Protokół szybkiej pośmiertnej hodowli komórkowej rozlanego wewnętrznego glejaka mostu (DIPG)

Ogólnym celem tego protokołu szybkiej pośmiertnej hodowli komórek jest wygenerowanie trwałych, pochodzących od pacjenta kultur komórkowych rozlanego glejaka mostu, aby ułatwić eksperymenty niezbędne do zrozumienia i ostatecznie opracowania skutecznych terapii DIPG. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania dotyczące podstawowej biologii i strategii terapeutycznych rozlanego glejaka mostu, takie jak to, czy niektóre leki działają w różnych kulturach pochodzących od pacjentów. Główną zaletą tej techniki jest to, że umożliwia bezpośrednie badanie biologii komórek pochodzących od pacjenta.

Implikacje tej techniki rozciągają się na terapię DIPG, ponieważ pozwala ona na testowanie różnych strategii terapeutycznych w różnych podtypach genetycznych choroby. Chociaż ta metoda może zapewnić wgląd w DIPG, może być również stosowana do innych chorób, takich jak inne glejaki wysokiego stopnia u dzieci, glejaki u dorosłych lub inne nowotwory ośrodkowego układu nerwowego. Ogólnie rzecz biorąc, osoby, które dopiero zaczynają przygodę z tą techniką, będą miały trudności, ponieważ trudno jest pozyskać i szybko przetworzyć próbki autopsyjne w efektywny sposób.

Przed przygotowaniem próbki wysterylizuj kaptur do hodowli tkankowych wraz z żyletkami, zakrzywionymi hemostatykami i innymi niesterylnymi narzędziami w świetle UV przez godzinę i wykonaj wszystkie poniższe czynności w sterylnych warunkach. Następnie przenieś tkankę do wysokościennego naczynia do hodowli komórek o wymiarach 100 milimetrów na 20 milimetrów. Usuń pożywkę pozostałą po wysyłce i zastąp ją 10 do 15 mililitrami zimnej pożywki hodowlanej.

Następnie, używając zakrzywionych hemostatów do chwycenia żyletki, drobno zmiel tkankę, usuwając naczynia krwionośne lub opony mózgowe. Końcowe fragmenty tkanki powinny być mniejsze niż jeden milimetr. Następnie przenieś tkankę do czystej stożkowej rurki o pojemności 50 mililitrów.

Umyć naczynie do hodowli komórkowych dodatkowymi pięcioma mililitrami zimnej pożywki hodowlanej i przenieść próbkę do stożkowej probówki. W razie potrzeby powtórz ten etap mycia, aby przenieść pozostałą tkankę. Za pomocą 10-mililitrowej pipety serologicznej delikatnie rozcieraj próbkę cztery do pięciu razy.

Pozwól, aby większe fragmenty tkanki osiadły na dnie probówki. W razie potrzeby krótko odwirować próbkę przez jedną minutę. Aby zebrać zdysocjowaną frakcję, usuń supernatant i przefiltruj przez filtr 100 mikronów do nowej 50-mililitrowej stożkowej rurki oznaczonej dysocjacją mechaniczną.

Odwróć filtr nad oryginalną stożkową rurką i umyj go pożywką hodowlaną, aby odzyskać fragmenty tkanki. Następnie odwirować mechaniczną frakcję dysocjacyjną przez pięć minut. Następnie usunąć supernatant z granulowanej frakcji dysocjacji mechanicznej i ponownie zawiesić tkankę w zimnej pożywce hodowlanej.

Jeśli w stożkowej rurce do dysocjacji mechanicznej znajduje się więcej niż pięć mililitrów tkanki, podziel tkankę na inne 50-mililitrowe stożkowe rurki tak, aby żadna rurka nie zawierała więcej niż pięć mililitrów tkanki. Następnie należy przechowywać mechanicznie zdysocjowaną frakcję na lodzie do momentu etapu wirowania w gradiacji sacharozy. W tej procedurze należy odwirować stożkową probówkę zawierającą pozostałe fragmenty tkanki przez pięć minut.

Następnie usuń sklarowany osad i dodaj wstępnie podgrzany roztwór do trawienia enzymatycznego, tak aby na każdy mililitr tkanki przypadało pięć mililitrów roztworu trawiącego. Następnie uszczelnij stożkową pokrywę probówki folią laboratoryjną i inkubuj reakcję na rotatorze w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 30 minut. Po inkubacji próbki należy delikatnie rozcierać.

