Badanie procesów dynamicznych nano-rozmiarów obiektów w cieczy za pomocą skaningowej transmisyjnej mikroskopii elektronowej
5 lutego 2017
Ten protokół opisuje działanie uchwytu na próbki przepływu cieczy do skanowania transmisyjnej mikroskopii elektronowej AuNPs w wodzie, używanej do obserwacji dynamicznych procesów w nanoskali.
Ogólnym celem skaningowej transmisyjnej mikroskopii elektronowej w fazie ciekłej jest obserwacja struktur i zjawisk zachodzących w nanomateriałach w próbkach biologicznych całkowicie osadzonych w warstwie cieczy o grubości do kilku mikrometrów. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie materiałoznawstwa, takie jak zachowanie nanomateriałów w cieczy i badanie próbek biologicznych w naturalnym środowisku ciekłym. Główną zaletą tej techniki jest to, że dostarcza ona informacji morfologicznych w nanoskali o próbkach w cieczy.
Ogólnie rzecz biorąc, osoby, które są nowe w tej metodzie, będą miały trudności, ponieważ ładowanie uchwytu próbki i akwizycja obrazu nie są tak proste, jak po raz pierwszy wykonane za pomocą mikroskopii elektronowej. Aby rozpocząć procedurę, w czystym okapie z przepływem laminarnym wyczyść szklane szkiełko mikroskopowe z lekkiej chusteczki bezwłóknistej i czystego etanolu. Umieść szkiełko na chusteczce higienicznej w pomieszczeniu czystym na szalce Petriego z pokrywką.
Aby manipulować mikroczipami SiN, za pomocą pęsety pokrytej węglem, chwyć mikroczip mocno, ale ostrożnie za dłuższe boki, trzymając membranę SiN przez cały czas skierowaną do góry. Korzystając z tej techniki, umieść na szkiełku podstawowym pięć mikroczipów bez przekładki i pięć mikroczipów z przekładką 200 nanometrów. Zamknij szalkę Petriego i umieść mikroczipy pod wyciągiem.
Umieść mikroczipy w zlewce z acetonem klasy HPLC membraną do góry. Delikatnie obracaj zlewką przez dwie minuty, aby usunąć powłokę ochronną, uważając, aby nie przewrócić mikroczipów. Następnie szybko przenieś mikroczipy do zlewki z czystym etanolem.
Przykryj zlewkę folią aluminiową. Delikatnie obracaj zlewką przez dwie minuty, aby zakończyć usuwanie powłoki i przenieś ją na zamkniętej szalce Petriego do okapu z przepływem laminarnym. Umieść mikroczipy na świeżej chusteczce w pomieszczeniu czystym, uważając, aby nie przewrócić mikroczipów podczas ich uwalniania z pęsety.
Pozostaw mikroczipy do wyschnięcia na kilka minut. A następnie umieść mikroczipy na szklanym szkiełku na szalce Petriego. Zamknij szalkę Petriego i przynieś mikroczipy do myjki plazmowej.
Umieść szkiełko podstawowe i mikroczipy w urządzeniu do czyszczenia plazmowego i uruchom pięciominutowy program czyszczenia, aby usunąć węglowodory z membrany SiN. Za pomocą mikroskopu świetlnego sprawdź mikroczipy pod kątem pękniętych membran lub cząstek brudu. Wyrzuć uszkodzone lub brudne mikroczipy.
W okapie z przepływem laminarnym unieruchomić mikroczipy w czystym pudełku transportowym z lepką powierzchnią wewnętrzną. Nałóż jedną mikrolitrową kroplę trzymolowego stabilizowanego cytrynianem wodnego roztworu nanocząstek złota na membranę SiN każdego mikrochipa bez przekładki i pozostaw roztwór do wyschnięcia. Następnie nałóż jeden mikrolitr wody dejonizowanej na membranę, aby zmyć sól i środki powierzchniowo czynne.
Po 30 sekundach użyj bibuły filtracyjnej, aby ostrożnie zetrzeć wodę i pozostaw mikroczipy do wyschnięcia. Umieść końcówkę uchwytu TEM przepływu cieczy pod mikroskopem dwuokularowym. Zdejmij tytanową pokrywkę z końcówki uchwytu i umieść ją na arkuszu folii aluminiowej.
