kwasu 2-hydroksystearynowego. Po opanowaniu, biokatalizę sterowaną światłem można wykonać w ciągu kilku godzin, jeśli powiedzmy, że wykonuję ją prawidłowo. W przypadku katalizy świetlnej wyzwaniem jest powiązanie użytecznych reakcji ze zbiorem światła.

W naszym przypadku mamy światło w cząsteczce FMN jako fotouczulacz i łączymy je z naszym enzymem za pomocą cząsteczki przenoszącej, którą jest nadtlenek wodoru.