Name: Dekarboksylacja enzymatyczna sterowana światłem (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-05-22T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 58 s
Description: Poznaj metodę fotobiokatalizy do przekształcania kwasów tłuszczowych w terminalne alkiny przy użyciu światła widzialnego i enzymu OleT. Technika ta zapewnia stałe dostarczanie nadtlenku wodoru bez inaktywacji enzymu.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

R.K. i F.H. są wdzięczni Komisji Europejskiej za wsparcie finansowe w ramach Biokaskad Marie-Skłodowska ITN (nr 634200).

Uwaga: Przed użyciem należy zapoznać się ze wszystkimi odpowiednimi kartami charakterystyki materiałów (MSDS). Kilka z substancji chemicznych wykorzystanych w tych syntezach jest silnie toksycznych i rakotwórczych. Wszystkie etapy z wykorzystaniem szkodliwych rozpuszczalników organicznych, w szczególności ekstrakcja produktów reakcji oraz derywatyzacja kwasów tłuszczowych, muszą być przeprowadzane w dygestorium z użyciem środków ochrony osobistej (okularów ochronnych, rękawiczek, fartucha laboratoryjnego, długich spodni oraz pełnego obuwia). Wszystkie operacje z wykorzystaniem organizmów zmodyfikowanych genetycznie w niniejszej pracy wymagają instalacji zatwierdzonych do pracy z organizmami zmodyfikowanymi genetycznie o poziomie bezpieczeństwa S1.
1. Ekspresja rekombinowanejy dekarboksylazy OleTJE w E. coli
<ol>
	<li>Przygotowanie szczepu produkcyjnego
	<ol>
		<li>Przygotować syntetyczny gen OleTJE z Jeotgalicoccus i sklonować go do wektora ekspresyjnego pASK-IBA37plus zgodnie z opisem.8 
		UWAGA: Aby uniknąć degradacji kwasów tłuszczowych przez enzymy metabolizmu bakteryjnego, wykorzystano szczep E. coli JW5020 z kolekcji Keio z dysfunkcyjnym szlakiem degradacji kwasów tłuszczowych.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Kultywacja i indukcja ekspresji enzymu
	<ol>
		<li>Przygotować prekulturę poprzez zaszczepienie mutanta OleT E. coli JW5020 z płytki LB (zawierającej 100 µg ml-1 ampicyliny) do dwóch probówek z 3 ml pożywki LB. Do pożywki w celu selekcji pipetować ampicylinę (100 µg ml-1) z roztworu zapasowego i inkubować w 37 °C przez 15 h w inkubatorze wytrząsowym przy 180 rpm.</li>
		<li>Do dwóch kolb wytrząsowych o pojemności 1 L z 200 ml pożywki LB zawierającej ampicylinę (100 µg ml-1) dodać po 2 ml prekultur. Inkubację prowadzić w 37 °C przy 180 rpm.</li>
		<li>Monitorować zmianę OD600nm po zaszczepieniu. Gdy OD600 osiągnie wartość między 0,6 a 0,8, indukować ekspresję poprzez dodanie tetracykliny (0,2 µg ml-1). Inkubować kultury przez 15 h w 20 °C przy 180 rpm. 
		UWAGA: Ponieważ OleTJE zawiera kofaktor hemu, przed indukcją konieczne jest dodanie kwasu δ-aminolewulinowego (0,5 mM), aby dostarczyć kulturze prekursor do syntezy kofaktora.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Liza komórek
	<ol>
		<li>Następujące kroki przeprowadzać w lodzie. Przenieść kultury poprzez zlewanie lub pipetowanie do probówek wirówkowych i użyć wagi, aby zapewnić równy rozkład. Wirować kultury przez 20 min przy 12 000 x g w 4 °C.</li>
		<li>Ostrożnie usunąć nadsącz i resuspender osady w 50 ml buforu (Tris 50 mM, NaCl 200 mM, pH 7,5) poprzez pipetowanie, a następnie przenieść zawiesinę do stożkowej probówki wirówkowej.</li>
		<li>Po wirowaniu przez 15 min przy 4 000 x g w 4 °C usunąć nadsącz i resuspender każdy osad w 3 ml buforu poprzez pipetowanie.</li>
		<li>Przeprowadzić lizę komórek poprzez sonikację roztworów w lodzie (trzy cykle x 30 s) z przerwą 1 min między cyklami. Wirować roztwory przez 20 min przy 15 000 x g w 4 °C w celu usunięcia resztek komórkowych, a następnie przenieść nadsącz do stożkowej probówki wirówkowej, unikając naruszenia osadu podczas pipetowania. Usunąć osad. 
		UWAGA: Jedna frakcja rozpuszczalnika zostanie użyta bezpośrednio do biokatalizy po usunięciu małych cząsteczek. Druga frakcja zostanie wykorzystana do oczyszczania OleTJE z tagiem His.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Usuwanie małych cząsteczek z ekstraktów komórkowych
	<ol>
		<li>Przed użyciem surowego ekstraktu w biokatalizie usunąć małe cząsteczki, które mogłyby zakłócać tworzenie nadtlenku wodoru lub transport elektronów, pipetując 3 ml ekstraktu pozbawionego komórek do jednostki filtra wirówkowego z membraną 10 kDa i wirować przy 4 000 x g w 4 °C. Resuspender pozostałe białko w 3 ml buforu Tris-HCl.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Oczyszczanie OleT
	<ol>
		<li>Nałożyć 3 ml drugiego ekstraktu komórkowego na kolumny spinowe His Pur Ni-NTA, które uprzednio zrównoważono buforem równoważącym (Tris 20 mM, NaCl 300 mM, imidazol 10 mM).</li>
		<li>Zamknąć kolumny dolnymi zatyczkami i górnymi nakrętkami, a następnie lekko nimi potrząsać, aż żywica zostanie równomiernie rozprowadzona w ekstrakcie pozbawionym komórek. Inkubować załadowane kolumny przez 30 min w wytrząsarce nadstołowej w 4 °C.</li>
		<li>Przemyć kolumny 1 ml buforu piorącego (Tris 20 mM, NaCl 300 mM, imidazol 20 mM, pH 7,4) poprzez wirowanie przy 700 x g przez 2 min. Powtórzyć ten krok dwukrotnie.</li>
		<li>Umieścić kolumny w nowej stożkowej probówce wirówkowej i dodać 1 ml buforu elucyjnego (Tris 20 mM, NaCl 300 mM, imidazol 250 mM, pH 7,4) dla OleTJE . Wirować przy 700 x g przez 2 min i powtórzyć ten krok dwukrotnie. 
		UWAGA: Imidazol zwiąże się z niklem, a tym samym usunie OleTJE z kolumny.</li>
		<li>Przenieść eluat do jednostki filtra wirówkowego (membrana 10 kDa) i wirować przy 4 000 x g w 4 °C, aby usunąć imidazol.</li>
		<li>Sprawdzić czystość enzymu za pomocą SDS-PAGE (15%).9 Wymieszać 3 µl eluatu z buforem SDS (stężenie końcowe 1x) i inkubować roztwór w 95 °C przez 5 min w celu denaturacji. Następnie nałożyć całkowitą ilość na żel SDS-PAGE. Prowadzić elektroforezę przy 35 mA, stosując komercyjny standard białkowy. Wykryć białko przy 50 kDa.</li>
		<li>W celu oznaczenia stężenia białka wykorzystać dostępny komercyjnie zestaw BSA. Pipetować 50 µl rozcieńczonych próbek białka (1:100, 1:200, 1:500) oraz standard BSA (0, 20, 30, 40, 50, 60, 80, 100 mg ml-1) na płytkę 96-dołkową. Dodać 200 µl odczynnika Bradforda, zmierzyć absorbancję przy 595 nm po 15 min za pomocą fluorymetru i obliczyć stężenia korzystając z krzywej wzorcowej.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Biotransformacja fotokatalityczna
<ol>
	<li>Reakcje biokatalityczne bez dodatku nadtlenku wodoru
	<ol>
		<li>Przygotować 10 ml roztworu stokowego 10 mM kwasu stearynowego (Mr 284,5 g mol-1), dodając 10%(v/v) tergitolu i 0,0284 g kwasu stearynowego do wody destylowanej. Podgrzać roztwór w komorze grzewczej do 60 °C, aż kwas tłuszczowy całkowicie się rozpuści.</li>
		<li>Biokataliza i pobieranie próbek
		<ol>
			<li>Przygotować dwie 2 ml mieszaniny reakcyjnej zawierającej 50 mM EDTA, 0,01 mM FMN i 0,5 mM kwasu stearynowego w buforze Tris-HCl. Dodać magnetyczny mieszadło w celu zapewnienia odpowiedniego dopływu tlenu i umieścić probówki szklane w łaźni wodnej podgrzanej do 25 °C.</li>
			<li>Dodać 200 µg ml-1 oczyszczonego enzymu lub 10% (v/v) ekstraktu bezkomórkowego do każdej z mieszanin reakcyjnych i naświetlać je żarówką z przezroczystego szkła (120 W) w odległości 15 cm od probówek reakcyjnych.</li>
			<li>Pobierać próbki o objętości 200 µl w określonych punktach czasowych (0, 10, 30, 60 i 120 min oraz przez noc), zatrzymując reakcję poprzez dodanie 20 µl 37% HCl. Dodać 5 µl kwasu mirystynowego (roztwór stokowy 10 mM) jako standard wewnętrzny.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Analiza produktów reakcji
	<ol>
		<li>W celu ekstrakcji dodać do próbek dwukrotnie 500 µl octanu etylu, odwrócić probówki i wirować przez 1 min przy 13 000 x g.</li>
		<li>Odbrać 400 µl supernatantu i pozwolić rozpuszczalnikowi całkowicie odparować.</li>
		<li>Przeprowadzić derywatyzację kwasów karboksylowych do kwasów trimetylosilylowych poprzez dodanie 200 µl N-metylo-N-(trimetylosilylo)trifluoroacetamidu (MSTFA). Inkubować roztwór w temperaturze 60 °C przez 30 min w celu przekształcenia grup hydroksylowych w etery trimetylosilylowe.</li>
		<li>Oznaczenie konwersji metodą GC/FID 
		UWAGA: Za pomocą GC/FID oznaczyć tworzenie się 1-heptadecenu (RT: 8,34 min), kwasu α- i β-hydroksystearynowego (RT: 12,05 i 12,1 min) oraz spadek ilości substratu (RT: 11,15 min).
