Name: Badanie procesów dynamicznych nano-rozmiarów obiektów w cieczy za pomocą skaningowej transmisyjnej mikroskopii elektronowej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-02-05T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 29 s
Description: Poznaj skaningową transmisyjną mikroskopię elektronową w fazie ciekłej do obserwacji nanomateriałów w środowisku wodnym. Ta metoda umożliwia badanie dynamicznych procesów nanorozmiarowych obiektów w cieczach.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy E. Arztowi za jego wsparcie za pośrednictwem INM. Badania były częściowo wspierane przez Konkurs Leibniza 2014.

<ol><li>Ring, E. A., de Jonge, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+system+for+transmission+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Microsc.+Microanal%22%5BJournal%5D)">Microfluidic system for transmission electron microscopy.</a> Microsc. Microanal. 16, 622-629 (2010).</li>
<li>Ross, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Opportunities+and+challenges+in+liquid+cell+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Opportunities and challenges in liquid cell electron microscopy.</a> Science. 350, 9881-9889 (2015).</li>
<li>de Jonge, N., Ross, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electron+microscopy+of+specimens+in+liquid%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Nanotechnol%22%5BJournal%5D)">Electron microscopy of specimens in liquid.</a> Nat. Nanotechnol. 6, 695-704 (2011).</li>
<li>Zheng, H., Smith, R. K., Jun, Y. W., Kisielowski, C., Dahmen, U., Alivisatos, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Observation+of+single+colloidal+platinum+nanocrystal+growth+trajectories%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Observation of single colloidal platinum nanocrystal growth trajectories.</a> Science. 324, 1309-1312 (2009).</li>
<li>Evans, J. E., Jungjohann, K. L., Browning, N. D., Arslan, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controlled+growth+of+nanoparticles+from+solution+with+in+situ+liquid+transmission+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Lett%22%5BJournal%5D)">Controlled growth of nanoparticles from solution with in situ liquid transmission electron microscopy.</a> Nano Lett. 11, 2809-2813 (2011).</li>
<li>Alloyeau, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unravelling+kinetic+and+thermodynamic+effects+on+the+growth+of+gold+nanoplates+by+liquid+transmission+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Lett%22%5BJournal%5D)">Unravelling kinetic and thermodynamic effects on the growth of gold nanoplates by liquid transmission electron microscopy.</a> Nano Lett. 15, 2574-2581 (2015).</li>
<li>Smeets, P. J., Cho, K. R., Kempen, R. G., Sommerdijk, N. A., De Yoreo, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+carbonate+nucleation+driven+by+ion+binding+in+a+biomimetic+matrix+revealed+by+in+situ+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Mater%22%5BJournal%5D)">Calcium carbonate nucleation driven by ion binding in a biomimetic matrix revealed by in situ electron microscopy.</a> Nat. Mater. 14, 394-399 (2015).</li>
<li>Peckys, D. B., de Jonge, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liquid+Scanning+Transmission+Electron+Microscopy%3A+Imaging+Protein+Complexes+in+their+Native+Environment+in+Whole+Eukaryotic+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Microsc.+Microanal%22%5BJournal%5D)">Liquid Scanning Transmission Electron Microscopy: Imaging Protein Complexes in their Native Environment in Whole Eukaryotic Cells.</a> Microsc. Microanal. 20, 346-365 (2014).</li>
<li>de Jonge, N., Peckys, D. B., Kremers, G. J., Piston, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electron+microscopy+of+whole+cells+in+liquid+with+nanometer+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci%22%5BJournal%5D)">Electron microscopy of whole cells in liquid with nanometer resolution.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 106, 2159-2164 (2009).</li>
<li>Evans, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+macromolecular+complexes+with+in+situ+liquid+scanning+transmission+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Micron%22%5BJournal%5D)">Visualizing macromolecular complexes with in situ liquid scanning transmission electron microscopy.</a> Micron. 43, 1085-1090 (2012).</li>
<li>Dukes, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+microchip+design+and+application+for+in+situ+transmission+electron+microscopy+of+macromolecules%5BTitle%5D)+AND+%22Microsc.+Microanal%22%5BJournal%5D)">Improved microchip design and application for in situ transmission electron microscopy of macromolecules.</a> Microsc. Microanal. 20, 338-345 (2014).</li>
<li>Ring, E. A., Peckys, D. B., Dukes, M. J., Baudoin, J. P., de Jonge, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Silicon+nitride+windows+for+electron+microscopy+of+whole+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Microsc%22%5BJournal%5D)">Silicon nitride windows for electron microscopy of whole cells.</a> J. Microsc. 243, 273-283 (2011).</li>
<li>de Jonge, N., Pfaff, M., Peckys, D. B. <a target="_blank" href="https://www.researchgate.net/publication/278397751_Practical_Aspects_of_Transmission_Electron_Microscopy_in_Liquid">Practical aspects of transmission electron microscopy in liquid.</a> Adv. Imag. Electr. Phys. 186, 1-37 (2014).</li>
<li>Verch, A., Pfaff, M., De Jonge, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exceptionally+slow+movement+of+gold+nanoparticles+at+a+solid%3Aliquid+interface+investigated+by+scanning+transmission+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Exceptionally slow movement of gold nanoparticles at a solid:liquid interface investigated by scanning transmission electron microscopy.</a> Langmuir. 31, 6956-6964 (2015).</li>
<li>Schneider, N. M., Norton, M. M., Mendel, B. J., Grogan, J. M., Ross, F. M., Bau, H. H. <a target="_blank" href="http://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/jp507400n">Electron-water interactions and implications for liquid cell electron microscopy.</a> J. Phys. Chem. C. 118, 22373-22382 (2014).</li>
<li>Hermannsdoerfer, J., de Jonge, N., Verch, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electron+beam+induced+chemistry+of+gold+nanoparticles+in+saline+solution%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Comm%22%5BJournal%5D)">Electron beam induced chemistry of gold nanoparticles in saline solution.</a> Chem. Comm. 51, 16393-16396 (2015).</li>
<li>Schuh, T., de Jonge, N. <a target="_blank" href="http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S163107051300203X">Liquid scanning transmission electron microscopy: Nanoscale imaging in micrometers-thick liquids.</a> C. R. Phys. 15, 214-223 (2014).</li>
<li>Jensen, E., Burrows, A., Molhave, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monolithic+chip+system+with+a+microfluidic+channel+for+in+situ+electron+microscopy+of+liquids%5BTitle%5D)+AND+%22Microsc.+Microanal%22%5BJournal%5D)">Monolithic chip system with a microfluidic channel for in situ electron microscopy of liquids.</a> Microsc. Microanal. 20, 445-451 (2014).</li>
<li>Creemer, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://ieeexplore.ieee.org/document/5428851/">A MEMS reactor for atomic-scale microscopy of nanomaterials under industrially relevant conditions.</a> J. Microelectromech. Syst. 19, 254-264 (2010).</li>
<li>Williamson, M. J., Tromp, R. M., Vereecken, P. M., Hull, R., Ross, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+microscopy+of+nanoscale+cluster+growth+at+the+solid-liquid+interface%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Mater%22%5BJournal%5D)">Dynamic microscopy of nanoscale cluster growth at the solid-liquid interface.</a> Nat. Mater. 2, 532-536 (2003).</li>
<li>Thiberge, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scanning+electron+microscopy+of+cells+and+tissues+under+fully+hydrated+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci%22%5BJournal%5D)">Scanning electron microscopy of cells and tissues under fully hydrated conditions.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 101, 3346(2004).</li>
<li>Chen, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+motion+of+DNA-Au+nanoconjugates+in+graphene+liquid+cell+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Lett%22%5BJournal%5D)">3D motion of DNA-Au nanoconjugates in graphene liquid cell electron microscopy.</a> Nano Lett. 13, 4556-4561 (2013).</li>
<li>Yuk, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+EM+of+colloidal+nanocrystal+growth+using+graphene+liquid+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">High-resolution EM of colloidal nanocrystal growth using graphene liquid cells.</a> Science. 336, 61-64 (2012).</li>
<li>Reimer, L., Kohl, H. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aReimer%2C+L+%22Transmission+electron+microscopy%3A+physics+of+image+formation%22">Transmission electron microscopy: physics of image formation</a>. , Springer. (2008).</li>
<li>Abellan, P., Woehl, T. J., Parent, L. R., Browning, N. D., Evans, J. E., Arslan, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Factors+influencing+quantitative+liquid+%28scanning%29+transmission+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Commun%22%5BJournal%5D)">Factors influencing quantitative liquid (scanning) transmission electron microscopy.</a> Chem. Commun. 50, 4873-4880 (2014).</li>
<li>Woehl, T. J., Jungjohann, K. L., Evans, J. E., Arslan, I., Ristenpart, W. D., Browning, N. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+procedures+to+mitigate+electron+beam+induced+artifacts+during+in+situ+fluid+imaging+of+nanomaterials%5BTitle%5D)+AND+%22Ultramicroscopy%22%5BJournal%5D)">Experimental procedures to mitigate electron beam induced artifacts during in situ fluid imaging of nanomaterials.</a> Ultramicroscopy. 127, 53-63 (2013).</li>
<li>Hohmann-Marriott, M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanoscale+3D+cellular+imaging+by+axial+scanning+transmission+electron+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Nanoscale 3D cellular imaging by axial scanning transmission electron tomography.</a> Nat. Methods. 6, 729-731 (2009).</li>
