Funkcjonalizacja wsporników mikroskopu sił atomowych z pojedynczymi limfocytami T lub pojedynczą cząstką do immunologicznej spektroskopii sił pojedynczych komórek

Protokół ten opisuje, w jaki sposób najlepiej funkcjonalizować wsporniki AFM przy użyciu pojedynczych limfocytów T i cząstek stałych. Końcówki te mogą być następnie wykorzystane odpowiednio do sondowania interakcji pojedynczej pary komórek dendrytycznych z komórkami T oraz do monitorowania odpowiedzi komórkowych o zmiennych rozmiarach. Główną zaletą tej techniki jest to, że wykorzystuje ona biokompatybilny klej do funkcjonalizacji pojedynczych limfocytów T w wspornikach.

Klej ten jest obojętny dla komórek eukariotycznych, utrzymując w ten sposób limfocyty T w ich podstawowym etapie aktywacji. Metody te zapewniają wgląd w aktywację komórek odpornościowych i złożone zdarzenia międzykomórkowe, takie jak tworzenie synaps immunologicznych. Metody te można również rozszerzyć na inne systemy obejmujące interakcje komórka-komórka lub komórka-powierzchnia.

Dla kogoś, kto jest nowy w tej technice, ważne jest, aby upewnić się, że limfocyty T są w dobrym stanie przed użyciem i że są wstępnie leczone IL-2 przez noc. Dodatkowo, używając biokompatybilnego kleju, poruszaj się szybko, aby zabezpieczyć go przed niepotrzebnym utlenianiem. Aby rozpocząć tę procedurę, należy przygotować pojedyncze limfocyty T do mikroskopii, postępując zgodnie z protokołem tekstowym.

Następnie przygotuj szklane szkiełka nakrywkowe wysiane komórkami DC2.4 i inkubuj komórki przez noc w wilgotnej komorze w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% CO2. Wyczyść miękkie, bezkońcówkowe wsporniki o niskiej stałej sprężystości za pomocą obróbki piranii, czyszczenia plazmowego lub czyszczenia ozonem UV. Następnie zamontuj oczyszczony wspornik na głowicy skanującej AFM.

Następnie przygotuj czystą komorę na próbkę i napełnij ją czystą wodą. Skalibruj wspornik w roztworze wodnym, najpierw przesuwając krzywą siły na szklanym podłożu, aby uzyskać czułość wspornika. Następnie zarejestruj widmo szumu termicznego, aby wyodrębnić stałą sprężystości.

Gdy wspornik jest prawidłowo skalibrowany, wyjmij głowicę skanującą AFM z roztworu. Umyj zamontowany wspornik kilkoma kroplami czystego etanolu i utrzymuj wspornik w suchym miejscu na głowicy skanującej. Podgrzej obudowę żywej komórki do 37 stopni Celsjusza za pomocą 5% CO2.

Następnie zamontuj szklane szkiełko nakrywkowe wysiane komórkami DC2.4 do zespołu komory na próbkę i natychmiast dodaj 600 mikrolitrów pożywki B do komory. Umieść gotowy zespół na stoliku AFM sample. Dodać ludzkie limfocyty T CD4-dodatnie inkubowane przez IL-2 do komory próbki.

Poczekaj, aż docelowe limfocyty T całkowicie osiądą na spodzie szkiełka nakrywkowego, a następnie umieść komórki w polu widzenia pod mikroskopem. Teraz dodaj dwumikrolitrową kroplę biokompatybilnego kleju na koniec zamontowanego wspornika za pomocą pipety. Po nałożeniu biokompatybilnego kleju na wspornik, kolejne kroki muszą zostać zakończone tak szybko, jak to możliwe, aby zmaksymalizować przyczepność.

Szybko umieść głowicę skanującą na stoliku na próbkę, zanurzając pokryty klejem wspornik w roztworze. Przesuwaj stolik próbki, aż komórka T zdrowia znajdzie się pod końcówką wspornika. Następnie dokładnie dostosuj jego położenie, przesuwając głowicę skanującą.

Następnie ręcznie opuść wspornik. Zacznij od kroku o wielkości 50 mikronów, a następnie stopniowo zmniejszaj do 10, pięciu i dwóch, a na końcu 0,5 mikrona, zgodnie z ostrością obrazu wspornikowego. Teraz przytrzymaj pozycję silników krokowych i dostosuj położenie głowicy skanującej, aby lepiej wyrównać końcówkę wspornika i ogniwo.

Kontynuuj, aż mocny kontakt zostanie wskazany przez niewielkie przemieszczenie położenia lasera, odpowiadające typowej sile od 0,5 do 1,5 nanoniutonów. Po 30 sekundach kontaktu wsuń wspornik. Jeśli ogniwo porusza się wraz z wspornikiem, mocowanie powiodło się.

Jeśli nie, powtórz krok klejenia do trzech razy przed przełączeniem na nowy wspornik. Umieść dołączoną komórkę T nad komórką DC2.4, przesuwając stolik na próbkę i głowicę skanującą. Po ustawieniu odpowiednich parametrów należy przeprowadzić spektroskopię sił na próbce.