		<ol>
			<li>Ustawić opisany poniżej profil temperatury. Ustawić temperaturę wstrzykiwania na 340 °C. Utrzymywać początkową temperaturę pieca na poziomie 90 °C przez 3,5 min, a następnie zwiększać ją w tempie 45 °C min-1. Przy 220 °C utrzymać temperaturę przez 2 min. Po ponownym zwiększeniu temperatury w tempie 45 °C min-1, utrzymać temperaturę 280 °C przez 2 min, a następnie zwiększać ją w tempie 60 °C min-1. 
			UWAGA: Maksymalną temperaturę 330 °C utrzymuje się przez 1,44 min.</li>
			<li>Wstrzyknąć 4 µl próbki, stosując podział (split ratio) 5:1, aby uzyskać szybkie odparowanie i jednorodne wymieszanie z gazem nośnym helem. 
			UWAGA: W zależności od wzrostu temperatury substrat i produkty przejdą w fazę gazową. Substancje są wykrywane przez detektor GC/FID po przejściu przez kolumnę w określonych czasach retencji i są wyświetlane jako piki na ekranie. Obserwować powstawanie pików na monitorze.</li>
			<li>Obliczyć stężenie powstałego produktu według następującego wzoru: 
			<img alt="Wzór na obliczenie stężenia produktu z użyciem stosunków pól powierzchni, współczynnik kalibracyjny; metoda analityczna." src="/files/ftp_upload/53439/53439eq1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Równanie 1"> 
			UWAGA: Współczynnik kalibracyjny został wyznaczony specjalnie dla tej kolumny dla każdego substratu i produktu poprzez obliczenie krzywej wzorcowej z znanych ilości zderywatyzowanych substancji i odpowiadających im pól powierzchni pików.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Identyfikacja pików olefin i kwasów β-hydroksylowych metodą GC/MS.
		<ol>
			<li>Zidentyfikować piki olefin i kwasów β-hydroksylowych metodą GC/MS. Ustawić profil temperatury. Ustawić temperaturę wstrzykiwania na 250 °C. Utrzymywać temperaturę pieca na poziomie 100 °C przez 5 min, a następnie zwiększać ją w tempie 20 °C min-1. 
			UWAGA: Maksymalna temperatura jest utrzymywana przez 7,5 min.</li>
			<li>Ustawić temperaturę detektora spektrometru mas na 250 °C i skanować w zakresie od 50 do 500 m/z w trybie uderzenia elektronami. 
			UWAGA: Jonizacja uderzeniem elektronów usuwa pojedynczy elektron, co prowadzi do powstania kationu rodnikowego, który zostanie przekazany do analizy masowej. Ze względu na wysoką energię wewnątrzcząsteczkową wiązania kowalencyjne w cząsteczce pękają, tworząc fragmenty o niższym m/z. Fragmenty te tworzą swoisty "odcisk palca" danej substancji.</li>
			<li>Wstrzyknąć 1 µl próbki. Wykryć 1-heptadecen po czasie retencji 11,4 min na podstawie odpowiadającego mu profilu fragmentacji (Rysunek 2).</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Kourist, R., Domìnguez de Marìa, P., Miyamoto, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biocatalytic+strategies+for+the+asymmetric+synthesis+of+profens+-+recent+trends+and+developments%5BTitle%5D)+AND+%22Green+Chem%22%5BJournal%5D)">Biocatalytic strategies for the asymmetric synthesis of profens - recent trends and developments.</a> Green Chem. , 2607-2618 (2011).</li>
<li>Holtmann, D., Fraaije, M. W., Arends, I. W., Opperman, D. J., Hollmann, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+taming+of+oxygen%3A+biocatalytic+oxyfunctionalisations%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Comm%22%5BJournal%5D)">The taming of oxygen: biocatalytic oxyfunctionalisations.</a> Chemical Comm. 50, 13180-13200 (2014).</li>
<li>Churakova, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+photobiocatalytic+oxyfunctionalization+reactions%5BTitle%5D)+AND+%22Ang.+Chem.+In.+Ed%22%5BJournal%5D)">Specific photobiocatalytic oxyfunctionalization reactions.</a> Ang. Chem. In. Ed. 123, 10904-10907 (2011).</li>
<li>Hollmann, F., Arends, I., Buehler, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biocatalytic+Redox+Reactions+for+Organic+Synthesis%3A+Nonconventional+Regeneration+Methods%5BTitle%5D)+AND+%22ChemCatChem%22%5BJournal%5D)">Biocatalytic Redox Reactions for Organic Synthesis: Nonconventional Regeneration Methods.</a> ChemCatChem. 2, 762-782 (2010).</li>
<li>Girhard, M., Kunigk, E., Tihovsky, S., Shumyantseva, V. V., Urlacher, V. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light-driven+biocatalysis+with+cytochrome+P450+peroxygenases%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol.+Appl.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Light-driven biocatalysis with cytochrome P450 peroxygenases.</a> Biotechnol. Appl. Biochem. 60, 111-118 (2013).</li>
<li>Bartsch, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photosynthetic+production+of+enantioselective+biocatalysts%5BTitle%5D)+AND+%22Microb.+Cell.+Fact%22%5BJournal%5D)">Photosynthetic production of enantioselective biocatalysts.</a> Microb. Cell. Fact. 14, 53(2015).</li>
<li>Rude, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Terminal+olefin+%281-alkene%29+biosynthesis+by+a+novel+P450+fatty+acid+decarboxylase+from+Jeotgalicoccus+species%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Terminal olefin (1-alkene) biosynthesis by a novel P450 fatty acid decarboxylase from Jeotgalicoccus species.</a> Appl. Environ. Microbiol. 77, 1718-1727 (2011).</li>
<li>Zachos, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photobiocatalytic+decarboxylation+for+olefin+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Comm%22%5BJournal%5D)">Photobiocatalytic decarboxylation for olefin synthesis.</a> Chem. Comm. 51, 1918-1921 (2015).</li>
<li>Liu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrogen+peroxide-independent+production+of+%CE%B1-alkenes+by+OleTJE+P450+fatty+acid+decarboxylase%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol.+Biofuels%22%5BJournal%5D)">Hydrogen peroxide-independent production of α-alkenes by OleTJE P450 fatty acid decarboxylase.</a> Biotechnol. Biofuels. 7, 28(2014).</li>
<li>Perez, D. I., Grau, M. M., Arends, I. W., Hollmann, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visible+light-driven+and+chloroperoxidase-catalyzed+oxygenation+reactions%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Comm%22%5BJournal%5D)">Visible light-driven and chloroperoxidase-catalyzed oxygenation reactions.</a> Chem. Comm. 40 (44), 6848-6850 (2009).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Napędzana światłem generacja nadtlenku wodoru może być stosowana do szeregu przemian redoks, w tym peroksygenaz3, chloroperoksydaz10 i monooksygenaz P4505. Jest to łatwe i praktyczne podejście. W dłuższej perspektywie wykorzystanie światła widzialnego otwiera perspektywę wykorzystania światła słonecznego do przemian chemicznych, które jest zrównoważoną alternatywą dla reakcji bogatych w energię.
Metodę stosuje się w przypadku oczyszczonego enzymu lub ekstraktu bezkomórkowego. Chociaż to ostatnie wymaga mniejszych kosztów i pracy, należy zauważyć, że małe cząsteczki w surowym ekstrakcie mogą zakłócać konwersję katalizowaną światłem. Praktycznym podejściem jest usunięcie tych małych składników za pomocą mikromembrany (tj. przez odwirowanie w filtrze odśrodkowym lub przez dializę). Stężenie cząsteczki zbierającej światło FMN określa stężenie nadtlenku wodoru. W zależności od powinowactwa oksydoreduktazy, stężenie to ma decydujące znaczenie dla aktywności enzymatycznej. Innym ważnym czynnikiem jest stężenie protektorowego donora elektronów EDTA. Najważniejszym parametrem jest jednak stabilność działania i aktywność enzymu.
Olefinizacja kwasów tłuszczowych jest elegancką reakcją przekształcania biopochodnych kwasów tłuszczowych w olefiny, które należą do głównych surowców dla przemysłu chemicznego. Sterowana światłem biokatalityczna dekarboksylacja może być przeprowadzana w temperaturze pokojowej i przy neutralnym pH, co zapewnia wyraźne korzyści w zakresie zrównoważonego rozwoju.
Nasze wyniki pokazują, że wytwarzanie nadtlenku wodoru in situ jest strategią dostarczania kofaktora bez pogorszenia stabilności enzymu, co prowadzi do wysokiej konwersji. Obecne metody regeneracji kofaktorów wykorzystują produkty rolne lub chemikalia na bazie ropy naftowej. Reakcje napędzane światłem stają się odnawialną alternatywą. Przyszłe badania będą poświęcone metodom zastępowania odczynnika protektorowego EDTA tańszymi cząsteczkami oraz zmniejszaniu ilości cząsteczki zbierającej światło FMN.