<li>Unocic, R. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+electrochemical+measurements+using+in+situ+ec-S%2FTEM+devices%5BTitle%5D)+AND+%22Microsc.+Microanal%22%5BJournal%5D)">Quantitative electrochemical measurements using in situ ec-S/TEM devices.</a> Microsc. Microanal. 20, 452-461 (2014).</li>
<li>Kourkoutis, L. F., Plitzko, J. M., Baumeister, W. <a target="_blank" href="http://www.annualreviews.org/doi/abs/10.1146/annurev-matsci-070511-155004">Electron Microscopy of Biological Materials at the Nanometer Scale.</a> Annu. Rev. Mater. Res. 42, 33-58 (2012).</li>
<li>Chao, W., Harteneck, B. D., Liddle, J. A., Anderson, E. H., Attwood, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Soft+X-ray+microscopy+at+a+spatial+resolution+better+than+15+nm%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Soft X-ray microscopy at a spatial resolution better than 15 nm.</a> Nature. 435, 1210-1213 (2005).</li>
<li>Larabell, C. A., Nugent, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+cellular+architecture+with+X-rays%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Struct+Biol%22%5BJournal%5D)">Imaging cellular architecture with X-rays.</a> Curr Opin Struct Biol. 20, 623-631 (2010).</li>
<li>Muller, D. J., Helenius, J., Alsteens, D., Dufrene, Y. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Force+probing+surfaces+of+living+cells+to+molecular+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Chem.+Biol%22%5BJournal%5D)">Force probing surfaces of living cells to molecular resolution.</a> Nat. Chem. Biol. 5, 383-390 (2009).</li>
<li>Allison, D. P., Mortensen, N. P., Sullivan, C. J., Doktycz, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((atomic+force+microscopy+of+biological+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Wiley+Interdiscip.+Rev.+Nanomed.+Nanobiotechnol%22%5BJournal%5D)">atomic force microscopy of biological samples.</a> Wiley Interdiscip. Rev. Nanomed. Nanobiotechnol. 2, 618-634 (2010).</li>
<li>Fleming, A. J., Kenton, B. J., Leang, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bridging+the+gap+between+conventional+and+video-speed+scanning+probe+microscopes%5BTitle%5D)+AND+%22Ultramicroscopy%22%5BJournal%5D)">Bridging the gap between conventional and video-speed scanning probe microscopes.</a> Ultramicroscopy. 110, 1205-1214 (2010).</li>
<li>Sulchek, T., Hsieh, R., Adams, J. D., Minne, S. C., Quate, C. F., Adderton, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-speed+atomic+force+microscopy+in+liquid%5BTitle%5D)+AND+%22Rev.+Sci.+Instr%22%5BJournal%5D)">High-speed atomic force microscopy in liquid.</a> Rev. Sci. Instr. 71, 2097-2099 (2000).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Opisany protokół umożliwia STEM AuNPs w cieczy, w tym obserwację procesów dynamicznych. Montaż uchwytu jest techniką łatwą do nauczenia. Jednak podczas pracy z uchwytem TEM przepływu cieczy należy wziąć pod uwagę kilka aspektów. Na przykład złamane krawędzie mikrochipa Si lub duże cząstki na O-ringach mogą spowodować wyciek płynnej komórki. Z drugiej strony duże cząstki (>200 nm; np. kurz lub zanieczyszczenia Si) na membranie SiN może powodować zwiększenie grubości ciekłej komórki, co prowadzi do niskiego kontrastu obrazowania lub niskiej rozdzielczości przestrzennej, a nawet może spowodować pęknięcie okien SiN. Co ważne, pozostałości soli lub innych substancji chemicznych mogą w niepożądany sposób wpłynąć na wynik eksperymentów. Dlatego tak ważne jest, aby poszczególne etapy przygotowania próbki i montażu uchwytu były wykonywane ostrożnie w czystym i wolnym od kurzu środowisku.
Grubość ciekłej komórki decyduje o osiągalnej rozdzielczości, a także o kontraście uzyskanych obrazów17. Grubość tę można regulować za pomocą przekładek umieszczonych na jednym z dwóch mikrochipów Si. W zależności od wymiarów próbki można uzyskać różne grubości kuwety cieczowej. Do badania AuNP możliwe jest użycie małych przekładek (200-500 nm), podczas gdy całe komórki eukariotyczne potrzebują większych przekładek do 5 μm. Na grubość ciekłej komórki ma ponadto wpływ wybrzuszenie okien membrany SiN wynikające z różnicy ciśnień między cieczą a otaczającą ją próżnią. Efekt ten staje się bardziej wyraźny w przypadku większych okien membranowych SiN. Dlatego, aby zminimalizować grubość ciekłej komórki, zaleca się stosowanie małych okien membrany SiN. W przypadku, gdy trudno jest znaleźć zakładkę między dwoma małymi oknami, można je zmontować w konfiguracji skrzyżowanej za pomocą innego mikroczipa bazowego. Alternatywne konfiguracje w dużej mierze zapobiegają wybrzuszeniom i składają się z monolitycznego mikrochipa18 lub okien membranowych wspartych na słupkach19, ale mają one wady dotyczące ładowania próbki. Jednym z najtrudniejszych aspektów obecnej technologii jest brak precyzyjnej kontroli nad gęstością cieczy. Często ciecz jest znacznie gęstsza niż można się spodziewać po zastosowanych wymiarach przekładki, jak pokazano tutaj. Kilka grup używało zamkniętych komór cieczowych 4,20,21,22; Systemy te mają pewne zalety w zakresie rozdzielczości przestrzennej, ponieważ grubość cieczy można zmniejszyć poprzez wywołanie pęcherzyka w cieczy. Alternatywnie, okna SiN mogą zostać zmuszone do zapadnięcia się, co prowadzi do cieńszej warstwy cieczy. Po trzecie, istnieje obudowa z innych cieńszych okien (np. grafen)23, co również skutkuje znacznie rzadszymi cieczami niż to, co jest możliwe w przypadku systemu opisanego w tym protokole. Jednak w tych układach nie ma możliwości przepływu cieczy.
Podobnie jak w przypadku każdej techniki mikroskopii o wysokiej rozdzielczości, należy wziąć pod uwagę szereg aspektów eksperymentalnych. Najważniejszym aspektem jest oddziaływanie wiązki elektronów z cieczą lub próbką. Oprócz uszkodzeń spowodowanych promieniowaniem, które ograniczają osiągalną rozdzielczość przestrzenną dla wielu próbek stałych24, na próbki cieczy wpływają również produkty radiolizy generowane wiązką elektronów15,25. Ponieważ produkty te mogą mieć wpływ na eksperyment, niezbędna jest staranna interpretacja danych i projekt eksperymentu26. Ustawienia mikroskopu powinny być dobrane zgodnie z celami konkretnego badania. ADF STEM jest bardziej wydajny do obrazowania nanocząstek o wysokiej liczbie atomowej (Z) w większej grubości ciekłej komórki, podczas gdy TEM zapewnia lepszy kontrast na materiałach o niskiej zawartości Z i jest zwykle szybszy, ale wymaga cieńszych warstw cieczy3. Zamiast detektora ADF, detektor Bright Field (BF) jest czasami używany do obrazowania ogniwa cieczowego, ponieważ BF STEM jest korzystny do obrazowania materiałów o niskiej zawartości Z w grubych warstwach27. Wraz ze wzrostem grubości ogniwa cieczowego potrzebny jest większy prąd. Jednak zwiększa to również stężenie produktów radiolizy i zwiększa uszkodzenia popromienne. Należy również zauważyć, że w detektorze ADF obserwuje się odwrócenie kontrastu dla bardzo gęstych cieczy (>10 μm dla wody).
Warunki cieczy zostały zmienione między naszymi eksperymentami poprzez wyjęcie uchwytu z mikroskopu i wymianę zarówno próbki, jak i cieczy. Oprócz zmiany stężenia soli, łatwo można zmienić inne właściwości cieczy poprzez przepływ w różnych cieczach (np. można użyć roztworów buforowych w celu ustawienia określonego pH16 lub można wprowadzić roztwory organiczne lub inne dodatki). Możliwa jest również zmiana cieczy, gdy uchwyt jest nadal włożony do mikroskopu, poprzez przepływ cieczy przez system mikroprzepływowy. Jednak w tym przypadku nie wiadomo, w którym momencie zmienia się ciecz w próbce. Warto również zauważyć, że dostępne są mikroczipy podtrzymujące elektrody, dzięki czemu można przeprowadzać eksperymenty elektrochemiczne w nanoskali28.
Obiekty badań nie ograniczają się do AuNP w wodzie, ale przy użyciu opisanego powyżej protokołu można badać szeroką gamę próbek, w tym krzemionkę, tlenek tytanu i polimery. Jeśli ruchy obiektów są zbyt szybkie, aby uchwycić je na obrazie w trakcie akwizycji, lepkość można zmniejszyć o rząd wielkości, stosując mieszaninę 50% glicerolu i 50% wody.
Z wyżej wymienionych punktów wyłania się szereg zalet, możliwości, a także wad. Podczas pracy z STEM w fazie ciekłej najważniejsze wady, które należy wziąć pod uwagę, to: 1) na każdy eksperyment ma wpływ dynamiczne oddziaływanie wiązki elektronów z całą próbką (obserwowanym obiektem, cieczą i membranami SiN); 2) obchodzenie się z próbką jest żmudne i często trudno jest uzyskać cienką warstwę cieczy, ponieważ próbka lub mikroczipy zawierają cząstki o wielkości mikrometra; 3) grubość cieczy zwykle różni się znacznie od zamierzonej grubości ustawionej przez przekładkę; oraz 4) rozdzielczość przestrzenna i kontrast silnie zależą od grubości cieczy i różnicy między gęstością zmian obserwowanego obiektu a cieczą.
Obecnie istnieje wiele metod mikroskopii obiektów w cieczy z nanometrową rozdzielczością przestrzenną. Mikroskopia elektronowa w lodzie amorficznym jest potężną techniką29, ale związane z nią procedury eksperymentalne są delikatne, nie wszystkie eksperymenty pozwalają na przygotowanie próbki w lodzie, a eksperymenty z rozdzielczością czasową są niemożliwe. Mikroskopia rentgenowska30,31 może być w zasadzie stosowana, ale ma ograniczoną rozdzielczość przestrzenną i nie jest powszechnie dostępna w laboratoriach. Mikroskopia sił atomowych w cieczy została ustalona, ale jest to technika powierzchniowa tylko 32,33,34,35. Mikroskopia świetlna nie wykazuje wystarczającej rozdzielczości przestrzennej. Obecnie mikroskopia elektronowa w cieczy wydaje się najpotężniejszą techniką bezpośredniej mikroskopii obiektów i procesów w nanoskali.
TEM i STEM w fazie ciekłej nie są jeszcze rutynowymi technikami analitycznymi, ale wciąż się rozwijają. Liczba parametrów, które należy wziąć pod uwagę, jest znaczna i często trudno jest odtworzyć wyniki eksperymentalne. Co więcej, dane ilościowe są trudne do uzyskania, ponieważ badane efekty przeplatają się z procesami zachodzącymi w wyniku działania wiązki elektronów. Opisany tutaj protokół ma na celu standaryzację protokołu eksperymentalnego, uwzględniając w ten sposób wszystkie istotne podstawowe aspekty eksperymentu. Mamy nadzieję, że protokół ten doprowadzi do lepszej odtwarzalności prac eksperymentalnych w tej rozwijającej się dziedzinie.

