Badanie procesów dynamicznych nano-rozmiarów obiektów w cieczy za pomocą skaningowej transmisyjnej mikroskopii elektronowej

Ogólnym celem skaningowej transmisyjnej mikroskopii elektronowej w fazie ciekłej jest obserwacja struktur i zjawisk zachodzących w nanomateriałach w próbkach biologicznych całkowicie osadzonych w warstwie cieczy o grubości do kilku mikrometrów. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie materiałoznawstwa, takie jak zachowanie nanomateriałów w cieczy i badanie próbek biologicznych w naturalnym środowisku ciekłym. Główną zaletą tej techniki jest to, że dostarcza ona informacji morfologicznych w nanoskali o próbkach w cieczy.

Ogólnie rzecz biorąc, osoby, które są nowe w tej metodzie, będą miały trudności, ponieważ ładowanie uchwytu próbki i akwizycja obrazu nie są tak proste, jak po raz pierwszy wykonane za pomocą mikroskopii elektronowej. Aby rozpocząć procedurę, w czystym okapie z przepływem laminarnym wyczyść szklane szkiełko mikroskopowe z lekkiej chusteczki bezwłóknistej i czystego etanolu. Umieść szkiełko na chusteczce higienicznej w pomieszczeniu czystym na szalce Petriego z pokrywką.

Aby manipulować mikroczipami SiN, za pomocą pęsety pokrytej węglem, chwyć mikroczip mocno, ale ostrożnie za dłuższe boki, trzymając membranę SiN przez cały czas skierowaną do góry. Korzystając z tej techniki, umieść na szkiełku podstawowym pięć mikroczipów bez przekładki i pięć mikroczipów z przekładką 200 nanometrów. Zamknij szalkę Petriego i umieść mikroczipy pod wyciągiem.

Umieść mikroczipy w zlewce z acetonem klasy HPLC membraną do góry. Delikatnie obracaj zlewką przez dwie minuty, aby usunąć powłokę ochronną, uważając, aby nie przewrócić mikroczipów. Następnie szybko przenieś mikroczipy do zlewki z czystym etanolem.

Przykryj zlewkę folią aluminiową. Delikatnie obracaj zlewką przez dwie minuty, aby zakończyć usuwanie powłoki i przenieś ją na zamkniętej szalce Petriego do okapu z przepływem laminarnym. Umieść mikroczipy na świeżej chusteczce w pomieszczeniu czystym, uważając, aby nie przewrócić mikroczipów podczas ich uwalniania z pęsety.

Pozostaw mikroczipy do wyschnięcia na kilka minut. A następnie umieść mikroczipy na szklanym szkiełku na szalce Petriego. Zamknij szalkę Petriego i przynieś mikroczipy do myjki plazmowej.

Umieść szkiełko podstawowe i mikroczipy w urządzeniu do czyszczenia plazmowego i uruchom pięciominutowy program czyszczenia, aby usunąć węglowodory z membrany SiN. Za pomocą mikroskopu świetlnego sprawdź mikroczipy pod kątem pękniętych membran lub cząstek brudu. Wyrzuć uszkodzone lub brudne mikroczipy.

W okapie z przepływem laminarnym unieruchomić mikroczipy w czystym pudełku transportowym z lepką powierzchnią wewnętrzną. Nałóż jedną mikrolitrową kroplę trzymolowego stabilizowanego cytrynianem wodnego roztworu nanocząstek złota na membranę SiN każdego mikrochipa bez przekładki i pozostaw roztwór do wyschnięcia. Następnie nałóż jeden mikrolitr wody dejonizowanej na membranę, aby zmyć sól i środki powierzchniowo czynne.

Po 30 sekundach użyj bibuły filtracyjnej, aby ostrożnie zetrzeć wodę i pozostaw mikroczipy do wyschnięcia. Umieść końcówkę uchwytu TEM przepływu cieczy pod mikroskopem dwuokularowym. Zdejmij tytanową pokrywkę z końcówki uchwytu i umieść ją na arkuszu folii aluminiowej.

Ustaw mikroprzepływową pompę strzykawkową z jednomililitrową szklaną strzykawką zawierającą 0,5 mililitra wody klasy HPLC. Podłączyć strzykawkę do systemu przepływu i uruchomić pompę. Gdy woda jest przepłukiwana przez system, sprawdź przewody pod kątem wycieków lub zwężeń przepływu.

Po zakończeniu odciągania usuń płukanie z komory na ogniwa cieczy i osusz końcówkę uchwytu bibułą filtracyjną. Sprawdź końcówkę uchwytu za pomocą mikroskopu świetlnego. Osusz końcówkę chusteczką do pomieszczeń czystych i usuń kurz lub włókna czystą pęsetą pokrytą PTFE.

Sprawdź pokrywę końcówki uchwytu, O-ring i, a następnie usuń kurz lub włókna za pomocą pęsety pokrytej PTFE. Umieść O-ring w grupach uchwytów. Wkręć pierwszą i przekręć ją kilka razy, aby po prostu została.

Za pomocą czystej, zakrzywionej pęsety umieść mikroczip próbki w kieszeni końcówki uchwytu z membraną SiN skierowaną do góry. Użyj mikroskopu światła lornetki, aby sprawdzić, czy mikroczip jest prawidłowo osadzony. Umieść kroplę czystej przefiltrowanej wody o pojemności 0,3 mikrolitra na próbce mikroczip.