Zmiany klimatu oraz przewidywalne wyczerpanie zasobów odnawialnych stanowią poważne zagrożenie dla naszego społeczeństwa. W tym kontekście kataliza enzymatyczna reprezentuje wciąż niew pełni wykorzystany potencjał w zakresie rozwoju zrównoważonej i „bardziej zielonej” chemii.1Oksydoreduktazy mają zdolność katalizowania wprowadzania i modyfikacji grup funkcyjnych w łagodnych warunkach reakcji i należą do najważniejszych biokatalizatorów.2Większość transformacji redoks wymaga dostarczenia zewnętrznych kofaktorów, takich jak NAD(P)H. Metody regeneracji kofaktorów są stosowane w skali przemysłowej. Niemniej jednak nadal wiążą się one z wysokimi kosztami procesowymi, co ogranicza ich zastosowanie głównie do produktów o wysokiej wartości. Co ciekawe, kilka peroksydaz3,4 or monooxygenazy P4505 przyjmują elektrony z nadtlenku wodoru poprzez tzw. bocznic nadtlenkową (peroxide shunt). Podczas gdy H2O2 jest tanim odczynnikiem pomocniczym, jednak według doniesień jest on szkodliwy dla wielu enzymów. Stały in situ tworzenie zastosowanie niskich stężeń nadtlenku wodoru jest skutecznym podejściem pozwalającym na przeprowadzenie reakcji bez upośledzenia stabilności operacyjnej enzymu.
<img alt="Schemat procesu fotochemicznego przedstawiający reakcję enzymu P450 OleT z substratami w układzie laboratoryjnym." src="/files/ftp_upload/53439/53439fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1. Układ eksperymentalny fotobiokatalitycznej dekarboksylacji kwasów tłuszczowych przez OleTJE. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53439/53439fig1large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
Wykorzystanie światła jako źródła energii w procesach chemicznych i biologicznych zyskuje w ostatnich latach coraz większą uwagę6. Generowanie nadtlenku wodoru napędzane światłem stało się prostą i niezawodną metodą dostarczania nadtlenku wodoru do transformacji redoks (Rysunek 1). Fotokatalizator, taki jak flawinowy adeninomononukleotyd (FMN), umożliwia redukcję tlenu cząsteczkowego do nadtlenku wodoru, który jest następnie wykorzystywany jako kofaktor w enzymatycznej reakcji oksyfunkcjonalizacji>. Możliwymi donorami elektronów są kwas etylenodiaminotetraoctowy (EDTA), askorbinian lub niedrogi mrówczan. Metoda ta znajduje ogólne zastosowanie w przypadku enzymów zależnych od H2O2, w tym peroksydaz3,4 i monooxygenaz P4505.
Niedawno zbadaliśmy zastosowanie nowej bakteryjnej dekarboksylazy7 w celu przekształcenia naturalnych tłuszczów w olefiny8. Przedstawia to zrównoważoną drogę syntezy powszechnie stosowanych chemikaliów platformowych z biosurowców. Dekarboksylaza OleTJE z gram-dodatniej bakterii Jeotgalicoccus sp. katalizuje utleniającą dekarboksylację kwasów tłuszczowych, tworząc jako produkty 1-alkeny. OleTJE jest blisko spokrewniona z bakteryjnymi monooxygenazami P450 i do zajścia reakcji wymaga elektronów z nadtlenku wodoru.
Niestety, dodanie H2O2 do roztworu substratu i enzymu skutkowało niską konwersją oraz słabą powtarzalnością wyników, co prawdopodobnie wynikało z szkodliwego wpływu nadtlenku wodoru na stabilność OleTJE. Stworzenie białka fuzyjnego z reduktazą NADPH RhFred umożliwiło przeprowadzenie zależnej od NADPH dekarboksylacji.9 Niemniej jednak, wysoka cena NADPH i obecne ograniczone możliwości jego kosztownej regeneracji skłoniły nas do zbadania tańszych donorów elektronów. Zainspirowani podobieństwem OleTJE do monooksygenaz P450, zastosowaliśmy fotokatalityczną generację H2O2. Z satysfakcją odnotowaliśmy wysoką konwersję (nawet &gt;95%) przy użyciu ekstraktów bezkomórkowych lub roztworów oczyszczonego enzymu.
Na przykładzie dekarboksylacji kwasów tłuszczowych przedstawiamy ogólny protokół napędzanych światłem enzymatycznych przekształceń redoks, w których FMN służy jako fotokatalizator, a nadtlenek wodoru jako kofaktor. Przedstawione metody obejmują produkcję enzymu w rekombinowanych komórkach E. coli, oczyszczanie enzymu, zastosowanie go do syntezy 1-alkenów oraz analizę produktów reakcji.