Ustaw mikroprzepływową pompę strzykawkową z jednomililitrową szklaną strzykawką zawierającą 0,5 mililitra wody klasy HPLC. Podłączyć strzykawkę do systemu przepływu i uruchomić pompę. Gdy woda jest przepłukiwana przez system, sprawdź przewody pod kątem wycieków lub zwężeń przepływu.
Po zakończeniu odciągania usuń płukanie z komory na ogniwa cieczy i osusz końcówkę uchwytu bibułą filtracyjną. Sprawdź końcówkę uchwytu za pomocą mikroskopu świetlnego. Osusz końcówkę chusteczką do pomieszczeń czystych i usuń kurz lub włókna czystą pęsetą pokrytą PTFE.
Sprawdź pokrywę końcówki uchwytu, O-ring i, a następnie usuń kurz lub włókna za pomocą pęsety pokrytej PTFE. Umieść O-ring w grupach uchwytów. Wkręć pierwszą i przekręć ją kilka razy, aby po prostu została.
Za pomocą czystej, zakrzywionej pęsety umieść mikroczip próbki w kieszeni końcówki uchwytu z membraną SiN skierowaną do góry. Użyj mikroskopu światła lornetki, aby sprawdzić, czy mikroczip jest prawidłowo osadzony. Umieść kroplę czystej przefiltrowanej wody o pojemności 0,3 mikrolitra na próbce mikroczip.
Przytrzymywanie mikroczipa na miejscu za pomocą pęsety. Następnie podnieś mikroczip dystansowy z zakrzywioną pęsetą trzymaną do góry nogami. Ostrożnie obróć pęsetę tak, aby membrana mikroczipa była skierowana w dół.
Umieść mikroczip dystansowy na mikrochipie próbki. Umieść materiał odbijający światło pod końcówką uchwytu i sprawdź wyrównanie mikroczipa pod mikroskopem światła lornetki. Użyj pęsety, aby ostrożnie wyregulować mikroczipy, jeśli okienka SiN nie są wyrównane.
Następnie podnieś pęsetą pokrywę komory na próbkę. Odwróć pokrywę do góry nogami i nie dotykając mikroczipów, oprzyj tylną stronę pokrywy na końcówce uchwytu. Umieść pozostałą za pomocą pęsety i dokręć obie w sposób iteracyjny.
Dokręć ostrożnie, aż napotkają opór. Szyby mogą łatwo pęknąć, jeśli dokręcenie jest zbyt mocne. Uruchom przepływ cieczy w ilości czterech mikrolitrów na minutę przez system i sprawdź, czy nie ma wycieków w końcówce uchwytu.
Następnie przynieś uchwyt do stacji pomp próżniowych i przeprowadź kontrolę szczelności. Upewnij się, że ciśnienie osiągnie co najmniej 10 do minus piątego mbar w ciągu pięciu minut. Umieść uchwyt w obudowie.
I przynieś uchwyt do mikroskopu elektronowego. Ustaw mikroskop w trybie STEM. Zmierz gęstość prądu wiązki elektronów za pomocą cienkiej warstwy węgla pokrytej nanocząstkami złota jako próbki referencyjnej bez wody.
Rozpocznij przepływ czystej wody z szybkością nie większą niż dwa mikrolitry na minutę. Włóż uchwyt TEM przepływu cieczy do zamka obciążenia podciśnieniowego i rozpocznij opróżnianie. Upewnij się, że ciśnienie spada normalnie.
A następnie włóż uchwyt TEM całkowicie do mikroskopu. Gdy ciśnienie jest wystarczająco niskie, otwórz zawór belki i włóż detektor ADF. Ustaw mikroskop w trybie akwizycji ciągłej i przesuń stolik próbki w kierunkach X i Y, aby znaleźć okno SiN.
Dostosuj kontrast i jasność tak, aby krawędzie okna były wyraźnie widoczne. Przesuń stół montażowy w kierunkach X i Y tak, aby róg okna znajdował się w środku pola widzenia. Następnie zresetuj soczewkę obiektywu.
