Name: Obrazowanie w rozdzielczości subnanometrowej z mikroskopią sił atomowych z modulacją amplitudy w cieczy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-12-20T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 25 s
Description: Poznaj metodę obrazowania w rozdzielczości subnanometrowej za pomocą mikroskopii sił atomowych z modulacją amplitudy w cieczy. Technika ta działa na standardowych komercyjnych mikroskopach AFM i pozwala uzyskać wysoką rozdzielczość bez specjalistycznego sprzętu.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wdzięczne są fundusze od Rady ds. Badań nad Naukami Inżynieryjnymi i Fizycznymi (granty 1452230 i EP/M023915/1), Rady ds. Badań Biotechnologii i Nauk Biologicznych (grant BB/M024830/1) oraz Rady Europejskiej (7PR CIG 631186).

1. Czyszczenie narzędzi i innych powierzchni
UWAGA: Przy dążeniu do uzyskania wysokiej rozdzielczości każda forma zanieczyszczenia może mieć szkodliwe skutki. Należy zatem upewnić się, że wszystkie narzędzia używane do manipulowania próbką, podłożem lub końcówkami AFM są dokładnie oczyszczone. Powyższe dotyczy każdej powierzchni lub instrumentu (np. pęsety), który może wejść w kontakt z próbką, belką dwuwporną lub celą AFM, w tym samego stolika do próbek.
<ol>
	<li>Instrumenty poddać myciu w myjce ultradźwiękowej w wodzie ultrapurej (18.2 MΩ, &lt;5 ppm organics), następnie w izopropanolu (czystość 99.7%), a potem ponownie w wodzie ultrapurej, przez 10 min w każdym etapie. W miarę możliwości izopropanol należy stosować pod dygestorium, aby ograniczyć wdychanie oparów.</li>
	<li>Osuszyć strumieniem azotu.</li>
	<li>Jeśli pełne zanurzenie nie jest możliwe (np. w przypadku uchwytu dźwigara/elektroniki), powierzchnię należy oczyścić mechanicznie, przecierając ją jednowarstwowymi, nie pylącymi chusteczkami (chusteczki do lekkich zabrudzeń) nasączonymi kolejno wodą ultrapurej, izopropanolem i wodą ultrapurej. Pozostawić powierzchnię do wyschnięcia na powietrzu (zazwyczaj od 15 do 30 min).</li>
</ol>
2. Przygotowanie podłoża
UWAGA: Podłoże określa powierzchnię stałą bezpośrednio wspierającą próbki, zazwyczaj będącą w fizycznym kontakcie zarówno ze skanerem AFM, jak i z próbką. Większość urządzeń AFM posiada uchwyt magnetyczny i można w nich stosować dyski stalowe, jednak ten sam protokół jest odpowiedni również dla takich podłoży jak szkiełka przedmiotowe. W tym przypadku zakładamy użycie dysku stalowego, do którego przymocowany jest dysk z miki. Celem tej procedury jest maksymalne ograniczenie zewnętrznych źródeł zanieczyszczeń, które mogą wpłynąć na obrazowanie. Przez cały czas należy nosić rękawiczki.
<ol>
	<li>Próbkę w postaci stalowego dysku poddaj sonicacji w kąpieli w wodzie ultrapurej (18,2 MΩ), następnie w izopropanolu, a na koniec ponownie w wodzie ultrapurej, po 10 min w każdym z tych mediów.</li>
	<li>Osusz dyski w strumieniu azotu.</li>
	<li>Przygotuj niewielką ilość kleju epoksydowego, dokładnie mieszając odczynniki, i nanieś ~10 µl na stalowy dysk.</li>
	<li>Przymocuj podłoże (mika muskowitowa, kryształ SiO2, szkło, itp.) do stalowego dysku, wywierając nacisk na podłoże. Pozostaw klej epoksydowy do utwardzenia przez kilka godzin w podwyższonej temperaturze (zgodnie ze specyfikacją producenta).</li>
	<li>Upewnij się, że wokół krawędzi podłoża żaden klej epoksydowy nie jest bezpośrednio wystawiony na działanie powietrza. Może to nastąpić w przypadku użycia nadmiernej ilości kleju i może stać się źródłem zanieczyszczeń.
	<ol>
		<li>W przypadku podłoża z miki, mocno dociśnij taśmę klejącą o szerokości ~2,5 cm do podłoża tak, aby zakryć całą jego powierzchnię, a następnie gładko ją odklej. Użyj taśmy o słabej sile klejenia i odklejaj mikę, ciągnąc równolegle do powierzchni. Usunięty materiał jest widoczny na taśmie. Powtórz ten proces 2-3 razy, aż mika będzie wyglądać na lustrzanie gładką.</li>
		<li>W przypadku szkła/SiO2, jeśli wymagana jest dalsza chemiczna modyfikacja powierzchni, powtórz procedurę sonicacji w kąpieli z kroków 2.1-2.2. Alternatywnie, użyj urządzenia do naświetlania UV (lampy bakteriobójcze UV-C 18 W) przez 30-60 min (zależnie od mocy), aby przeprowadzić pirolizę wszelkich substancji organicznych, które mogą pozostać na powierzchni. Procedura ta sprawia również, że powierzchnia staje się bardziej hydrofilowa bez znaczącego zwiększenia chropowatości.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Przygotowanie wspornika i końcówki
<ol>
	<li>Zanurz chip z belką w kąpieli z izopropanolu, a następnie w wodzie ultrapurej, po 60 min w każdym z roztworów.</li>
	<li>Jeśli belka/igła wymaga dokładnego czyszczenia (np. po długotrwałym przechowywaniu w pudełku żelowym), przed krokiem 1 należy zastosować 30-minutowe moczenie w acetonie (czystość &gt; 99,5%) (patrz również sekcja dotycząca zanieczyszczeń). Przechowywanie igieł w pudełkach żelowych jest, w naszym doświadczeniu, jednym z głównych źródeł zanieczyszczeń, które mogą pojawić się bardzo szybko59.</li>
	<li>Krótko naświetl igłę światłem UV (&lt;5 min), aby wspomóc tworzenie stabilnych miejsc hydratacji60. Unikaj dłuższego naświetlania, ponieważ może ono uszkodzić igłę lub zwiększyć jej promień krzywizny.</li>
	<li>Wsuń belkę do uchwytu na belkę w AFM i nanieś pipetą ~50 µl roztworu obrazującego (rodzaj roztworu zależy od badanego obiektu, ale w tym przypadku należy użyć 10 mM roztworu chlorku rubidu w wodzie ultrapurej) na belkę i igłę w celu ich wstępnego zwilżenia; ograniczy to powstawanie pęcherzyków powietrza podczas zbliżania się do próbki.</li>
</ol>
4. Konfiguracja celi AFM
<ol>
	<li>Zamocuj dysk z próbką i podłoże na stoliku próbkowym, a następnie dodaj kroplę cieczy obrazującej (ciecz powinna mieć zazwyczaj od 2-3 mm grubości w najwyższym punkcie).</li>
	<li>Podłącz uchwyt wspornika do AFM.</li>
	<li>Zbliż wspornik do próbki tak, aby utworzył się mostek kapilarny między cieczami na wsporniku/igle a próbką.</li>
</ol>
5. Inicjowanie pomiaru i kalibracja wspornika
<ol>
	<li>Ustaw laser pomiarowy (zazwyczaj czerwony) blisko końcówki wspornika. W zależności od modelu AFM należy to zrobić za pomocą sterowania programowego lub poprzez ręczną regulację pozycji lasera. Pozyskaj widmo termiczne wspornika w cieczy (patrz Rycina 1A). Proces ten rejestruje fluktuacje termiczne wspornika za pomocą lasera, aby wyznaczyć częstotliwość głównego rezonansu wspornika (podstawową modę własną). W większości nowoczesnych urządzeń AFM odbywa się to poprzez zautomatyzowane procedury w sterowaniu programowym, jednak szczegóły mogą się różnić w zależności od modelu AFM.</li>
</ol>
<img alt="Wykres częstotliwości względem intensywności oraz wykres odchylenia optycznego przedstawiający dopasowanie widma i widmo termiczne." src="/files/ftp_upload/54924/54924fig1.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1: Strojenie i kalibracja wspornika. A: Widmo szumu termicznego pionowego odchylenia wspornika (czarne) z dopasowaniem prostego oscylatora harmonicznego (SHO) dla podstawowego modu własnego (czerwone). W tym przypadku rezonans w wodzie wynosi 18.7 kHz. Pierwsze trzy częstotliwości rezonansowe, odpowiadające pierwszym trzem zginającym moduom własnym, są zaznaczone niebieskimi strzałkami. B: Kalibracja odwrotnej czułości optycznej dźwigni wspornika. Liniowe ugięcie wspornika dociśniętego do sztywnej (niedeformowalnej) powierzchni jest wykorzystywane do pomiaru współczynnika konwersji (InvOLS) między odchyleniem mierzonym w woltach a odpowiadającą mu wartością w nanometrach. <a href="http://cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/54924/54924fig1large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.</a>
<ol start="2">
	<li>Zarejestruj krzywą ugięcia w funkcji odległości, umieszczając wspornik na sztywnym podłożu (np. mika lub szkło) i skalibruj ugięcie, przyjmując, że nachylenie krzywej w liniowym obszarze ugięcia (jak w Rysunku 1B) wynosi jeden61-63. 
	UWAGA: Proces ten pozwala wyznaczyć współczynnik konwersji między zmierzonym ugięciem na fotodetektorze (w woltach) a rzeczywistym ugięciem wspornika (w nanometrach) — znanym jako Inverse Optical Lever Sensitivity (InvOLS). Kalibracja może uszkodzić wierzchołek, dlatego lepiej przeprowadzić ją po zakończeniu wszystkich pomiarów. Aby uzyskać przybliżoną wartość (zazwyczaj dokładną w &gt;90%) rzeczywistej amplitudy przed kalibracją, można zastosować wartość InvOLS wyznaczoną dla innego wspornika tego samego typu podczas poprzedniego eksperymentu.</li>
