Name: Protokół szybkiej pośmiertnej hodowli komórkowej rozlanego wewnętrznego glejaka mostu (DIPG) (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-03-07T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 46 s
Description: Poznaj protokół szybkiej pośmiertnej hodowli komórkowej rozlanego wewnętrznego glejaka mostu (DIPG). Ta metoda umożliwia bezpośrednie badanie biologii komórek pochodzących od pacjenta i testowanie strategii terapeutycznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy dziękują za wsparcie ze strony Fundacji McKenna Claire, Narodowego Instytutu Zaburzeń Neurologicznych i Udaru Mózgu (NINDS K08NS070926 i R01NS092597), Departamentu Obrony (NF140075), Kalifornijskiego Instytutu Medycyny Regeneracyjnej (CIRM RB4-06093 i RN3-06510), Fundacji Alex's Lemonade Stand, Fundacji The Cure Starts Now i DIPG Collaborative, Fundacji Lyla Nsouli, Unravel Pediatric Cancer, Childhood Brain Tumor Foundation, Matthew Larson Foundation, V Foundation, Godfrey Family Fund in Memorial of Fiona Penelope, Wayland Villars DIPG Foundation, Dylan Jewett, Connor Johnson, Zoey Ganesh, Dylan Frick, Abigail Jensen i Jennifer Kranz Memorial Funds, N8 Foundation, Virginia and D.K. Ludwig Fund for Cancer Research, Child Health Research Institute w Stanford Anne T. and Robert M. Bass Endowed Faculty Scholarship in Pediatric Cancer and Blood Diseases.