<table><tbody><tr><td>Chemicals</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ampicillin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>69-52-3</td><td></td></tr><tr><td>Odczynnik Bradford</td><td>Roth</td><td>K015.1</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>90604-29-8</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma Aldrich</td><td>67-68-5</td><td></td></tr><tr><td>Octan etylu</td><td>Fisher Chemical</td><td>141-78-6</td><td></td></tr><tr><td>Kwas etylenodiaminotetraoctowy (EDTA)</td><td>Roth</td><td>8043.1</td><td></td></tr><tr><td>Hydrat soli sodowej 5-monofosforanu ryboflawiny</td><td>Sigma Aldrich</td><td>130-40-5</td><td></td></tr><tr><td>Kwas chlorowodorowy 37%</td><td>Sigma Aldrich</td><td>7647-01-0</td><td></td></tr><tr><td>Nadtlenek wodoru 30%</td><td>Sigma Aldrich</td><td>7722-84-1</td><td></td></tr><tr><td>&delta;-Kwas aminolewulinowy</td><td>Sigma Aldrich</td><td>5451-09-2</td><td></td></tr><tr><td>N-metylo-N-(trimetylosililo)trifluoroacetamid (MSTFA)Sigma</td> <td>Aldrich</td><td>24589-78-4</td><td></td></tr><tr><td>Kwas mirystynowy >99%</td><td>Sigma Aldrich</td><td>208-875-2&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Imidazol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>288-32-4</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek sodu</td><td>Fisher Chemical</td><td>7647-14-5</td><td></td></tr><tr><td>Kwas stearynowy >99%</td><td>Sigma Aldrich</td><td>57-11-4</td><td></td></tr><tr><td>Tetracyklina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>60-54-8&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Tergitol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>MFCD01779855&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Tris(hydroksymetylo)-aminomethan</td><td>Sigma Aldrich</td><td>77-86-1</td><td></td></tr><tr><td>Device</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Inkubator wytrząsarka</td><td>G-25CK</td><td>New Brunswick Scientific</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Ecotron</td><td>Infors HT</td><td></td></tr><tr><td>Wirówka</td><td>400R</td><td>Heraeus</td><td></td></tr><tr><td></td><td>RC 5B Plus</td><td>Sorvall</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Fresco 17</td><td>Thermo Scientific</td><td></td></tr><tr><td>Wirniki wirówkowe</td><td>SS34</td><td>Sorvall</td><td></td></tr><tr><td></td><td>SLA</td><td>Sorvall</td><td></td></tr><tr><td>Clean bench</td><td>Envirco</td><td>Ceag Schirp Reinraum technik</td><td></td></tr><tr><td>Kolumna GC-FID&nbsp;</td><td>CP-Sil 5CB (30 m x 0,25&nbsp; mm x 0,25 &mikro; m)&nbsp;</td><td>Kolumna Agilent Technologies</td><td></td></tr><tr><td>GC-MS</td><td>FactorKolumna kapilarna czterokapilarna (VF-5 ms + 5 m EZ Guard)&nbsp;</td><td>Varian</td><td></td></tr><tr><td>GC-FID</td><td>GC-2010 plus</td><td>Shimadzu</td><td></td></tr><tr><td>GC-MS</td><td>IST-40</td><td>Varian</td><td></td></tr><tr><td>Mieszadło magnetyczne</td><td>RCT klasyczny</td><td></td> pH-metr IKA <td></td></tr><tr><td></td><td>SevenEasy</td><td>Mettler toledo</td><td></td></tr><tr><td>Sonicator</td><td>Branson Sonifier 250</td><td>Branson</td><td></td></tr><tr><td>Fotometr spektralny</td><td>FLUOstar Omega</td><td>BMG Labtech</td><td></td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kolumna chromatografii powinowactwa</td><td>Jego kolumna wirowa Pur Ni-NTA</td><td>Thermo Scientific</td><td></td></tr><tr><td>Centricon</td><td>Vivaspin turbo 15</td><td>VWR International</td><td></td></tr><tr><td>Microtiter Płytki</td><td>96 Well Multiply&reg; Płytki do PCR</td><td>Sarstedt</td><td></td></tr></tbody></table>