	<li>Dopasuj pik rezonansowy w widmie termicznym do modelu prostego oscylatora harmonicznego64-66, aby wyznaczyć stałą sprężystości wspornika. Procedura ta jest zautomatyzowana w większości oprogramowań AFM i zazwyczaj nie wymaga specjalistycznej wiedzy na temat omawianego modelu.</li>
	<li>Nastroj wspornik. Wyznacz odpowiedź amplitudową wspornika przy wymuszaniu zewnętrznym (np. akustycznym lub poprzez wzbudzenie fototermiczne) w zakresie częstotliwości zbliżonych do jego nominalnej częstotliwości rezonansowej. Ustaw częstotliwość wymuszania w pobliżu maksimum w tym widmie, nieco po lewej stronie. W przypadku wymuszania akustycznego podczas strojenia może pojawić się wiele pozornych maksimów.
	<ol>
		<li>Wybierz pik rezonansowy jak najbliższy (i mieszczący się w obwiedni) rezonansu zidentyfikowanego w widmie termicznym, korzystając z oprogramowania sterującego AFM; szczegóły mogą zależeć od typu i wersji oprogramowania sterującego urządzeniem AFM.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
6. Podejście i wstępna kontrola próbki
<ol>
	<li>Ustaw amplitudę wzbudzenia tak, aby amplituda oscylacji swobodnych wynosiła około 5 nm. W przypadku niekalibrowanego InvOLS zazwyczaj odpowiada to wartościom 0,2-0,8 V w większości urządzeń AFM. Ustaw wartość zadaną (setpoint) amplitudy na około 80% amplitudy swobodnej.</li>
	<li>Ustaw wzmocnienia pętli sprzężenia zwrotnego na stosunkowo wysokie wartości (wartość bezwzględna zależy od modelu AFM), upewniając się jednocześnie, że nie występuje niestabilność ani drgania (ringing).</li>
	<li>Ustaw początkową prędkość skanowania oraz obszar skanowania na małe wartości (np. odpowiednio około 1 Hz i 10 nm). Pomaga to chronić końcówkę przed uszkodzeniem w przypadku niewłaściwego ustawienia parametrów sprzężenia zwrotnego poprzez unikanie skanowania na dużych dystansach. Jeśli warunki skanowania okażą się odpowiednie, obszar skanowania można następnie zwiększyć do większej wartości (np. 100 nm).</li>
	<li>Przed przystąpieniem do zbliżania końcówki określ przybliżoną wysokość powierzchni (w niektórych przypadkach należy to zrobić optycznie).</li>
	<li>Rozpocznij zbliżanie końcówki do powierzchni za pomocą oprogramowania sterującego AFM. Szczegóły tego procesu zależą od modelu AFM i używanego oprogramowania.
	<ol>
		<li>W przypadku problemów ze zbliżaniem przy użyciu miękkiego wspornika, przeprowadź zbliżanie w trybie kontaktowym. W takim przypadku upewnij się, że wzmocnienia są niższe niż w trybie AM i ustaw wartość zadaną na stosunkowo niski poziom (0,1-0,2 V po wycentrowaniu lasera na fotodetektorze), aby chronić końcówkę.</li>
		<li>Oceń, czy końcówka dotarła do powierzchni bez rozpoczynania obrazowania, lekko zmieniając wartość zadaną (zwiększając w trybie kontaktowym lub zmniejszając w trybie AM). Jeśli końcówka znajduje się na powierzchni, wpływ na wysunięcie piezoelektryka Z powinien być pomijalny. Ruchy piezoelektryka Z w czasie rzeczywistym są zazwyczaj wyświetlane graficznie w oprogramowaniu sterującym większości urządzeń AFM. Jeśli zmiana wartości zadanej wywołuje widoczny ruch piezoelektryka, oznacza to fałszywe zetknięcie (false engage). W takim przypadku ponownie rozpocznij zbliżanie z aktualnej pozycji końcówki, stosując nieco wyższą (tryb kontaktowy) lub niższą (tryb AM) wartość zadaną.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Gdy końcówka dotrze do powierzchni, wycofaj piezoelektryk Z (zazwyczaj poprzez naciśnięcie przycisku „stop”) i ponownie nastroj wspornik (powtórz krok 5.4.); częstotliwość rezonansowa prawdopodobnie przesunęła się w stronę niższych wartości z powodu oddziaływań końcówka-próbka.</li>
	<li>Zmień wartość zadaną na około 80% nowo nastrojonej amplitudy swobodnej (przy tej odległości końcówki od próbki).</li>
	<li>Zestaw wspornik z powierzchnią i przeprowadź skanowanie obszaru 10×10 nm2 w trybie AM, aby zweryfikować, czy parametry obrazowania są odpowiednie.
	<ol>
		<li>Sprawdź, czy profile przejścia w przód (skanowanie od lewej do prawej) i w tył (skanowanie od prawej do lewej) nakładają się na siebie. Jeśli nie, dodatkowo zmniejsz wartość zadaną i spróbuj zwiększyć wzmocnienie.</li>
		<li>Zmniejsz wzmocnienia, jeśli obraz staje się zaszumiony.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Powtórz operację, wykonując skanowanie większego obszaru próbki — od 1×1 µm2 do 5×5 µm2 — o ile jest to możliwe. W przypadku próbek miękkich lub biologicznych może to doprowadzić do zanieczyszczenia końcówki.</li>
</ol>
7. Obrazowanie o wysokiej rozdzielczości
<ol>
	<li>Zmniejsz rozmiar skanowania do wartości odpowiedniej dla wizualizacji badanych cech (np. 100×100 nm2 dla kryształów białek lub 20×20 nm2 dla miki lub kalcytu).</li>
	<li>Zmniejsz amplitudę wzbudzenia wspornika na tyle, aby pętla sprzężenia zwrotnego automatycznie cofnęła piezoelektryk Z, a tym samym końcówkę od powierzchni. Gdy wspornik znajduje się poza powierzchnią, dostosuj amplitudę wzbudzenia tak, aby amplituda wspornika wynosiła ~1-2 nm (od szczytu do szczytu).</li>
	<li>Za pomocą oprogramowania sterującego AFM stopniowo zmniejszaj wartość setpoint o kilkadziesiąt mV za razem, aż piezoelektryk Z ponownie wysunie się w kierunku powierzchni i zostanie odzyskanym pierwotny obraz. Utrzymuj amplitudę setpoint w zakresie od 75% do 95% nowej amplitudy swobodnej.</li>
	<li>Ponownie dostosuj wzmocnienia (gains) za pomocą oprogramowania sterującego AFM; przy niższych amplitudach można stosować wyższe wzmocnienia bez wprowadzania znaczących szumów.
	<ol>
		<li>Powtórz kroki 7.2-7.4, aby określić najlepszą kombinację amplitudy swobodnej, setpoint i wzmocnienia dla wysokiej rozdzielczości. Optymalne warunki zależą od próbki (krajobrazu solwatacji i właściwości zwilżania cieczy), ale także od wspornika (stałej sprężystości, sztywności).</li>
		<li>Przetestuj różne kombinacje amplitud w celu optymalizacji warunków obrazowania. Może być konieczne ponowne zwiększenie amplitudy swobodnej42. W takim przypadku najpierw dostosuj setpoint do wyższej wartości, a następnie zwiększ wzbudzenie (tzn. procedura odwrotna do tej stosowanej przy zmniejszaniu amplitudy).</li>
		<li>Utrzymuj amplitudę setpoint w zakresie 0,5 nm - 1,5 nm (od szczytu do szczytu), zachowując stosunki setpoint powyżej 0,7 (typowo 0,75-0,95). Dla interfejsów solvofilnych stosuj wsporniki o stałej sprężystości 0,5 - 2 N/m. Jest to wystarczające, aby końcówka usunęła większość cieczy międzyfazowej bez uderzania w powierzchnię. Praktyczna zasada została zaproponowana w równaniu 4 referencji29.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Od czasu swojego wynalezienia, trzy dekady temu, mikroskopia sił atomowych (AFM)1 stała się preferowaną techniką do badania próbek w nanoskali, zwłaszcza tam, gdzie uśrednianie na makroskopowych powierzchniach nie jest możliwe i wymagane są informacje lokalne. W typowym pomiarze AFM ugięcie elastycznego wspornika jest wykorzystywane do ilościowego określenia siły oddziaływania między niewielką liczbą cząsteczek a ultraostrą końcówką zamontowaną na końcu wspornika. W zależności od rodzaju oddziaływań i rozważanych skal czasowych można uzyskać szeroki zakres informacji, w tym właściwości lepkosprężyste miękkich błon biologicznych2,3, siłę pojedynczego wiązania chemicznego lub molekularnego4,5, atomowe szczegóły powierzchni 6-8, magnetyczne9, pojemnościowe10, przewodzące11, termiczne12,13 i chemiczne14 właściwości próbek15. Częścią sukcesu AFM jest jego zdolność do pracy z szeroką gamą materiałów16 i w wielu środowiskach, takich jak próżnia17, gaz11,18 lub ciecz19,20, ponieważ nie opiera się na określonej sile między sondą a próbką.