Przytrzymywanie mikroczipa na miejscu za pomocą pęsety. Następnie podnieś mikroczip dystansowy z zakrzywioną pęsetą trzymaną do góry nogami. Ostrożnie obróć pęsetę tak, aby membrana mikroczipa była skierowana w dół.

Umieść mikroczip dystansowy na mikrochipie próbki. Umieść materiał odbijający światło pod końcówką uchwytu i sprawdź wyrównanie mikroczipa pod mikroskopem światła lornetki. Użyj pęsety, aby ostrożnie wyregulować mikroczipy, jeśli okienka SiN nie są wyrównane.

Następnie podnieś pęsetą pokrywę komory na próbkę. Odwróć pokrywę do góry nogami i nie dotykając mikroczipów, oprzyj tylną stronę pokrywy na końcówce uchwytu. Umieść pozostałą za pomocą pęsety i dokręć obie w sposób iteracyjny.

Dokręć ostrożnie, aż napotkają opór. Szyby mogą łatwo pęknąć, jeśli dokręcenie jest zbyt mocne. Uruchom przepływ cieczy w ilości czterech mikrolitrów na minutę przez system i sprawdź, czy nie ma wycieków w końcówce uchwytu.

Następnie przynieś uchwyt do stacji pomp próżniowych i przeprowadź kontrolę szczelności. Upewnij się, że ciśnienie osiągnie co najmniej 10 do minus piątego mbar w ciągu pięciu minut. Umieść uchwyt w obudowie.

I przynieś uchwyt do mikroskopu elektronowego. Ustaw mikroskop w trybie STEM. Zmierz gęstość prądu wiązki elektronów za pomocą cienkiej warstwy węgla pokrytej nanocząstkami złota jako próbki referencyjnej bez wody.

Rozpocznij przepływ czystej wody z szybkością nie większą niż dwa mikrolitry na minutę. Włóż uchwyt TEM przepływu cieczy do zamka obciążenia podciśnieniowego i rozpocznij opróżnianie. Upewnij się, że ciśnienie spada normalnie.

A następnie włóż uchwyt TEM całkowicie do mikroskopu. Gdy ciśnienie jest wystarczająco niskie, otwórz zawór belki i włóż detektor ADF. Ustaw mikroskop w trybie akwizycji ciągłej i przesuń stolik próbki w kierunkach X i Y, aby znaleźć okno SiN.

Dostosuj kontrast i jasność tak, aby krawędzie okna były wyraźnie widoczne. Przesuń stół montażowy w kierunkach X i Y tak, aby róg okna znajdował się w środku pola widzenia. Następnie zresetuj soczewkę obiektywu.

Dostosuj pionowe położenie stolika na próbkę, aby zgrubnie ustawić ostrość rogu. Przechyl stolik o pięć stopni do przodu i do tyłu, aby sprawdzić, czy próbka znajduje się na wysokości eucentrycznej. Wyśrodkuj róg okna w polu view, a następnie zapisz pozycję sceny w oprogramowaniu.

Przesuń stolik w kierunkach X i Y, aż nanocząstki złota będą widoczne. A następnie ustaw ostrość obiektywu. Zanotuj aktualną gęstość i oblicz grubość komórki cieczy.

Przesuń stolik w kierunkach X i Y, aby zlokalizować obszar z co najmniej 20 nanocząstkami złota. Ustaw parametry i uzyskaj obraz. Nanocząstki złota są unieruchamiane na membranie z azotku krzemu i obrazowane za pomocą STEM w fazie ciekłej.

W czystej wodzie nanocząstki złota zachowały swój kształt przez cały okres obrazowania. Produkty radiolizy z wody mogą utleniać pojedyncze atomy złota, co ostatecznie może zmienić kształt nanocząstek. W innym eksperymencie jony chlorkowe wprowadzamy do fazy ciekłej.

Nanocząstki złota powoli rozpuszczały się w eksperymencie, gdy utlenione atomy złota tworzyły rozpuszczalny tetrachloroaureat. Aby zbadać ruchy nanocząstek złota w wodzie, w kolejnym eksperymencie nanocząstki nie były w pełni unieruchomione na membranie próbki. Nanocząstki złota aglomerowały się i po osiągnięciu krytycznej wielkości klastra zniknęły z pola widzenia.

Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w ciągu dwóch godzin, jeśli jest wykonywana prawidłowo. Wymagane będzie kilkutygodniowe szkolenie. Podejmując się tego zabiegu, należy pamiętać o spokojnej pracy i sprawdzaniu szczelności próżni oraz gęstości cieczy.

Po jej opracowaniu technika ta utorowała drogę naukowcom zajmującym się materiałoznawstwem, chemią i biologią do badania wzrostu i ruchu nanocząstek w cieczy, struktury materiałów w nanoskali w środowisku ciekłym oraz funkcjonalności białek w komórkach ssaków. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak przeprowadzać skaningową transmisyjną mikroskopię elektronową nanocząstek złota osadzonych w warstwie wody, w tym prawidłowe obciążenie uchwytu próbki i regulację mikroskopu. Nie zapominaj, że praca z cieczą w mikroskopie elektronowym może spowodować uszkodzenie, jeśli uchwyt próbki nie zostanie prawidłowo załadowany.

Dlatego ważne jest, aby przed załadowaniem sprawdzić, czy nie ma wycieków podciśnienia.