Konwencjonalna skaningowa transmisyjna mikroskopia elektronowa (STEM) jest ograniczona zakresem próbek odpowiednich do analizy, a konkretnie do próbek suchych i stałych, które nadają się do umieszczenia w wysokiej próżni. Jednak wiele pytań naukowych i technologicznych dotyczy materiałów w nanoskali oraz procesów zachodzących w środowisku ciekłym. Próbki całkowicie zanurzone w cieczy można obecnie badać za pomocą STEM, wykorzystując koncepcję polegającą na zastosowaniu komory mikrofluidycznej zamontowanej w uchwycie próbek do transmisyjnej mikroskopii elektronowej (TEM) i STEM1. Ta nowo opracowana technika staje się coraz popularniejsza, ponieważ dostarcza nowej wiedzy na temat istotnych procesów w różnych tematach badawczych, w tym procesów wzrostu, rozpuszczania i agregacji nanocząstek2,3,4,5,6. Badania te mogą obejmować nie tylko metale, ale także biominerały7 i układy biologiczne8,9,10,11. Załadunek próbek i akwizycja obrazów w STEM w fazie ciekłej różnią się od procedur stosowanych w STEM dla próbek suchych i wymagają protokołu, który wiąże się z dedykowanym szkoleniem.
System mikroprzepływowy składa się z dwóch krzemowych mikrochipów z oknami membranowymi z azotku krzemu (SiN), które są przezroczyste dla wiązki elektronów o energii 200 keV12 (patrz Rysunek 1A). Szczegółowe informacje dotyczące wymiarów oraz obsługi tych mikrochipów można znaleźć w innym opracowaniu12,13. Próbka zazwyczaj zawiera obiekty w skali nanometrycznej. W niniejszej pracy obserwowano złote nanocząsteczki (AuNPs). Nanocząsteczki AuNPs są unieruchomione na górnym oknie (względem wiązki elektronów biegnącej w dół) lub zawieszone w cieczy. Nanometryczna rozdzielczość przestrzenna w STEM jest uzyskiwana poprzez skanowanie wiązką elektronów nanocząsteczek AuNPs i zbieranie transmitowanych elektronów rozproszonych za pomocą detektora pola ciemnego (ADF)9. Dwa mikrochipy są umieszczone w małym gnieździe w końcówce uchwytu TEM do przepływu cieczy1 (uchwyt ten obsługuje zarówno tryb STEM, jak i TEM, lecz określany jest jako uchwyt TEM). Jeden z mikrochipów zawiera dystans, dzięki czemu między mikrochipami tworzy się komora z cieczą. Uszczelki O-ring po obu stronach dwóch mikrochipów zapewniają szczelność próżniową komory z cieczą13 (patrz Rysunek 1B).
Celem niniejszego artykułu jest zaprezentowanie podstawowych kroków ładowania próbek i akwizycji danych, aby zainteresowani użytkownicy mogli łatwo uzyskać dostęp do tej nowej, rozwijającej się techniki. Wykorzystano system dostępny od konkretnego producenta, jednak protokół jest również aktualny dla systemów innych firm. Technika ta jest bardziej złożona niż konwencjonalne TEM i STEM, a podczas pracy z systemem uchwytu do cieczy należy wziąć pod uwagę szereg aspektów praktycznych13. Najważniejsze jest zapewnienie prawidłowego montażu komory z cieczą, co pozwoli na uzyskanie cienkiej warstwy cieczy oraz szczelności próżniowej. Dlatego niezwykle istotne jest zachowanie czystości i zapobieganie powstawaniu pyłu podczas przygotowania i montażu uchwytu TEM do przepływu cieczy. W szczególności pierścienie O-ring oraz dwa krzemowe mikroczipy muszą być wolne od wszelkich zanieczyszczeń. Nawet niewielkie cząsteczki pyłu na jednym z mikroczipów mogą znacznie zwiększyć grubość zmontowanej celi, co może uniemożliwić osiągnięcie użytecznej rozdzielczości przestrzennej. Uszczelnienie próżniowe jest istotne, aby po eksperymencie w mikroskopie elektronowym nie pozostały żadne zanieczyszczenia ani uszkodzenia. Niniejszy protokół opisuje procedurę ładowania oraz kilka niezbędnych testów. Obsługa mikroskopu elektronowego jest prosta, ale wymaga kilku dodatkowych kroków w porównaniu z mikroskopią próbek stałych. Wraz ze wzrostem grubości cieczy więcej elektronów jest pochłanianych i rozpraszanych przez ciecz; pomiar grubości cieczy jest zatem niezbędny. Na koniec protokół wyjaśnia sposób wykonywania obrazów oraz sposób badania procesów dynamicznych.
<img alt="Układ TEM z ogniwem cieczowym: Schemat oddziaływania wiązki elektronów z nanocząsteczkami złota w przepływie cieczy." src="/files/ftp_upload/54943/54943fig1.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1: Ogniwo przepływowe z cieczą do skaningowej transmisyjnej mikroskopii elektronowej (STEM). (A)Schematyczny rysunek zmontowanego ogniwa cieczowego. Dwa krzemowe mikrochipy z oknami z membrany azotku krzemu (SiN) są umieszczone pomiędzy dwoma pierścieniami O-ring. Ciecz znajduje się pomiędzy membranami SiN, dzięki czemu jest oddzielona od próżni w mikroskopie elektronowym. Skupiona wiązka elektronów skanuje próbkę. Kontrast uzyskuje się z elektronów rozproszonych. Nanocząsteczki złota (AuNPs) są unieruchomione w cieczy przy membranie SiN, ale mogą również poruszać się w cieczy. (B)Schematyczny przekrój boczny stosu dwóch mikrochipów z pierścieniami O-ring. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/54943/54943fig1large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>

