Name: Protokoły wizualizacji narządów steroidogennych i ich interaktywnych narządów z barwieniem immunologicznym u muszki owocowej Drosophila melanogaster (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-04-14T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 10 s
Description: Poznaj protokół wizualizacji narządów steroidogennych u Drosophila melanogaster z zachowaniem unerwienia. Metoda immunobarwienia umożliwia badanie biosyntezy hormonów steroidowych i mechanizmów neuronalnych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Reiko Kise i Tomotsune Ameku za ich wsparcie techniczne dla tej pracy. Jesteśmy również wdzięczni Kei Ito, Oldze Alekseyenko, Akiko Koto, Masayuki Miura, Bloomington Drosophila Stock Center, KYOTO Stock Center (DGRC) oraz Developmental Studies Hybridoma Bank za zapasy i odczynniki. Praca ta została wsparta grantami dla Y.S.N. z JSPS KAKENHI Grant Number 16K20945, The Naito Foundation i Inoue Science Research Award; oraz poprzez dotację na rzecz R.N. z MEXT KAKENHI Grant Number 16H04792.

UWAGA: Ogólny schemat protokołów jest pokazany w Rysunek 1.
1. Rozwarstwienie larwalnego gruczołu pierścieniowego (RG)
UWAGA: W D. melanogaster, który należy do cyklorhaphous Diptera, PG znajduje się w złożonym narządzie endokrynnym zwanym gruczołem pierścieniowym (RG, <silna klasa = "xfig">Ryc. 2D). Ponieważ niewykonalne jest, aby PG został chirurgicznie oddzielony od innych typów komórek (omówionych później), praktycznym celem jest wyizolowanie nienaruszonego, nieuszkodzonego RG przez sekcję.
<ol>
	<li>Przygotowanie larw w odpowiednich stadiach rozwojowych 
	UWAGA: Aby zsynchronizować etapy rozwojowe larw D. melanogaster, konieczne jest zbieranie jaj w wąskim oknie czasowym i zbieranie larw w odpowiednim czasie.
	<ol>
		<li>Zbieraj jajka przez 2 godziny na talerzu agarowym z sokiem winogronowym w temperaturze 25 °C.</li>
		<li>Zebrać nowo wyklute larwy 1st instar pod mikroskopem preparacyjnym za pomocą kleszczy i przenieść je do małej fiolki zawierającej puree z drożdży standardowych/mąki kukurydzianej na muchy. 
		UWAGA: Wiek larw jest reprezentowany przez "godziny po złożeniu jaj (hAEL)", "godziny po wykluciu (hAH)" lub "godziny po ekdyzie L3 (hAL3E)".</li>
		<li>W odpowiednim momencie zbierz zainscenizowane larwy za pomocą jednorazowej plastikowej pętli, aby uniknąć niepożądanych obrażeń. Aby zminimalizować różnicę w postępie rozwojowym larw w 3.stadium rozwojowym, należy zebrać larwy 2. stadium w wieku 70 hAEL (48 hAH) i pozwolić im linieć w odstępach 2-godzinnych. Następnie zbierz larwy 3.stadium rozwojowe w ciągu 2 godzin po ekdyzie L3; ta procedura daje 0-2 larwy hAL3E.</li>
		<li>Przenieść stadia larwy do naczynia wypełnionego solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS).</li>
		<li>Opłucz larwy PBS, aby usunąć resztki pokarmu z organizmu.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zgrubna sekcja larw pod mikroskopem preparacyjnym
	<ol>
		<li>Przytrzymaj haczyk na usta larwy za pomocą kleszczy. Odetnij ciało larwy w przedniej jednej trzeciej długości ciała za pomocą mikronożyczek.</li>
		<li>Przytrzymaj odcięty koniec przedniego ciała larwy jedną parą kleszczy. Używając drugiej pary kleszczy, delikatnie popchnij czubek głowy w kierunku wnętrza ciała; Ta procedura wywraca ciało larwy na lewą stronę. 
		UWAGA: Ten krok można pominąć w przypadku sekcji larw 1st instadium.</li>
		<li>Powtórz kroki 1.2.1-1.2.2 z dodatkowymi larwami przez 5-10 min. 
		UWAGA: Liczba larw powinna być równa lub mniejsza niż 20, aby zaoszczędzić czas na rozebranie.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Preparacja filetów larw<br />
	UWAGA: Ta metoda pozwala na utrzymanie pozycji tkanek w stanie nienaruszonym.
	<ol>
		<li>Pozostaw larwy w wodzie tylko na 1 godzinę. Larwy są unieruchomione z powodu uduszenia.</li>
		<li>Umieść larwę grzbietową stroną do góry w kropli PBS na naczyniu pokrytym silikonem, grzbietem do góry. 
