Protokół szybkiej pośmiertnej hodowli komórkowej rozlanego wewnętrznego glejaka mostu (DIPG)
March 7th, 2017
Ten protokół opisuje metodę szybkiego przetwarzania pośmiertnego rozlanego wewnętrznego glejaka mostu w celu stworzenia modeli hodowli komórkowych pochodzących od pacjenta lub bezpośredniej charakterystyki komórek nowotworowych i mikrośrodowiskowych.
Ogólnym celem tego protokołu szybkiej pośmiertnej hodowli komórek jest wygenerowanie trwałych, pochodzących od pacjenta kultur komórkowych rozlanego glejaka mostu, aby ułatwić eksperymenty niezbędne do zrozumienia i ostatecznie opracowania skutecznych terapii DIPG. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania dotyczące podstawowej biologii i strategii terapeutycznych rozlanego glejaka mostu, takie jak to, czy niektóre leki działają w różnych kulturach pochodzących od pacjentów. Główną zaletą tej techniki jest to, że umożliwia bezpośrednie badanie biologii komórek pochodzących od pacjenta.
Implikacje tej techniki rozciągają się na terapię DIPG, ponieważ pozwala ona na testowanie różnych strategii terapeutycznych w różnych podtypach genetycznych choroby. Chociaż ta metoda może zapewnić wgląd w DIPG, może być również stosowana do innych chorób, takich jak inne glejaki wysokiego stopnia u dzieci, glejaki u dorosłych lub inne nowotwory ośrodkowego układu nerwowego. Ogólnie rzecz biorąc, osoby, które dopiero zaczynają przygodę z tą techniką, będą miały trudności, ponieważ trudno jest pozyskać i szybko przetworzyć próbki autopsyjne w efektywny sposób.
Przed przygotowaniem próbki wysterylizuj kaptur do hodowli tkankowych wraz z żyletkami, zakrzywionymi hemostatykami i innymi niesterylnymi narzędziami w świetle UV przez godzinę i wykonaj wszystkie poniższe czynności w sterylnych warunkach. Następnie przenieś tkankę do wysokościennego naczynia do hodowli komórek o wymiarach 100 milimetrów na 20 milimetrów. Usuń pożywkę pozostałą po wysyłce i zastąp ją 10 do 15 mililitrami zimnej pożywki hodowlanej.
Następnie, używając zakrzywionych hemostatów do chwycenia żyletki, drobno zmiel tkankę, usuwając naczynia krwionośne lub opony mózgowe. Końcowe fragmenty tkanki powinny być mniejsze niż jeden milimetr. Następnie przenieś tkankę do czystej stożkowej rurki o pojemności 50 mililitrów.
Umyć naczynie do hodowli komórkowych dodatkowymi pięcioma mililitrami zimnej pożywki hodowlanej i przenieść próbkę do stożkowej probówki. W razie potrzeby powtórz ten etap mycia, aby przenieść pozostałą tkankę. Za pomocą 10-mililitrowej pipety serologicznej delikatnie rozcieraj próbkę cztery do pięciu razy.
Pozwól, aby większe fragmenty tkanki osiadły na dnie probówki. W razie potrzeby krótko odwirować próbkę przez jedną minutę. Aby zebrać zdysocjowaną frakcję, usuń supernatant i przefiltruj przez filtr 100 mikronów do nowej 50-mililitrowej stożkowej rurki oznaczonej dysocjacją mechaniczną.
Odwróć filtr nad oryginalną stożkową rurką i umyj go pożywką hodowlaną, aby odzyskać fragmenty tkanki. Następnie odwirować mechaniczną frakcję dysocjacyjną przez pięć minut. Następnie usunąć supernatant z granulowanej frakcji dysocjacji mechanicznej i ponownie zawiesić tkankę w zimnej pożywce hodowlanej.
Jeśli w stożkowej rurce do dysocjacji mechanicznej znajduje się więcej niż pięć mililitrów tkanki, podziel tkankę na inne 50-mililitrowe stożkowe rurki tak, aby żadna rurka nie zawierała więcej niż pięć mililitrów tkanki. Następnie należy przechowywać mechanicznie zdysocjowaną frakcję na lodzie do momentu etapu wirowania w gradiacji sacharozy. W tej procedurze należy odwirować stożkową probówkę zawierającą pozostałe fragmenty tkanki przez pięć minut.
Następnie usuń sklarowany osad i dodaj wstępnie podgrzany roztwór do trawienia enzymatycznego, tak aby na każdy mililitr tkanki przypadało pięć mililitrów roztworu trawiącego. Następnie uszczelnij stożkową pokrywę probówki folią laboratoryjną i inkubuj reakcję na rotatorze w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 30 minut. Po inkubacji próbki należy delikatnie rozcierać.