Ten protokół został przeprowadzony za zgodą naszej instytucjonalnej komisji rewizyjnej z odpowiednią deidentyfikacją wszystkich danych pacjenta i zgodnie ze wszystkimi instytucjonalnymi, krajowymi i międzynarodowymi wytycznymi dotyczącymi dobra człowieka. Uzyskaj odpowiednią zgodę instytucjonalnej komisji rewizyjnej i świadomą zgodę rodziny pacjenta przed rozpoczęciem pracy z tym protokołem.
1. Pobieranie próbek tkanek
UWAGA: Krytyczny element tego protokołu wymaga właściwego postępowania z pobraniem tkanki, począwszy od razu po autopsji. Ogólna żywotność próbki zależy w znacznym stopniu od zminimalizowania interwału pośmiertnego (PMI), natychmiastowego przeniesienia tkanki do odpowiedniego zimnego podłoża uzupełnionego antybiotykami/środkami przeciwgrzybiczymi, utrzymywania próbki na mokrym lodzie przez cały transport i utrzymania sterylnej techniki przez cały protokół.
<ol>
	<li>Po otrzymaniu powiadomienia o zbliżającej się dawce przygotuj zestaw do pobierania próbek. Korzystając z pudełka transportowego z izolowanym pojemnikiem, który może być bezpośrednio użyty do transportu zwrotnego próbki tkanki, dołącz następujące materiały:
	<ol>
		<li>Dołącz materiały do sterylnego przygotowania, w tym sterylne rękawiczki, serwety i skalpele.</li>
		<li>Dołącz 8 - 10 sterylnych stożkowych probówek o pojemności 50 ml zawierających 30 ml pożywki transportowej w izolowanym pojemniku z lodem lub zimnymi wkładami. 
		UWAGA: Chociaż każda standardowa pożywka do hodowli komórkowych może działać, najlepszą żywotność próbki uzyskuje się za pomocą Hibernate-A uzupełnionego antybiotykiem/antybiotykiem.</li>
		<li>Dołączyć wszelkie dalsze probówki z próbkami do innych analiz (np. utrwalaczy).</li>
		<li>Jeśli sekcja zwłok nie zostanie przeprowadzona na miejscu badacza, dołącz dokument, który jasno określa, jak pobrać próbkę guza. Obejmuje to takie szczegóły, jak utrzymanie sterylności, trzymanie probówek z próbkami na mokrym lodzie oraz dołączanie próbek ze śródmózgowia i rdzenia, ponieważ komórki nowotworowe często atakują te obszary.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zachowaj sterylność podczas autopsji. Weź pod uwagę, że mózg jest sterylny wewnątrz czaszki, więc obserwuj sterylną technikę (w tym zmianę rękawiczek), gdy czaszka jest otwarta. Unikanie zanieczyszczenia skóry i włosów ma kluczowe znaczenie.</li>
	<li>Wypreparuj guz od strony brzusznej ("brzuch" mostu, patrz rysunek uzupełniający 1). Za pomocą sterylnego skalpela odetnij małe 1 cm kawałki guza i natychmiast przenieś do zimnego podłoża transportowego (patrz UWAGA w kroku 1.1.2) i połóż na mokrym lodzie. Umieść 10 ml tkanki w każdej probówce, uzyskując końcową objętość tkanki i pożywki w każdej probówce wynoszącą 40 ml. 
	UWAGA: W przypadku DIPG guz dylanowo nacieka most i często resztę pnia mózgu. W związku z tym należy pobrać jak najwięcej próbki, zwykle w tym 3-4 probówki (30-40 ml tkanki) z mostu i 1-2 probówki (10-20 ml tkanki) każda ze śródmózgowia i rdzenia.</li>
	<li>Zbierz próbki ze śródmózgowia i rdzenia zestawione z mostem, który często zawiera wiele komórek nowotworowych.</li>
	<li>Po pobraniu próbki wyślij O/N na mokrym lodzie w izolowanym pojemniku. Nie wysyłaj próbki na suchym lodzie, ponieważ zamrożenie zabije komórki.</li>
</ol>
2. Przygotowanie do przetwarzania próbek
<ol>
	<li>Przed rozpoczęciem przygotowywania próbki sterylizuj kaptury do hodowli tkankowych wraz z żyletkami, zakrzywionymi hemostatykami i innymi niesterylnymi narzędziami w świetle UV przez 1 godzinę. Wykonaj wszystkie poniższe czynności w sterylnych warunkach, aby zapobiec zanieczyszczeniu kultur.</li>
	<li>Przygotować i sterylne roztwory filtracyjne.
	<ol>
		<li>Aby przygotować 1,8 M roztwór sacharozy, rozpuść 308,07 g sacharozy w 300 ml wody destylowanej. Dodaj 50 ml 10x buforowany roztworem soli fizjologicznej Hanksa (HBSS) bez wapnia i magnezu i zwiększ całkowitą objętość do 500 ml za pomocą wody destylowanej. Przechowywać w temperaturze 4 °C.</li>
		<li>Aby przygotować roztwór do wytrawiania enzymatycznego, należy pobrać 50 ml HBSS z wapniem i magnezem na każde 10 ml tkanki mielonej i dodać 500 μl 5 mg/ml deoksyrybonukleazy I (stężenie końcowe 50 μg/ml), 500 μl 2,5 mg/ml kolagenazy I/II i roztworu dyspazy (końcowe stężenie 25 μg/ml) oraz 500 μl 1 M buforu HEPES. Wstępnie podgrzej roztwór wytrawiający w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C.</li>
		<li>Aby przygotować podłoże z pnia nowotworu (TSM), wymieszaj 250 ml Neurobasal-A, 250 ml Dulbecco's Modified Eagle Media: Mieszanka składników odżywczych F12 (DMEM/F12), 5 ml 100x antybiotyk-antybiotyk przeciwgrzybiczy, 5 ml 200 mM dipeptydu L-alanylo-L-glutaminy (GlutaMAX-A), 5 ml buforu HEPES, 5 ml 100 mM pirogronianu sodu i 5 ml 100x MEM aminokwasów endogennych.</li>
		<li>Aby przygotować kompletny TSM z czynnikami wzrostu, dodaj następujące suplementy do bazy TSM: 50x B27 Suplement Minus Witamina A (1:50), ludzki naskórkowy czynnik wzrostu (H-EGF, 20 ng/ml), ludzki czynnik wzrostu fibroblastów (H-FGF, 20 ng/ml), ludzki płytkopochodny czynnik wzrostu AA (H-PDGF-AA, 10 ng/ml), ludzki czynnik wzrostu pochodzenia płytkowego BB (H-PDGF-BB, 10 ng/ml) i roztwór heparyny (2 μg/ml).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Schłodzenie wirówki laboratoryjnej wyposażonej w obracający się wirnik kubełkowy do temperatury 4 °C.</li>
</ol>
3. Dysocjacja mechaniczna
<ol>
	<li>Przenieść tkankę do wysokościennego naczynia do hodowli komórkowej o wymiarach 100 mm x 20 mm. Usuń pozostałą pożywkę z transportu i zastąp ją 10-15 ml zimnej pożywki hodowlanej.</li>
	<li>Używając zakrzywionych hemostatów do chwycenia żyletki, drobno zmiel tkankę, usuwając widoczne naczynia krwionośne lub opony mózgowe. 
	UWAGA: Końcowe fragmenty tkanki powinny być mniejsze niż 1 mm (patrz rysunek 1B).</li>
	<li>Przenieś tkankę do czystej stożkowej probówki o pojemności 50 ml. Umyj naczynie do hodowli komórkowych dodatkowym 5 ml zimnej pożywki hodowlanej i przenieś do stożkowej probówki. W razie potrzeby powtórz ten etap mycia, aby przenieść pozostałą tkankę.</li>
	<li>Za pomocą pipety serologicznej o pojemności 10 ml delikatnie rozetrzeć (4 - 5 razy). Pozwól, aby większe fragmenty tkanki osiadły na dnie probówki. W razie potrzeby krótko odwirować próbkę przez 1 minutę (350 x g, 4 °C).</li>
	<li>Zbierz frakcję mechanicznie zdysocjowaną.
	<ol>
		<li>Usunąć supernatant i przefiltrować go przez filtr 100 μm do nowej stożkowej probówki o pojemności 50 ml z napisem "Dysocjacja mechaniczna". Odwróć filtr nad oryginalną stożkową probówką i przemyj pożywką hodowlaną w celu odzyskania fragmentów tkanki.</li>
		<li>Odwirować frakcję "dysocjacji mechanicznej" przez 5 minut (350 x g, 4 °C).</li>
		<li>Usunąć supernatant z granulowanej frakcji "dysocjacji mechanicznej" i ponownie zawiesić tkankę w zimnej pożywce hodowlanej. Jeśli w stożkowej probówce "Dysocjacja mechaniczna" znajduje się więcej niż 5 ml tkanki, podziel tkankę na inne stożkowe probówki o pojemności 50 ml tak, aby żadna probówka nie zawierała więcej niż 5 ml tkanki.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Mechanicznie zdysocjowaną frakcję przechowywać na lodzie do momentu etapu wirowania w gradiacji sacharozy (etap 5). Alternatywnie, frakcja zdysocjowana mechanicznie może przejść do etapu 5 podczas okresu inkubacji dysocjacji enzymatycznej (etap 4.4).</li>
</ol>
4. Dysocjacja enzymatyczna
<ol>
	<li>Jeśli w probówce zawierającej pozostałe większe fragmenty tkanki znajduje się więcej niż 5 ml tkanki, należy podzielić tkankę na inne nowe stożkowe probówki o pojemności 50 ml tak, aby żadna probówka nie zawierała więcej niż 5 ml tkanki.</li>
	<li>Odwirować stożkową probówkę (stożki) zawierającą pozostałe fragmenty tkanek przez 5 minut (350 x g, 4 °C).</li>
	<li>Usunąć supernatant i dodać wstępnie podgrzany roztwór do wytrawiania enzymatycznego, tak aby na każdy 1 ml tkanki przypadało 5 ml roztworu wytrawiającego (np. 25 ml roztworu do wytrawiania na 5 ml tkanki).</li>
	<li>Uszczelnić stożkowe pokrywki probówek folią laboratoryjną i inkubować reakcję na rotatorze w temperaturze 37 °C przez 30 minut.</li>
	<li>Po inkubacji próbki należy delikatnie rozcierać (zob. rysunek 1C).
	<ol>
		<li>Za pomocą pipety serologicznej o pojemności 10 ml pipetować próbkę w górę i w dół 6 - 8 razy. Unikaj generowania nadmiernej ilości pęcherzyków powietrza.</li>
		<li>Dodać końcówkę pipety o pojemności 1 000 μl na koniec pipety i rozcierać dodatkowe 6-8 razy.</li>
		<li>Pozwól, aby pozostałe kawałki osiadły na dnie tuby. Usunąć i przefiltrować supernatant z komórkami nadal zawieszonymi w filtrze 100 μm do nowej stożkowej probówki o pojemności 50 ml z napisem "Dysocjacja enzymatyczna" i przechowywać na lodzie.</li>
		<li>Jeśli pozostaną znaczne fragmenty tkanki, dodać do nich dodatkowe 10 ml HBSS z wapniem i magnezem i powtórzyć kroki 3.5.1 i 3.5.2. Przefiltrować ten końcowy roztwór przez filtr 100 μm do probówki "dysocjacja enzymatyczna".</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Odwirować probówkę "dysocjacja enzymatyczna" przez 5 minut (350 x g, 4 °C) i kontynuować wirowanie w gradiacji sacharozy.</li>
</ol>
5. Wirowanie w gradinie sacharozy
<ol>
	<li>Jeżeli próbki są nadal zawieszone w roztworze, odwirować przez 5 minut (350 x g, 4 °C).</li>
	<li>Usunąć supernatant i ponownie zawiesić tkankę w 20 ml zimnego HBSS bez wapnia i magnezu. Zwiększyć objętość do 25 ml za pomocą zimnego HBSS.</li>
	<li>Powoli dodać 25 ml 1,8 M roztworu sacharozy i odwrócić probówkę, aby wymieszać. Daje to gradient sacharozy 0,9 M.</li>
	<li>Wirówka bez hamulca przez 10 min (800 x g, 4 °C). Użycie hamulca wirowania spowoduje zakłócenie gradientu i zmniejszenie wydajności (patrz rysunek 1D dla przykładu próbki przed i po odwirowaniu).</li>
	<li>Ostrożnie odessać resztki mieliny i jak najwięcej roztworu sacharozy. Przemyć próbkę, dodając 30 ml zimnego HBSS bez wapnia i magnezu i delikatnie mieszając. Wirować przez 5 minut (350 x g, 4 °C).</li>
</ol>
6. ACK Deliza czerwonych krwinek
<ol>
	<li>Usunąć supernatant z przemywania płucz. Dodać 5 ml buforu do lizy ACK i delikatnie zawiesić osad komórkowy, obracając probówkę przez 1 minutę w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Ugasić lizę, dodając 30 ml zimnego HBSS bez wapnia i magnezu.</li>
	<li>Wirować przez 5 minut (350 x g, 4 °C).</li>
</ol>
7. Początkowe utrzymanie kultury
<ol>
	<li>Zawiesić końcowe granulki komórek w 10 - 15 ml ciepłym, kompletnym TSM z czynnikami wzrostu i określić ilościowo gęstość żywotnych komórek na hemocytometrze za pomocą wykluczenia błękitu trypanowego. 
	UWAGA: Zakres żywotnych komórek różni się znacznie w zależności od okoliczności dawstwa tkanki, a kwantyfikacja może być trudna na tym wczesnym etapie ze względu na resztki resztek komórkowych. W idealnym przypadku należy dążyć do tego, aby na próbkę przypadało milion żywych komórek. W przypadkach, gdy pozostaje nadmierna ilość zanieczyszczeń, rozpylić płytkę o mniejszej gęstości w kolbie T175.</li>
	<li>Przenieść końcowe zawiesiny komórek do nowej kolby hodowlanej T75. Zwiększ dodatkowe czynniki wzrostu co drugi dzień, aby utrzymać ogólny poziom czynnika wzrostu i monitorować rozwój neurosfer komórek nowotworowych (patrz Rysunek 1E i Rysunek 2).</li>
	<li>Alternatywnie, przetwarzaj enzymatycznie zdysocjowane komórki do dalszej analizy, w tym cytometrii przepływowej i sortowania komórek aktywowanych fluorescencją.</li>
	<li>Po rozwinięciu się neurosfer (co średnio trwa 3-4 tygodnie, ale waha się od kilku dni do nawet 2 miesięcy), należy odwrócić filtr próbki za pomocą nylonowego filtra siatkowego o grubości 100 μm, aby zmniejszyć ilość zanieczyszczeń. 
	UWAGA: Przesącz powinien być utrzymywany w hodowli na wypadek, gdyby obecne były żywe pojedyncze komórki lub małe kulki.</li>
	<li>Zapewnić integralność i czystość hodowli, wykonując odciski palców DNA podczas pasażu, w porównaniu z początkową próbką pacjenta.</li>
</ol>