		UWAGA: Po stronie grzbietowej znajdują się 2 rurki tchawicy biegnące wzdłużnie.</li>
		<li>Pod mikroskopem preparacyjnym wbij szpilkę do owada w przedni koniec larwy za pomocą kleszczy. Rozciągnij ciało larwy na tylną stronę i wbij drugą szpilkę w tylny koniec larwy. 
		UWAGA: Oprócz szpilek przeciw owadom przydatna może być igła wykonana z drutu wolframowego21. Igła może być osadzona w końcówce pipety poprzez ogrzewanie w celu użycia jako igła preparacyjna.</li>
		<li>Pod mikroskopem preparacyjnym wykonaj małe nacięcie w pobliżu ogona mikronożyczkami. Od nacięcia odetnij naskórek grzbietowy wzdłuż grzbietowej linii środkowej w kierunku głowy. Uważaj, aby nie uszkodzić tkanek pod naskórkiem.</li>
		<li>Rozciągnij naskórek bodywall z każdej strony i umieść 4 szpilki w każdym rogu rozciętej ściany ciała.</li>
		<li>Usuń część przedniej części ciała tłuszczowego za pomocą kleszczy, aby odsłonić kompleks mózg-RG na powierzchni. W razie potrzeby usuń parę gruczołów ślinowych.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Utrwalanie i barwienie tkanek za pomocą immunohistochemii
	<ol>
		<li>Umieścić przednią jedną trzecią ciał larw (krok 1.2.2) do mikroprobówki o pojemności 1,5 ml wypełnionej 500 μl roztworu utrwalającego (4% paraformaldehydu w PBS). Jednorazowo należy ustalić mniej niż 20 próbek, w przeciwnym razie PBS dołączony do utrwalonych próbek może spowodować niekorzystne rozcieńczenie utrwalacza. W celu rozbioru filetów usuń kroplę PBS, a następnie dodaj kroplę roztworu utrwalającego. 
		UWAGA: Do roztworu utrwalającego można użyć 3,7% formaldehydu lub 4% paraformaldehydu.</li>
		<li>Wypreparowane tkanki inkubować w roztworze utrwalającym przez 30 minut w temperaturze pokojowej (RT) lub alternatywnie przez 2 godziny w temperaturze 4 °C.</li>
		<li>Zastąp roztwór utrwalający 500 μl PBS i szybko przepłucz próbki 3 razy. Przemyć próbki 500 μl 0,3% PBT (PBS + 0,3% etoksylowany oktylofenol) przez 15 minut na bujaku w temperaturze pokojowej. W celu rozbioru filetów należy usunąć szpilki owadów i przenieść próbki do mikroprobówki o pojemności 1,5 ml. 
		UWAGA: W celu zwiększenia przepuszczalności przeciwciał w tkankach, próbki poddaje się działaniu 500 μl 2,0% PBT przez 1-2 godziny na kołysce w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Zastąp PBT 500 μl roztworu blokującego (2% albuminy surowicy bydlęcej w PBT). Próbki należy inkubować przez 1,5 godziny na kołysce w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Zastąp roztwór blokujący 50 μl roztworem przeciwciał pierwszorzędowych, tj. przeciwciałami rozcieńczonymi w roztworze blokującym.</li>
		<li>Próbki należy inkubować przez noc na bujaku w temperaturze 4 °C.</li>
		<li>Zastąp pierwszorzędowy roztwór przeciwciała 500 μl 0,3% PBT i szybko przepłucz próbki 5 razy. Przemyj próbki 3 razy 500 μl 0,3% PBT przez 15 minut każda na bujaczku w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Zastąp 0,3% PBT 50 μl roztworem przeciwciała drugorzędowego (przeciwciała sprzężone z barwnikiem rozcieńczone w roztworze blokującym). Do barwienia jądrowego 0,5 μl 4',6-diamidyno-2-fenyloindolu (DAPI, 0,1 mg/ml roztworu podstawowego) dodaje się do 50 μl roztworu. Próbki inkubować na bujaku przez 2 godziny w temperaturze pokojowej lub alternatywnie w temperaturze 4 °C przez noc. 
		UWAGA: Próbki należy przechowywać w ciemności.</li>
		<li>Zastąp roztwór przeciwciała 500 μl 0,3% PBT i spłucz 5 razy. Przemyć próbki 3 razy 500 μl 0,3% PBT przez 15 minut każda w temperaturze pokojowej.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Dokładna sekcja kompleksu mózg-RG zawierającego PG i montaż
	<ol>
		<li>Użyj jednorazowej pipety, aby przenieść próbki wybarwione immunologicznie do naczynia wypełnionego 0,3% PBT. 
