Akwizycja elektroencefalograficzna o dużej gęstości w modelu gryzoni przy użyciu tanich zasobów typu open source

Ogólnym celem tej metodologii jest zaprezentowanie niskokosztowego, alternatywnego protokołu konstrukcji i rejestracji sygnałów z przewlekłego, wysokogęstościowego przezczaszkowego układu elektrod. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania z zakresu neuronauk, takie jak wielkoskalowa organizacja sieci neuronalnych oraz przestrzenne i czasowe cechy odpowiedzi wywołanych sensorycznie. Głównymi zaletami tej techniki są niski koszt, powtarzalność oraz łatwość dostosowania do specyfiki konkretnego eksperymentu.

Choć metoda ta może dostarczyć cennych informacji w ramach złożonych analiz danych elektroencefalograficznych, jej zastosowanie jest idealne w badaniach nad anestezjologią, epilepsją i neurobiologią snu. Aby przygotować opaskę na głowę, należy rozpocząć od izolacji pinów w kostce pinów o układzie dwa na pięćdziesiąt, nakładając bardzo cienką warstwę lakieru do paznokci. Następnie, za pomocą pęsety, należy usunąć co ósmą rzędową grupę pinów, wypychając ich końcówce gniazdowe przez kostkę.

Gdy lakier całkowicie wyschnie, należy usunąć powłokę z końcówek pinów za pomocą małej ściereczki i acetonu. Następnie, używając żyletki lub obcinaczy do drutu, należy przyciąć bloki tak, aby uzyskać klocki o wymiarach dwa na siedem pinów. Dwa z tych klocków będą pełnić funkcję elektrod przezczaszkowego EEG.

Następnie, z każdego końca klocka o wymiarach 2x50, przygotuj w ten sam sposób dwa klocki z wypustkami o wymiarach 1x2 do rejestracji sygnału EMG. Każdy klocek 1x2 powinien zachować jedną z zewnętrznych gładkich boków klocka 2x50. Aby ukończyć dwie połowy pełnej macierzy, dopasuj otwory i wypustki klocka 1x2 do tylnego rzędu wypustek klocka o wymiarach 2x7.

Następnie należy użyć dwuskładnikowej żywicy epoksydowej, aby połączyć ich gładkie powierzchnie i w razie potrzeby wzmocnić połączenie dodatkową ilością żywicy. Pozostaw obie połowy do utwardzenia na noc. Aby przygotować dwa przewody EMG do klatki piersiowej, należy użyć 3cm izolowanego srebrnego drutu.

Usuń 1 cm izolacji z jednego końca i wykonaj dwie pętle na odsłoniętym drucie, owijając go wokół pęsety. Następnie usuń 25 mm izolacji z drugiego końca. Teraz w ten sam sposób przygotuj dwa przewody do EMG szyi, zaczynając od drutu o długości 1,5 cm.

Z każdej połowy uchwytu głowy usuń boczny pin w najbardziej przednim rzędzie, ponieważ pin ten nie będzie miał kontaktu z odpowiednimi tkankami. Aby przymocować przewody, utnij piny klocków jeden na dwa w odległości 3mm od ich końców. Następnie przylutuj przewód EMG szyjnego do przedniego pinu oraz przewód EMG piersiowego do tylnego pinu.

Przed przystąpieniem do dalszych działań należy użyć multimetru w trybie sprawdzania ciągłości obwodu, aby upewnić się, że każdy pin jest elektrycznie odizolowany. Należy podłączyć sondy do różnych kombinacji pinów; jeśli para jest sprzężona elektrycznie, miernik wyemituje sygnał dźwiękowy. Po wyschnięciu należy zgiąć przewody EMG tak, aby biegły równolegle do osi AP z minimalnym przesunięciem bocznym.

Następnie pokryć luty lakierem do paznokci. Teraz, przy użyciu obcinaczek do drutu i z pomocą atlasu mózgu, dopasować długość pinów. Znaleźć pin, którego odległość brzuszna od bregmy będzie największa.