<ol><li>Fisher, P. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+clinicopathologic+reappraisal+of+brain+stem+tumor+classification.+Identification+of+pilocystic+astrocytoma+and+fibrillary+astrocytoma+as+distinct+entities%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer%22%5BJournal%5D)">A clinicopathologic reappraisal of brain stem tumor classification. Identification of pilocystic astrocytoma and fibrillary astrocytoma as distinct entities.</a> Cancer. 89 (7), 1569-1576 (2000).</li>
<li>Johung, T. B., Monje, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diffuse+Intrinsic+Pontine+Glioma%3A+New+Pathophysiological+Insights+and+Emerging+Therapeutic%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Neuropharmacol%22%5BJournal%5D)">Diffuse Intrinsic Pontine Glioma: New Pathophysiological Insights and Emerging Therapeutic.</a> Curr. Neuropharmacol. , (2016).</li>
<li>Cage, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Feasibility%2C+safety%2C+and+indications+for+surgical+biopsy+of+intrinsic+brainstem+tumors+in+children%5BTitle%5D)+AND+%22Child+Nerv.+Syst%22%5BJournal%5D)">Feasibility, safety, and indications for surgical biopsy of intrinsic brainstem tumors in children.</a> Child Nerv. Syst. 29 (8), 1313-1319 (2013).</li>
<li>Puget, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biopsy+in+a+series+of+130+pediatric+diffuse+intrinsic+Pontine+gliomas%5BTitle%5D)+AND+%22Child+Nerv.+Syst%22%5BJournal%5D)">Biopsy in a series of 130 pediatric diffuse intrinsic Pontine gliomas.</a> Child Nerv. Syst. 31 (10), 1773-1780 (2015).</li>
<li>Kieran, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Time+to+rethink+the+unthinkable%3A+Upfront+biopsy+of+children+with+newly+diagnosed+diffuse+intrinsic+pontine+glioma+%28DIPG%29%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatr.+Blood+Cancer%22%5BJournal%5D)">Time to rethink the unthinkable: Upfront biopsy of children with newly diagnosed diffuse intrinsic pontine glioma (DIPG).</a> Pediatr. Blood Cancer. 62 (1), 3-4 (2014).</li>
<li>Sturm, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Paediatric+and+adult+glioblastoma%3A+multiform+%28epi%29genomic+culprits+emerge%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Cancer%22%5BJournal%5D)">Paediatric and adult glioblastoma: multiform (epi)genomic culprits emerge.</a> Nat. Rev. Cancer. 14 (2), 92-107 (2014).</li>
<li>Jones, C., Baker, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unique+genetic+and+epigenetic+mechanisms+driving+paediatric+diffuse+high-grade+glioma%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Cancer%22%5BJournal%5D)">Unique genetic and epigenetic mechanisms driving paediatric diffuse high-grade glioma.</a> Nat. Rev. Cancer. , (2014).</li>
<li>Taylor, K. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recurrent+activating+ACVR1+mutations+in+diffuse+intrinsic+pontine+glioma%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Genet%22%5BJournal%5D)">Recurrent activating ACVR1 mutations in diffuse intrinsic pontine glioma.</a> Nat. Genet. 46 (5), 457-461 (2014).</li>
<li>Wu, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+genomic+landscape+of+diffuse+intrinsic+pontine+glioma+and+pediatric+non-brainstem+high-grade+glioma%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Genet%22%5BJournal%5D)">The genomic landscape of diffuse intrinsic pontine glioma and pediatric non-brainstem high-grade glioma.</a> Nat. Genet. 46 (5), 444-450 (2014).</li>
<li>Fontebasso, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recurrent+somatic+mutations+in+ACVR1+in+pediatric+midline+high-grade+astrocytoma%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Genet%22%5BJournal%5D)">Recurrent somatic mutations in ACVR1 in pediatric midline high-grade astrocytoma.</a> Nat. Genet. 46 (5), 462-466 (2014).</li>
<li>Buczkowicz, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomic+analysis+of+diffuse+intrinsic+pontine+gliomas+identifies+three+molecular+subgroups+and+recurrent+activating%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Genet%22%5BJournal%5D)">Genomic analysis of diffuse intrinsic pontine gliomas identifies three molecular subgroups and recurrent activating.</a> Nat. Genet. 46 (5), 451-456 (2014).</li>
<li>Monje, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hedgehog-responsive+candidate+cell+of+origin+for+diffuse+intrinsic+pontine+glioma%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci%22%5BJournal%5D)">Hedgehog-responsive candidate cell of origin for diffuse intrinsic pontine glioma.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 108 (11), 4453-4458 (2011).</li>
<li>Aoki, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+experimental+xenograft+mouse+model+of+diffuse+pontine+glioma+designed+for+therapeutic+testing%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neuro-Oncol%22%5BJournal%5D)">An experimental xenograft mouse model of diffuse pontine glioma designed for therapeutic testing.</a> J. Neuro-Oncol. 108 (1), 29-35 (2012).</li>
<li>Grasso, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functionally+defined+therapeutic+targets+in+diffuse+intrinsic+pontine+glioma%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Med%22%5BJournal%5D)">Functionally defined therapeutic targets in diffuse intrinsic pontine glioma.</a> Nat. Med. , 1-10 (2015).</li>
<li>Shu, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+Orthotopic+Transplantation+of+Fresh+Surgical+Specimen+Preserves+CD133+%2BTumor+Cells+in+Clinically+Relevant+Mouse+Models+of+Medulloblastoma+and+Glioma%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Direct Orthotopic Transplantation of Fresh Surgical Specimen Preserves CD133 +Tumor Cells in Clinically Relevant Mouse Models of Medulloblastoma and Glioma.</a> Stem Cells. 26 (6), 1414-1424 (2008).</li>
<li>Becher, O. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preclinical+evaluation+of+radiation+and+perifosine+in+a+genetically+and+histologically+accurate+model+of+brainstem+glioma%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Preclinical evaluation of radiation and perifosine in a genetically and histologically accurate model of brainstem glioma.</a> Cancer Res. 70 (6), 2548-2557 (2010).</li>
<li>Funato, K., Major, T., Lewis, P. W., Allis, C. D., Tabar, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+human+embryonic+stem+cells+to+model+pediatric+gliomas+with+H3.3K27M+histone+mutation%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Use of human embryonic stem cells to model pediatric gliomas with H3.3K27M histone mutation.</a> Science. 346 (6216), 1529-1533 (2014).</li>
<li>Olah, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+optimized+protocol+for+the+acute+isolation+of+human+microglia+from+autopsy+brain+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">An optimized protocol for the acute isolation of human microglia from autopsy brain samples.</a> Glia. 60 (1), 96-111 (2012).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Protokół ten opisuje metodę szybkiego przetwarzania pośmiertnych dawców tkanek nowotworowych w celu opracowania kultur komórkowych pochodzących od pacjentów, które mogą być wykorzystane w różnych eksperymentach in vitro lub in vivo . Ze względu na charakter pracy z próbkami z autopsji, utrzymanie ich żywotności stanowi poważne wyzwanie. Kilka czynników przyczyniających się do tego, w tym odstęp między sekcją zwłok do autopsji lub czas potrzebny na transport tkanki, powinno być zminimalizowanych w jak największym stopniu, ale często są one trudne do kontrolowania. Z naszego doświadczenia wynika, że interwał pośmiertny krótszy niż 6-8 godzin (od momentu śmierci do momentu, gdy tkanka jest umieszczana w lodowatych podłożach do wysyłki i transportu) dał największą szansę na ustanowienie trwałej hodowli komórkowej. Najlepiej jest następnie otrzymać tkankę w laboratorium w ciągu 24 godzin i przetworzyć ją do hodowli natychmiast po otrzymaniu.
Ponieważ lokalizacja tych rzadkich przypadków jest bardzo zróżnicowana, a jakość etapu pobierania tkanek silnie wpływa na szansę powodzenia, logistyka przeprowadzenia autopsji może być wyzwaniem. W wielu przypadkach, aby osiągnąć 6-8 godzinne ramy czasowe, nie jest możliwe przeprowadzenie pobrania tkanek w ośrodku akademickim. Zamiast tego, posiadanie usługi odzyskiwania tkanek na wezwanie w celu odzyskania tkanki nowotworowej w domu pogrzebowym zgodnie z protokołem zatwierdzonym przez IRB jest często bardziej celowe dla odzyskania tkanek. Uzyskanie świadomej zgody przed śmiercią jest zalecane i ułatwia planowanie logistyczne. Zdecydowanie zaleca się przygotowanie samodzielnych zestawów do autopsji z jasnymi i dokładnymi instrukcjami oraz sterylnymi materiałami do pobierania tkanek (rękawice, serwety, skalpele). Ponadto kluczowe znaczenie ma ustanowienie jasnych punktów komunikacji między badaczem, patologiem i domem pogrzebowym. Na przykład badacz powinien omówić protokół z patologiem przed sekcją zwłok i zwrócić uwagę na typowe błędy. Błędy te obejmują zanieczyszczenie mikrobiologiczne (zwykle drożdże) podczas pobierania tkanek, brak wysyłki nocnej/przyspieszonej oraz niewysyłkę próbki na wystarczającej ilości mokrego lodu w termoizolowanym pojemniku. Na koniec zalecamy skorzystanie z usługi kurierskiej "od drzwi do drzwi" do wysyłki próbki, aby zminimalizować czas transportu.
Należy również zachować ostrożność podczas dysocjacji tkanek, aby zachować żywotność komórek. Na przykład zastosowanie pożywek zaprojektowanych w celu zachowania zdrowia tkanek nerwowych do transportu (Hibernate-A uzupełniony antybiotykiem/antybiotykiem) zwiększy szansę na uzyskanie udanej hodowli. Ważne jest również, aby utrzymywać próbkę w niskiej temperaturze przez cały czas trwania protokołu, zawsze przenosząc próbki na lodzie. Zbieranie zarówno mechanicznych, jak i enzymatycznych frakcji dysocjacyjnych wraz z minimalizacją trituracji może poprawić skuteczność protokołu, ponieważ oba etapy są traumatyczne dla komórek. Z naszego doświadczenia wynika, że podczas gdy większość udanych kultur wyrasta z obu frakcji, mieliśmy przypadki, w których tylko jeden z dwóch preparatów stworzył trwałą kulturę, potencjalnie odzwierciedlającą delikatną naturę tych próbek. Kolejnym traumatycznym krokiem w protokole jest utarcie; Jedną ze strategii, która może zmniejszyć niezbędny stopień roztarcia, jest upewnienie się, że próbki są dokładnie rozdrobnione na samym początku przygotowania. Inne przykłady aspektów protokołu mających na celu poprawę żywotności próbki obejmują dodawanie (np . HEPES) w całym protokole, co jest szczególnie ważne podczas dysocjacji enzymatycznej.
Możliwą modyfikacją tego protokołu w celu dalszego zwiększenia żywotności komórek jest usunięcie etapu lizy czerwonych krwinek ACK. Jednak w tym przypadku często konieczne jest wykonanie etapu lizy ACK w pierwszym tygodniu hodowli w celu usunięcia czerwonych krwinek. Innym aspektem tego protokołu, który może być modyfikowany, jest eliminacja mieliny i resztek komórkowych za pomocą gradientu gęstości sacharozy. W szczególności na tym etapie możliwe są również inne strategie, które zostały zgłoszone w celu poprawy żywotności komórek mikrogleju, takie jak nieciągły gradient gęstości Percoll18 lub magnetyczne kulki do usuwania mieliny.
Wreszcie, czas między początkową dysocjacją tkanek a pojawieniem się neurosfer różni się w zależności od próbki i może trwać od tygodnia do miesiąca lub dłużej. Ponieważ początkowe hodowle zazwyczaj zawierają znaczny stopień martwych komórek i resztek komórkowych, ustalenie, czy żywe komórki pozostają, może być trudne; kultura powinna być utrzymywana przez co najmniej 4 - 8 tygodni (ryc. 2). Przedstawiono tutaj jedną ze strategii izolowania rosnących komórek od pozostałych szczątków (tj. odwrotne filtrowanie klastrów komórek i ponowne powlekanie w świeżych pożywkach). Decyzja o tym, czy kontynuować utrzymywanie posiewu, jest ostatecznie decyzją indywidualną w każdym przypadku opartą na czynnikach otaczających autopsję (np. przedłużony okres pośmiertny, problemy podczas transportu tkanki), dysocjacji tkanek (np. nadmierna ilość krwi lub szczątków) oraz tym, jak próbka pojawia się w hodowli. Po ustaleniu posiewu tożsamość powinna zostać zweryfikowana za pomocą odcisków palców DNA przy użyciu krótkiej analizy powtórzeń tandemowych lub podobnej metody, porównując hodowlę z próbką pierwotnego guza zachowaną w tym celu. Zalecamy rutynową walidację kultur za pomocą odcisków palców DNA, aby upewnić się, że nie doszło do zanieczyszczenia innymi kulturami, na przykład co 3-6 miesięcy.
Stworzenie tych kultur DIPG pochodzących od pacjentów stanowi ważny krok w pomyślnym rozwoju skutecznych terapii. Rozszerzenie dostępnych kultur DIPG i modeli ksenoprzeszczepów pochodzących od pacjentów będzie miało kluczowe znaczenie dla określenia najskuteczniejszych strategii terapeutycznych i ostatecznego przezwyciężenia tej wyniszczającej choroby.