dekarboksylacja enzymatyczna sterowana światłem

Light-driven Enzymatic Decarboxylation

Oksydoreduktazy należą do najczęściej stosowanych enzymów przemysłowych. Niemniej jednak potrzebują zewnętrznych elektronów, których dostarczanie jest często kosztowne i trudne. Recykling donorów elektronów NADH lub NADPH wymaga użycia dodatkowych enzymów i substratów protektorowych. Co ciekawe, kilka oksydoreduktaz akceptuje nadtlenek wodoru jako donor elektronów. Chociaż jest niedrogi, odczynnik ten często zmniejsza stabilność enzymów. Rozwiązaniem tego problemu jest generowanie kofaktora in situ. Ciągłe dostarczanie kofaktora o niskim stężeniu napędza reakcję bez pogorszenia stabilności enzymu. W artykule przedstawiono metodę katalizowanego światłem wytwarzania nadtlenku wodoru in situ na przykładzie zależnej od hemu dekarboksylazy kwasów tłuszczowych OleTJE. Dekarboksylaza kwasów tłuszczowych OleTJE została odkryta ze względu na jej unikalną zdolność do wytwarzania długołańcuchowych 1-alkenów z kwasów tłuszczowych, co jest nieznaną dotąd reakcją enzymatyczną. 1-alkeny są szeroko stosowanymi dodatkami do plastyfikatorów i smarów. Wykazano, że OleTJE akceptuje elektrony z nadtlenku wodoru do oksydacyjnej dekarboksylacji. Podczas gdy dodanie nadtlenku wodoru uszkadza enzym i skutkuje niską wydajnością, wytwarzanie kofaktora in situ pozwala obejść ten problem. System fotobiokatalityczny wykazuje wyraźne korzyści w zakresie aktywności enzymu i wydajności, co skutkuje prostym i wydajnym systemem dekarboksylacji kwasów tłuszczowych.