		UWAGA: Aby uniknąć niewygodnych pęcherzyków powietrza podczas preparowania i montażu, 0,3% PBT można zastąpić PBS.</li>
		<li>Pod mikroskopem preparacyjnym przytrzymaj naskórek lub haczyk do ust jedną parą kleszczy. Używając igły 27 G dołączonej do strzykawki o pojemności 1 ml jako "noża", odetnij przedni koniec przełyku i krążki oka, aby usunąć kompleks dysk mózg-RG-oko z naskórka ciała.</li>
		<li>Oddziel przełyk i jelito od kompleksu mózg-RG-dysk oko za pomocą kleszczy. Ponieważ przełyk przechodzi przez mózg powyżej brzusznego rdzenia nerwowego (VNC), wyciągnij jelito na tylną stronę. 
		UWAGA: Aby usunąć dodatkowe wyimaginowane dyski z próbek, przetnij połączenia między mózgiem, dyskami oczu i dyskami nóg za pomocą noża do igieł.</li>
		<li>Powtórz kroki 1.5.1-1.5.4 dla innych próbek. 
		UWAGA: Aby zapobiec przywieraniu resztek tkanek do próbek, każdą ukończoną próbkę należy przenieść do innego czystego naczynia wypełnionego 0.3% PBT lub PBS.</li>
		<li>Przenieść próbki do środka czystego szkiełka za pomocą mikropipety. 
		UWAGA: W przypadku larw w 2. lub 3. stadium rozwojowym koniec końcówki mikropipety należy obciąć żyletką.</li>
		<li>Pod mikroskopem preparacyjnym wyrównaj poszczególne próbki grzbietową stroną do góry za pomocą kleszczy. 
		UWAGA: RG znajduje się po grzbietowej stronie mózgu (<silna klasa="xfig">Ryc. 2A). To wyrównanie ułatwia specyfikację poszczególnych próbek podczas obrazowania.</li>
		<li>Przechyl szklane szkiełko i zetrzyj jak najwięcej nadmiaru PBT. Umieść kroplę odczynnika montażowego z boku szkiełka. Umieść krawędź szkiełka nakrywkowego z drugiej strony kropli i powoli nakładaj szkiełko nakrywkowe na próbki za pomocą kleszczyków. 
		UWAGA: Ta procedura zapobiega przemieszczaniu się próbek poza szkiełko nakrywkowe.</li>
		<li>Przechowywać próbki w temperaturze 4 °C. Przechowywać próbki w ciemności.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Rozwarstwienie jajnika u dorosłych kobiet
<ol>
	<li>Przygotowanie dorosłych samic
	<ol>
		<li>Karm samice much standardowym pokarmem na muchy drożdżowe/kukurydzianym przez 3-4 dni, aby utuczyć jajnik. Przechowywać w temperaturze 25 °C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Rozwarstwienie jajnika dorosłej kobiety
	<ol>
		<li>Znieczulij samice much gazem CO2 i odetnij im głowy.</li>
		<li>Przenieś ciała much do 3 cm naczynia wypełnionego PBS.</li>
		<li>Pod mikroskopem preparacyjnym przytrzymaj klatkę piersiową po stronie grzbietowej za pomocą kleszczy. Chwyć segment brzuszny A5 lub A6 innymi kleszczami i oderwij naskórek brzucha w kierunku tylnej strony. Zetrzyj lepki naskórek z końcówki kleszczy.</li>
		<li>Uszczypnij jajowód i wyjmij jajnik z ciała.</li>
		<li>Rozczesz i rozprowadź końcówki jajnika za pomocą kleszczy. 
		UWAGA: Ta operacja poprawia skuteczność barwienia immunologicznego.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Preparacja mózgu dorosłej kobiety, VNC i narządów rozrodczych. 
	UWAGA: Ta metoda pozwala na utrzymanie unerwienia jajnika w stanie nienaruszonym.
	<ol>
		<li>Znieczulij samice much gazem CO2 i przenieś je do naczynia pokrytego silikonem wypełnionego PBS.</li>
		<li>Pod mikroskopem preparacyjnym przytrzymaj trąbkę i oderwij naskórek głowy, aby odsłonić mózg za pomocą kleszczy. Usuń tchawicę przyczepioną do mózgu. 