W praktyce jednak, obsługa AFM w warunkach innych niż otoczenie może być wyzwaniem, a wiele opublikowanych wyników nadal uzyskuje się w powietrzu. Dodatkową trudnością jest fakt, że zwykle konieczne jest działanie AFM w trybie dynamicznym (końcówka wibracyjna), aby zachować zarówno końcówkę, jak i próbkę, unikając dużych sił tarcia. Chociaż jest to bardziej wymagające, dynamiczne działanie może w zasadzie dostarczyć więcej informacji o analizowanej próbce i bez utraty rozdzielczości przestrzennej. W ciągu ostatniej dekady w dziedzinie dynamicznego AFM w cieczach nastąpił ważny rozwój, od pojawienia się AFM 21-23 z szybkością wideo, po pomiary wieloczęstotliwościowe24,25 i subnanometrowe obrazowanie struktur hydratacyjnych na granicy faz26-31. Działanie AFM zanurzone w cieczy jest obecnie rutynowo stosowane w biologii i biofizyce32-36, badaniach polimerów37, elektrochemii38-40 i charakterystyce granicy faz ciało stałe-ciecz41-44. Obecność cieczy wokół wibrującego wspornika znacząco zmienia jego dynamikę45, jak również interakcję między końcówką a próbką29,42. Przy odpowiednim użyciu ciecz może być wykorzystana do zwiększenia rozdzielczościobrazowania 26,29, z typową poprawą prawie prawie o rząd wielkości w porównaniu z najlepszą rozdzielczością osiągniętą w warunkach otoczenia46.
W AFM najwyższa rozdzielczość przestrzenna osiągalna dla danego pomiaru zależy zarówno od jakości samego AFM, jak i od charakteru badanej interakcji20,47,48. W chwili obecnej większość wysokiej klasy, dostępnych na rynku AFM charakteryzuje się poziomem hałasu zbliżonym do limitu termicznego12, więc czynnikiem decydującym o rozdzielczości jest zwykle interakcja końcówka-próbka. W rzeczywistości to gradient przestrzenny tej interakcji determinuje rozdzielczość: pomiary oparte na oddziaływaniach krótkiego zasięgu, szybko zanikających, dają wyniki o wyższej rozdzielczości niż w przypadku oddziaływań o dłuższym zasięgu. W cieczy siły solwatacji mogą poprawić rozdzielczość obrazowania, ponieważ mają tendencję do zanikania tylko na kilku średnicach molekularnych cieczy (zwykle < 1 nm) podczas oddalania się od powierzchni próbki49. Siły te wynikają z interakcji między cząsteczkami cieczy a powierzchnią próbki. Ciecz o silnym powinowactwie do powierzchni będzie miała tendencję do bycia bardziej uporządkowaną i mniej ruchliwą niż ciecz luzem na granicy faz z próbką29,42,50. W rezultacie, wibrująca końcówka AFM będzie potrzebowała więcej energii, aby przemieścić międzyfazowe cząsteczki cieczy niż masowa ciecz42, co sprawi, że pomiar będzie bardzo czuły na lokalne zmiany właściwości cieczy międzyfazowych w nanoskali - krajobrazie solwatacji.
Aby wykorzystać siły solwatacji, należy wziąć pod uwagę kilka praktycznych aspektów. Po pierwsze, amplituda oscylacji końcówki musi być porównywalna z zakresem sił solwatacji, zwykle < 1 nm. Po drugie, użyta ciecz musi tworzyć dobrze zdefiniowany krajobraz solwatacji na powierzchni próbki. W skali makroskopowej jest to równoznaczne z wymogiem "zwilżania" cieczy dla rozważanej próbki. Na przykład w wodzie łatwiej jest osiągnąć rozdzielczość na poziomie molekularnym na mice hydrofilowej niż na hydrofobowym graficie42,51. Na koniec należy odpowiednio dobrać stałą sprężystości wspornika podpierającego końcówkę52,53. Podczas pracy w tych warunkach AFM nie tylko dostarcza obrazy granicy faz na poziomie molekularnym, ale także uzyskuje informacje o lokalnym powinowactwie próbka-ciecz, które można wykorzystać do uzyskania informacji chemicznych o powierzchni próbki54.
Najczęstszymi dynamicznymi trybami pracy dla AFM w cieczy są modulacja amplitudy (AM, również 'tryb stukania') AFM i modulacja częstotliwości (FM) AFM. W pierwszym przypadku55 raster końcówki skanuje próbkę, podczas gdy jej amplituda drgań jest utrzymywana na stałym poziomie przez pętlę sprzężenia zwrotnego, która w sposób ciągły dostosowuje odległość końcówka-próbka. Obraz topograficzny próbki uzyskuje się z poprawki zastosowanej przez pętlę sprzężenia zwrotnego. W FM-AFM28,41,56 jest to częstotliwość oscylacji wspornika/końcówki, która jest utrzymywana na stałym poziomie, podczas gdy końcówka skanuje próbkę. Obie techniki zapewniają porównywalną rozdzielczość topograficzną w cieczy36,57. Kwantyfikacja interakcji końcówka-próbka wydaje się być prostsza i dokładniejsza w FM-AFM, ale AM-AFM jest łatwiejszy do wdrożenia, bardziej wytrzymały i umożliwia pracę z bardziej miękkimi wspornikami, co jest przydatne do badania łatwo odkształcalnych lub delikatnych próbek. Co istotne, AM-AFM jest bardziej rozpowszechniony wśród użytkowników AFM, częściowo ze względów historycznych, ale także ze względu na fakt, że jest technicznie łatwiejszy do kontrolowania.
Chociaż amplituda jest utrzymywana na stałym poziomie przez pętlę sprzężenia zwrotnego podczas obrazowania AM-AFM, opóźnienie fazowe między oscylacją końcówki a oscylacją napędową może się swobodnie zmieniać. Opóźnienie fazowe może dostarczyć użytecznych informacji na temat interakcji końcówka-próbka, związanych z energią rozpraszaną podczas oscylacji końcówki na styku z próbką58. W związku z tym obrazowanie fazowe może być uzyskiwane jednocześnie z obrazowaniem topograficznym i często jest komplementarne w podkreślaniu niejednorodności powierzchni próbki. Obrazowanie fazowe zostało wykorzystane do różnych mapowań interakcji, w tym do bezpośredniego mapowania energii adhezji42, właściwości lepkosprężystych58 i krajobrazu hydratacji granicy faz44.
Praktycznie, uzyskanie obrazów o wysokiej rozdzielczości w płynie pozostaje nietrywialne ze względu na dużą liczbę parametrów do kontrolowania oraz brak prostego, systematycznego protokołu, który działa w każdej sytuacji. Jakość obrazu zazwyczaj zależy między innymi od geometrii i elastyczności wspornika, składu chemicznego końcówki, amplitudy oscylacji i sztywności próbki55. Pomiary AFM są również z definicji perturbacyjne dla systemu. W rezultacie, zmiana zmiennych obrazowania i warunków środowiskowych bez odpowiednich rozważań może prowadzić do trudności w odtwarzalności i/lub błędnych obserwacji i fałszywych wyników.
Tutaj prezentujemy nasz protokół do uzyskiwania obrazów o wysokiej rozdzielczości twardych i miękkich próbek w roztworze, przy użyciu komercyjnych instrumentów działających w modulacji amplitudy. Naszym celem jest zaoferowanie praktycznej procedury optymalizacji głównych parametrów, które mogą mieć wpływ na rozdzielczość dla różnych próbek, wyjaśniając w każdym przypadku uzasadnienie naszych wyborów na podstawie zasad fizycznych leżących u podstaw procesu obrazowania. Szczegółowo opisujemy podejście krok po kroku, od czyszczenia i przygotowania podłoża, po wybór wspornika, regulację parametrów obrazowania i rozwiązywanie typowych problemów. Wyjaśnienie naukowych przesłanek stojących za naszymi wyborami i procedurami dotyczącymi wysokiej rozdzielczości powinno pomóc w dokonywaniu racjonalnych wyborów podczas dostosowywania metodologii i służyć jako punkt wyjścia dla nowych systemów obrazowania.
W całym tym tekście używamy AM w odniesieniu do trybu pracy modulacji amplitudy AFM. Jako wartość zadaną odnosimy się do parametru sprzężenia zwrotnego, który jest utrzymywany na stałym poziomie podczas ugięcia wspornika (tryb kontaktowy) lub amplitudy oscylacji (tryb AM). W trybie AM wspornik jest napędzany zewnętrznie albo przez oscylację akustyczną, albo przez impulsowy laser skupiony u podstawy wspornika. Amplituda napędu to natężenie zewnętrznego sygnału oscylacyjnego. Bezwzględna wartość amplitudy napędu wymaganej do osiągnięcia danej amplitudy oscylacji wspornika zależy od wielu parametrów, takich jak sposób jazdy (akustyczny, fototermiczny lub magnetyczny), mocowanie wspornika i parametry (sztywność, geometria) oraz osiowanie lasera. Dokładna wartość amplitudy napędu nie jest zatem istotna, ale jest dostosowywana w każdym doświadczeniu tak, aby zapewnić odpowiednią (i wymierną) amplitudę oscylacji wspornika. Gdy napędzany wspornik znajduje się daleko od próbki i nie występuje tłumienie jego drgań w wyniku interakcji końcówka-próbka, jego amplituda oscylacji nazywana jest amplitudą swobodną. Gdy wibrująca końcówka zbliża się do powierzchni próbki, jej amplituda zaczyna się zmniejszać. Jeśli sprzężenie zwrotne jest włączone, z-piezo będzie stale dostosowywać swoje wydłużenie tak, aby wyciszyć wybraną amplitudę wartości zadanej, stałą. Wartość zadana jest zwykle zawsze mniejsza niż amplituda swobodna. Powszechne jest odniesienie do współczynnika wartości zadanej, stosunku amplitudy wartości zadanej (amplitudy obrazowania) do amplitudy swobodnej. Im mniejszy współczynnik wartości zadanej, tym trudniejsze są warunki obrazowania.