<table><tbody><tr><td>Lornetkowy mikroskop świetlny</td><td>Leica</td><td>M60 CMO</td><td></td></tr><tr><td>Skaningowy miroskop elektronowy transmisyjny z korektorem aberracji sferycznej</td><td>JEOL</td><td>ARM200F</td><td></td></tr><tr><td>Uchwyt na próbki TEM z przepływem cieczy</td><td>DENS Solutions</td><td>Ocean</td><td></td></tr><tr><td>Mikroprzepływowa pompa strzykawkowa</td><td>Harvard Scientific</td><td>PicoPlus</td><td></td></tr><tr><td>Środek do czyszczenia plazmy</td><td>Gatan</td><td>Solarus950</td><td></td></tr><tr><td>Chemicals</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Aceton, Rotisolv&nbsp; Plus dla HPLC</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>7328.2</td><td></td></tr><tr><td>Woda, chromasolv Plus dla HPLC</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>34877-2.5L</td><td></td></tr><tr><td>Etanol, Rotisolv HPLC klasy</td><td>Carl Roth</td><td>P076.2</td><td></td></tr><tr><td>Stabilizowany cytrynianem koloidu złota, średnica 30 nm</td><td>British-Biocell</td><td>EM. GC20</td><td></td></tr><tr><td>Materials</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Base silicon microchipy z membranami z azotku krzemu o grubości 50 nm i wymiarach 20 &mikro; m x 0,40 mm</td><td>DENS Solutions</td><td>for Ocean System</td><td></td></tr><tr><td>Dystansowe mikroczipy krzemowe z membranami z azotku krzemu o grubości 50 nm, wymiarach 20 i mikro; m x 0,40 mm i grubość dystansu 200 nm</td><td>Rozwiązania DENS</td><td>dla systemu</td><td></td>Ocean</tr><tr><td>Rurki mikroprzepływowe</td><td>Upchurch Scientific</td><td>1570</td><td></td></tr><tr><td>Plastikowe wymienne końcówki Pęseta</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>(antymagnetyczny, przeciwkwasowy korpus ze stali nierdzewnej z końcówkami ESD PVDF (SV</td><td>)) ideal-tek</td><td>2ASVR.SA</td><td></td></tr><tr><td>Pęseta ze stali giętej pokrytej teflonem (EMS SA z "PTFE" Powłoka)</td><td>Mikroskopia elektronowa Sciences</td><td>78322-7Te</td><td></td></tr><tr><td>Pęseta ze stali szerokodziobowej pokrytej teflonem (powłoka EMS 2A "PTFE")</td><td>Mikroskopia elektronowa Sciences</td><td>78322-2ATe</td><td></td></tr><tr><td>Strzykawka Hamiltona, 1 ml, gazoszczelna (Model 1001 TLLX SYR)</td><td>Hamilton</td><td>81323</td><td></td></tr><tr><td>Chusteczka do pomieszczeń czystych Sontara Micropure AP (224 x 224 mm)</td><td>DuPont</td><td>Sontara MicroPure</td><td></td></tr></tbody></table>