Nie przycinaj tego pinu, lecz przytnij wszystkie pozostałe piny względem niego. Aby wykończyć głowice, pokryj wszystkie końcówki pinów roztworem srebra za pomocą pisaka aplikacyjnego. Aby przygotować adapter, należy zacząć od 36-pozycyjnego, dwurzędowego męskiego nano-złącza.

W pierwszej kolejności przytnij żyły przewodów łączących do jednolitej długości 2cm. Następnie zdejmij izolację z 2,5mm końcówki każdego przewodu. Na koniec ocynuj sploty cienkich żył i usuń pozostałą izolację z ocynowanego drutu.

Następnie należy wykonać pasujący do uchwytu konektor męży-męski z listwy pinowej 2x50. Podobnie jak poprzednio, przygotuj dwa moduły 2x7 oraz dwa moduły 2x1. Teraz przylutuj jeden z przewodów uziemienia z nano-konektora do pinu znajdującego się 0,6mm przed (anterior) i 1mm bocznie (lateral) od bregma.

Pin ten pełni funkcję referencyjną, a w przypadku użycia układu wzmacniacza RHD 2132 – funkcję masy. Następnie przylutuj ocynowane przewody nanokonektora po tej samej stronie, co połączenie pinu masy. Ponieważ każdy przewód odpowiada konkretnemu kanałowi, należy zapoznać się ze schematem mapowania kanałów stopnia wejściowego wzmacniacza i przyporządkować odpowiednie kanały.

Po przylutowaniu wszystkich przewodów do odpowiednich pinów, należy odciąć niewykorzystane końcówki drutów. Następnie, używając woltomierza, upewnij się, że każdy pin jest odizolowany elektrycznie od pozostałych. Po potwierdzeniu izolacji elektrycznej nałóż cienką warstwę lakieru do paznokci wokół każdego połączenia lutowniczego, aby dodatkowo odizolować każdy pin.

Następnie, używając dwuskładnikowej żywicy epoksydowej, przymocuj odpowiedni nano-adapter do bocznych macierzy pinów w klockach typu męsko-męski. Na środkowych częściach adapterów nie może znajdować się nadmiar żywicy, ponieważ uniemożliwi to jednoczesne podłączenie głowic. Aby zwiększyć trwałość, pokryj żywicą epoksydową podstawę nano-konektora.

Należy upewnić się, że wszystkie połączenia lutowane zostały pokryte żywicą epoksydową. Po wyschnięciu żywicy należy potwierdzić mapowanie kanałów za pomocą pomiarów impedancji. Po bezpiecznym unieruchomieniu myszy i zdefiniowaniu bregmy jako punktu zerowego stereotaktycznego układu współrzędnych, należy wypoziomować czaszkę w osi bocznej oraz w osi przednio-tylnej.

Następnie, używając wiertła mikro otwornicy o średnicy 0,5mm, wykonaj otwory trepanacyjne w odstępach 1,3mm, w odległości 1mm od linii środkowej, zaczynając 3,3mm przed bregma i kończąc 4,5mm za bregma. Wykonaj dwa rzędy obustronnie. Następnie wywierć otwory trepanacyjne po obu stronach linii środkowej w odstępach 1,3mm, zaczynając 2mm przed bregma i kończąc 4,5mm za bregma.

Następnie należy zaimplantować uchwyty głowowe. Za pomocą pęsety prostej należy przygotować tunele dla przewodów EMG w obrębie klatki piersiowej. Od strony grzbietowej myszy należy wykonać tunel pod skórą na głębokości 2,5cm i umieścić w nim przewody EMG.

Następnie, za pomocą zakrzywionych pęsety ustaw moduł EEG w taki sposób, aby piny pokrywały się z otworami trepanacyjnymi. Wywierając lekki nacisk, wprowadź piny do czaszki, delikatnie nimi poruszając. Po prawidłowym osadzeniu moduł EEG będzie stabilny.