Używając 10-mililitrowej pipety serologicznej, pipetuj próbkę w górę iw dół od sześciu do ośmiu razy, unikając generowania nadmiernych pęcherzyków powietrza. Następnie dodaj końcówkę pipety o pojemności 1 000 mikrolitrów na końcu pipety i rozcieraj próbkę przez dodatkowe sześć do ośmiu razy. Pozwól, aby pozostałe kawałki osiadły na dnie tuby.
Następnie usuń i przefiltruj supernatant z komórkami nadal zawieszonymi przez filtr 100 mikronów do nowej 50-mililitrowej stożkowej rurki oznaczonej dysocjacją enzymatyczną i przechowuj ją na lodzie. Następnie odwiruj enzymatyczną probówkę dysocjacyjną przez pięć minut i kontynuuj wirowanie w gradiacji sacharozy. Jeśli próbka jest nadal zawieszona w roztworze, odwirować ją przez pięć minut.
Następnie usuń supernatant i ponownie zawieś tkankę w 20 mililitrach zimnego HBSS bez wapnia i magnezu. Następnie zwiększ objętość do 25 mililitrów zimnym HBSS. Powoli dodaj 25 mililitrów 1,8-molowego roztworu sacharozy i odwróć probówkę, aby wymieszać.
Daje to gradient sacharozy 0,9 molowej. Następnie odwirować próbkę bez przerwy przez 10 minut. Ostrożnie odessać resztki mieliny w jak największej ilości roztworu sacharozy i sacharozy.
Następnie umyj próbkę, dodając 30 mililitrów zimnego HBSS bez wapnia i magnezu i delikatnie mieszając. Następnie odwiruj go przez pięć minut. W tej procedurze usuń supernatant do mycia.
Dodaj pięć mililitrów buforu do lizy ACK i delikatnie ponownie zawiesić osad komórkowy, obracając probówkę przez jedną minutę w temperaturze pokojowej. Następnie ugasić lizę, dodając 30 mililitrów zimnego HBSS bez wapnia i magnezu. Następnie odwiruj go przez pięć minut.
Ponownie zawiesić końcową osadkę komórkową w 10 do 15 mililitrach ciepłego kompletnego TSM z czynnikami wzrostu i określić ilościowo gęstość żywotnych komórek na hemocytometrze, stosując wykluczenie błękitu trypanowego. Następnie przenieść ostatnią zawiesinę komórek do nowej kolby hodowlanej T75. Dodawaj dodatkowe czynniki wzrostu co drugi dzień, aby utrzymać ogólny poziom czynnika wzrostu i monitorować rozwój neurosfer komórek nowotworowych.
Oto różne przykłady tego, jak próbki mogą wyglądać od wczesnych etapów hodowli do trwałej kultury. Początkowo posiew i wczesne hodowle często nie wydają się zawierać wielu ocalałych komórek. Co więcej, wczesne skupiska komórek często nie wykazują stopnia kontrastu typowego dla neurosfer.
Jednak początkowe przejście tych klastrów komórkowych, w połączeniu z odwrotnym filtrowaniem klastrów komórkowych, może wyizolować zdrowe komórki nowotworowe, które są w stanie tworzyć kule. Przesącz zazwyczaj zawiera resztki zanieczyszczeń. Te próbki pochodzące od pacjentów mogą być następnie utrzymywane w kulturze przez wiele pasaży.
Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w ciągu trzech do czterech godzin, jeśli zostanie wykonana prawidłowo. Podczas próby wykonania tej procedury ważne jest, aby upewnić się, że próbka jest utrzymywana w niskiej temperaturze na każdym etapie z wyjątkiem dysocjacji enzymatycznej i zminimalizować traumatyczne obchodzenie się z próbką. Po tej procedurze można przeprowadzić dodatkowe badania, takie jak badania przesiewowe leków in vitro lub ksenograf ortotopowy, aby odpowiedzieć na kolejne pytania dotyczące patobiologii DIPG.
Po opracowaniu, ta technika hodowli utorowała drogę naukowcom w dziedzinie neuroonkologii dziecięcej do zbadania nowych ścieżek terapeutycznych dla dzieci z DIPG. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś mieć dobry pomysł na to, jak wykonać szybkie protokoły pośmiertnej hodowli komórek na próbkach guza mózgu. Nie zapominaj, że praca z tkankami ludzkimi może być niebezpieczna i zawsze należy stosować środki ostrożności, takie jak noszenie środków ochrony osobistej i sterylna technika.