badanie procesów dynamicznych nano-rozmiarów obiektów w cieczy za pomocą skaningowej transmisyjnej mikroskopii elektronowej

Studying Dynamic Processes of Nano-sized Objects in Liquid using Scanning Transmission Electron Microscopy

Próbki w pełni zanurzone w cieczy mogą być badane w nanoskali w rozdzielczości przestrzennej za pomocą skaningowej transmisyjnej mikroskopii elektronowej (STEM) przy użyciu komory mikroprzepływowej umieszczonej w uchwycie próbki do transmisyjnej mikroskopii elektronowej (TEM) i STEM. System mikroprzepływowy składa się z dwóch mikroprocesorów krzemowych podtrzymujących cienkie okienka membranowe z azotku krzemu (SiN). W tym artykule opisano podstawowe kroki ładowania próbki i pozyskiwania danych. Najważniejsze jest upewnienie się, że komora na ciecz jest prawidłowo zmontowana, zapewniając w ten sposób cienką warstwę cieczy i uszczelnienie próżniowe. Protokół ten zawiera również szereg testów niezbędnych do wykonania podczas ładowania próbki w celu zapewnienia prawidłowego montażu. Po załadowaniu próbki do mikroskopu elektronowego należy zmierzyć grubość cieczy. Nieprawidłowy montaż może spowodować, że ciecz będzie zbyt gęsta, podczas gdy zbyt rzadka ciecz może wskazywać na brak płynu, na przykład gdy tworzy się pęcherzyk. Na koniec protokół wyjaśnia, w jaki sposób wykonywane są obrazy i jak można badać procesy dynamiczne. Próbka zawierająca AuNPs jest obrazowana zarówno w czystej wodzie, jak i w soli fizjologicznej.