DIPG to agresywny nowotwór złośliwy ośrodkowego układu nerwowego, który pojawia się w połowie wieku młodzieńczego1,2. Pomimo dziesięcioleci badań klinicznych, obecne leczenie ogranicza się do radioterapii, która zapewnia tymczasową poprawę lub stabilizację objawów i wydłuża medianę przeżycia średnio tylko o 3 miesiące. Nawet w przypadku radioterapii mediana całkowitego przeżycia wynosi tylko 9 miesięcy, a 90% dzieci umiera z powodu choroby w ciągu 2 lat od wstępnego rozpoznania. Ze względu na naciekający charakter guza i krytyczne funkcje pnia mózgu, resekcja chirurgiczna nie jest możliwa. Co więcej, w Stanach Zjednoczonych w przeszłości nie wykonywano biopsji chirurgicznej w kierunku DIPG 3, ponieważ analiza histopatologiczna nie odgrywa obecnie żadnej roli w kierowaniu leczeniem klinicznym, a diagnozę można zwykle postawić za pomocą samego neuroobrazowania. W związku z tym dostępność tkanki nowotworowej do badań jest ograniczona, co ogranicza wysiłki zmierzające do prowadzenia badań nad cząsteczkami kandydującymi na leki i biologią leżącą u podstaw nowotworu. Warto zauważyć, że ulepszenia w neuroobrazowaniu i technikach stereotaktycznych pozwoliły na opracowanie bezpiecznych biopsji DIPG w ostatnich latach4, które w połączeniu z postępem w biologii molekularnej zmieniły nasze rozumienie choroby. Obecnie prowadzonych jest wiele badań klinicznych wykorzystujących biopsję wstępną i profilowanie molekularne DIPG w celu indywidualizacji planów leczenia (NCT01182350, NCT02274987)5.
DIPG i inne glejaki wysokiego stopnia u dzieci reprezentują odrębne choroby od swoich dorosłych odpowiedników glejaka6,7, a zatem wierne modele eksperymentalne DIPG są niezbędne do zrozumienia jego unikalnej patofizjologii i odkrycia skutecznych strategii terapeutycznych. W ostatnich latach skoncentrowane wysiłki mające na celu uzyskanie tkanki nowotworowej DIPG do badań w czasie autopsji lub, rzadziej, biopsji, zrewolucjonizowały nasze zrozumienie i zdolność do badania DIPG. Sekwencjonowanie całego genomu ujawniło powtarzającą się mutację w histonie H3, rodzinie 3A (H3F3A) i klastrze histonów 1, H3b (HIST1H3B), co stanowi pierwszy przykład choroby człowieka spowodowanej mutacjami w białkach kodujących histony8,9,10,11. Ponadto podzbiór DIPG wyraża mutacje w genie ACVR1, które nie zostały wcześniej zgłoszone w raku, ale są identyczne z mutacjami występującymi we wrodzonym zaburzeniu rozwoju wieku dziecięcego fibrodysplazja kostna progressiva8,9,10,11. Również pierwsze hodowle komórek DIPG pochodzące od pacjentów i ortotopowe modele ksenoprzeszczepów zostały już stworzone1,2,12,13,14, a także modele mysie stworzone poprzez bezpośrednią ksenotransplantację komórek nowotworowych myszom z niedoborem odporności w celu wygenerowania seryjnych ksenoprzeszczepów 3,14,15. Wstępne badania przesiewowe leków z wykorzystaniem tych modeli pochodzących od pacjentów zidentyfikowały obiecujące nowe czynniki do translacji klinicznej4,14 i położyły podwaliny pod co najmniej jedno badanie kliniczne (NCT02717455).
Te pierwsze kroki w kierunku postępu to dopiero początek, a liczne próbki tkanek pochodzących od pacjentów i modele hodowlane będą niezbędne do zdefiniowania podtypów choroby i opracowania najskuteczniejszych strategii terapeutycznych. Genetycznie zmodyfikowane mysie modele DIPG ułatwią również badania mające na celu pogłębienie naszej podstawowej wiedzy na temat choroby. Wysiłki podjęte w celu wygenerowania modeli genetycznych dla DIPG będą wspomagane przez podstawowe badania genomiczne omówione powyżej, ale obecnie dostępna jest ograniczona liczba opcji. Jeden z takich modeli, który generuje histologicznie podobne glejaki pnia mózgu o wysokim stopniu złośliwości, wykorzystuje wirusowy system RCAS/tv-a do napędzania nadekspresji PDGF-B i utraty Ink4a-ARF w komórkach gniazdynowo-dodatnich w tylnym dole noworodków5,16. Inne podejście polega na rekapitulacji kilku głównych mutacji związanych z DIPG (mutacja histonu H3.3 K27M, utrata p53 i aktywacja PDGFRA) w nerwowych komórkach prekursorowych pochodzących z ludzkich embrionalnych komórek macierzystych, co jest wystarczające do uczynienia tych komórek rakotwórczymi6,7,17. Połączenie metod genetycznych i modeli pochodzących od pacjentów umożliwi przeprowadzanie badań przedklinicznych i dalszy rozwój skutecznych terapii.
Aby sprostać wyzwaniom związanym z badaniami DIPG opisanym powyżej, ten protokół szybkiej autopsji został opracowany w celu generowania kultur komórkowych pochodzących od pacjentów do badania8,9,10,11,12,14. Protokół ma na celu ochronę żywotności tkanki i maksymalizację prawdopodobieństwa wytworzenia trwałych kultur pomimo wyzwań związanych z wydłużonymi odstępami między sekcjami pośmiertnymi i czasem transportu. Po pomyślnym wygenerowaniu, te hodowle DIPG mogą być wykorzystane w kolejnych manipulacjach in vitro i eksperymentach ksenoprzeszczepów in vivo, co pozwoli na ocenę potencjalnych cząsteczek terapeutycznych na komórkach pobranych od pacjenta.