<table><tbody><tr><td>Multimode IIIA AFM</td><td>Brucker</td><td>NA</td><td>Jedna z używanych maszyn</td></tr><tr><td>Cypher ES AFM</td><td>Asylum Resarch</td><td>NA</td><td>Jedna z maszyn używanych</td></tr><tr>Wspornik<td>/ końcówka AFM</td><td>Nanoworld</td><td>Arrow UHF-AUD</td><td>najlepsza do</td></tr><tr><td>wysokiej częstotliwości Wspornik / końcówka AFM</td><td>Olympus</td><td>RC800-PSA</td><td>wszechstronna i tania</td></tr><tr><td>woda ultraczysta</td><td>Milipore</td><td>NA</td><td>laboratoryjne systemy filtrujące mogą indukować zanieczyszczenie</td></tr><tr><td>Dimetylosulfotlenek</td><td>Sigma-Aaldrich</td><td>200-664-3&nbsp;</td><td>standardowa substancja chemiczna, bez dalszego oczyszczania</td></tr><tr><td>Sole monowartościowe</td><td>Sigma-Aaldrich</td><td></td><td>standardowa substancja chemiczna, bez dalszego oczyszczania</td></tr><tr><td>Lipidy</td><td>Avanti Polar Lipids</td> dwuwarstwy lipidowe <td></td><td>utworzone przy użyciu standardowych protokołów</td></tr><tr><td>Kryształy</td><td>Kryształy polerowane MTI</td><td></td><td>Taśma</td></tr><tr><td>klejąca</td><td>3M</td><td>Taśma Scotch Magic Tape</td><td>Najlepiej sprawdza się taśma półprzezroczysta. Przezroczyste przykleja się zbyt mocno</td></tr></tbody></table>