Do badania zachowania AuNP w cieczy wykorzystano uchwyt TEM do przepływu cieczy. AuNP zostały stabilnie unieruchomione na membranie SiN w czystej wodzie i obrazowano je z rozdzielczością nanometryczną przy użyciu STEM w fazie ciekłej (Rysunek 6). Uzyskano doskonały kontrast dla silnie rozpraszającego złota. Gęstość prądu na ekranie fosforyzującym zmierzona dla suchej próbki testowej wynosiła 20 pA/cm², natomiast przy włożonym uchwycie TEM do przepływu cieczy wyniosła 8 pA/cm². Korzystając z Równania 1, twater = 2.4 ±0.5 µm, co jest wartością znacznie większą niż oczekiwano na podstawie grubości dystansera wynoszącej 200 nm. Niemniej jednak grubość ta nie jest zbyt duża, aby obrazować AuNP z nanometryczną rozdzielczością przestrzenną. Warstwa cieczy była grubsza niż 200 nm wyznaczone przez dystanser ze względu na wybrzuszenia membran SiN, nierówności mikrochipów oraz zanieczyszczenia znajdujące się na mikrochipach.
W przypadku czystej wody AuNPs zachowują swój kształt podczas obrazowania16, choć reaktywne produkty radiolizy (e-aq, H•, H+, OH•) powstające w wyniku oddziaływania wiązki elektronów z wodą mogą utleniać pojedyncze atomy złota, co prowadzi do zmiany kształtu AuNPs15. Jednakże, gdy w drugim eksperymencie zastosowano system przepływu cieczy do wprowadzenia jonów chlorkowych, zmieniła się stabilność AuNPs. Jony chlorkowe są w stanie stabilizować utlenione atomy złota w formie tetrachloroaureinianu, AuCl4-. Rysunek 7 pokazuje, że AuNPs powoli rozpuszczały się podczas serii obrazowania STEM w czasie, podobnie jak w wynikach raportowanych wcześniej16. Przy zastosowanej gęstości dawki elektronów rozpuszczenie AuNPs o rozmiarze 30 nm trwało ~300 s.
Ruchy AuNP w wodzie zbadano w trzecim eksperymencie (Rycina 8). Przed eksperymentem uchwyt TEM do przepływu cieczy został oczyszczony w celu usunięcia wszelkich śladów soli. W przeciwieństwie do pierwszego eksperymentu, zastosowano alternatywne podejście do przygotowania próbki, aby uzyskać słabsze przytwierdzenie AuNP do membrany SiN14. W tym eksperymencie roztwór AuNP naniesiono na krzemowy mikroczip i zamontowano w uchwycie TEM do przepływu cieczy, nie dopuszczając do wyschnięcia roztworu. W ten sposób AuNP łatwo odrywały się od membrany SiN podczas obrazowania przy zastosowanej dawce promieniowania. Niektóre AuNP oddaliły się z pola widzenia do objętości roztworu, natomiast pozostałe AuNP pozostały w polu widzenia w bezpośrednim sąsiedztwie okna SiN. Obserwowano ruchy tych AuNP, które ostatecznie uległy aglomeracji. Po pewnym czasie aglomeraty te również odłączyły się od membrany SiN i przemieściły się poza pole widzenia do roztworu.
<img alt="Agregacja nanocząsteczek, obraz z mikroskopu elektronowego, pasek skali 100 nm, badanie z zakresu inżynierii materiałowej." src="/files/ftp_upload/54943/54943fig6.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 6"> 
Rysunek 6: Mikrografia z transmisyjnego mikroskopu elektronowego z detekcją skanującą (STEM) nanocząsteczek AuNPs o średnicy 30 nm na powierzchni warstwy czystej wody. Przedstawiony obraz jest wybranym obszarem obrazu oryginalnego. Rozmiar obrazu wynosił 1 024 x 1 024 piksele, czas ekspozycji piksela wynosił 19 µs, rozmiar piksela wynosił 0,73 nm, a powiększenie wynosiło 400 000X. Dawka elektronów wynosiła zatem 7,1 x 104 e-/nm². Gęstość prądu zmierzona na ekranie fluorescencyjnym wynosiła 8 pA/cm2, zatem obliczono, że grubość cieczy wynosiła 2,4 µm. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/54943/54943fig6large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Mikroskopia poklatkowa agregacji nanocząsteczek w ciągu 90 sekund; pasek skali 60 nm." src="/files/ftp_upload/54943/54943fig7.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 7"> 
Rycina 7: Seria poklatkowa mikrografii STEM AuNP w soli fizjologicznej. (A-D) Obrazy wyodrębnione z serii obrazów STEM wykonanych w odstępach 30 s. AuNP stopniowo rozpuszczają się w cieczy w wyniku obecności jonów chlorkowych. Czas przebywania wiązki na pikselu wynosił 2 µs, czas klatki w serii poklatkowej wynosił 1,75 s, rozmiar piksela wynosił 0,44 nm, a powiększenie wynosiło 500 000X. Dawka elektronów na obraz wynosiła 1,2 x 104 e-/nm². Grubość cieczy wynosiła 2,4 µm. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/54943/54943fig7large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Dynamiczne śledzenie cząstek w mikroskopii; panel A: ścieżki ruchu cząstek, panel B: kolorowe trajektorie." src="/files/ftp_upload/54943/54943fig8.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 8"> 
Rysunek 8: Mikrografia STEM AuNP przemieszczających się w czystej wodzie. (A) Membrana SiN z AuNP, z których kilka zostało zaznaczone strzałkami. (B) Ścieżki ruchu wybranych AuNP (patrz A). Niektóre AuNP opuściły pole widzenia w czasie obrazowania. Pozostałe AuNP poruszają się bocznie wzdłuż membrany SiN i zaczynają aglomerować. Po osiągnięciu krytycznego rozmiaru klastra odrywają się od membrany i oddalają od pola widzenia. Czas przebywania na pikselu wynosił 1 µs, czas klatki 0,52 s, rozmiar piksela 1,8 nm, a powiększenie 120 000X. Dawka elektronów na obraz wynosiła 3,5 x 102 e-/nm², a grubość cieczy 2,4 µm. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/54943/54943fig8large.jpg" target="_blank">Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>

Ten protokół opisuje działanie uchwytu na próbki przepływu cieczy do skanowania transmisyjnej mikroskopii elektronowej AuNPs w wodzie, używanej do obserwacji dynamicznych procesów w nanoskali.

Badanie procesów dynamicznych nano-rozmiarów obiektów w cieczy za pomocą skaningowej transmisyjnej mikroskopii elektronowej

Samples fully embedded in liquid can be studied at a nanoscale spatial resolution with Scanning Transmission Electron Microscopy (STEM) using a ...

