Obrazowanie w rozdzielczości subnanometrowej z mikroskopią sił atomowych z modulacją amplitudy w cieczy

Ogólnym celem tej procedury jest osiągnięcie najwyższej możliwej rozdzielczości obrazowania w cieczy, z komercyjną obsługą AFM i modulacją amplitudy, znaną również jako tryb stukania. Ta metoda pomaga przesunąć granicę standardowej operacji AFM w cieczy, wykorzystując najlepszą kombinację parametrów w celu uzyskania wysokiej rozdzielczości. Główną zaletą tej techniki jest to, że może być używana z większością komercyjnych AFM, a zatem nie wymaga żadnego specjalistycznego sprzętu.

Przedstawiona tutaj metoda jest skierowana do naukowców i techników, którzy posiadają już podstawową wiedzę na temat AFM, ale chcieliby wyciągnąć więcej z tej techniki. Metoda ta nie jest ukierunkowana na żaden konkretny typ próbki i może być szeroko stosowana do próbek z fizyki, biologii, chemii, materiałów i nauk o usługach. Ogólnie rzecz biorąc, osoby, które są nowe w tej technice, będą miały trudności, ponieważ wymaga to trochę cierpliwości, aby znaleźć najlepsze parametry dla danej próbki.

Kąpiel sonikuje instrumenty, a dysk podtrzymuje podłoże w ultra czystej wodzie. Następnie izopropanol i ponownie ultra czysta woda, każdy przez 10 minut. Dążąc do wysokiej rozdzielczości, wszelkie zanieczyszczenia mogą mieć szkodliwe konsekwencje.

Przez cały czas noś rękawice i upewnij się, że wszelkie powierzchnie lub instrumenty, które mają kontakt z sample, wspornikiem lub ogniwem AFM, są dokładnie oczyszczone. Po sonikacji wysuszyć każdy z instrumentów i krążek z próbką pod strumieniem azotu. Użyj stalowego dysku jako podpory dla miki, aby zobrazować pojedyncze pochłonięte jony metali.

Fizycznie oczyść powierzchnie, których nie można wyczyścić za pomocą sonikacji, przecierając je jednowarstwowymi chusteczkami o niskiej ilości kłaczków, nasączonymi kolejno ultra czystą wodą, izopropanolem i ultra czystą wodą. Pozostaw powierzchnię do wyschnięcia na powietrzu do 30 minut. Następnie przygotuj niewielką ilość kleju epoksydowego, dokładnie mieszając odczynniki i umieść około 10 mikrolitrów żywicy epoksydowej na czystym stalowym dysku na próbkę.

Umieść podłoże mikowe na żywicy epoksydowej i przymocuj je do stalowego dysku, wywierając nacisk na podłoże. Pozostaw żywicę epoksydową do utwardzenia przez kilka godzin w podwyższonej temperaturze zgodnie ze specyfikacją producenta. Następnie mocno dociśnij do podłoża kawałek taśmy klejącej o szerokości 2,5 centymetra, tak aby pokryć całą twarz, a następnie płynnie odklej wierzchnią warstwę.

Powtórz ten proces dwa do trzech razy, aż mika będzie gładka jak lustro dla oka. Zanurz wiór wspornikowy w kąpieli z izopropanolem, a następnie w ultra czystej wodzie na 60 minut. Następnie wystaw końcówkę na działanie światła UV przez maksymalnie pięć minut, aby sprzyjać tworzeniu stabilnych miejsc nawodnienia.

Dłuższe czasy prześwietlenia mogą uszkodzić końcówkę lub zwiększyć jej promień krzywizny. Włóż wspornik do uchwytu wspornika AFM i odpipetuj 25 mikrolitrów płynu obrazującego na wspornik i końcówkę, aby wstępnie zwilżyć powierzchnię. Zmniejszy to pojawianie się pęcherzyków powietrza podczas zbliżania się do próbki.

Stopić krążek próbki i podłoże na stoliku próbki i dodać do próbki kroplę cieczy do obrazowania. Następnie podłącz uchwyt wspornika do AFM. Zbliżyć wspornik i próbkę do siebie, tak aby utworzyć mostek kapilarny między płynami na końcówce wspornika a płynami na próbce.

Użyj oprogramowania AFM, aby ustawić laser pomiarowy blisko końcówki wspornika. Następnie znajdź częstotliwość przebywania wspornika od głównego piku w jego widmie termicznym. Jeśli ugięcie wspornika jest skalibrowane, dopasowanie szczytu rezydencji do prostego modelu oscylatora harmonicznego daje stałą sprężystości wspornika.

Następnie dostrój wspornik, znajdując jego odpowiedź amplitudową, gdy jest sterowany zewnętrznie w zakresie częstotliwości zbliżonym do częstotliwości rezonansowej zidentyfikowanej w widmie termicznym. Dostosuj amplitudę jazdy tak, aby amplituda drgań swobodnych wynosiła około pięciu nanometrów. Zwykle odpowiada to 0,2-0,8 V w większości AFM.

Następnie ustaw nastawę amplitudy na około 80% swobodnej amplitudy. Następnie ustaw zyski z informacji zwrotnych stosunkowo wysoko. Po upewnieniu się, że nie wystąpi żadna niestabilność ani dzwonienie, ustaw początkową szybkość skanowania na około jeden herc, a rozmiar skanowania na 10 nanometrów.