obrazowanie w rozdzielczości subnanometrowej z mikroskopią sił atomowych z modulacją amplitudy w cieczy

Sub-nanometer Resolution Imaging with Amplitude-modulation Atomic Force Microscopy in Liquid

Mikroskopia sił atomowych (AFM) stała się dobrze znaną techniką obrazowania próbek w nanoskali w powietrzu i cieczy. Ostatnie badania wykazały, że podczas pracy w trybie modulacji amplitudy (stukania) obrazy o rozdzielczości atomowej lub molekularnej można uzyskać na szerokim zakresie miękkich i twardych próbek w cieczy. W takich sytuacjach małe amplitudy oscylacji (SAM-AFM) zwiększają rozdzielczość poprzez wykorzystanie zasolwatowanej cieczy na powierzchni próbki. Chociaż technika ta jest z powodzeniem stosowana w tak różnych dziedzinach, jak materiałoznawstwo, biologia i biofizyka oraz chemia powierzchni, uzyskanie obrazów o wysokiej rozdzielczości w cieczy może nadal stanowić wyzwanie dla początkujących użytkowników. Wynika to częściowo z dużej liczby zmiennych, które należy kontrolować i optymalizować, takich jak wybór wspornika, przygotowanie próbki i prawidłowa manipulacja parametrami obrazowania. W tym miejscu przedstawiamy protokół uzyskiwania obrazów o wysokiej rozdzielczości twardych i miękkich próbek w płynie za pomocą SAM-AFM na komercyjnym instrumencie. Naszym celem jest dostarczenie praktycznego przewodnika krok po kroku, jak uzyskać obrazy o wysokiej rozdzielczości, w tym czyszczenie i przygotowanie aparatury i próbki, wybór wspornika i optymalizację parametrów obrazowania. Na każdym etapie wyjaśniamy naukowe uzasadnienie naszych wyborów, aby ułatwić dostosowanie metodologii do konkretnego systemu każdego użytkownika.

