Obrazowanie w rozdzielczości subnanometrowej z mikroskopią sił atomowych z modulacją amplitudy w cieczy

Ogólnym celem tej procedury jest uzyskanie obrazowania o najwyższej możliwej rozdzielczości w cieczy, z wykorzystaniem komercyjnego AFM pracującego w trybie modulacji amplitudy, znanego również jako tryb tapping mode. Metoda ta pozwala na przesunięcie granicy standardowego działania AFM w cieczy poprzez zastosowanie optymalnej kombinacji parametrów dla wysokiej rozdzielczości. Główną zaletą tej techniki jest to, że można ją stosować w większości komercyjnych urządzeń AFM, dzięki czemu nie wymaga ona specjalistycznego sprzętu.

Metoda przedstawiona w niniejszym materiale jest skierowana do naukowców i techników, którzy posiadają już podstawową wiedzę z zakresu AFM, ale chcieliby w pełni wykorzystać możliwości tej techniki. Metoda ta nie jest ukierunkowana na konkretny rodzaj próbki i może być szeroko stosowana w badaniach z zakresu fizyki, biologii, chemii, materiałoznawstwa oraz nauk stosowanych. Zazwyczaj osoby rozpoczynające pracę z tą techniką mogą napotkać trudności, ponieważ znalezienie optymalnych parametrów dla danej próbki wymaga pewnej dozy cierpliwości.

Poddaj instrumenty oraz dysk podtrzymujący podłoże sonikacji w kąpieli w wodzie ultrapurej. Następnie powtórz czynność z izopropanolem, a potem ponownie z wodą ultrapurej, po 10 minut każdego etapu. W przypadku dążenia do uzyskania wysokiej rozdzielczości, wszelkie zanieczyszczenia mogą mieć niekorzystne skutki.

Przez cały czas należy nosić rękawiczki oraz upewnić się, że wszystkie powierzchnie lub instrumenty mające kontakt z próbką, wspornikiem (cantilever) lub celą AFM zostały dokładnie oczyszczone. Po sonikacji należy wysuszyć każdy z instrumentów oraz dysk z próbką w strumieniu azotu. W celu obrazowania pojedynczych zaabsorbowanych jonów metali, jako podłoże dla miki należy zastosować stalowy dysk.

Powierzchnie, których nie można oczyścić za pomocą sonikacji, należy oczyścić mechanicznie, przecierając je jednowarstwowymi, niepozostawiającymi kłaczków chusteczkami nasączonymi kolejno wodą ultrapure, izopropanolem i ponownie wodą ultrapure. Pozostaw powierzchnię do wyschnięcia na powietrzu przez maksymalnie 30 minut. Następnie przygotuj niewielką ilość kleju epoksydowego, dokładnie mieszając odczynniki, i nanieś około 10 µl kleju epoksydowego na oczyszczony stalowy dysk próbkowy.

Umieść podłoże z miki na żywicy epoksydowej i przymocuj je do stalowego dysku, wywierając nacisk na podłoże. Pozostaw żywicę do utwardzenia przez kilka godzin w podwyższonej temperaturze, zgodnie ze specyfikacją producenta. Następnie mocno dociśnij do podłoża kawałek taśmy klejącej o szerokości 2,5 centymetra, tak aby pokryć całą jego powierzchnię, i gładko oderwij górną warstwę.

Powtórz ten proces od dwóch do trzech razy, aż powierzchnia miki będzie gładka jak lustro w świetle widzialnym. Zanurz chip z belką w kąpieli z izopropanolu, a następnie w wodzie ultra czystej, po 60 minut w każdym z roztworów. Następnie naświetl końcówkę światłem UV przez maksymalnie pięć minut, aby sprzyjać tworzeniu stabilnych miejsc hydratacji.

Dłuższy czas nadmiernej ekspozycji może uszkodzić końcówkę lub zwiększyć jej promień krzywizny. Włóż wspornik do uchwytu wsporników AFM, a następnie nanieś pipetą 25 µL cieczy obrazującej na wspornik i końcówkę, aby wstępnie zwilżyć powierzchnię. Pozwoli to ograniczyć powstawanie pęcherzyków powietrza podczas zbliżania się do próbki.

Przymocuj dysk z próbką i podłoże do stolika próbki i dodaj kroplę cieczy obrazującej do próbki. Następnie podłącz uchwyt wspornika do AFM. Zbliż wspornik i próbkę do siebie w taki sposób, aby utworzył się mostek kapilarny między cieczami na końcówce wspornika a cieczami na próbce.

Użyj oprogramowania AFM, aby ustawić laser pomiarowy blisko końca końcówki dźwigni. Następnie wyznacz częstotliwość rezonansową dźwigni na podstawie głównego piku w jej widmie termicznym. Jeśli ugięcie dźwigni jest skalibrowane, dopasowanie piku rezonansowego do modelu prostego oscylatora harmonicznego pozwala wyznaczyć stałą sprężystości dźwigni.

Następnie należy nastroić wspornik, wyznaczając jego odpowiedź amplitudy podczas wymuszenia zewnętrznego w zakresie częstotliwości zbliżonych do częstotliwości rezonansowej zidentyfikowanej w widmie termicznym. Dostrój amplitudę wymuszenia tak, aby amplituda wolnych oscylacji wynosiła około pięciu nanometrów. W większości urządzeń AFM odpowiada to zazwyczaj wartości od 0,2 do 0,8 V.