Używając 10-mililitrowej pipety serologicznej, pipetuj próbkę w górę iw dół od sześciu do ośmiu razy, unikając generowania nadmiernych pęcherzyków powietrza. Następnie dodaj końcówkę pipety o pojemności 1 000 mikrolitrów na końcu pipety i rozcieraj próbkę przez dodatkowe sześć do ośmiu razy. Pozwól, aby pozostałe kawałki osiadły na dnie tuby.

Następnie usuń i przefiltruj supernatant z komórkami nadal zawieszonymi przez filtr 100 mikronów do nowej 50-mililitrowej stożkowej rurki oznaczonej dysocjacją enzymatyczną i przechowuj ją na lodzie. Następnie odwiruj enzymatyczną probówkę dysocjacyjną przez pięć minut i kontynuuj wirowanie w gradiacji sacharozy. Jeśli próbka jest nadal zawieszona w roztworze, odwirować ją przez pięć minut.

Następnie usuń supernatant i ponownie zawieś tkankę w 20 mililitrach zimnego HBSS bez wapnia i magnezu. Następnie zwiększ objętość do 25 mililitrów zimnym HBSS. Powoli dodaj 25 mililitrów 1,8-molowego roztworu sacharozy i odwróć probówkę, aby wymieszać.

Daje to gradient sacharozy 0,9 molowej. Następnie odwirować próbkę bez przerwy przez 10 minut. Ostrożnie odessać resztki mieliny w jak największej ilości roztworu sacharozy i sacharozy.

Następnie umyj próbkę, dodając 30 mililitrów zimnego HBSS bez wapnia i magnezu i delikatnie mieszając. Następnie odwiruj go przez pięć minut. W tej procedurze usuń supernatant do mycia.

Dodaj pięć mililitrów buforu do lizy ACK i delikatnie ponownie zawiesić osad komórkowy, obracając probówkę przez jedną minutę w temperaturze pokojowej. Następnie ugasić lizę, dodając 30 mililitrów zimnego HBSS bez wapnia i magnezu. Następnie odwiruj go przez pięć minut.

Ponownie zawiesić końcową osadkę komórkową w 10 do 15 mililitrach ciepłego kompletnego TSM z czynnikami wzrostu i określić ilościowo gęstość żywotnych komórek na hemocytometrze, stosując wykluczenie błękitu trypanowego. Następnie przenieść ostatnią zawiesinę komórek do nowej kolby hodowlanej T75. Dodawaj dodatkowe czynniki wzrostu co drugi dzień, aby utrzymać ogólny poziom czynnika wzrostu i monitorować rozwój neurosfer komórek nowotworowych.

Oto różne przykłady tego, jak próbki mogą wyglądać od wczesnych etapów hodowli do trwałej kultury. Początkowo posiew i wczesne hodowle często nie wydają się zawierać wielu ocalałych komórek. Co więcej, wczesne skupiska komórek często nie wykazują stopnia kontrastu typowego dla neurosfer.

Jednak początkowe przejście tych klastrów komórkowych, w połączeniu z odwrotnym filtrowaniem klastrów komórkowych, może wyizolować zdrowe komórki nowotworowe, które są w stanie tworzyć kule. Przesącz zazwyczaj zawiera resztki zanieczyszczeń. Te próbki pochodzące od pacjentów mogą być następnie utrzymywane w kulturze przez wiele pasaży.

Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w ciągu trzech do czterech godzin, jeśli zostanie wykonana prawidłowo. Podczas próby wykonania tej procedury ważne jest, aby upewnić się, że próbka jest utrzymywana w niskiej temperaturze na każdym etapie z wyjątkiem dysocjacji enzymatycznej i zminimalizować traumatyczne obchodzenie się z próbką. Po tej procedurze można przeprowadzić dodatkowe badania, takie jak badania przesiewowe leków in vitro lub ksenograf ortotopowy, aby odpowiedzieć na kolejne pytania dotyczące patobiologii DIPG.

Po opracowaniu, ta technika hodowli utorowała drogę naukowcom w dziedzinie neuroonkologii dziecięcej do zbadania nowych ścieżek terapeutycznych dla dzieci z DIPG. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś mieć dobry pomysł na to, jak wykonać szybkie protokoły pośmiertnej hodowli komórek na próbkach guza mózgu. Nie zapominaj, że praca z tkankami ludzkimi może być niebezpieczna i zawsze należy stosować środki ostrożności, takie jak noszenie środków ochrony osobistej i sterylna technika.