Protokół opisany w poprzedniej sekcji został z sukcesem zastosowany z wykorzystaniem kilku komercyjnych mikroskopów AFM w celu uzyskania obrazów na poziomie molekularnym lub atomowym. Wszystkie obrazy uzyskano przy amplitudach pracy od 0.5 nm do 1.5 nm, dostosowanych indywidualnie zgodnie z krokami procedury 7.1-7.4. Wyniki uzyskano dla szerokiego zakresu próbek miękkich (Rycina 2) i sztywnych (Rycina 3). W każdym przypadku wyróżniono interesujące cechy strukturalne. Jedną z głównych zalet tej techniki jest to, że małe amplitudy oscylacji i wysokie wartości set-point minimalizują siłę wywieraną przez końcówkę na próbkę, co pozwala na obrazowanie w roztworze kruchych samoorganizacji lipidów (Rycina 2A), białek (Rycina 2B oraz D) i cząsteczek amfifilowych (Rycina 2C) bez ich uszkadzania. Twardsze materiały krystaliczne, takie jak minerały (Rycyny 3A, B, D) i pojedyncze jony metali zaadsorbowane na powierzchni (Rycina 3C), mogą być obrazowane tą metodą, ponieważ w każdym przypadku to ciecz międzyfazowa jest efektywnie obrazowana zgodnie z opisanym protokołem. Siły solwatacji są porównywalne dla próbek przedstawionych na Rycynach 2 i 3: wszystkie próbki są hydrofilowe (bardziej ogólnie „solwofilowe” w przypadku Rycyn 2C, 3B, 3D) w stosunku do roztworu obrazującego. Spójnie z tym, we wszystkich przypadkach zastosowano wsporniki o porównywalnej sztywności (0.2 - 0.8 N/m). Zarówno próbka, jak i końcówka powinny być solwofilowe, aby zapewnić utworzenie przez cząsteczki cieczy dobrze zdefiniowanej struktury solwatacji, którą można obrazować. Nie jest to zawsze warunek wystarczający, ale w większości przypadków i dla stosunkowo małych cząsteczek cieczy, ciecz reorganizuje się w sposób naśladujący symetrię próbki. Głównym czynnikiem determinującym wysoką rozdzielczość jest lokalna zmienność powinowactwa zaadsorbowanych cząsteczek rozpuszczalnika do powierzchni (w skali Ångströma, w przypadku Rycyn 2A, 3A, 3C). Technika ta jest zatem najlepiej dostosowana do materiałów, w których struktura rozpuszczalnika znacznie różni się w obrębie powierzchni.
<img alt="Mikroskopia sił atomowych dwuwarstwy lipidowej, purpurowej błony, SAM, akwaporyny; topografia i faza." src="/files/ftp_upload/54924/54924fig2.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2: Miękkie interfejsy obrazowane za pomocą AM-AFM w roztworach wodnych. A: Dwuwarstwa lipidowa dipalmitoylofosfatydylocholiny (DPPC) w fazie żelowej obrazowana w 150 mM KCl. Sześciokątnie upakowane grupy głowowe lipidów są rozróżnialne zarówno w topografii, jak i fazie, wraz z lokalnym kontrastem wskazującym na specyficzne dla danego miejsca zmienności w hydratacji. B: Purpurowe błony Halobacterium salinarum obrazowane w 150 mM KCl, 10 mM Tris, pH 7.4. Wyróżniono kilka trimerów białka bakteriorodopsyny. Faza wykazuje kontrast inny niż topografia ze względu na lokalne miejsca hydratacji na białkach. Można dostrzec poszczególne trimery białkowe (linie przerywane). C: Cząsteczki barwnika amfifilowego (Z907) zaadsorbowane na powierzchni nanocząsteczki TiO2 w ogniwie słonecznym uwrażliwionym barwnikiem. Obraz został pozyskany w etylo-izopropylosulfonie. Wygląd przypominający gąbkę jest tworzony przez zaadsorbowane cząsteczki barwnika. D: Kryształ akwaporyny w rodzimych błonach soczewki bydlęcej obrazowany w tym samym buforze co w B. Wyróżniono tetramer akwaporyny. W topografii widoczna jest substruktura odpowiadająca pętlom międzyhelikalnym, podczas gdy faza wykazuje uderzająco inny kontrast ze względu na nietypowe zachowanie wody w pobliżu białka. Obrazy zostały zaadaptowane z ref36 (B), ref38 (C) oraz ref67 (D). Pasek skali wynosi 5 nm (A), 10 nm (B), 3 nm w (C) oraz 15 nm (D). Skala kolorów wskazuje odpowiednio zmienność wysokości i fazy wynoszącą 200 pm i 15° (A), 600 pm i 4° (B), 2.5 nm i 2.5° (C) oraz 1.6 nm i 9.5° (D). <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/54924/54924fig2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Obrazy topografii i fazy z mikroskopii sił atomowych kalcytu, SrTiO3, miką+RbCl oraz SiC." src="/files/ftp_upload/54924/54924fig3.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3: Reprezentatywne obrazy AM-AFM twardych próbek w roztworach ciekłych. A: Powierzchnia kryształu kalcytu [<img alt="Notacja naukowa, symbol ułamka okresowego; odpowiedni do wzorów matematycznych lub fizycznych." src="/files/ftp_upload/54924/54924equation2.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Equation2">] obrazowana w zrównoważonym roztworze wody ultrapure. B: Obraz tytanianu strontu uzyskany w dimetylosulfotlenku (DMSO). Wysoka rozdzielczość nie była możliwa do uzyskania w wodzie. C: Muskowit obrazowany w 3 mM RbCl — pojedyncze zaadsorbowane jony Rb+ są widoczne w miejscach sieciowych miki zarówno w skanach fazowych, jak i wysokościowych. D: Węglik krzemu obrazowany w DMSO. Oczekiwane układy krystalograficzne przedstawiono na obrazach B i D. Obrazy zostały zaadaptowane z ref 68 (A), ref 42 (B i D) oraz ref 44 (C). Pasek skali wynosi 3 nm (A, B, D) oraz 5 nm (C). Skala kolorów wskazuje odpowiednio zmienność wysokości i fazy wynoszącą 250 pm i 14° (A), 600 pm i 5,5° (B), 800 pm i 15° (C) oraz 500 pm i 3,5° (D). <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/54924/54924fig3large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.</a>

Prezentujemy metodę uzyskiwania obrazów o rozdzielczości subnanometrowej za pomocą mikroskopii sił atomowych z modulacją amplitudy (tryb stukania) w cieczy. Metodę zademonstrowano na komercyjnych mikroskopach sił atomowych. Wyjaśniamy powody naszego wyboru parametrów i sugerujemy strategie optymalizacji rozdzielczości.

Obrazowanie w rozdzielczości subnanometrowej z mikroskopią sił atomowych z modulacją amplitudy w cieczy

Atomic force microscopy (AFM) has become a well-established technique for nanoscale imaging of samples in air and in liquid. Recent studies have shown ...