Następnie ustaw wartość zadaną amplitudy na około 80% amplitudy swobodnej. Kolejno ustaw stosunkowo wysokie wzmocnienia sprzężenia zwrotnego. Po upewnieniu się, że nie występują niestabilności ani drgania, ustaw początkową prędkość skanowania na około 1 Hz, a zakres skanowania na 10 nm.

Rozpocznij zbliżanie sondy do powierzchni za pomocą oprogramowania sterującego AFM. Oceń, czy sonda dotarła do powierzchni, zanim rozpoczniesz obrazowanie, poprzez niewielką zmianę wartości punktu nastawy (set point). Jeśli sonda znajduje się na powierzchni, wpływ na rozciągnięcie strefy ZPA powinien być pomijalny.

Gdy końcówka dotknie powierzchni, wycofaj strefę ZPA i ponownie dostrój dźwigar. Częstotliwość rezonansowa prawdopodobnie przesunie się w stronę niższych wartości z powodu oddziaływań między końcówką a próbką. Teraz zmień wartość set point na około 80% nowo dostrojonej amplitudy swobodnej i uruchom dźwigar, aby przeprowadzić skanowanie powierzchni o wymiarach 10 na 10 nanometrów kwadratowych w trybie modulacji amplitudy w celu weryfikacji, czy parametry obrazowania są odpowiednie.

Sprawdź, czy profile przejścia i powrotu się pokrywają. Jeśli nie, dodatkowo zmniejsz wartość zadaną i spróbuj zwiększyć wzmocnienia. Jeśli obraz stanie się zaszumiony, zmniejsz wzmocnienia.

Powtórz tę operację dla dużego obszaru próbki o wymiarach od jednego do pięciu mikrometrów kwadratowych, o ile jest to możliwe. W przypadku próbek miękkich lub biologicznych może to doprowadzić do zanieczyszczenia końcówki. Zmniejsz rozmiar skanowania do wartości odpowiedniej do wizualizacji interesujących cech.

Wartość ta może wynosić nawet 20 na 20 nanometrów. Następnie należy zmniejszyć amplitudę wzbudzenia przetwornika na tyle, aby pętla sprzężenia zwrotnego automatycznie wycofała strefę ZPA, odsunąwszy wierzchołek od powierzchni. Gdy przetwornik znajduje się poza powierzchnią, należy dostosować amplitudę wzbudzenia tak, aby amplituda przetwornika wynosiła od jednego do dwóch nanometrów od szczytu do szczytu.

Stopniowo obniżaj wartość zadana w małych krokach, aż strefa ZPA ponownie rozszerzy się w kierunku powierzchni i zostanie odzyskany pierwotny obraz. Utrzymuj amplitudę wartości zadanej w zakresie od 75% do 95% nowej amplitudy swobodnej. Następnie ponownie dostrój wzmocnienia, ponieważ przy niższych amplitudach można zastosować wyższe wzmocnienia bez wprowadzania istotnego szumu.

Zoptymalizuj system, aby znaleźć najlepszą kombinację amplitudy swobodnej, punktu zadania i wzmocnienia w celu uzyskania wysokiej rozdzielczości. Optymalne warunki systemu zależą od próbki, właściwości zwilżania cieczy, a także od używanego wspornika. W przypadku interfejsów solwofilnych należy stosować wsporniki o stałej sprężystości od 0,5 do dwóch newtonów na metr.

Zastosowanie tej techniki pozwoliło na uzyskanie obrazów o rozdzielczości subnanometrycznej dla szerokiego zakresu próbek. Przedstawione tutaj próbki miękkie obejmują dwuwarstwę lipidową, purpurowe błony z halobacterium salinarum, samoorganizującą się monowarstwę dimolekuł amfifilnych oraz kryształy akwaporyny z błony soczewki bydlęcej. W każdym przypadku wyróżniono istotne cechy strukturalne.

Małe amplitudy oscylacji i wysokie wartości punktów nastaw ograniczają siłę wywieraną przez końcówkę na próbkę, co pozwala na obrazowanie w roztworze, bez uszkodzeń, kruchych struktur samoorganizujących się lipidów w dwuwarstwie, białek w natywnych biomembranach oraz cząsteczek amfifilnych. Tą metodą można obrazować również twardsze materiały krystaliczne, takie jak kalcyt, tytanian strontu, węglik krzemu, a także pojedyncze jony metali zaadsorbowane na powierzchni miki, ponieważ w każdym z tych przypadków obrazowana jest efektywnie ciecz międzyfazowa, a nie sam kryształ. Po opanowaniu ta technika niemal za każdym razem, gdy zostanie prawidłowo przeprowadzona, zapewnia rozdzielczość na poziomie molekularnym lub atomowym w cieczy.

Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać, że obrazowaniu podlega ciecz międzyfazowa. Oznacza to konieczność zastosowania łagodnych warunków obrazowania. Zanieczyszczenie końcówki, próbki lub cieczy jest zazwyczaj główną przyczyną nieosiągnięcia wysokiej rozdzielczości.

W razie wątpliwości dobrym rozwiązaniem jest często oczyszczenie wszystkich powierzchni mających kontakt z cieczą oraz ponowne wykorzystanie roztworów obrazujących. Hałas zewnętrzny również pogarsza rozdzielczość. Korzystniej jest ustawić urządzenie na podłodze o niskim poziomie wibracji, z dala od kanałów wentylacyjnych.

Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo mieć dobrą wiedzę na temat tego, jak optymalizować parametry obrazowania w celu uzyskania wysokiej rozdzielczości w AFM. Oczywiście, jak w przypadku każdej nowoczesnej techniki, znalezienie najlepszego sposobu obrazowania próbki może wymagać kilku prób, dlatego kluczowa jest cierpliwość.