Podczas gdy dodatek nadtlenku wodoru do mieszaniny reakcyjnej skutkował niską lub umiarkowaną konwersją (&lt;10%), generowanie nadtlenku wodoru in situ zwiększyło konwersję do 80%. Analiza GC/MS wykazuje tworzenie się olefin z kwasów tłuszczowych (Rysunek 2).
<img alt="Schemat chromatografii gazowej; profil temperatury, widma mas i struktura węglowodorów." src="/files/ftp_upload/53439/53439fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2. (A) Profil temperatury dla pomiarów GC/MS. (B) Odcisku palca 1-heptadecenu eluującego po 11,4 min. (C) Charakterystyczne wtórne jony fragmentacyjne CnH2n-1 olefin terminalnych przedstawione na przykładzie 1-heptadecenu. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53439/53439fig2large.jpg" target="_blank">Aby wyświetlić większą wersję tej ryciny, kliknij tutaj.</a>
Reakcja fotokatalityczna osiągnęła wysokie stopnie konwersji z zastosowaniem ekstraktów bezkomórkowych E. coli. W przypadku oczyszczonego roztworu enzymu stwierdzono wyraźną korelację między stężeniem enzymu a stopniem konwersji. Zwiększenie stężenia cząsteczki absorbującej światło FMN prowadziło do wyższych konwersji. Jednak zwiększenie stężenia powyżej 10 mM nie przyspieszyło dalej reakcji, co wskazuje na to, że ilość nadtlenku wodoru jest wystarczająca i nie stanowi już czynnika ograniczającego.
Oprócz dekarboksylacji kwasów tłuszczowych, OleTJE katalizuje również hydroksylację w pozycji β. W przypadku konwersji kwasu stearynowego dekarboksylacja przebiega około trzy razy szybciej niż hydroksylacja. W typowym eksperymencie z wykorzystaniem roztworu 0,5 mM kwasu stearynowego i 10 µM FMN, 99% substratu przekształcono w mieszaninę 1-heptadecenu i kwasu 2-hydroksystearynowego w stosunku 3,3:1 (Rysunek 3)8. Badanie spektrum substratowego biokatalizy napędzanej światłem wykazało, że w przypadku kwasów tłuszczowych z dłuższymi łańcuchami acylowymi OleTJE preferencyjnie katalizuje dekarboksylację, podczas gdy względna ilość hydroksykwasów tłuszczowych w mieszaninie produktów wzrastała wraz ze skróceniem długości łańcucha. Kwasy tłuszczowe krótsze od kwasu mirystynowego (C14) nie ulegały dekarboksylacji.
<img alt="Wykres chromatograficzny przedstawiający struktury cząsteczkowe z analizą piku w celu identyfikacji." src="/files/ftp_upload/53439/53439fig3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3. Analiza chromatograficzna gazowa dekarboksylacji kwasu stearynowego (11,15 min) do 1-heptadecenu (8,4 min), α-hydroksykwasu stearynowego (12,04 min) i β-hydroksykwasu stearynowego (12,1 min) katalizowanej przez OleTJE. Przedstawiono zmianę powierzchni pików w próbkach pobranych w ciągu 2 hr. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53439/53439fig3large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
Co zaskakujące, nienasycone kwasy oleinowy (C18:1d9 cis) i linolowy (C18:2d9d12) nie zostały zaakceptowane jako substraty, co wskazuje, że skręcona konfiguracja wiązań podwójnych cis nie może zostać dopasowana w produktywny sposób wiązania w enzymie. Dodatek kwasu oleinowego (10%) zapobiegał również konwersji kwasu stearynowego. Co ciekawe, kwas stearynowy (C18:1d9 trans) był konwertowany przez OleTJE, choć z nieco niższą aktywnością niż kwas stearynowy.

Opisujemy protokół katalizowanego światłem wytwarzania nadtlenku wodoru — kofaktora przemian oksydacyjnych.

Dekarboksylacja enzymatyczna sterowana światłem

Oxidoreductases belong to the most-applied industrial enzymes. Nevertheless, they need external electrons whose supply is often costly and challenging. ...