<table><tbody><tr><td>Hibernate-A</td><td>Gibco</td><td>A12475-01</td><td></td></tr><tr><td>HBSS z wapniem/magnezem</td><td>Gibco</td><td>24020-117</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Corning</td><td>21-022-CV</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Gibco</td><td>15630-080</td><td></td></tr><tr><td>Liberase DH (kolagenaza / dispaza)</td> <td>Roche</td><td>5401054001</td><td></td></tr><tr><td>DNAse I</td><td>Worthington</td><td>Biochemical LS002007</td><td></td></tr><tr><td>Sacharoza</td><td>Sigma</td><td>S0389</td><td></td></tr><tr><td>Antybiotyk/Antybiotyk Grzybicze</td><td>Gibco</td><td>15240-096</td><td></td></tr><tr><td>Neurobasal-A</td><td>Gibco</td><td>10888-022</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Gibco</td><td>11330-032</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX-I (100x)</td><td>Gibco</td><td>35050-061</td><td></td></tr><tr><td>Pirogronian sodu (100 mM)</td><td>Gibco</td><td>11360-070</td><td></td></tr><tr><td>B27 Suplement minus witamina A</td><td>Gibco</td><td>12587-010</td><td></td></tr><tr><td>MEM Aminokwasy endogenne (100x)</td><td>Gibco</td><td>11140-050</td><td></td></tr><tr><td>Ludzki PDGF-AA</td><td>Shenandoah Biotechnologia</td><td>100-16</td><td></td></tr><tr><td>Ludzki PDGF-BB</td><td>Shenandoah Biotechnologia</td><td>100-18</td><td></td></tr><tr><td>Ludzki EGF</td><td>Shenandoah Biotechnologia</td><td>100-26</td><td></td></tr><tr><td>Ludzki FGF</td><td>Shenandoah Biotechnology</td><td>100-146</td><td></td></tr><tr><td>Sterylne ostrza skalpela</td><td>Bard Paker</td><td>372610</td><td></td></tr><tr><td>Zakrzywione hemostatyki</td><td>Fine Science Tools</td><td>13013-14</td><td></td></tr><tr><td>Żyletki</td><td>VWR</td><td>55411-050</td><td></td></tr><tr><td>Naczynie do hodowli komórkowych 100 x 20 mm</td><td>Corning</td><td>353003</td><td></td></tr><tr><td>Sterylne kleszcze</td><td>TWD Tradewinds</td><td>DF8988-5</td><td></td></tr><tr><td>Sterylne serwety</td><td>3M</td><td>2037</td><td></td></tr><tr><td>Sterylne</td><td>rękawiczki Kimberly Clark</td><td>1182307</td><td></td></tr><tr><td>ACK Lysis Buffer</td><td>Gibco</td><td>A1049201</td><td></td></tr><tr><td>100 mikronowy filtr siatkowy</td><td>Fisher</td><td>352360</td><td></td></tr><tr><td>50 ml rurka stożkowa</td><td>Fisher</td><td>1495949A</td><td></td></tr></tbody></table>

protokół szybkiej pośmiertnej hodowli komórkowej rozlanego wewnętrznego glejaka mostu (dipg)

A Protocol for Rapid Post-mortem Cell Culture of Diffuse Intrinsic Pontine Glioma (DIPG)

