Dekarboksylacja enzymatyczna sterowana światłem

Ogólnym celem niniejszego eksperymentu jest napędzanie reakcji enzymatycznych za pomocą światła widzialnego. W tym podejściu światło jest wykorzystywane do przekształcania kwasów tłuszczowych w terminalne alkiny w łagodnych warunkach reakcji. Dekarboksylacja wymaga zerwania wiązań CC.

Więź ta jest bardzo stabilna, co sprawia, że jest to reakcja niezwykle trudna. Wykorzystanie światła stanowi zrównoważone podejście pozwalające na przeprowadzenie tak trudnej reakcji. Pomysł zastosowania tej metody pojawił się po pierwszej próbie bezpośredniego dodania nadtlenku wodoru do reakcji, co doprowadziło do inaktywacji enzymów.

Główną zaletą tej techniki jest zapewnienie stałej ilości nadtlenku wodoru. W pierwszej kolejności wykorzystaliśmy oczyszczone OleT do biocatalizy napędzanej światłem w celu charakterystyzacji enzymu. Następnie przetestowaliśmy również ekstrakt surowy, co byłoby istotne dla rozwoju zastosowań przemysłowych.

Po sklonowaniu syntetycznego genu OleT do wektora ekspresyjnego i transformacji plazmidu do E.Coli zgodnie z opisem w protokole tekstowym, zaszczep komórki w dwóch probówkach zawierających trzy mililitry pożywki LB z dodatkiem 100 µg/mL ampicyliny. Inkubuj prekultury w inkubatorze wytrząsowym przez 15 godzin. Przenieś dwa mililitry kultury do 200 mililitrów pożywki LB z ampicyliną w dwóch kolbach o pojemności jednego litra.

Inkubuj kolby w inkubatorze z wytrząsaniem w temperaturze 37 °C i przy 180 RPM, aż hodowle osiągną gęstość optyczną przy 600 nm w zakresie od 0,6 do 0,8. Następnie dodaj do hodowli 0,5 mM kwasu delta-aminolewulinowego. Po tym indukuj komórki, dodając do kolb tetracyklinę w stężeniu 0,2 µg/mL.

Inkubować kultury przez 15 godzin w temperaturze 20 °C przy 180 RPM. Po indukcji przelać kultury do probówek do wirowania i wirować probówki przy 12000 ×g i w temperaturze 4 °C przez 20 minut. Odrzucić nadsącz.

Resuspenduj osady poprzez pipetowanie w 50 mililitrach lodowatego buforu Tris i przenieś zawiesinę do stożkowej probówki wirówkowej. Następnie wiruj przy 4000 ×g i temperaturze 4 stopni Celsjusza przez 15 minut. Odlej supernatant i resuspenduj każdy osad w trzech mililitrach buforu poprzez wielokrotne pipetowanie.

Zlizuj komórki poprzez sonikację w trzech cyklach po 30 sekund, zachowując jednominutową przerwę między cyklami. Następnie odwiruj lizat przy 15000 ×g w temperaturze 4°C przez 20 minut, a następnie ostrożnie przenieś pipetą ekstrakt pozbawiony komórek do stożkowych probówek do wirowania. W celu przygotowania ekstraktu surowego do biokatalizy napędzanej światłem, przenieś 3 mL ekstraktu pozbawionego komórek do filtra wirówkowego o progu odcięcia 10 kDa i odwiruj przy 4000 ×g w temperaturze 4°C, aby usunąć małe cząsteczki.

Resuspender białko w trzech mililitrach buforu Tris. Aby scharakteryzować aktywność OleT w biocatalizie napędzanej światłem, białko musi zostać oczyszczone. W celu rozpoczęcia oczyszczania białka, nałożyć trzy mililitry ekstraktu bezkomórkowego na wyrównane kolumny spinowe z niklem NTA.

Zamknąć kolumny korkami dolnymi i zakrętkami. Następnie delikatnie nimi potrząsać, aż żywica zostanie równomiernie rozłożona. Kontynuować, inkubując kolumny w wytrząsarce nadokiennej.

Następnie odwiruj kolumnę. Potem przemyj kolumny, dodając 1 ml buforu do mycia i wirując je z prędkością 700 ×g przez dwie minuty. Powtórz proces płukania jeszcze dwukrotnie.