		UWAGA: Mózg jest białą i zaokrągloną strukturą. Mózg łączy się z VNC w klatce piersiowej.</li>
		<li>Przytrzymaj klatkę piersiową po stronie grzbietowej i odetnij nogi i skrzydła jedną parą kleszczy. Za pomocą drugiej pary kleszczy oderwij naskórek brzuszny klatki piersiowej od podstawy nóg. Po odsłonięciu VNC usuń resztki naskórka grzbietowego i mięśnie przyczepione do VNC za pomocą kleszczy. Uważaj, aby nie uszkodzić połączenia między mózgiem a VNC.</li>
		<li>Użyj kleszczy, aby oderwać naskórek brzucha i odsłonić jajnik oraz ich interaktywne narządy, w tym neurony, plon, jelita, jajowód, macicę i gruczoł dodatkowy.</li>
		<li>Usuń resztki tkanek, w tym tchawicę i ciało tłuszczowe, za pomocą kleszczy.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Utrwalanie i barwienie tkanek za pomocą immunohistochemii
	<ol>
		<li>Przenieść około 8-10 par jajników do mikroprobówki o pojemności 1,5 ml wypełnionej 250 μl roztworu utrwalającego (4% paraformaldehydu w PBS) i inkubować próbki przez 30 minut w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Zastąp roztwór utrwalający 500 μl PBS i szybko przepłucz próbki 3 razy.</li>
		<li>Przemyć próbki 2 razy 500 μl 0,1% PBT przez 5 minut każda w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Zastąp PBT 50 μl roztworu blokującego. Próbki należy inkubować przez 1 godzinę na bujaku w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Zastąp roztwór blokujący 50 μl roztworu przeciwciała pierwszorzędowego.</li>
		<li>Próbki należy inkubować przez noc na bujaku w temperaturze 4 °C.</li>
		<li>Zastąp pierwszorzędowy roztwór przeciwciała 500 μl 0,1% PBT. Przemyj próbki 3 razy 500 μl 0,1% PBT przez 15 minut każda na bujaku w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Zastąp 0,1% PBT 50 μl roztworem przeciwciał drugorzędowych. W przypadku barwienia jądrowego dodać 0,5 μl DAPI do 50 μl roztworu. Inkubować próbki przez 2 godziny na wahaczu w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Zastąp drugorzędowy roztwór przeciwciała 500 μl 0,1% PBT. Przemyć próbki 3 razy 500 μl 0,1% PBT przez 15 minut każda na bujaku w temperaturze RT. 
		UWAGA: Procedurę prania można wykonać w temperaturze 4 °C przez noc. Próbki należy przechowywać w ciemności.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Mocowanie próbek na szkiełkach podstawowych
	<ol>
		<li>Przenieść próbki do szkiełka podstawowego z 0,1% PBT za pomocą mikropipety. 
		UWAGA: Aby uniknąć niewygodnych pęcherzyków podczas sekcji i montażu, 0,1% PBT można zastąpić PBS.</li>
		<li>W przypadku jajnika oddziel sznurki jajników od siebie kleszczami pod mikroskopem preparacyjnym. Nie uszkadzać końcówek jajników zawierających germaria. W przypadku kompleksu mózg-VNC-narząd rozrodczy usuń resztki naskórka i ułóż pozycję na szkiełku podstawowym.</li>
		<li>Zetrzyj jak najwięcej nadmiaru PBT i umieść kroplę odczynnika montażowego na środku próbek. Powoli nakładaj szkiełko nakrywkowe za pomocą kleszczy.</li>
		<li>Przechowywać próbki w temperaturze 4 °C. Przechowywać próbki w ciemności.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Obrazowanie za pomocą konfokalnego laserowego mikroskopu skaningowego
<ol>
	<li>Obserwuj próbki pod mikroskopem i umieść narządy steroidogenne w polu widzenia. Po ustaleniu widoku przełącz system obrazowania w tryb akwizycji obrazu. 
	UWAGA: Soczewki obiektywowe 10-20X służą do uzyskiwania obrazów kompleksu mózg-RG lub całego jajnika. Alternatywnie, soczewki obiektywowe 40-63X (zanurzenie w wodzie lub oleju) są używane do wizualizacji subkomórkowej lokalizacji białek w GSC lub unerwienia neuronów PG i jajnika.</li>
	<li>Ustaw parametry akwizycji obrazu na podłączonym oprogramowaniu. Wybierz kombinację fluorescencji (np. GFP i RFP). Dzięki szybkiej procedurze skanowania dostosuj moc lasera, czułość detektorów (wzmocnienie/przesunięcie) oraz rozmiar otworka. 
	UWAGA: Aby uzyskać obrazy w wysokiej jakości, moc lasera skanującego i czułość detektora (wzmocnienie) powinny być zoptymalizowane dla każdej próbki. Aby nakreślić kształt tkanek, oprócz obrazu fluorescencyjnego można wykonać obraz w świetle przechodzącym.</li>
	<li>Zrób stosy Z obrazów. Podczas ciągłego szybkiego skanowania przesuń płaszczyznę ogniskowej z napędem ostrości mikroskopu i ustaw pozycję początkową i pozycję końcową. Liczba wycinków i odstęp między plasterkami są odpowiednio dostosowywane.</li>
	<li>Wybierz szybkość skanowania, metodę skanowania i tryb skanowania dwukierunkowego.</li>
	<li>"Rozpocznij prawdziwe skanowanie" w celu uzyskania obrazu.</li>
	<li>Zapisz obraz w formacie dołączonego oprogramowania. 