Rozlany glejak wewnętrzny mostu (DIPG) to nowotwór pnia mózgu wieku dziecięcego, który niesie ze sobą powszechnie śmiertelne rokowania. Ponieważ resekcja chirurgiczna nie jest opłacalną strategią leczenia, a biopsja nie jest rutynowo wykonywana, dostępność próbek pacjentów do badań jest ograniczona. W związku z tym wysiłki mające na celu zbadanie tej choroby zostały zakwestionowane przez niedostatek wiernych modeli choroby. Aby odpowiedzieć na tę potrzebę, opisujemy tutaj protokół szybkiego przetwarzania próbek tkanek z sekcji zwłok w celu wygenerowania trwałych modeli hodowli komórkowych pochodzących od pacjenta, które można wykorzystać w testach in vitro lub eksperymentach in vivo z ortotopowym ksenoprzeszczepem. Modele te mogą być wykorzystywane do badań przesiewowych potencjalnych celów leków oraz do badania podstawowych procesów patobiologicznych w obrębie DIPG. Protokół ten można dalej rozszerzyć o analizę i izolację komórek nowotworowych i mikrośrodowiskowych za pomocą sortowania komórek aktywowanego fluorescencją (FACS), co umożliwia późniejszą analizę ekspresji genów, ekspresji białek lub epigenetycznych modyfikacji DNA na poziomie komórki masowej lub pojedynczej komórki. Wreszcie, protokół ten można również dostosować do generowania posiewów pochodzących od pacjentów dla innych nowotworów ośrodkowego układu nerwowego.

Opisany protokół został przedstawiony w formie pięcioetapowego schematu pracy, a zdjęcia tkanki na różnych etapach przetwarzania znajdują się na Rysunku 1. Próbkę pobiera się najpierw podczas szybkiej sterylnej autopsji. Podczas dysocjacji mechanicznej tkankę rozdrabnia się, usuwając z próbki naczynia krwionośne oraz opony mózgowe, a następnie filtruje przez nylonowy filtr o oczkach 100 μm. Pozostałe fragmenty tkanki poddaje się dysocjacji enzymatycznej w inkubatorze. Następnie, za pomocą wirowania w gradiencie sacharozy, redukuje się ilość zanieczyszczeń, izolując z próbki wyraźną warstwę mieliny. Dodatkowo liza ACK widocznie zmniejsza liczbę obecnych w próbce erytrocytów. Na koniec komórki wysiewa się na pożywkę bezzieczułkową uzupełnioną o czynniki wzrostu.
Rycina dodatkowa 1 przedstawia przykład guza podczas autopsji. Guz rozwija się jako rozlany naciek mostu oraz przyległych obszarów pnia mózgu. Podczas przygotowywania próbek należy wyciąć małe fragmenty o rozmiarach ok. 1 cm x 1 cm i natychmiast umieścić je w zimnym medium transportowym na lodzie.
Rysunek 2 przedstawia różne przykłady wyglądu próbek od wczesnych etapów hodowli po kulturę trwałą. Początkowo wysiane i wczesne hodowle (A, B) często nie sprawiają wrażenia, jakby zawierały wiele przeżywających komórek. Co więcej, wczesne skupiska komórek (C, D) często nie wykazują stopnia kontrastu typowego dla neurosfer. Należy zauważyć, że czas trwania hodowli przed pojawieniem się skupisk komórek może wynosić od kilku tygodni do paru miesięcy. Jednakże pierwsze pasażowanie tych skupisk komórek, w połączeniu z filtrowaniem zwrotnym, pozwala wyizolować zdrowe komórki nowotworowe zdolne do tworzenia sfer (F). Filtrat (E) zazwyczaj zawiera pozostałe zanieczyszczenia; zalecamy jednak wysiewanie i utrzymywanie filtratu oraz monitorowanie go pod kątem rozwoju skupisk komórek. Te próbki pochodzące od pacjentów mogą następnie być utrzymywane w hodowli przez wiele pasaży (G, H).
Rycina 3 demonstruje możliwość przeszczepienia tych komórek w formie ksenoprzeszczepu do myszy. W każdym z tych przypadków komórki DIPG zostały przetransfekowane reporterem GFP-Luciferase w celu monitorowania rozwoju guzów za pomocą bioluminescencji (A). Guzy można również badać histologicznie, na przykład w celu obserwacji przyjęcia się przeszczepu guza (B) lub ekspresji specyficznych markerów (C). Te modele in vivo, w połączeniu z testami in vitro , mogą być wykorzystywane do oceny efektów działania różnych leków lub manipulacji genetycznych (np.8,9,10,1,14).
<img alt="Szybki schemat sekcyjny: mechaniczna i enzymatyczna dysocjacja tkanek; wirowanie w gradiencie sacharozy." src="/files/ftp_upload/55360/55360fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rycina 1. Próbki tkanek na różnych etapach obróbki. (A) Pobrać próbkę w drodze sterylnej autopsji, a następnie przesłać ją w ciągu jednej doby w transporcie w lodzie. (B) Od lewej do prawej: (rząd 1) probówki zawierające tkankę guza w medium transportowym; świeża tkanka w naczyniu do hodowli komórek o wymiarach 10 mm x 20 mm; wstępne rozdrobnienie tkanki; (rząd 2) częściowo rozdrobniona tkanka; usuwanie opon mózgowych i naczyń krwionośnych; końcowa wielkość fragmentów rozdrobnionej tkanki. (C) Od lewej do prawej: (rzad 1) tkanka inkubowana na stole rotacyjnym w 37 °C piekarnik; (wiersz 2) rozcieranie tkanki za pomocą 1000 μL końcówka do pipety zamocowana do pipety 10 ml; filtrowanie zdysocjowanej tkanki przez 100 μm filtr z nylonowej siatki.D) Od lewej do prawej: zdysocjowana tkanka zawieszona w 0,9 M roztworze sacharozy przed wirowaniem; zdysocjowana tkanka rozdzielona w gradiencie sacharozy po wirowaniu; widoczna warstwa resztek mieliny na górze gradientu sacharozy; końcowy osad komórkowy po lizie ACK i przemyciu. (EKońcową próbkę można poddać hodowli lub wykorzystać w innych dalszych analizach. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55360/55360fig1large.jpg" target="_blank">Aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny, kliknij tutaj.</a>
<img alt="Proces różnicowania kultur komórkowych w mikroskopii. Wiele etapów przedstawionych na ośmiu obrazach A-H." src="/files/ftp_upload/55360/55360fig2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 2"> 
Rysunek 2. Obrazy kultur pierwotnych i komórek z wczesnych pasażów. (A - B) Kultury wysiane bezpośrednio po dysocjacji (SU-DIPG-XXX, A), lub takich, które nie wykształciły jeszcze neurosfer (SU-DIPG-XXIX, B). (C - D) Wczesne pojawienie się neurosfer w hodowlach pierwotnych SU-DIPG-XXVIII (C) oraz SU-DIPG-XXIX (D). (E-F) Pierwszy pasaż hodowli pierwotnej z D przy użyciu 100 μm filtr nylonowy, z filtratem (E) oraz filtratu odwrotnego (F) wysiane. (G - Hdojrzałe neurosfery z pierwszego pasażu SU-DIPG-XXVII (G) oraz trzecie pasażowanie SU-DIPG-XXV (H) hodowane in vitro. Pasek skali = 200 μm. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55360/55360fig2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej figury.</a>
<img alt="Obrazowanie wzrostu guza u myszy, mikroskopia fluorescencyjna, badanie nowotworów; analiza bioluminescencyjna in vivo." src="/files/ftp_upload/55360/55360fig3.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3. Hodowle komórkowe pochodzące od pacjentów mogą ulegać engraftacji i tworzyć guzy u myszy. (A) Obrazy bioluminescencyjne czterech różnych kultur komórek pochodzących od pacjentów, przetransfekowanych reporterem GFP-Luciferase. (B) Przekrój strzałkowy ksenoprzeszczepu mysiego, przedstawiający komórki nowotworowe wszczepione do mostu mózgu myszy. Zielony: GFP, czerwony: podstawowe białko mieliny. Pasek skali = 1 mm. (C) Przykładowy obraz immunofluorescencyjny przedstawiający komórki nowotworowe GFP wszczepione do mózgu myszy. Niebieski: DAPI, zielony: GFP, czerwony: IGF2R. Pasek skali = 40 μm. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55360/55360fig3large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej figury.</a>
Rycina dodatkowa 1. Próbka z autopsji guza mostu mózguBezpośredni wygląd pośmiertny rozlanego wewnątrzmostkowego glejaka. Guz występuje jako duża, bogata w mielinę masa na brzusznej powierzchni mostu. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55360/SupplementalFigure1.pdf" target="_blank">Prosimy o kliknięcie tutaj, aby pobrać ten obraz.</a>

Ten protokół opisuje metodę szybkiego przetwarzania pośmiertnego rozlanego wewnętrznego glejaka mostu w celu stworzenia modeli hodowli komórkowych pochodzących od pacjenta lub bezpośredniej charakterystyki komórek nowotworowych i mikrośrodowiskowych.