Po przemyciu umieść kolumny w stożkowych probówkach do wirowania i dodaj jeden mililitr buforu elucyjnego do każdej kolumny. Wiruj probówki przy 700 ×g przez dwie minuty i powtórz elucję jeszcze dwukrotnie. Połączone ekstrakty z kolumn przenieś do filtra wirówkowego 10 kDa i wiruj przy 4000 ×g w temperaturze 4 °C, aby oddzielić imidazol użyty do elucji od enzymu.

Na koniec należy określić czystość i stężenie białka zgodnie z treścią protokołu. Aby rozpocząć procedurę biotransformacji, najpierw należy dodać 10% surfaktanta, takiego jak tergitol, oraz 28,4 miligrama kwasu stearynowego do wody destylowanej, aby przygotować 10 mililitrów roztworu zapasowego o stężeniu 10 milimolarnym. Roztwór należy podgrzewać w komorze grzewczej w temperaturze 60 stopni celsius until kwas stearynowy zostanie całkowicie rozpuszczony.

Użyj tego roztworu do przygotowania mieszaniny reakcyjnej zgodnie z poniższym protokołem. Dodaj FMN, EDTA, bufor oraz kwas stearynowy do dwóch przezroczystych probówek szklanych i mieszaj w kąpieli wodnej w temperaturze 25 °C. Następnie dodaj do probówek 200 µg/mL oczyszczonego enzymu lub ekstraktu surowego.

Następnie oświetl je czystą żarówką LED z odległości dwóch centymetrów. Kolejno, w określonych punktach czasowych, pobierz próbki o objętości 200 µL do probówek wypełnionych uprzednio 20 µL 37% kwasu solnego, aby zatrzymać reakcje. Następnie do każdej próbki dodaj 5 µL 10 mM roztworu kwasu mirystynowego jako wzorca wewnętrznego.

Aby przeanalizować produkty reakcji, dodać do probówek dwukrotnie 500 µL octanu etylu. Odwrócić probówki, aby wymieszać zawartość, a następnie wirować przez jedną minutę przy 13 000 ×g. Następnie przenieść 400 µL nadkładów do probówek do mikrocentryfugi i całkowicie odparować, delikatnie wydmuchując zawartość sprężonym powietrzem. Dodać do probówek 200 µL MSTFA.

Mieszaninę inkubuje się w temperaturze 60 °C przez 30 minut w celu przeprowadzenia derywatyzacji próbek przed analizą. Produkty reakcji analizuje się poprzez wstrzyknięcie 4 µL próbki do chromatografu gazowego wyposażonego w detektor odpalań (FID), stosując profil temperaturowy opisany w protokole tekstowym. Następnie, za pomocą chromatografu gazowego sprzężonego ze spektrometrem mas, wyznacza się stosunek heptadekanu do beta-kwasu hydroksylowego powstałego w każdej z próbek reakcyjnych.

Należy zastosować temperaturę pieca oraz ustawienia spektrometru mas opisane w protokole tekstowym. Do chromatografu gazowego należy wstrzyknąć 1 µL każdej próbki i zapisać chromatogram. Na koniec należy monitorować chromatogramy GCMS dla każdej próbki i przeanalizować je zgodnie z protokołem producenta.

Masu cząsteczkowe produktów reakcji enzymatycznych określono przy użyciu chromatografu gazowego sprzężonego ze spektrometrem mas. W przypadku kwasów tłuszczowych o dłuższych łańcuchach acylowych enzym OleT preferencyjnie katalizuje ich dekarboksylację do olefin o różnych długościach. Próbki z reakcji biotransformacji analizowano za pomocą chromatografu gazowego wyposażonego w detektor płomieniowo-jonizacyjny.

Wykazano, że dekarboksylacja kwasu stearynowego przebiega trzykrotnie szybciej niż reakcja hydroksylacji, przy czym 99% kwasu stearynowego przekształcono w mieszaninę heptadekanu i kwasu 2-hydroksystearynowego w stosunku 3,3:1. Po opanowaniu metody, fotokatalityczna biokataliza może zostać przeprowadzona w ciągu kilku godzin, pod warunkiem prawidłowego wykonania procedury. W katalizie świetlnej wyzwaniem jest powiązanie użytecznych reakcji z absorpcją światła.

W naszym przypadku rolę fotouszestawiacza pełni światło wewnątrz cząsteczki FMN, która jest połączona z naszym enzymem za pomocą cząsteczki przenoszącej, którą jest nadtlenek wodoru.