	UWAGA: Oryginalne pliki obrazów zawierają informacje o parametrach akwizycji obrazu i skalach. Wyeksportowane obrazy można przetwarzać za pomocą oprogramowania do przetwarzania obrazów na komputerze22.</li>
</ol>

<ol><li>Miller, W. L., Auchus, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Molecular+Biology%2C+Biochemistry%2C+and+Physiology+of+Human+Steroidogenesis+and+Its+Disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Endocr.+Rev%22%5BJournal%5D)">The Molecular Biology, Biochemistry, and Physiology of Human Steroidogenesis and Its Disorders.</a> Endocr. Rev. 32 (1), 81-151 (2011).</li>
<li>Rousseau, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fifty+years+ago%3A+The+quest+for+steroid+hormone+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell.+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">Fifty years ago: The quest for steroid hormone receptors.</a> Mol. Cell. Endocrinol. 375 (1), 10-13 (2013).</li>
<li>Gilbert, L. I., Rybczynski, R., Warren, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+and+biochemical+nature+of+the+ecdysteroidogenic+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Entomol%22%5BJournal%5D)">Control and biochemical nature of the ecdysteroidogenic pathway.</a> Annu. Rev. Entomol. 47, 883-916 (2002).</li>
<li>Niwa, R., Niwa, Y. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzymes+for+ecdysteroid+biosynthesis%3A+their+biological+functions+in+insects+and+beyond%5BTitle%5D)+AND+%22Biosci.+Biotechnol.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Enzymes for ecdysteroid biosynthesis: their biological functions in insects and beyond.</a> Biosci. Biotechnol. Biochem. 78 (8), 1283-1292 (2014).</li>
<li>Kozlova, T., Thummel, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Steroid+regulation+of+postembryonic+development+and+reproduction+in+drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Endocrinol.+Metab%22%5BJournal%5D)">Steroid regulation of postembryonic development and reproduction in drosophila.</a> Trends Endocrinol. Metab. 11 (7), 276-280 (2000).</li>
<li>Ishimoto, H., Kitamoto, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beyond+molting-roles+of+the+steroid+molting+hormone+ecdysone+in+regulation+of+memory+and+sleep+in+adult+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Fly%22%5BJournal%5D)">Beyond molting-roles of the steroid molting hormone ecdysone in regulation of memory and sleep in adult Drosophila.</a> Fly. 5 (3), 215-220 (2011).</li>
<li>Ishimoto, H., Sakai, T., Kitamoto, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ecdysone+signaling+regulates+the+formation+of+long-term+courtship+memory+in+adult+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Ecdysone signaling regulates the formation of long-term courtship memory in adult Drosophila melanogaster.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 106 (15), 6381-6386 (2009).</li>
<li>Simon, A. F., Shih, C., Mack, A., Benzer, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Steroid+control+of+longevity+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Steroid control of longevity in Drosophila melanogaster.</a> Science. 299 (5611), 1407-1410 (2003).</li>
<li>Buszczak, M., Freeman, M. R., Carlson, J. R., Bender, M., Cooley, L., Segraves, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((a+Ecdysone+response+genes+govern+egg+chamber+development+during+mid-oogenesis+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">a Ecdysone response genes govern egg chamber development during mid-oogenesis in Drosophila.</a> Development. 126 (20), 4581-4589 (1999).</li>
<li>Carney, G. E., Bender, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+drosophila+ecdysone+receptor+%28EcR%29+gene+is+required+maternally+for+normal+oogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">The drosophila ecdysone receptor (EcR) gene is required maternally for normal oogenesis.</a> Genetics. 154 (3), 1203-1211 (2000).</li>
<li>Uryu, O., Ameku, T., Niwa, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+progress+in+understanding+the+role+of+ecdysteroids+in+adult+insects%3A+Germline+development+and+circadian+clock+in+the+fruit+fly+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Zoological+Lett%22%5BJournal%5D)">Recent progress in understanding the role of ecdysteroids in adult insects: Germline development and circadian clock in the fruit fly Drosophila melanogaster.</a> Zoological Lett. 1, 32(2015).</li>
<li>Ameku, T., Niwa, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mating-Induced+Increase+in+Germline+Stem+Cells+via+the+Neuroendocrine+System+in+Female+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+Genet%22%5BJournal%5D)">Mating-Induced Increase in Germline Stem Cells via the Neuroendocrine System in Female Drosophila.</a> PLOS Genet. 12 (6), e1006123(2016).</li>