Ogólnym celem skaningowej transmisyjnej mikroskopii elektronowej w fazie ciekłej jest obserwacja struktur i zjawisk zachodzących w nanomateriałach w próbkach biologicznych całkowicie osadzonych w warstwie cieczy o grubości do kilku mikrometrów. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie materiałoznawstwa, takie jak zachowanie nanomateriałów w cieczy i badanie próbek biologicznych w naturalnym środowisku ciekłym. Główną zaletą tej techniki jest to, że dostarcza ona informacji morfologicznych w nanoskali o próbkach w cieczy.Ogólnie rzecz biorąc, osoby, które są nowe w tej metodzie, będą miały trudności, ponieważ ładowanie uchwytu próbki i akwizycja obrazu nie są tak proste, jak po raz pierwszy wykonane za pomocą mikroskopii elektronowej. Aby rozpocząć procedurę, w czystym okapie z przepływem laminarnym wyczyść szklane szkiełko mikroskopowe z lekkiej chusteczki bezwłóknistej i czystego etanolu. Umieść szkiełko na chusteczce higienicznej w pomieszczeniu czystym na szalce Petriego z pokrywką.Aby manipulować mikroczipami SiN, za pomocą pęsety pokrytej węglem, chwyć mikroczip mocno, ale ostrożnie za dłuższe boki, trzymając membranę SiN przez cały czas skierowaną do góry. Korzystając z tej techniki, umieść na szkiełku podstawowym pięć mikroczipów bez przekładki i pięć mikroczipów z przekładką 200 nanometrów. Zamknij szalkę Petriego i umieść mikroczipy pod wyciągiem.Umieść mikroczipy w zlewce z acetonem klasy HPLC membraną do góry. Delikatnie obracaj zlewką przez dwie minuty, aby usunąć powłokę ochronną, uważając, aby nie przewrócić mikroczipów. Następnie szybko przenieś mikroczipy do zlewki z czystym etanolem.Przykryj zlewkę folią aluminiową. Delikatnie obracaj zlewką przez dwie minuty, aby zakończyć usuwanie powłoki i przenieś ją na zamkniętej szalce Petriego do okapu z przepływem laminarnym. Umieść mikroczipy na świeżej chusteczce w pomieszczeniu czystym, uważając, aby nie przewrócić mikroczipów podczas ich uwalniania z pęsety.Pozostaw mikroczipy do wyschnięcia na kilka minut. A następnie umieść mikroczipy na szklanym szkiełku na szalce Petriego. Zamknij szalkę Petriego i przynieś mikroczipy do myjki plazmowej.Umieść szkiełko podstawowe i mikroczipy w urządzeniu do czyszczenia plazmowego i uruchom pięciominutowy program czyszczenia, aby usunąć węglowodory z membrany SiN. Za pomocą mikroskopu świetlnego sprawdź mikroczipy pod kątem pękniętych membran lub cząstek brudu. Wyrzuć uszkodzone lub brudne mikroczipy.W okapie z przepływem laminarnym unieruchomić mikroczipy w czystym pudełku transportowym z lepką powierzchnią wewnętrzną. Nałóż jedną mikrolitrową kroplę trzymolowego stabilizowanego cytrynianem wodnego roztworu nanocząstek złota na membranę SiN każdego mikrochipa bez przekładki i pozostaw roztwór do wyschnięcia. Następnie nałóż jeden mikrolitr wody dejonizowanej na membranę, aby zmyć sól i środki powierzchniowo czynne.Po 30 sekundach użyj bibuły filtracyjnej, aby ostrożnie zetrzeć wodę i pozostaw mikroczipy do wyschnięcia. Umieść końcówkę uchwytu TEM przepływu cieczy pod mikroskopem dwuokularowym. Zdejmij tytanową pokrywkę z końcówki uchwytu i umieść ją na arkuszu folii aluminiowej.Ustaw mikroprzepływową pompę strzykawkową z jednomililitrową szklaną strzykawką zawierającą 0,5 mililitra wody klasy HPLC. Podłączyć strzykawkę do systemu przepływu i uruchomić pompę. Gdy woda jest przepłukiwana przez system, sprawdź przewody pod kątem wycieków lub zwężeń przepływu.Po zakończeniu odciągania usuń płukanie z komory na ogniwa cieczy i osusz końcówkę uchwytu bibułą filtracyjną. Sprawdź końcówkę uchwytu za pomocą mikroskopu świetlnego. Osusz końcówkę chusteczką do pomieszczeń czystych i usuń kurz lub włókna czystą pęsetą pokrytą PTFE.Sprawdź pokrywę końcówki uchwytu, O-ring i, a następnie usuń kurz lub włókna za pomocą pęsety pokrytej PTFE. Umieść O-ring w grupach uchwytów. Wkręć pierwszą i przekręć ją kilka razy, aby po prostu została.Za pomocą czystej, zakrzywionej pęsety umieść mikroczip próbki w kieszeni końcówki uchwytu z membraną SiN skierowaną do góry. Użyj mikroskopu światła lornetki, aby sprawdzić, czy mikroczip jest prawidłowo osadzony. Umieść kroplę czystej przefiltrowanej wody o pojemności 0,3 mikrolitra na próbce mikroczip.Przytrzymywanie mikroczipa na miejscu za pomocą pęsety. Następnie podnieś mikroczip dystansowy z zakrzywioną pęsetą trzymaną do góry nogami. Ostrożnie obróć pęsetę tak, aby membrana mikroczipa była skierowana w dół.Umieść mikroczip dystansowy na mikrochipie próbki. Umieść materiał odbijający światło pod końcówką uchwytu i sprawdź wyrównanie mikroczipa pod mikroskopem światła lornetki. Użyj pęsety, aby ostrożnie wyregulować mikroczipy, jeśli okienka SiN nie są wyrównane.Następnie podnieś pęsetą pokrywę komory na próbkę. Odwróć pokrywę do góry nogami i nie dotykając mikroczipów, oprzyj tylną stronę pokrywy na końcówce uchwytu. Umieść pozostałą za pomocą pęsety i dokręć obie w sposób iteracyjny.Dokręć ostrożnie, aż napotkają opór. Szyby mogą łatwo pęknąć, jeśli dokręcenie jest zbyt mocne. Uruchom przepływ cieczy w ilości czterech mikrolitrów na minutę przez system i sprawdź, czy nie ma wycieków w końcówce uchwytu.Następnie przynieś uchwyt do stacji pomp próżniowych i przeprowadź kontrolę szczelności. Upewnij się, że ciśnienie osiągnie co najmniej 10 do minus piątego mbar w ciągu pięciu minut. Umieść uchwyt w obudowie.I przynieś uchwyt do mikroskopu elektronowego. Ustaw mikroskop w trybie STEM. Zmierz gęstość prądu wiązki elektronów za pomocą cienkiej warstwy węgla pokrytej nanocząstkami złota jako próbki referencyjnej bez wody.Rozpocznij przepływ czystej wody z szybkością nie większą niż dwa mikrolitry na minutę. Włóż uchwyt TEM przepływu cieczy do zamka obciążenia podciśnieniowego i rozpocznij opróżnianie. Upewnij się, że ciśnienie spada normalnie.A następnie włóż uchwyt TEM całkowicie do mikroskopu. Gdy ciśnienie jest wystarczająco niskie, otwórz zawór belki i włóż detektor ADF. Ustaw mikroskop w trybie akwizycji ciągłej i przesuń stolik próbki w kierunkach X i Y, aby znaleźć okno SiN.Dostosuj kontrast i jasność tak, aby krawędzie okna były wyraźnie widoczne. Przesuń stół montażowy w kierunkach X i Y tak, aby róg okna znajdował się w środku pola widzenia. Następnie zresetuj soczewkę obiektywu.Dostosuj pionowe położenie stolika na próbkę, aby zgrubnie ustawić ostrość rogu. Przechyl stolik o pięć stopni do przodu i do tyłu, aby sprawdzić, czy próbka znajduje się na wysokości eucentrycznej. Wyśrodkuj róg okna w polu view, a następnie zapisz pozycję sceny w oprogramowaniu.Przesuń stolik w kierunkach X i Y, aż nanocząstki złota będą widoczne. A następnie ustaw ostrość obiektywu. Zanotuj aktualną gęstość i oblicz grubość komórki cieczy.Przesuń stolik w kierunkach X i Y, aby zlokalizować obszar z co najmniej 20 nanocząstkami złota. Ustaw parametry i uzyskaj obraz. Nanocząstki złota są unieruchamiane na membranie z azotku krzemu i obrazowane za pomocą STEM w fazie ciekłej.W czystej wodzie nanocząstki złota zachowały swój kształt przez cały okres obrazowania. Produkty radiolizy z wody mogą utleniać pojedyncze atomy złota, co ostatecznie może zmienić kształt nanocząstek. W innym eksperymencie jony chlorkowe wprowadzamy do fazy ciekłej.Nanocząstki złota powoli rozpuszczały się w eksperymencie, gdy utlenione atomy złota tworzyły rozpuszczalny tetrachloroaureat. Aby zbadać ruchy nanocząstek złota w wodzie, w kolejnym eksperymencie nanocząstki nie były w pełni unieruchomione na membranie próbki. Nanocząstki złota aglomerowały się i po osiągnięciu krytycznej wielkości klastra zniknęły z pola widzenia.Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w ciągu dwóch godzin, jeśli jest wykonywana prawidłowo. Wymagane będzie kilkutygodniowe szkolenie. Podejmując się tego zabiegu, należy pamiętać o spokojnej pracy i sprawdzaniu szczelności próżni oraz gęstości cieczy.Po jej opracowaniu technika ta utorowała drogę naukowcom zajmującym się materiałoznawstwem, chemią i biologią do badania wzrostu i ruchu nanocząstek w cieczy, struktury materiałów w nanoskali w środowisku ciekłym oraz funkcjonalności białek w komórkach ssaków. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak przeprowadzać skaningową transmisyjną mikroskopię elektronową nanocząstek złota osadzonych w warstwie wody, w tym prawidłowe obciążenie uchwytu próbki i regulację mikroskopu. Nie zapominaj, że praca z cieczą w mikroskopie elektronowym może spowodować uszkodzenie, jeśli uchwyt próbki nie zostanie prawidłowo załadowany.Dlatego ważne jest, aby przed załadowaniem sprawdzić, czy nie ma wycieków podciśnienia.