Ogólnym celem tej procedury jest uzyskanie obrazowania o najwyższej możliwej rozdzielczości w cieczy, z wykorzystaniem komercyjnego AFM pracującego w trybie modulacji amplitudy, znanego również jako tryb tapping mode. Metoda ta pozwala na przesunięcie granicy standardowego działania AFM w cieczy poprzez zastosowanie optymalnej kombinacji parametrów dla wysokiej rozdzielczości. Główną zaletą tej techniki jest to, że można ją stosować w większości komercyjnych urządzeń AFM, dzięki czemu nie wymaga ona specjalistycznego sprzętu.Metoda przedstawiona w niniejszym materiale jest skierowana do naukowców i techników, którzy posiadają już podstawową wiedzę z zakresu AFM, ale chcieliby w pełni wykorzystać możliwości tej techniki. Metoda ta nie jest ukierunkowana na konkretny rodzaj próbki i może być szeroko stosowana w badaniach z zakresu fizyki, biologii, chemii, materiałoznawstwa oraz nauk stosowanych. Zazwyczaj osoby rozpoczynające pracę z tą techniką mogą napotkać trudności, ponieważ znalezienie optymalnych parametrów dla danej próbki wymaga pewnej dozy cierpliwości.Poddaj instrumenty oraz dysk podtrzymujący podłoże sonikacji w kąpieli w wodzie ultrapurej. Następnie powtórz czynność z izopropanolem, a potem ponownie z wodą ultrapurej, po 10 minut każdego etapu. W przypadku dążenia do uzyskania wysokiej rozdzielczości, wszelkie zanieczyszczenia mogą mieć niekorzystne skutki.Przez cały czas należy nosić rękawiczki oraz upewnić się, że wszystkie powierzchnie lub instrumenty mające kontakt z próbką, wspornikiem (cantilever) lub celą AFM zostały dokładnie oczyszczone. Po sonikacji należy wysuszyć każdy z instrumentów oraz dysk z próbką w strumieniu azotu. W celu obrazowania pojedynczych zaabsorbowanych jonów metali, jako podłoże dla miki należy zastosować stalowy dysk.Powierzchnie, których nie można oczyścić za pomocą sonikacji, należy oczyścić mechanicznie, przecierając je jednowarstwowymi, niepozostawiającymi kłaczków chusteczkami nasączonymi kolejno wodą ultrapure, izopropanolem i ponownie wodą ultrapure. Pozostaw powierzchnię do wyschnięcia na powietrzu przez maksymalnie 30 minut. Następnie przygotuj niewielką ilość kleju epoksydowego, dokładnie mieszając odczynniki, i nanieś około 10 µl kleju epoksydowego na oczyszczony stalowy dysk próbkowy.Umieść podłoże z miki na żywicy epoksydowej i przymocuj je do stalowego dysku, wywierając nacisk na podłoże. Pozostaw żywicę do utwardzenia przez kilka godzin w podwyższonej temperaturze, zgodnie ze specyfikacją producenta. Następnie mocno dociśnij do podłoża kawałek taśmy klejącej o szerokości 2,5 centymetra, tak aby pokryć całą jego powierzchnię, i gładko oderwij górną warstwę.Powtórz ten proces od dwóch do trzech razy, aż powierzchnia miki będzie gładka jak lustro w świetle widzialnym. Zanurz chip z belką w kąpieli z izopropanolu, a następnie w wodzie ultra czystej, po 60 minut w każdym z roztworów. Następnie naświetl końcówkę światłem UV przez maksymalnie pięć minut, aby sprzyjać tworzeniu stabilnych miejsc hydratacji.Dłuższy czas nadmiernej ekspozycji może uszkodzić końcówkę lub zwiększyć jej promień krzywizny. Włóż wspornik do uchwytu wsporników AFM, a następnie nanieś pipetą 25 µL cieczy obrazującej na wspornik i końcówkę, aby wstępnie zwilżyć powierzchnię. Pozwoli to ograniczyć powstawanie pęcherzyków powietrza podczas zbliżania się do próbki.Przymocuj dysk z próbką i podłoże do stolika próbki i dodaj kroplę cieczy obrazującej do próbki. Następnie podłącz uchwyt wspornika do AFM. Zbliż wspornik i próbkę do siebie w taki sposób, aby utworzył się mostek kapilarny między cieczami na końcówce wspornika a cieczami na próbce.Użyj oprogramowania AFM, aby ustawić laser pomiarowy blisko końca końcówki dźwigni. Następnie wyznacz częstotliwość rezonansową dźwigni na podstawie głównego piku w jej widmie termicznym. Jeśli ugięcie dźwigni jest skalibrowane, dopasowanie piku rezonansowego do modelu prostego oscylatora harmonicznego pozwala wyznaczyć stałą sprężystości dźwigni.Następnie należy nastroić wspornik, wyznaczając jego odpowiedź amplitudy podczas wymuszenia zewnętrznego w zakresie częstotliwości zbliżonych do częstotliwości rezonansowej zidentyfikowanej w widmie termicznym. Dostrój amplitudę wymuszenia tak, aby amplituda wolnych oscylacji wynosiła około pięciu nanometrów. W większości urządzeń AFM odpowiada to zazwyczaj wartości od 0,2 do 0,8 V.Następnie ustaw wartość zadaną amplitudy na około 80% amplitudy swobodnej. Kolejno ustaw stosunkowo wysokie wzmocnienia sprzężenia zwrotnego. Po upewnieniu się, że nie występują niestabilności ani drgania, ustaw początkową prędkość skanowania na około 1 Hz, a zakres skanowania na 10 nm.Rozpocznij zbliżanie sondy do powierzchni za pomocą oprogramowania sterującego AFM. Oceń, czy sonda dotarła do powierzchni, zanim rozpoczniesz obrazowanie, poprzez niewielką zmianę wartości punktu nastawy (set point). Jeśli sonda znajduje się na powierzchni, wpływ na rozciągnięcie strefy ZPA powinien być pomijalny.Gdy końcówka dotknie powierzchni, wycofaj strefę ZPA i ponownie dostrój dźwigar. Częstotliwość rezonansowa prawdopodobnie przesunie się w stronę niższych wartości z powodu oddziaływań między końcówką a próbką. Teraz zmień wartość set point na około 80% nowo dostrojonej amplitudy swobodnej i uruchom dźwigar, aby przeprowadzić skanowanie powierzchni o wymiarach 10 na 10 nanometrów kwadratowych w trybie modulacji amplitudy w celu weryfikacji, czy parametry obrazowania są odpowiednie.Sprawdź, czy profile przejścia i powrotu się pokrywają. Jeśli nie, dodatkowo zmniejsz wartość zadaną i spróbuj zwiększyć wzmocnienia. Jeśli obraz stanie się zaszumiony, zmniejsz wzmocnienia.Powtórz tę operację dla dużego obszaru próbki o wymiarach od jednego do pięciu mikrometrów kwadratowych, o ile jest to możliwe. W przypadku próbek miękkich lub biologicznych może to doprowadzić do zanieczyszczenia końcówki. Zmniejsz rozmiar skanowania do wartości odpowiedniej do wizualizacji interesujących cech.Wartość ta może wynosić nawet 20 na 20 nanometrów. Następnie należy zmniejszyć amplitudę wzbudzenia przetwornika na tyle, aby pętla sprzężenia zwrotnego automatycznie wycofała strefę ZPA, odsunąwszy wierzchołek od powierzchni. Gdy przetwornik znajduje się poza powierzchnią, należy dostosować amplitudę wzbudzenia tak, aby amplituda przetwornika wynosiła od jednego do dwóch nanometrów od szczytu do szczytu.Stopniowo obniżaj wartość zadana w małych krokach, aż strefa ZPA ponownie rozszerzy się w kierunku powierzchni i zostanie odzyskany pierwotny obraz. Utrzymuj amplitudę wartości zadanej w zakresie od 75% do 95% nowej amplitudy swobodnej. Następnie ponownie dostrój wzmocnienia, ponieważ przy niższych amplitudach można zastosować wyższe wzmocnienia bez wprowadzania istotnego szumu.Zoptymalizuj system, aby znaleźć najlepszą kombinację amplitudy swobodnej, punktu zadania i wzmocnienia w celu uzyskania wysokiej rozdzielczości. Optymalne warunki systemu zależą od próbki, właściwości zwilżania cieczy, a także od używanego wspornika. W przypadku interfejsów solwofilnych należy stosować wsporniki o stałej sprężystości od 0,5 do dwóch newtonów na metr.Zastosowanie tej techniki pozwoliło na uzyskanie obrazów o rozdzielczości subnanometrycznej dla szerokiego zakresu próbek. Przedstawione tutaj próbki miękkie obejmują dwuwarstwę lipidową, purpurowe błony z halobacterium salinarum, samoorganizującą się monowarstwę dimolekuł amfifilnych oraz kryształy akwaporyny z błony soczewki bydlęcej. W każdym przypadku wyróżniono istotne cechy strukturalne.Małe amplitudy oscylacji i wysokie wartości punktów nastaw ograniczają siłę wywieraną przez końcówkę na próbkę, co pozwala na obrazowanie w roztworze, bez uszkodzeń, kruchych struktur samoorganizujących się lipidów w dwuwarstwie, białek w natywnych biomembranach oraz cząsteczek amfifilnych. Tą metodą można obrazować również twardsze materiały krystaliczne, takie jak kalcyt, tytanian strontu, węglik krzemu, a także pojedyncze jony metali zaadsorbowane na powierzchni miki, ponieważ w każdym z tych przypadków obrazowana jest efektywnie ciecz międzyfazowa, a nie sam kryształ. Po opanowaniu ta technika niemal za każdym razem, gdy zostanie prawidłowo przeprowadzona, zapewnia rozdzielczość na poziomie molekularnym lub atomowym w cieczy.Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać, że obrazowaniu podlega ciecz międzyfazowa. Oznacza to konieczność zastosowania łagodnych warunków obrazowania. Zanieczyszczenie końcówki, próbki lub cieczy jest zazwyczaj główną przyczyną nieosiągnięcia wysokiej rozdzielczości.W razie wątpliwości dobrym rozwiązaniem jest często oczyszczenie wszystkich powierzchni mających kontakt z cieczą oraz ponowne wykorzystanie roztworów obrazujących. Hałas zewnętrzny również pogarsza rozdzielczość. Korzystniej jest ustawić urządzenie na podłodze o niskim poziomie wibracji, z dala od kanałów wentylacyjnych.Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo mieć dobrą wiedzę na temat tego, jak optymalizować parametry obrazowania w celu uzyskania wysokiej rozdzielczości w AFM. Oczywiście, jak w przypadku każdej nowoczesnej techniki, znalezienie najlepszego sposobu obrazowania próbki może wymagać kilku prób, dlatego kluczowa jest cierpliwość.