<li>Danielsen, E. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Drosophila+Genome-Wide+Screen+Identifies+Regulators+of+Steroid+Hormone+Production+and+Developmental+Timing%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Cell%22%5BJournal%5D)">A Drosophila Genome-Wide Screen Identifies Regulators of Steroid Hormone Production and Developmental Timing.</a> Dev. Cell. 37 (6), 558-570 (2016).</li>
<li>Ou, Q., Zeng, J., Yamanaka, N., Brakken-Thal, C., O'Connor, M. B., King-Jones, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Insect+Prothoracic+Gland+as+a+Model+for+Steroid+Hormone+Biosynthesis+and+Regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">The Insect Prothoracic Gland as a Model for Steroid Hormone Biosynthesis and Regulation.</a> Cell Rep. , (2016).</li>
<li>Yamanaka, N., Rewitz, K. F., O'Connor, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ecdysone+control+of+developmental+transitions%3A+lessons+from+Drosophila+research%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Entomol%22%5BJournal%5D)">Ecdysone control of developmental transitions: lessons from Drosophila research.</a> Annu. Rev. Entomol. 58, 497-516 (2013).</li>
<li>Niwa, Y. S., Niwa, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+regulation+of+insect+steroid+hormone+biosynthesis+and+its+role+in+controlling+timing+of+molting+and+metamorphosis%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Growth+Differ%22%5BJournal%5D)">Transcriptional regulation of insect steroid hormone biosynthesis and its role in controlling timing of molting and metamorphosis.</a> Dev. Growth Differ. 58, 94-105 (2015).</li>
<li>Monastirioti, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+octopamine+cell+population+residing+in+the+CNS+abdominal+ganglion+controls+ovulation+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Distinct octopamine cell population residing in the CNS abdominal ganglion controls ovulation in Drosophila melanogaster.</a> Dev. Biol. 264 (1), 38-49 (2003).</li>
<li>Siegmund, T., Korge, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Innervation+of+the+ring+gland+of+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Innervation of the ring gland of Drosophila melanogaster.</a> J. Comp. Neurol. 431 (4), 481-491 (2001).</li>
<li>McBrayer, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prothoracicotropic+Hormone+Regulates+Developmental+Timing+and+Body+Size+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Cell%22%5BJournal%5D)">Prothoracicotropic Hormone Regulates Developmental Timing and Body Size in Drosophila.</a> Dev. Cell. 13 (6), 857-871 (1979).</li>
<li>Shimada-Niwa, Y., Niwa, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serotonergic+neurons+respond+to+nutrients+and+regulate+the+timing+of+steroid+hormone+biosynthesis+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Commun%22%5BJournal%5D)">Serotonergic neurons respond to nutrients and regulate the timing of steroid hormone biosynthesis in Drosophila.</a> Nat. Commun. 5, 5778(2014).</li>
<li>Brady, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+technique+for+making+very+fine%2C+durable+dissecting+needles+by+sharpening+tungsten+wire+electrolytically%5BTitle%5D)+AND+%22Bull+World+Health+Organ%22%5BJournal%5D)">A simple technique for making very fine, durable dissecting needles by sharpening tungsten wire electrolytically.</a> Bull World Health Organ. 32 (1), 143-144 (1965).</li>
<li>Abramoff, M. D., Magalhães, P. J., Ram, S. J. <a target="_blank" href="https://imagescience.org/meijering/publications/download/bio2004.pdf">Image processing with ImageJ.</a> Biophotonics Int. 11 (7), 36-42 (2004).</li>
<li>Ohhara, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autocrine+regulation+of+ecdysone+synthesis+by+%CE%B23-octopamine+receptor+in+the+prothoracic+gland+is+essential+for+Drosophila+metamorphosis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Autocrine regulation of ecdysone synthesis by β3-octopamine receptor in the prothoracic gland is essential for Drosophila metamorphosis.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 112 (5), 1452-1457 (2015).</li>
<li>Gibbens, Y. Y., Warren, J. T., Gilbert, L. I., O'Connor, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuroendocrine+regulation+of+Drosophila+metamorphosis+requires+TGFbeta%2FActivin+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Neuroendocrine regulation of Drosophila metamorphosis requires TGFbeta/Activin signaling.</a> Development. 138 (13), 2693-2703 (2011).</li>
<li>Parvy, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+role+for+%CE%B2FTZ-F1+in+regulating+ecdysteroid+titers+during+post-embryonic+development+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">A role for βFTZ-F1 in regulating ecdysteroid titers during post-embryonic development in Drosophila melanogaster.</a> Dev. Biol. 282 (1), 84-94 (2005).</li>
<li>Parvy, J. -P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Forward+and+feedback+regulation+of+cyclic+steroid+production+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Forward and feedback regulation of cyclic steroid production in Drosophila melanogaster.</a> Development. 141 (20), 3955-3965 (2014).</li>