Przegląd
Ten protokół opisuje metodę szybkiego przetwarzania próbek dyfuzyjnego guza śródmózgowia po śmierci, aby utworzyć modele kultur komórkowych pochodzących od pacjenta. Ta technika ułatwia badanie biologii guza i strategii terapeutycznych.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauki
- Onkologia
- Biologia komórki
Tło
- Dyfuzyjny guz śródmózgowia (DIPG) jest wyzwaniem dla pediatrycznych guzów mózgu.
- Zrozumienie biologii DIPG jest kluczowe dla opracowywania skutecznych terapii.
- Kultury komórek pochodzące od pacjenta mogą dostarczyć wglądu w zachowanie guza.
- Ta metoda może być również zastosowana do innych guzów wysoko złośliwych i guzów OUN.
Cel badania
- Generowanie trwałych kultur komórkowych pochodzących od pacjenta z DIPG.
- Ułatwienie eksperymentów mających na celu zrozumienie biologii DIPG.
- Testowanie strategii terapeutycznych w różnych podtypach genetycznych.
Zastosowane metody
- Przetwarzanie próbek po śmierci w warunkach sterylnych.
- Mechaniczne i enzymatyczne dysocjacja próbek tkankowych.
- Centryfugacja gradientowa sacharozowa do separacji komórek.
- Utrzymanie kultur komórkowych z czynnikami wzrostu.
Główne wyniki
- Skuteczna generacja kultur komórkowych pochodzących od pacjenta.
- Wgląd w biologię DIPG i potencjalne odpowiedzi terapeutyczne.
- Wykazana możliwość zastosowania do innych guzów OUN.
Wnioski
- Ten protokół umożliwia bezpośrednie badanie komórek DIPG pochodzących od pacjenta.
- Stanowi platformę do testowania różnych strategii terapeutycznych.
- Przyszłe zastosowania mogą obejmować inne dziecięce i dorosłe guzy mózgu.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
This protocol addresses the critical need for physiologically relevant models in pediatric oncology by enabling rapid generation of patient-derived DIPG cultures from post-mortem tissue. It supports target validation and preclinical de-risking by providing a scalable system to evaluate therapeutic response across genetic subtypes. The method enhances translational continuity from discovery to lead identification by supplying durable cultures for mechanistic and phenotypic screening.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses using patient-derived cells that retain tumor-specific biology.
- Operational Value: Provides a renewable source of DIPG cells for functional target validation and pathway analysis.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by allowing drug response comparison across genetically distinct cultures.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates dissociated cell suspensions suitable for FACS isolation and downstream molecular profiling.
- Operational Value: Standardizes sample preparation to produce consistent inputs for high-throughput screening platforms.
- Scalability: Enables production of sufficient cell numbers for multi-well assay formats and dose-response testing.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Maintains tumor-derived neurosphere-forming capacity, preserving key pathobiological features for preclinical modeling.
- Operational Value: Facilitates orthotopic xenograft establishment for in vivo efficacy and pharmacokinetic studies.
- Translational Alignment: Bridges discovery findings to preclinical validation through continuous culture passaging.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the early discovery continuum, supplying validated biological systems for lead identification and preclinical evaluation. It enables hypothesis-driven screening and supports go/no-go decisions through quantitative, reproducible outputs.
- Discovery Biology: Supports mechanistic de-risking by allowing direct testing of drug effects on patient-derived DIPG cells.
- Screening: Delivers standardized, viable cell suspensions ready for compound library screening and target engagement assays.
- Analytics: Enables quantification of viable cell density and neurosphere formation as phenotypic readouts for compound screening.
- Translational Research: Provides a continuous culture system that maintains tumor properties for longitudinal preclinical studies.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for generating CNS tumor models applicable to multiple therapeutic programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence by reducing reliance on non-predictive cell lines and enhancing biological relevance.
- Operational Value: Ensures reproducibility through standardized dissociation, filtration, and centrifugation steps under sterile conditions.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by enabling early elimination of ineffective compounds using patient-relevant models.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted advancement by generating efficacy data across multiple DIPG genetic subtypes.
Implementation Considerations
- Requires expertise in sterile tissue handling and enzymatic dissociation techniques.
- Depends on access to post-mortem tissue and rapid processing infrastructure to maintain sample viability.
- Necessitates standardized protocols across teams to ensure culture consistency and comparability of results.
- Involves adaptation considerations when applying the protocol to other CNS tumor types with differing tissue characteristics.
- Limited by the difficulty in procuring and rapidly processing autopsy samples, which affects throughput and accessibility.