Ogólnym celem niniejszego eksperymentu jest napędzanie reakcji enzymatycznych za pomocą światła widzialnego. W tym podejściu światło jest wykorzystywane do przekształcania kwasów tłuszczowych w terminalne alkiny w łagodnych warunkach reakcji. Dekarboksylacja wymaga zerwania wiązań CC.Więź ta jest bardzo stabilna, co sprawia, że jest to reakcja niezwykle trudna. Wykorzystanie światła stanowi zrównoważone podejście pozwalające na przeprowadzenie tak trudnej reakcji. Pomysł zastosowania tej metody pojawił się po pierwszej próbie bezpośredniego dodania nadtlenku wodoru do reakcji, co doprowadziło do inaktywacji enzymów.Główną zaletą tej techniki jest zapewnienie stałej ilości nadtlenku wodoru. W pierwszej kolejności wykorzystaliśmy oczyszczone OleT do biocatalizy napędzanej światłem w celu charakterystyzacji enzymu. Następnie przetestowaliśmy również ekstrakt surowy, co byłoby istotne dla rozwoju zastosowań przemysłowych.Po sklonowaniu syntetycznego genu OleT do wektora ekspresyjnego i transformacji plazmidu do E.Coli zgodnie z opisem w protokole tekstowym, zaszczep komórki w dwóch probówkach zawierających trzy mililitry pożywki LB z dodatkiem 100 µg/mL ampicyliny. Inkubuj prekultury w inkubatorze wytrząsowym przez 15 godzin. Przenieś dwa mililitry kultury do 200 mililitrów pożywki LB z ampicyliną w dwóch kolbach o pojemności jednego litra.Inkubuj kolby w inkubatorze z wytrząsaniem w temperaturze 37 °C i przy 180 RPM, aż hodowle osiągną gęstość optyczną przy 600 nm w zakresie od 0,6 do 0,8. Następnie dodaj do hodowli 0,5 mM kwasu delta-aminolewulinowego. Po tym indukuj komórki, dodając do kolb tetracyklinę w stężeniu 0,2 µg/mL.Inkubować kultury przez 15 godzin w temperaturze 20 °C przy 180 RPM. Po indukcji przelać kultury do probówek do wirowania i wirować probówki przy 12000 ×g i w temperaturze 4 °C przez 20 minut. Odrzucić nadsącz.Resuspenduj osady poprzez pipetowanie w 50 mililitrach lodowatego buforu Tris i przenieś zawiesinę do stożkowej probówki wirówkowej. Następnie wiruj przy 4000 ×g i temperaturze 4 stopni Celsjusza przez 15 minut. Odlej supernatant i resuspenduj każdy osad w trzech mililitrach buforu poprzez wielokrotne pipetowanie.Zlizuj komórki poprzez sonikację w trzech cyklach po 30 sekund, zachowując jednominutową przerwę między cyklami. Następnie odwiruj lizat przy 15000 ×g w temperaturze 4°C przez 20 minut, a następnie ostrożnie przenieś pipetą ekstrakt pozbawiony komórek do stożkowych probówek do wirowania. W celu przygotowania ekstraktu surowego do biokatalizy napędzanej światłem, przenieś 3 mL ekstraktu pozbawionego komórek do filtra wirówkowego o progu odcięcia 10 kDa i odwiruj przy 4000 ×g w temperaturze 4°C, aby usunąć małe cząsteczki.Resuspender białko w trzech mililitrach buforu Tris. Aby scharakteryzować aktywność OleT w biocatalizie napędzanej światłem, białko musi zostać oczyszczone. W celu rozpoczęcia oczyszczania białka, nałożyć trzy mililitry ekstraktu bezkomórkowego na wyrównane kolumny spinowe z niklem NTA.Zamknąć kolumny korkami dolnymi i zakrętkami. Następnie delikatnie nimi potrząsać, aż żywica zostanie równomiernie rozłożona. Kontynuować, inkubując kolumny w wytrząsarce nadokiennej.Następnie odwiruj kolumnę. Potem przemyj kolumny, dodając 1 ml buforu do mycia i wirując je z prędkością 700 ×g przez dwie minuty. Powtórz proces płukania jeszcze dwukrotnie.Po przemyciu umieść kolumny w stożkowych probówkach do wirowania i dodaj jeden mililitr buforu elucyjnego do każdej kolumny. Wiruj probówki przy 700 ×g przez dwie minuty i powtórz elucję jeszcze dwukrotnie. Połączone ekstrakty z kolumn przenieś do filtra wirówkowego 10 kDa i wiruj przy 4000 ×g w temperaturze 4 °C, aby oddzielić imidazol użyty do elucji od enzymu.Na koniec należy określić czystość i stężenie białka zgodnie z treścią protokołu. Aby rozpocząć procedurę biotransformacji, najpierw należy dodać 10% surfaktanta, takiego jak tergitol, oraz 28,4 miligrama kwasu stearynowego do wody destylowanej, aby przygotować 10 mililitrów roztworu zapasowego o stężeniu 10 milimolarnym. Roztwór należy podgrzewać w komorze grzewczej w temperaturze 60 stopni celsius until kwas stearynowy zostanie całkowicie rozpuszczony.Użyj tego roztworu do przygotowania mieszaniny reakcyjnej zgodnie z poniższym protokołem. Dodaj FMN, EDTA, bufor oraz kwas stearynowy do dwóch przezroczystych probówek szklanych i mieszaj w kąpieli wodnej w temperaturze 25 °C. Następnie dodaj do probówek 200 µg/mL oczyszczonego enzymu lub ekstraktu surowego.Następnie oświetl je czystą żarówką LED z odległości dwóch centymetrów. Kolejno, w określonych punktach czasowych, pobierz próbki o objętości 200 µL do probówek wypełnionych uprzednio 20 µL 37% kwasu solnego, aby zatrzymać reakcje. Następnie do każdej próbki dodaj 5 µL 10 mM roztworu kwasu mirystynowego jako wzorca wewnętrznego.Aby przeanalizować produkty reakcji, dodać do probówek dwukrotnie 500 µL octanu etylu. Odwrócić probówki, aby wymieszać zawartość, a następnie wirować przez jedną minutę przy 13 000 ×g. Następnie przenieść 400 µL nadkładów do probówek do mikrocentryfugi i całkowicie odparować, delikatnie wydmuchując zawartość sprężonym powietrzem. Dodać do probówek 200 µL MSTFA.Mieszaninę inkubuje się w temperaturze 60 °C przez 30 minut w celu przeprowadzenia derywatyzacji próbek przed analizą. Produkty reakcji analizuje się poprzez wstrzyknięcie 4 µL próbki do chromatografu gazowego wyposażonego w detektor odpalań (FID), stosując profil temperaturowy opisany w protokole tekstowym. Następnie, za pomocą chromatografu gazowego sprzężonego ze spektrometrem mas, wyznacza się stosunek heptadekanu do beta-kwasu hydroksylowego powstałego w każdej z próbek reakcyjnych.Należy zastosować temperaturę pieca oraz ustawienia spektrometru mas opisane w protokole tekstowym. Do chromatografu gazowego należy wstrzyknąć 1 µL każdej próbki i zapisać chromatogram. Na koniec należy monitorować chromatogramy GCMS dla każdej próbki i przeanalizować je zgodnie z protokołem producenta.Masu cząsteczkowe produktów reakcji enzymatycznych określono przy użyciu chromatografu gazowego sprzężonego ze spektrometrem mas. W przypadku kwasów tłuszczowych o dłuższych łańcuchach acylowych enzym OleT preferencyjnie katalizuje ich dekarboksylację do olefin o różnych długościach. Próbki z reakcji biotransformacji analizowano za pomocą chromatografu gazowego wyposażonego w detektor płomieniowo-jonizacyjny.Wykazano, że dekarboksylacja kwasu stearynowego przebiega trzykrotnie szybciej niż reakcja hydroksylacji, przy czym 99% kwasu stearynowego przekształcono w mieszaninę heptadekanu i kwasu 2-hydroksystearynowego w stosunku 3,3:1. Po opanowaniu metody, fotokatalityczna biokataliza może zostać przeprowadzona w ciągu kilku godzin, pod warunkiem prawidłowego wykonania procedury. W katalizie świetlnej wyzwaniem jest powiązanie użytecznych reakcji z absorpcją światła.W naszym przypadku rolę fotouszestawiacza pełni światło wewnątrz cząsteczki FMN, która jest połączona z naszym enzymem za pomocą cząsteczki przenoszącej, którą jest nadtlenek wodoru.