<li>Brand, A. H., Perrimon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+gene+expression+as+a+means+of+altering+cell+fates+and+generating+dominant+phenotypes%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes.</a> Development. 118 (2), 401-415 (1993).</li>
<li>Rewitz, K. F., Yamanaka, N., Gilbert, L. I., O'Connor, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Insect+Neuropeptide+PTTH+Activates+Receptor+Tyrosine+Kinase+Torso+to+Initiate+Metamorphosis%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The Insect Neuropeptide PTTH Activates Receptor Tyrosine Kinase Torso to Initiate Metamorphosis.</a> Science. 326 (5958), 1403-1405 (2009).</li>
<li>Li, H. -H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+GAL4+driver+resource+for+developmental+and+behavioral+studies+on+the+larval+CNS+of+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">A GAL4 driver resource for developmental and behavioral studies on the larval CNS of Drosophila.</a> Cell Rep. 8 (3), 897-908 (2014).</li>
<li>Alekseyenko, O. V., Lee, C., Kravitz, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+manipulation+of+serotonergic+neurotransmission+affects+the+escalation+of+aggression+in+adult+male+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+One%22%5BJournal%5D)">Targeted manipulation of serotonergic neurotransmission affects the escalation of aggression in adult male Drosophila melanogaster.</a> PLOS One. 5 (5), e10806(2010).</li>
<li>Domanitskaya, E., Anllo, L., Schüpbach, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phantom%2C+a+cytochrome+P450+enzyme+essential+for+ecdysone+biosynthesis%2C+plays+a+critical+role+in+the+control+of+border+cell+migration+in+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Phantom, a cytochrome P450 enzyme essential for ecdysone biosynthesis, plays a critical role in the control of border cell migration in in Drosophila.</a> Dev. Biol. 386 (2), 408-418 (2014).</li>
<li>Song, X., Zhu, C. -H., Doan, C., Xie, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Germline+stem+cells+anchored+by+adherens+junctions+in+the+Drosophila+ovary+niches%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Germline stem cells anchored by adherens junctions in the Drosophila ovary niches.</a> Science. 296 (5574), 1855-1857 (2002).</li>
<li>Niwa, Y. S., Niwa, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+control+of+steroid+hormone+biosynthesis+during+development+in+the+fruit+fly+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Genet.+Syst%22%5BJournal%5D)">Neural control of steroid hormone biosynthesis during development in the fruit fly Drosophila melanogaster.</a> Genes Genet. Syst. 89 (1), 27-34 (2014).</li>
<li>Yoshiyama-Yanagawa, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+conserved+Rieske+oxygenase+DAF-36%2FNeverland+is+a+novel+cholesterol-metabolizing+enzyme%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">The conserved Rieske oxygenase DAF-36/Neverland is a novel cholesterol-metabolizing enzyme.</a> J. Biol. Chem. 286 (29), 25756-25762 (2011).</li>
<li>Niwa, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-molting+glossy%2Fshroud+encodes+a+short-chain+dehydrogenase%2Freductase+that+functions+in+the+%26%2334%3BBlack+Box%26%2334%3B+of+the+ecdysteroid+biosynthesis+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Non-molting glossy/shroud encodes a short-chain dehydrogenase/reductase that functions in the &#34;Black Box&#34; of the ecdysteroid biosynthesis pathway.</a> Development. 137 (12), 1991-1999 (2010).</li>
<li>Komura-Kawa, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Drosophila+Zinc+Finger+Transcription+Factor+Ouija+Board+Controls+Ecdysteroid+Biosynthesis+through+Specific+Regulation+of+spookier%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+Genet%22%5BJournal%5D)">The Drosophila Zinc Finger Transcription Factor Ouija Board Controls Ecdysteroid Biosynthesis through Specific Regulation of spookier.</a> PLOS Genet. 11 (12), e1005712(2015).</li>
<li>Yamanaka, N., Marqués, G., O'Connor, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vesicle-Mediated+Steroid+Hormone+Secretion+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Vesicle-Mediated Steroid Hormone Secretion in Drosophila melanogaster.</a> Cell. 163 (4), 907-919 (2015).</li>
<li>Riemensperger, T., Pech, U., Dipt, S., Fiala, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+calcium+imaging+in+the+nervous+system+of+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22BBA-Gen.+Subjects%22%5BJournal%5D)">Optical calcium imaging in the nervous system of Drosophila melanogaster.</a> BBA-Gen. Subjects. 1820 (8), 1169-1178 (2012).</li>
<li>Owald, D., Lin, S., Waddell, S. <a target="_blank" href="http://rstb.royalsocietypublishing.org/content/370/1677/20140211">Light, heat, action: neural control of fruit fly behavior.</a> Phil. T. Roy. Soc. B. 370 (1677), 20140211(2015).</li>
</ol>

Nie stwierdzono konfliktu interesów.