sub-nanometer-resolution-imaging-with-amplitude-modulation-atomic

Research

JoVE Journal

Engineering

Inżynieria

Source: Williams, S. M. et al. Novel Atomic Force Microscopy Based Biopanning for Isolation of Morphology Specific Reagents against TDP-43 Variants in Amyotrophic Lateral Sclerosis. J. Vis. Exp. (2015)This video demonstrates tapping-mode AFM to visualize phage–antigen interactions on a mica surface. It outlines the steps for antigen immobilization, phage binding, and high-resolution nanoscale imaging.

Atomic Force Microscopy to Visualize Phage–Antigen Interactions

Nanoskopia sondy koloidalnej może być używana w różnych dziedzinach, aby uzyskać wgląd w fizyczną stabilność i kinetykę krzepnięcia systemów koloidalnych oraz pomóc w odkrywaniu leków i naukach o recepturach przy użyciu systemów biologicznych. Opisana w nim metoda dostarcza ilościowych i jakościowych środków do badania takich systemów.

Ilościowe i jakościowe badanie oddziaływań cząstka-cząstka za pomocą nanoskopii sondy koloidalnej

Metoda badania struktury fotoreceptora białkowego za pomocą mikroskopii sił atomowych (AFM) jest opisana w tym artykule. PeakForce Quantitative Nanomechanical Property Mapping (PF-QNM) ujawnia nienaruszone dimery białkowe na powierzchni miki.

Mikroskopia sił atomowych fotoreceptorów światła czerwonego przy użyciu ilościowego mapowania właściwości nanomechanicznych PeakForce

Opisujemy protokół przygotowania dwuwarstw lipidowych i jego charakterystyki za pomocą mikroskopii sił atomowych i spektroskopii sił.

Obrazowanie mikroskopii sił atomowych i spektroskopia sił podpartych dwuwarstw lipidowych

Ten protokół opisuje działanie uchwytu na próbki przepływu cieczy do skanowania transmisyjnej mikroskopii elektronowej AuNPs w wodzie, używanej do obserwacji dynamicznych procesów w nanoskali.

Badanie procesów dynamicznych nano-rozmiarów obiektów w cieczy za pomocą skaningowej transmisyjnej mikroskopii elektronowej

Mikroskopia sił atomowych - spektroskopia w podczerwieni (AFM-IR) stanowi potężną platformę do badań nad bakteriami, umożliwiając osiągnięcie rozdzielczości w nanoskali. Zarówno mapowanie zmian subkomórkowych (np. po podziale komórki), jak i badania porównawcze składu chemicznego (np. wynikającego z oporności na leki) mogą być prowadzone na poziomie pojedynczej komórki u bakterii.

Mikroskopia sił atomowych w połączeniu ze spektroskopią w podczerwieni jako narzędzie do badania chemii pojedynczych bakterii

Mikroskopia siły magnetycznej (MFM) wykorzystuje pionowo namagnesowaną sondę mikroskopową sił atomowych do pomiaru topografii próbki i lokalnego natężenia pola magnetycznego z rozdzielczością nanoskali. Optymalizacja rozdzielczości przestrzennej i czułości MFM wymaga zrównoważenia zmniejszającej się wysokości podnoszenia ze zwiększającą się amplitudą napędu (oscylacji) i korzyści płynących z pracy w komorze rękawicowej w atmosferze obojętnej.

Optymalizacja rozdzielczości i czułości mikroskopii sił magnetycznych w celu wizualizacji domen magnetycznych w nanoskali

Wielkoskalowa kontrola próbek z rozdzielczością nanoskali ma szeroki zakres zastosowań, szczególnie dla nanofabrykowanych płytek półprzewodnikowych. Mikroskopy sił atomowych mogą być doskonałym narzędziem do tego celu, ale są ograniczone przez szybkość obrazowania. W tej pracy wykorzystuje się równoległe aktywne układy wspornikowe w AFM, aby umożliwić inspekcje o wysokiej przepustowości i na dużą skalę.

Mikroskopia sił atomowych z sondą aktywną z układami wspornikowymi Quattro-Parallel do wysokowydajnej kontroli próbek na dużą skalę

Tutaj pokazujemy protokół obrazowania do obserwacji oddziaływań biomolekularnych za pomocą fototermicznego odsłuchu off-rezonansowego (PORT), gdzie zoptymalizowaliśmy parametry obrazowania, zidentyfikowaliśmy ograniczenia systemu i zbadaliśmy potencjalne ulepszenia w obrazowaniu montażu motywu DNA gwiazdy trzypunktowej.

Obrazowanie motywu trzypunktowej gwiazdy DNA za pomocą szybkiej mikroskopii sił atomowych Obrazowanie samoorganizacji motywu trójpunktowej gwiazdy za pomocą fototermicznego stukania rezonansowego

Opracowaliśmy niezależną komórkę cieczową, która umożliwia obrazowanie przez ciecze za pomocą transmisyjnego mikroskopu elektronowego. Dynamiczne procesy zachodzące w nanocząstkach w cieczach mogą być ujawniane w czasie rzeczywistym z rozdzielczością subnanometrową.

Odkrywanie dynamicznych procesów materiałów w cieczach za pomocą mikroskopii elektronowej transmisji komórek ciekłych

Poznaj metodę obrazowania w rozdzielczości subnanometrowej za pomocą mikroskopii sił atomowych z modulacją amplitudy w cieczy. Technika ta działa na standardowych komercyjnych mikroskopach AFM i pozwala uzyskać wysoką rozdzielczość bez specjalistycznego sprzętu.

Obrazowanie w rozdzielczości subnanometrowej z mikroskopią sił atomowych z modulacją amplitudy w cieczy

Przeglądaj więcej filmów