Dostosuj pionowe położenie stolika na próbkę, aby zgrubnie ustawić ostrość rogu. Przechyl stolik o pięć stopni do przodu i do tyłu, aby sprawdzić, czy próbka znajduje się na wysokości eucentrycznej. Wyśrodkuj róg okna w polu view, a następnie zapisz pozycję sceny w oprogramowaniu.
Przesuń stolik w kierunkach X i Y, aż nanocząstki złota będą widoczne. A następnie ustaw ostrość obiektywu. Zanotuj aktualną gęstość i oblicz grubość komórki cieczy.
Przesuń stolik w kierunkach X i Y, aby zlokalizować obszar z co najmniej 20 nanocząstkami złota. Ustaw parametry i uzyskaj obraz. Nanocząstki złota są unieruchamiane na membranie z azotku krzemu i obrazowane za pomocą STEM w fazie ciekłej.
W czystej wodzie nanocząstki złota zachowały swój kształt przez cały okres obrazowania. Produkty radiolizy z wody mogą utleniać pojedyncze atomy złota, co ostatecznie może zmienić kształt nanocząstek. W innym eksperymencie jony chlorkowe wprowadzamy do fazy ciekłej.
Nanocząstki złota powoli rozpuszczały się w eksperymencie, gdy utlenione atomy złota tworzyły rozpuszczalny tetrachloroaureat. Aby zbadać ruchy nanocząstek złota w wodzie, w kolejnym eksperymencie nanocząstki nie były w pełni unieruchomione na membranie próbki. Nanocząstki złota aglomerowały się i po osiągnięciu krytycznej wielkości klastra zniknęły z pola widzenia.
Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w ciągu dwóch godzin, jeśli jest wykonywana prawidłowo. Wymagane będzie kilkutygodniowe szkolenie. Podejmując się tego zabiegu, należy pamiętać o spokojnej pracy i sprawdzaniu szczelności próżni oraz gęstości cieczy.
Po jej opracowaniu technika ta utorowała drogę naukowcom zajmującym się materiałoznawstwem, chemią i biologią do badania wzrostu i ruchu nanocząstek w cieczy, struktury materiałów w nanoskali w środowisku ciekłym oraz funkcjonalności białek w komórkach ssaków. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak przeprowadzać skaningową transmisyjną mikroskopię elektronową nanocząstek złota osadzonych w warstwie wody, w tym prawidłowe obciążenie uchwytu próbki i regulację mikroskopu. Nie zapominaj, że praca z cieczą w mikroskopie elektronowym może spowodować uszkodzenie, jeśli uchwyt próbki nie zostanie prawidłowo załadowany.
Dlatego ważne jest, aby przed załadowaniem sprawdzić, czy nie ma wycieków podciśnienia.
Przegląd
Ten protokół opisuje działanie uchwytu próbki o przepływie cieczy do skanującej transmisyjnej mikroskopii elektronowej AuNPs w wodzie, ułatwiając obserwację dynamicznych procesów na skalę nanometrów.
Kluczowe elementy badania
Obszar nauki
- Skanująca transmisyjna mikroskopia elektronowa
- Nanomateriały
- Obrazownie fazy ciekłej
Tło
- Skanująca transmisyjna mikroskopia elektronowa w fazie ciekłej pozwala na obserwację nanomateriałów w środowisku ciekłym.
- Ta technika dostarcza informacji morfologicznych na skalę nanometrów o próbkach.
- Jest szczególnie przydatna do badania biologicznych próbek w ich naturalnym stanie ciekłym.
- Nowi użytkownicy mogą uważać za trudne ładowanie próbek i pozyskiwanie obrazów.
Cel badania
- Aby obserwować struktury i zjawiska nanomateriałów w biologicznych próbkach.
- Aby zbadać zachowanie nanomateriałów w cieczy.
- Aby zwiększyć zrozumienie dynamicznych procesów na skalę nanometrów.
Zastoosowane metody
- Czyszczenie i przygotowywanie mikrochipów SiN do ładowania próbek.
- Nakładanie roztworu nanocząstek złota na mikrochipy.
- Używanie uchwytu TEM o przepływie cieczy do obrazowania.
- Przeprowadzanie kontroli szczelności i zapewnianie prawidłowego wyrównania mikrochipów.
Główne wyniki
- Protokół skutecznie demonstruje przygotowanie i obrazywanie AuNPs w środowisku ciekłym.