Research

JoVE Journal

Chemistry

Chemia

Aktywność indukowalnejydekarboksylazy lizyny monitoruje się poprzez reakcję substratu L-lizyny oraz produktu, kadaweryny, z kwasem 2,4,6-trinitrobenzenosulfonowym w celu utworzenia adduktów o różnej rozpuszczalności w toluenie.

Analiza służąca do pomiaru aktywności indukowalnejy lizinowej dekarboksylazy Escherichia coli

Opisano metodę oznaczania aktywności kinazy octanowej. Analiza ta wykorzystuje reakcję bezpośrednią do wyznaczania aktywności enzymatycznej i kinetyki kinazy octanowej w kierunku tworzenia octanu z zastosowaniem różnych akceptorów fosforanowych. Ponadto metodę tę można wykorzystać do analizy innych enzymów wykorzystujących acetylofosforan lub acetylo-CoA.

Bezpośrednie wykrywanie aktywności octanowej enzymu kinazy octanowej

Zaprojektowano zrównoważony, samoregulujący się system bakteryjny do remediacji zanieczyszczeń ropą naftową, wykorzystując standardowe, wymienne części DNA (BioBricks). Zmodyfikowany szczep E. coli został wykorzystany do degradacji alkanów poprzez β-oksydację w toksycznych środowiskach wodnych. Odpowiednie enzymy pochodzące od różnych gatunków wykazały aktywność degradującą alkany. Ponadto, poprzez wprowadzenie genów z bakterii tolerujących alkany, osiągnięto zwiększoną tolerancję na n-heksan.

Zestaw narzędzi umożliwiających konwersję węglowodorów w środowiskach wodnych

Opisano dwuetapową procedurę syntezy farmaceutycznie aktywnych pochodnych indolu poprzez funkcjonalizację C-H z anilinami, przy użyciu katalizy foto- i kwasowej Brønsteda.

Synteza przeciwwirusowych pochodnych tetrahydrokarbazolu metodą fotochemicznej i katalizowanej kwasem funkcjonalizacji C-H za pomocą pośrednich nadtlenków (CHIPS)

Tutaj prezentujemy protokół, który może być użyty do mikroskopowego obrazowania i ilościowego określania aktywności dehydrogenaz w komórkach i tkankach oraz jej kinetyki, funkcji i lokalizacji subkomórkowej.

Mapowanie metaboliczne: ilościowa cytochemia enzymatyczna i histochemia w celu określenia aktywności dehydrogenaz w komórkach i tkankach

Chiralne aminoalkohole są wszechstronnymi cząsteczkami do wykorzystania jako rusztowania w syntezie organicznej. Zaczynając od L-lizyny, syntetyzujemy aminoalkohole w enzymatycznej reakcji kaskadowej łączącej diastereoselektywne utlenianie C-H katalizowane przez dioksygenazę, a następnie rozszczepienie ugrupowania kwasu karboksylowego odpowiedniego aminokwasu hydroksylowego przez dekarboksylazę.

Enzymatyczne reakcje kaskadowe do syntezy chiralnych aminoalkoholi z L-lizyny

Tutaj prezentujemy protokół beztlenowego oczyszczania białek, koncentracji białka beztlenowego i późniejszej charakterystyki kinetycznej za pomocą systemu elektrod tlenowych. Metodę zilustrowano przy użyciu enzymu DesB, enzymu dioksygenazy, który jest bardziej stabilny i aktywny, gdy jest oczyszczany i przechowywany w środowisku beztlenowym.

Oczyszczanie białek beztlenowych i analiza kinetyczna za pomocą elektrody tlenowej do badania aktywności i inhibicji dioksygenazy DesB

Ekspresja i oczyszczanie białek zawierających hydrolazę hydrolazy fumaryloacetooctanu jest opisane przykładami (ekspresja w E. coli, FPLC). Oczyszczone białka są używane do krystalizacji i produkcji przeciwciał oraz wykorzystywane do testów enzymatycznych. Przedstawiono wybrane testy fotometryczne w celu wykazania wielofunkcyjności FAHD1 jako dekarboksylazy szczawiooctanu i hydrolazy acylopirogronianowej.

Ekspresja, oczyszczanie, krystalizacja i oznaczanie enzymatyczne białek zawierających hydrolazę hydrolazy fumaryloacetooctanu

Optogenetyczna kontrola metabolizmu mikrobiologicznego oferuje elastyczną dynamiczną kontrolę nad procesami fermentacji. Niniejszy protokół pokazuje, jak skonfigurować fermentację regulowaną niebieskim światłem do produkcji chemicznej i białkowej w różnych skalach objętościowych.

Fermentacja kontrolowana światłem do produkcji mikrobiologicznej, chemicznej i białkowej

Izotermiczna kalorymetria miareczkowa mierzy przepływ ciepła uwalnianego lub pochłanianego w reakcjach chemicznych. Metoda ta może być stosowana do ilościowego określania katalizy enzymatycznej. W tym artykule ogólnie opisano protokół konfiguracji instrumentalnej, prowadzenia eksperymentu i analizy danych, który jest stosowany do charakterystyki enzymatycznej hydrolizy mocznika za pomocą ureazy fasoli jack.

Gorąca kataliza biologiczna: kalorymetria miareczkowa izotermiczna w celu scharakteryzowania reakcji enzymatycznych

Poznaj metodę fotobiokatalizy do przekształcania kwasów tłuszczowych w terminalne alkiny przy użyciu światła widzialnego i enzymu OleT. Technika ta zapewnia stałe dostarczanie nadtlenku wodoru bez inaktywacji enzymu.

Dekarboksylacja enzymatyczna sterowana światłem

Przeglądaj więcej filmów