Aby przeprowadzić nową rundę sondowania, zamontuj nowy, czysty wspornik. Skalibruj go w czystej wodzie, a następnie wróć do pary limfocytów T-komórki dendrytyczne i powtórz skanowanie. Zamontować oczyszczone szklane szkiełko nakrywkowe do zespołu komory na próbki.

Po lewej stronie szkiełka nakrywkowego dodaj kroplę roztworu kulki, który został rozcieńczony w etanolu i zawiera kulki polistyrenowe o średnicy sześciu mikronów. Gdy rozpuszczalnik odparuje, sprawdź odstępy między kulkami za pomocą mikroskopu jasnego pola wyposażonego w obiektyw 20x. Upewnij się, że poszczególne koraliki są dobrze oddzielone.

Następnie zanurz końcówkę mikropipety lub wykałaczkę w dobrze wymieszanym kleju epoksydowym i przenieś niewielką ilość kleju do trzech oddzielnych miejsc, kolejno delikatnymi dotknięciami po prawej stronie, ale blisko środka szkiełka nakrywkowego, jak pokazano tutaj. Następnie zamontuj oczyszczony, bezkońcówkowy wspornik do głowicy skanującej AFM i skalibruj go w powietrzu z czystą powierzchnią, aby uzyskać stałą sprężystości. Następnie umieść końcówkę wspornika nad lewą granicą ostatniego miejsca kleju epoksydowego i powoli zbliż wspornik do kleju, używając małych kroków na silnikach krokowych.

Po nawiązaniu kontaktu z klejem szybko pociągnij wspornik na boki, przesuwając głowicę skanującą AFM do tyłu. Usuń nadmiar kleju, wcierając go o szkło, pozostawiając tylko niewielką ilość kleju na samym końcu końcówki. Teraz przesuń końcówkę wspornika na dobrze odizolowany koralik.

Powoli zbliżaj się do pojedynczego koralika i mocno się z nim stykaj w zakresie od dwóch do pięciu nanoniutonów przez około 10 sekund. Podczas nawiązywania kontaktu użyj precyzyjnej regulacji końcówki, aby ustawić koralik na samym końcu końcówki. Cofnij końcówkę na końcu styku.

Jeśli ścieg zniknie z pierwotnej płaszczyzny ogniskowej, oznacza to, że nastąpiło pomyślne zdarzenie adhezji. Na koniec ostrożnie zdemontuj wspornik zmodyfikowany stopkami i przechowuj go na noc w pudełku wspornikowym, aby żywica epoksydowa w pełni się utwardziła. Oto typowe krzywe siła-odległość od interakcji wiążącej między pojedynczą komórką T a pojedynczą komórką dendrytyczną w trakcie jednego cyklu zbliżania-wycofywania.

Jasnoczerwona krzywa to krzywa wydłużenia, a ciemnoczerwona to krzywa wycofania. Minimalna wartość krzywej jest miarą maksymalnej siły adhezji między komórką T a komórką dendrytyczną, a obszar pod krzywą reprezentuje pracę wymaganą do ich rozdzielenia. Ostre i stopniowe pęknięcia można interpretować jako zerwanie więzów błonowych z powierzchni komórki z powodu silnego wiązania na granicy komórki, a następnie dyskretne zerwanie pod wpływem ciągłego ciągnięcia.

Tutaj konwencjonalne wiązanie limfocytów T z komórkami dendrytycznymi jest pokazane na szaro, a wiązanie regulatorowych limfocytów T z komórkami dendrytycznymi jest pokazane na niebiesko. Siły adhezyjne między konwencjonalnym limfocytem T a regulatorowym limfocytem T rozpoznają antygeny peptydowe prezentowane przez komórki prezentujące antygen, podczas gdy limfocyty T regulatorowe to limfocyty T supresorowe, które wyłączają konwencjonalną odporność za pośrednictwem limfocytów T pod koniec reakcji immunologicznej. Ten schemat znakowanej fluorescencyjnie, fagocytarnej komórki RAW264.7 pokazuje, że do komórki zbliża się pojedynczy nagi kulka polistyrenowy o średnicy sześciu mikronów.

Po zaczepieniu się o kulkę, błona PIP2 jest sortowana w miejscu kontaktu, w pobliżu b, co następnie indukuje rekrutację mezyny przez błonę, powodując zdarzenie fagocytarne. Oprócz opisanej tutaj procedury, spektroskopia sił pojedynczych komórek oparta na AFM może być stosowana wraz z obrazowaniem fluorescencyjnym do badania aktywacji komórek odpornościowych w czasie rzeczywistym na poziomie pojedynczej komórki. Połączone techniki fluorescencji pozwalają na zajęcie się bardziej złożonymi procesami komórkowymi w czasie rzeczywistym, takimi jak tworzenie synapsy immunologicznej między komórką dendrytyczną a parą limfocytów T.