- Zarysuje kroki zapewniające integralność próbki w trakcie procesu.
- Wyniki wskazują na skuteczność uchwytu o przepływie cieczy w rejestrowaniu dynamicznych procesów.
Wnioski
- Ta metoda dostarcza cennych informacji o zachowaniu nanomateriałów w cieczy.
- Zwiększa zdolności mikroskopii elektronowej do badania biologicznych próbek.
- Przyszłe zastosowania mogą rozszerzyć się na różne dziedziny nauki o materiałach.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Liquid phase scanning transmission electron microscopy enables direct observation of nanomaterial behavior in physiologically relevant liquid environments, supporting target validation through mechanistic de-risking of nanoparticle-biological interactions. This capability enhances predictive confidence in preclinical models by capturing dynamic processes such as agglomeration, dissolution, and cellular uptake under controlled fluid conditions. The method addresses a critical gap in nanomedicine development by providing nanoscale resolution in hydrated states, reducing reliance on inferential assays and improving go/no-go decisions in early discovery.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by visualizing nanomaterial structural changes in liquid, clarifying mechanisms of action and degradation pathways.
- Operational Value: Enables functional target validation through direct observation of nanoparticle interactions with biological components in near-native conditions.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by identifying unstable or reactive nanomaterials early, reducing late-stage failure risk due to unforeseen liquid-phase behavior.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Prepares validated biological systems for downstream workflows by confirming nanomaterial stability and dispersion in liquid media prior to high-content screening.
- Quantitative Outputs: Enables measurement of particle size, shape, and concentration changes over time, providing reproducible metrics for assay standardization.
- Platform Reuse: Facilitates screening readiness and scalability through standardized microfluidic chip preparation and leak-tight holder assembly, supporting repeated use across compound libraries.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Bridges discovery and preclinical validation by maintaining nanomaterials in liquid environments that mimic physiological conditions, improving relevance of efficacy and toxicity readouts.
- Risk-Adjusted Decisions: Informs advancement criteria by quantifying dynamic processes such as ion-induced dissolution or agglomeration, which directly impact bioavailability and safety profiles.
- Mechanistic De-risking: Focuses on predictive de-risking when primarily mechanistic, clarifying whether observed effects stem from the nanomaterial itself or liquid-phase transformation products.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from Early Discovery through Lead Identification to Preclinical work, supporting hypothesis testing, assay readiness, and translational continuity when nanomaterials are evaluated in liquid environments.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by enabling direct visualization of nanomaterial behavior in liquid, reducing mechanistic ambiguity in target engagement studies.
- Screening: Describes assay readiness through reproducible liquid cell formation and nanoparticle immobilization, ensuring consistent starting conditions for compound evaluation.
- Analytics: Highlights liquid thickness measurement and nanoparticle tracking as key readouts that help teams compare stability across formulations or environmental conditions.
- Translational Research: Connects method to preclinical continuity by maintaining nanomaterials in hydrated states that reflect in vivo exposure, supporting biomarker alignment when dissolution products or agglomerates correlate with biological response.
- Enterprise Reuse:Frames the method as a reusable capability through standardized microfluidic chip preparation, holder assembly, and leak testing protocols, enabling consistent application across projects and teams.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence, target validation, reduction of mechanistic ambiguity in nanomaterial-biological interactions.
- Operational Value: Standardization, reproducibility, and scalability of liquid cell preparation and imaging workflows.
- Strategic Value: Better go/no-go decisions, capital efficiency, and reduced late-stage biological risk by identifying unstable nanomaterials early.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization and advancement decisions based on direct observation of liquid-phase stability and transformation.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microfluidic handling, vacuum systems, and electron microscopy to ensure proper specimen holder assembly and leak testing.
- Depends on instrumentation including plasma cleaners, liquid flow TEM holders, and STEM-capable microscopes with environmental holders.
- Necessitates cross-team standardization of chip cleaning, spacer use, and flow rate protocols to ensure reproducibility across sites.
- Involves adaptation considerations when transitioning from water-based to complex biological media, including viscosity effects and potential membrane fouling.
- Includes practical limitations such as beam-induced radiolysis effects on liquid chemistry and the need for vacuum compatibility, which may restrict certain volatile or reactive formulations.