Zainicjuj zbliżanie się końcówki do powierzchni za pomocą oprogramowania sterującego AFM. Oceń, czy końcówka dotarła do powierzchni bez rozpoczynania obrazowania, nieznacznie zmieniając wartość zadaną. Jeśli końcówka znajduje się na powierzchni, wpływ na rozszerzenie strefy ZPA powinien być znikomy.

Gdy końcówka dotrze do powierzchni, wsuń strefę ZPA i ponownie nastroić wspornik. Częstotliwość rezonansowa prawdopodobnie przesunęła się do niższej wartości z powodu interakcji próbki końcówki. Teraz zmień nastawę na około 80% nowo dostrojonej amplitudy swobodnej i włącz wspornik, aby przeprowadzić skanowanie powierzchni w formacie 10 na 10 nanometrów kwadratowych w trybie modulacji amplitudy, aby sprawdzić, czy parametry obrazowania są odpowiednie.

Sprawdź, czy profile śledzenia i ponownego śledzenia nakładają się na siebie. Jeśli nie, jeszcze bardziej zmniejsz wartość zadaną i spróbuj zwiększyć wzmocnienia. Jeśli obraz stanie się zaszumiony, zmniejsz wzmocnienie.

Powtórzyć operację z dużym obszarem próbki o powierzchni od jednego do pięciu mikrometrów kwadratowych, o ile jest to możliwe. W przypadku próbek miękkich lub biologicznych może to spowodować zanieczyszczenie końcówki. Zmniejsz rozmiar skanowania do wartości odpowiedniej do wizualizacji interesujących obiektów.

Może to być nawet 20 na 20 nanometrów. Następnie zmniejsz amplitudę napędu wspornika na tyle, aby pętla sprzężenia zwrotnego automatycznie cofnęła strefę ZPA, uwydatnij końcówkę od powierzchni. Gdy wspornik znajduje się z dala od powierzchni, dostosuj amplitudę napędu tak, aby amplituda wspornika wynosiła od jednego do dwóch nanometrów od szczytu do szczytu.

Stopniowo zmniejszaj wartość zadaną małymi krokami, aż strefa ZPA ponownie rozszerzy się w kierunku powierzchni i zostanie odzyskany oryginalny obraz. Utrzymuj nastawę amplitudy między 75% a 95% nowej wolnej amplitudy. Następnie ponownie wyreguluj wzmocnienia, ponieważ wyższe wzmocnienia mogą być używane przy niższych amplitudach bez wprowadzania znacznego szumu.

Zoptymalizuj system, aby znaleźć najlepszą kombinację swobodnej amplitudy, wartości zadanej i wzmocnienia w celu uzyskania wysokiej rozdzielczości. Optymalne warunki systemu zależą od próbki, właściwości zwilżających cieczy, a także od zastosowanego wspornika. W przypadku interfejsów solvofilnych należy stosować wsporniki o stałej sprężystości od 0,5 do dwóch niutonów na metr.

Korzystając z tej techniki, uzyskano obrazy o rozdzielczości subnanometrowej dla szerokiego zakresu próbek. Pokazane tutaj miękkie próbki obejmują dwuwarstwę lipidową, fioletowe błony z halobacterium salinarum, samoorganizującą się monowarstwę amfofilowych dimolekuł i kryształy akwaporyny z błony soczewki bydlęcej. W każdym przypadku wyróżnione są interesujące cechy.

Małe amplitudy oscylacji i wysokie wartości zadane minimalizują siłę wywieraną przez końcówkę na próbkę, umożliwiając obrazowanie delikatnych samoorganizacji lipidów w dwuwarstwie, białek w natywnych błonach biologicznych i cząsteczek amfofilowych w roztworze bez uszkodzeń. Twardsze materiały krystaliczne, takie jak kalcyt, tytanit strontu, węglik krzemu i pojedyncze jony metali zaabsorbowane na powierzchni miki, można obrazować przy użyciu tego podejścia, ponieważ w każdym przypadku to ciecz międzyfazowa jest skutecznie obrazowana, a nie sam kryształ. Po opanowaniu technika ta zapewnia rozdzielczość na poziomie molekularnym lub atomowym w cieczy prawie za każdym razem, gdy jest wykonywana prawidłowo.

Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać, że obrazowana jest ciecz międzyfazowa. Oznacza to stosowanie miękkich warunków obrazowania. Zanieczyszczenie końcówki, próbki lub cieczy jest zwykle główną przyczyną nieosiągnięcia wysokiej rozdzielczości.

W razie jakichkolwiek wątpliwości często dobrym pomysłem jest oczyszczenie wszystkich powierzchni mających kontakt z cieczą i ponowne użycie roztworów do obrazowania. Hałas zewnętrzny jest również szkodliwy dla wysokiej rozdzielczości. Podłoga o niskim poziomie wibracji, z dala od kanału wentylacyjnego, jest lepsza.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak zoptymalizować parametry obrazowania, aby uzyskać AFM o wysokiej rozdzielczości. Oczywiście, jak w przypadku każdej najnowocześniejszej techniki, może to wymagać kilku prób, aby dowiedzieć się, jak najlepiej zobrazować próbkę, więc cierpliwość jest kluczowa.