Następnie ustaw druty EMG w ich końcowych pozycjach. Po ich ustaleniu przygotuj mieszaninę metakrylanu metylu z odpowiednim związkiem sieciującym w stosunku jeden do jednego. Następnie pokryj cementem odsłoniętą czaszkę, pomalowane lakierem do paznokci części elektrod szpilkowych oraz proksymalne odcinki przewodów EMG.

Należy uważać, aby nie zakryć gniazd żeńskich uchwytu głowowego i nie dopuścić do dostania się cementu do futra zwierzęcia. Po wyschnięciu cementu procedura montażu jest zakończona. Wyjmij mysz z ramy stereotaksycznej i pozwól jej dojść do siebie, monitorując parametry życiowe.

Dwa tygodnie po operacji w pełni zregenerowana mysz może zostać podłączona do kabla rejestrującego za pomocą adaptera w celu habituacji. Po habituacji myszy mogą być wykorzystane w eksperymentach. Po podłączeniu myszy do karty akwizycji sygnału poprzez adapter, wzmacniacz i standardowy kabel interfejsu, należy uruchomić oprogramowanie rejestrujące Open E-Fizz.

Następnie, tworząc łańcuch sygnałowy, przeciągnij moduły rhythm FPGA oraz LFP viewer do obszaru łańcucha sygnałowego. Następnie uzyskaj wartości impedancji elektrod przy częstotliwości 30.0 kilo-samples per second. Na koniec wybierz żądaną częstotliwość próbkowania dla rejestracji.

Jeśli jest to pożądane, filtry można również przeciągnąć do łańcucha sygnałowego. Następnie należy wybrać ścieżkę zapisu danych oraz pożądaną częstotliwość próbkowania. Następnie kliknij w oknie podglądu LFP i naciśnij przycisk odtwarzania.

Teraz, korzystając z metody rysowania w celu wizualizacji EEG, dostosuj widok, zmieniając amplitudę sygnału, prędkość sweep oraz ustawienia wszystkich używanych filtrów. Po dostosowaniu wszystkich ustawień rozpocznij rejestrację. Dane zostały zebrane od swobodnie poruszającej się myszy z implantowanym gęstym układem elektrod EEG.

Rejestracja EMG klatki piersiowej zawiera wbudowaną aktywność elektryczną pochodzącą z serca. EMG szyjne zawiera informacje o napięciu mięśniowym. Poszczególne przebiegi EEG odpowiadają schematowi mapowania kanałów.

Dzięki temu nagraniu możliwe jest obliczenie tętna myszy poprzez pomiar czasu pomiędzy impulsami QRS w zapisie elektrokardiograficznym. Podobnie można zmierzyć częstotliwość oddechów myszy, obliczając zmienność fazową impulsu QRS podczas rozszerzania się i kurczenia jamy klatki piersiowej przy każdym oddechu. W związku z tym ta konfiguracja umożliwia przeprowadzenie polisomnografii u myszy.

Taki układ umożliwia mapowanie korowe potencjałów wywołanych wzrokowo. Gdy dziesięciomilisiekundowy impuls światła jest dostarczany wyłącznie do lewego oka, klasyczne odpowiedzi są rejestrowane w przeciwległej pierwotnej korze wzrokowej, a następnie następuje opóźniona odpowiedź w przeciwległej wtórnej korze wzrokowej. Jest to wyraźnie widoczne w zmieniających się w czasie potencjałach elektrycznych na całej powierzchni kory w przeciwległych obszarach V1 i V2. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać dobrą wiedzę na temat tego, jak konstruować macierze mikroelektrod o wysokiej gęstości dla modelu gryzoni oraz jak rejestrować sygnały z wszczepionej macierzy.

Po opanowaniu techniki, etapy konstrukcji i implantacji mogą zostać wykonane w ciągu dwóch godzin, o ile zostaną przeprowadzone prawidłowo. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest zapewnienie odpowiedniego kontaktu elektrod znadtwardzeniowych bez przebijania opony twardej. Przycinanie wyprowadzeń oraz uważność podczas implantacji głowic zapewnią najlepsze szanse na uzyskanie właściwego kontaktu elektrod.

Powodzenia!