Protokół szybkiej pośmiertnej hodowli komórkowej rozlanego wewnętrznego glejaka mostu (DIPG)

Diffuse Intrinsic Pontine Glioma (DIPG) is a childhood brainstem tumor that carries a universally fatal prognosis. Because surgical resection is not a ...

Ogólnym celem niniejszego protokołu szybkiej hodowli komórkowej po śmierci jest stworzenie trwałych hodowli komórkowych rozlanego wewnątrzmostkowego glejaka pochodzących od pacjentów, aby ułatwić przeprowadzenie eksperymentów niezbędnych do zrozumienia i ostatecznie opracowania skutecznych terapii DIPG. Metoda ta może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania dotyczące podstawowej biologii oraz strategii terapeutycznych w przypadku rozlanego wewnątrzmostkowego glejaka, na przykład czy określone leki działają w różnych hodowlach pochodzących od pacjentów. Główną zaletą tej techniki jest możliwość bezpośredniego badania biologii komórek pochodzących od pacjentów.Implikacje tej techniki rozciągają się na terapię DIPG, ponieważ pozwala ona na testowanie różnych strategii terapeutycznych w obrębie różnych podtypów genetycznych tej choroby. Chociaż metoda ta może dostarczyć wiedzy na temat DIPG, może ona zostać zastosowana również w przypadku innych schorzeń, takich jak inne pediatryczne glejaki wysokiego stopnia, glejaki wielopostaciowe u dorosłych lub inne guzy ośrodkowego układu nerwowego. Zazwyczaj osoby rozpoczynające pracę z tą techniką napotykają trudności, ponieważ pozyskiwanie i szybkie przetwarzanie próbek z sekcji zwłok w sposób efektywny jest wymagające.Przed przygotowaniem próbek należy wysterylizować dygestorium do hodowli tkankowych wraz z żyletkami, zakrzywionymi kleszczykami hemostatycznymi oraz innymi niesterylnymi narzędziami pod światłem UV przez jedną godzinę, a wszystkie kolejne kroki przeprowadzić w warunkach sterylnych. Następnie tkankę należy przenieść do wysokiej szalki hodowlanej o wymiarach 100 mm na 20 mm. Należy usunąć pożywkę pozostałą po transporcie i zastąpić ją 10 do 15 ml zimnej pożywki hodowlanej.Następnie, używając zakrzywionych kleszczyków hemostatycznych do uchwycenia żyletki, drobno posiekaj tkankę, usuwając naczynia krwionośne lub opony mózgowe. Końcowe fragmenty tkanki powinny być mniejsze niż 1 mm. Następnie przenieś tkankę do czystej probówki stożkowej o pojemności 50 ml.Wypłucz szalkę z hodowlą komórkową dodatkowymi pięcioma mililitrami zimnej pożywki hodowlanej i przenieś próbkę do probówki stożkowej. Powtórz ten etap płukania w razie potrzeby, aby przenieść pozostałą tkankę. Używając pipety serologicznej o pojemności 10 ml, delikatnie potryturuj próbkę od czterech do pięciu razy.Pozostaw większe fragmenty tkanki do czasu, aż opadną na dno probówki. W razie potrzeby krótko odwiruj próbkę przez jedną minutę. Aby zebrać frakcję dysocjowaną, usuń nadsącz i przefiltruj zawartość przez filtr 100 µm do nowej probówki stożkowej o pojemności 50 mL z etykietą Mechanical Dissociation.Odwróć filtr nad pierwotną probówką stożkową i przemyj go pożywką hodowlaną, aby odzyskać fragmenty tkanki. Następnie odwiruj frakcję dysocjacji mechanicznej przez pięć minut. Po tym czasie usuń nadsącz z osadu frakcji dysocjacji mechanicznej i resuspenduj tkankę w zimnej pożywce hodowlanej.Jeśli w stożkowej probówce do dysocjacji mechanicznej znajduje się więcej niż 5 ml tkanki, należy podzielić ją do innych probówek stożkowych o pojemności 50 ml w taki sposób, aby w żadnej probówce nie było więcej niż 5 ml tkanki. Następnie frakcję poddaną dysocjacji mechanicznej należy przechowywać w lodzie do momentu przeprowadzenia wirowania w gradiencie sacharozy. W tej procedurze probówkę stożkową zawierającą pozostałe fragmenty tkanki należy wirować przez pięć minut.Następnie usunąć nadsącz i dodać uprzednio ogrzany roztwór do trawienia enzymatycznego, tak aby na każdy 1 mL tkanki przypadało 5 mL roztworu trawiennego. Następnie zamknąć pokrywkę probówki stożkowej folią laboratoryjną i inkubować reakcję na rotatorze w temperaturze 37°C przez 30 minut. Po inkubacji delikatnie rozetrzeć próbki poprzez tryturację.Używając pipety serologicznej o pojemności 10 ml, aspiruj i wydmuchuj próbkę od sześciu do ośmiu razy, unikając powstawania nadmiernej ilości pęcherzyków powietrza. Następnie załóż końcówkę do pipety 1 000 µl na koniec pipety i tryturuj próbkę dodatkowe sześć do ośmiu razy. Pozostaw wszelkie pozostałe grudki, aby osiadły na dnie probówki.Następnie należy zebrać i przefiltrować supernatant z zawieszonymi w nim komórkami przez filtr 100 µm do nowej probówki stożkowej o pojemności 50 ml opisanej jako Rozwiązanie enzymatyczne i przechowywać go w lodzie. Następnie probówkę z roztworem enzymatycznym należy wirować przez pięć minut, a potem przejść do wirowania w gradiencie sacharozy. Jeśli próbka wciąż znajduje się w zawiesinie, należy ją wirować przez pięć minut.Następnie należy usunąć nadsącz i ponownie zawiesić tkankę w 20 mililitrach zimnego roztworu HBSS bez jonów wapnia i magnezu. Następnie należy uzupełnić objętość do 25 mililitrów, używając zimnego HBSS. Powoli dodać 25 mililitrów 1,8 molarnego roztworu sacharozy i odwrócić probówkę, aby wymieszać zawartość.Daje to gradient sacharozy o stężeniu 0,9 M. Następnie odwiruj próbkę bez hamowania przez 10 minut. Ostrożnie odessaj pozostałości mieliny w jak największej ilości roztworu sacharozy.Następnie przemyj próbkę, dodając 30 mililitrów zimnego HBSS bez wapnia i magnezu, i delikatnie wymieszaj. Po tym czasie odwiruj próbkę przez pięć minut. W tej procedurze usuń nadsącz z płukania.Dodać pięć mililitrów buforu lizującego ACK i delikatnie zawiesić osad komórkowy, obracając probówkę przez jedną minutę w temperaturze pokojowej. Następnie przerwać lizę, dodając 30 mililitrów zimnego HBSS bez wapnia i magnezu. Następnie odwirować przez pięć minut.Ponownie zawiesić końcowy osad komórkowy w 10–15 ml ocieplonego, kompletnego medium TSM z czynnikami wzrostu, a następnie określić gęstość żywych komórek za pomocą hemocytometru, stosując metodę wykluczania błękitu trypanu. Następnie przenieść końcową zawiesinę komórkową do nowej kolby hodowlanej T75. Co drugi dzień dodawać kolejne czynniki wzrostu w celu utrzymania całkowitego poziomu tych czynników i monitorować powstawanie neurosfer komórek nowotworowych.Poniżej przedstawiono różne przykłady wyglądu próbek, od wczesnych etapów hodowli po kulturę trwałą. Początkowo próbki wysiane na płytki oraz wczesne hodowle często nie wydają się zawierać wielu przeżywających komórek. Co więcej, wczesne skupiska komórek często nie wykazują stopnia kontrastu typowego dla neurosfer.Jednakże wstępne pasażowanie tych skupisk komórek, w połączeniu z filtrowaniem wstecznym, pozwala na wyizolowanie zdrowych komórek nowotworowych zdolnych do tworzenia sfer. Filtrat zawiera zazwyczaj pozostałe szczątki komórkowe. Tak przygotowane próbki pochodzące od pacjentów mogą być następnie utrzymywane w hodowli przez wiele pasaży.Po opanowaniu tej techniki, przy prawidłowym wykonaniu, procedura ta zajmuje od trzech do czterech godzin. Podczas przeprowadzania tej procedury ważne jest, aby zapewnić utrzymanie próbki w niskiej temperaturze na każdym etapie, z wyjątkiem dysocjacji enzymatycznej, oraz zminimalizować urazy mechaniczne próbki. Po wykonaniu tej procedury można przeprowadzić dodatkowe badania, takie jak przesiewowe badania leków in vitro lub ksenoprzeszczepy ortotopowe, aby odpowiedzieć na kolejne pytania dotyczące patobiologii DIPG.Po opracowaniu, ta technika hodowli otworzyła przed badaczami z dziedziny neuroonkologii dziecięcej nowe możliwości terapeutyczne dla dzieci z DIPG. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo mieć jasne wyobrażenie o tym, jak przeprowadzać protokoły szybkiej hodowli komórkowej post mortem z próbek guzów mózgu. Należy pamiętać, że praca z tkanką ludzką może być niebezpieczna, dlatego zawsze należy stosować środki ostrożności, takie jak noszenie środków ochrony osobistej i zachowanie zasad sterylności.