studying-dynamic-processes-nano-sized-objects-liquid-using-scanning

Research

JoVE Journal

Engineering

Inżynieria

Opracowaliśmy niezależną komórkę cieczową, która umożliwia obrazowanie przez ciecze za pomocą transmisyjnego mikroskopu elektronowego. Dynamiczne procesy zachodzące w nanocząstkach w cieczach mogą być ujawniane w czasie rzeczywistym z rozdzielczością subnanometrową.

Odkrywanie dynamicznych procesów materiałów w cieczach za pomocą mikroskopii elektronowej transmisji komórek ciekłych

Tutaj opisujemy procedurę obrazowania kompleksów wirusowych w cieczy w rozdzielczości nanometrowej za pomocą transmisyjnego mikroskopu elektronowego.

In situ TEM zespołów biologicznych w cieczy

Tutaj wprowadzamy eksperymentalne protokoły obserwacji procesu samoorganizacji w czasie rzeczywistym za pomocą mikroskopii elektronowej transmisyjnej komórki cieczowej.

Mikroskopia elektronowa transmisyjna z ciekłymi komórkami do śledzenia samoorganizacji nanocząstek

Demonstrujemy całkowicie elektroniczną metodę obserwacji dynamiki ładunków nanosekundowych domieszek atomów w krzemie za pomocą skaningowego mikroskopu tunelowego.

W pełni elektroniczna skaningowa mikroskopia tunelowa z nanorozdzielczością: ułatwiająca badanie dynamiki ładunku pojedynczej domieszki

Tutaj prezentujemy protokół do badania struktury i dynamiki wody międzyfazowej w skali atomowej, pod kątem obrazowania w rozdzielczości submolekularnej, manipulacji molekularnej i spektroskopii wibracyjnej pojedynczych wiązań.

Badanie struktury i dynamiki wody międzyfazowej za pomocą skaningowej mikroskopii tunelowej i spektroskopii

Mikroskopia elektronowa z ciekłych komórek grafenowych może być używana do obserwacji dynamiki nanokryształów w środowisku ciekłym z większą rozdzielczością przestrzenną niż inne techniki mikroskopii elektronowej w ciekłych komórkach. Wytrawianie gotowych nanokryształów i śledzenie ich kształtu za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej z ciekłymi ogniwami grafenowymi może dostarczyć ważnych informacji mechanistycznych na temat przemian nanocząstek.

Wykorzystanie mikroskopii elektronowej transmisji ciekłych komórek grafenowych do badania trawienia nanokryształów in situ

Używamy skaningowego transmisyjnego mikroskopu elektronowego z korekcją aberracji, aby zdefiniować jednocyfrowe wzorce nanometrowe w dwóch powszechnie stosowanych rezystancjach wiązki elektronów: poli (metakrylan metylu) i silseskwioksan wodoru. Wzory rezystancji mogą być powielane w wybranych materiałach docelowych z jednocyfrową dokładnością nanometrową przy użyciu liftoffu, trawienia plazmowego i infiltracji odporności przez metaloorganiczne.

Litografia wiązką elektronów w jednocyfrowych nanometrach z skaningowym transmisyjnym mikroskopem elektronowym z korekcją aberracji

Techniki kriogenicznej skupionej wiązki jonów (FIB) i skaningowej mikroskopii elektronowej (SEM) mogą dostarczyć kluczowych informacji na temat chemii i morfologii nienaruszonych granic faz ciało stałe-ciecz. Szczegółowo omówiono metody sporządzania wysokiej jakości map spektroskopowych takich interfejsów z dyspersją energii (EDX), ze szczególnym uwzględnieniem urządzeń do magazynowania energii.

Charakterystyka granic faz ciecz-ciało stałe w nanoskali poprzez sprzężenie kriofokusowego mielenia wiązki jonów ze skaningową mikroskopią elektronową i spektroskopią

Kontrola temperatury podczas eksperymentów z mikroskopią elektronową w fazie ciekłej otwiera nowe perspektywy badania dynamiki nanocząstek w środowiskach ciekłych, naśladując ich powstawanie lub stosowanie mediów. Korzystając z niedawno opracowanych ogniw cieczy grzewczej, bezpośrednio obserwowaliśmy wpływ temperatury na procesy zarodkowania i wzrostu nanocząstek złota w wodzie.

Badanie wpływu temperatury na zarodkowanie i wzrost nanocząstek za pomocą mikroskopii elektronowej transmisji ciekłych komórek

Obecny protokół opisuje modyfikacje transmisyjnego mikroskopu elektronowego (TEM) z systemem oświetlenia świetlnego, wytwarzanie komórek płynnych oraz obserwacje in situ TEM indukowanych światłem interakcji między komórkami bakteryjnymi a fotosensybilizatorem. Omówiono również metody przygotowania próbek, uszkodzenia wiązki elektronów i obrazowanie.

Indukowana światłem transmisyjna mikroskopia elektronowa in situ do obserwacji oddziaływania ciecz-miękka materia

Tutaj prezentujemy protokół wykorzystujący oprogramowanie do widzenia maszynowego do stabilizacji dynamicznych procesów podczas obrazowania TEM, przy jednoczesnym indeksowaniu wielu strumieni metadanych do każdego obrazu na osi czasu, w której można nawigować. Pokazujemy, w jaki sposób platforma ta umożliwia automatyczną kalibrację i mapowanie dawki elektronów w trakcie eksperymentu.

Podejście oparte na widzeniu maszynowym do procesów pracy związanych z transmisyjną mikroskopią elektronową, analizą wyników i zarządzaniem danymi

Poznaj skaningową transmisyjną mikroskopię elektronową w fazie ciekłej do obserwacji nanomateriałów w środowisku wodnym. Ta metoda umożliwia badanie dynamicznych procesów nanorozmiarowych obiektów w cieczach.

Badanie procesów dynamicznych nano-rozmiarów obiektów w cieczy za pomocą skaningowej transmisyjnej mikroskopii elektronowej

Przeglądaj więcej filmów