a-protocol-for-rapid-post-mortem-cell-culture-diffuse-intrinsic

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Badania nad rakiem

Ten film pokazuje proces izolowania i hodowli glejowych komórek progenitorowych z rozlanego wewnętrznego glejaka mostu, czyli tkanki pnia mózgu dotkniętej DIPG. Komórki glejowe wyizolowane z tkanki nowotworowej poprzez trawienie enzymatyczne są hodowane w pożywce neurobazalnej, co sprzyja ich wzrostowi i rozwojowi swobodnie unoszących się neurosfer.

Izolowanie i hodowla komórek z rozlanego glejaka wewnętrznego mostu

Złośliwe glejaki stanowią niejednorodną grupę wysoce naciekających nowotworów glejowych o wyraźnych cechach klinicznych i molekularnych. Pierwszorzędowe ksenoprzeszczepy ortotopowe podsumowują histopopatologiczne i molekularne cechy podtypów glejaka złośliwego w przedklinicznych modelach zwierzęcych.

Pierwotne ksenoprzeszczepy glejaka ortotopowego podsumowują wzrost naciekowy i mutację dehydrogenazy izocytrynianowej I

Protokół rozmnażania zdysocjowanych próbek chirurgicznych glejaka wysokiego stopnia w pożywce neurosfery wolnej od surowicy do selekcji komórek o fenotypie rakowych komórek macierzystych. W przypadku próbek, które nie rosną jako neurosfery, sugerowany jest alternatywny protokół. Opisano technikę zatapiania parafiny w celu utrzymania architektury neurosfery 3D dla immunocytochemii.

Optymalizacja hodowli komórek glejaka o wysokim stopniu złośliwości z próbek chirurgicznych do zastosowania w klinicznie istotnych modelach zwierzęcych i immunochemii 3D

Ustaliliśmy korowy model glejaka ortotopowego u myszy do przyżyciowej mikroskopii dwufotonowej, który podsumowuje ograniczenia biofizyczne, które normalnie występują podczas wzrostu guza. Przewlekłe szklane okienko zastępujące czaszkę nad guzem umożliwia śledzenie postępu guza w czasie za pomocą mikroskopii dwufotonowej.

Ortotopowy mysi model glejaka wielopostaciowego utrzymujący fizyczne ograniczenia miąższu mózgu i nadający się do przyżyciowej mikroskopii dwufotonowej

Przedstawiona tutaj jest prosta metoda izolacji i analizy metodą cytometrii przepływowej komórek jednojądrzastych krwi obwodowej naciekającej glejak, która dostarcza zależnych od czasu danych ilościowych na temat liczby i statusu aktywacji komórek odpornościowych wchodzących do wczesnego mikrośrodowiska guza mózgu.

Izolacja i analiza cytometryczna przepływowa jednojądrzastych komórek krwi obwodowej naciekających glejaka

Tutaj prezentujemy system mieszanych hodowli jednowarstwowych ex-vivo do badania migracji ludzkich komórek glejaka (hGC) w czasie rzeczywistym. Model ten zapewnia możliwość obserwowania interakcji między hGC a aksonami mielinizowanymi i niemielinizowanymi w obrębie komory z przedziałami.

Monitorowanie w czasie rzeczywistym migracji komórek ludzkiego glejaka w kokulturach aksonów i oligodendrocytów w zwoju korzenia grzbietowego

Ta praca opisuje rozwój elastycznych elektrod międzypalcowych do implementacji w modelach 3D guzów mózgu, a mianowicie w hodowli in vitro, modelu in ovo i modelu mysim in vivo. Proponowana metoda może być wykorzystana do oceny wpływu pulsacyjnych pól elektrycznych na nowotwory na różnych poziomach złożoności.

Elastyczne organiczne urządzenia elektroniczne do terapii pulsacyjnym polem elektrycznym glejaka

To badanie wprowadza zautomatyzowaną metodę generowania trójwymiarowych organoidów glejaka pochodzących od pacjenta za pomocą rozdrabniacza tkanek. Metoda zapewnia odpowiednie i skuteczne podejście do pozyskiwania takich organoidów do badań terapeutycznych.

Hodowla organoidów glejaka pochodzącego od pacjenta ex vivo za pomocą rozdrabniacza tkanek

Prezentujemy nowatorskie podejście do dwufotonowej mikroskopii dostarczania przez nowotwór znakowanych fluorescencyjnie nanocząstek tlenku żelaza do glejaka w modelu mysim.

Dwufotonowa mikroskopia przyżyteczna glejaka w modelu mysim

Zmutowane IDH1 rozlane glejaki o niskim stopniu złośliwości to rzadkie nowotwory, które są trudne do hodowli. Wprowadzamy prostą, nieenzymatyczną metodę eksplantacji, która zachowuje ekspresję białka z mutacją IDH1 i utrzymuje kultury przez wiele miesięcy. Co ważne, technika ta działa w przypadku kriokonserwowanych guzów, oferując cenne źródło informacji do badań nad glejakiem.

Protokół dla eksplantatów rozlanych glejaków o niskim stopniu złośliwości z mutacją IDH1

Poznaj protokół szybkiej pośmiertnej hodowli komórkowej rozlanego wewnętrznego glejaka mostu (DIPG). Ta metoda umożliwia bezpośrednie badanie biologii komórek pochodzących od pacjenta i testowanie strategii terapeutycznych.

Protokół szybkiej pośmiertnej hodowli komórkowej rozlanego wewnętrznego glejaka mostu (DIPG)

Przeglądaj więcej filmów