Badaliśmy biosyntezę ekdysteroidów i jej mechanizm regulacyjny u D. melanogaster oraz opracowaliśmy protokół sekcji i barwienia immunologicznego. Na czas biosyntezy ekdysteroidów mają wpływ sygnały środowiskowe poprzez wejścia neuronalne33, dlatego ważne jest, aby utrzymać unerwienie narządów ekdysteroidogennych wraz z mózgiem, VNC i innymi tkankami podczas sekcji.
Jak opisano powyżej, D. melanogaster PG tworzy złożony narząd endokrynny RG z ciałami bi...

W organizmach wielokomórkowych grupa komórek jest wyposażona w wyspecjalizowaną funkcję w swojej aktywności biogennej, która jest niezbędna dla całego organizmu. Aby spełnić swoje misje, każda tkanka lub narząd wyraża szereg genów związanych z ich funkcjami i komunikuje się z innymi tkankami, aby koordynować ich działania w kontekście rozwoju. Aby scharakteryzować takie wyspecjalizowane funkcje komórkowe i interakcje międzynarządowe, musimy określić grupę komórek wraz z innymi typami komórek, które są nienaruszone w architekturze wielokomórkowej.
Jednym z przykładów takich wyspecjalizowanych organów jest narząd steroidogenny, gdzie wiele enzymów biosyntetycznych pośredniczy w etapach konwersji z cholesterolu na aktywne hormony steroidowe1. Większość z tych genów enzymatycznych ulega specyficznej ekspresji w narządach steroidogennych, a szlak biosyntezy jest ściśle regulowany przez wiele bodźców zewnętrznych za pośrednictwem wejść humoralnych i neuronalnych. Po zsyntetyzowaniu hormony steroidowe są wydzielane do hemolimfy i są skierowane do wielu tkanek i narządów w celu regulacji ekspresji różnych genów2. Dlatego działanie hormonu steroidowego indukuje odpowiedź ogólnoustrojową w celu utrzymania homeostazy, wzrostu i reprodukcji.
Aby zbadać funkcje biosyntezy hormonów steroidowych i plejotropowe działanie hormonów steroidowych, Drosophila melanogaster może być wykorzystana jako odpowiedni system modelowy. W stadiach larwalnych hormon steroidowy owada, ekdysteroid, jest biosyntetyzowany w wyspecjalizowanym narządzie endokrynnym zwanym gruczołem przedpiersiowym (PG)3. W PG kilka enzymów ekdysteroidogennych specyficznie katalizuje wiele etapów konwersji z cholesterolu do ekdyzonu, który kontroluje linienie i metamorfozę na odpowiednich etapach rozwoju4. Dlatego dynamiczna zmiana miana ekdysteroidów jest regulowana przez wiele szlaków sygnałowych w odpowiedzi na sygnały środowiskowe. Z drugiej strony, w stadium dorosłym ekdysteroid odgrywa istotną rolę w fizjologii, w tym w reprodukcji, śnie, pamięci i długości życia5,6,7,8. Wiadomo, że ekdysteroid jest aktywnie biosyntetyzowany w jajniku, regulując postęp oogenezy6,7,8,9,10,11. Ostatnio informowaliśmy, że na liczbę komórek macierzystych linii zarodkowej (GSC) wpływa sygnalizacja ekdysteroidów i peptydów płciowych w odpowiedzi na bodźce godowe12.
Potężne narzędzia genetyki i biologii komórki D. melanogaster, w tym dobrze opisane informacje o genomie, binarne systemy ekspresji genów i techniki transgenicznego RNAi, umożliwiły nam zidentyfikowanie genów niezbędnych do biosyntezy ekdysteroidów w PG i jajniku13,14,15. Po zidentyfikowaniu genów ekdysteroidogennych, regulacja transkrypcji tych genów i dynamiczne lokalizacje produktów genów mogą być badane w szlaku biosyntezy16. W tym celu przeprowadza się ilościowo-odwrotną transkrypcję-PCR, hybrydyzację RNA in situ i analizę immunohistologiczną. Zastosowanie tych technik wiąże się z trudnym zadaniem; skomplikowane rozwarstwienie PG lub jajnika. W szczególności, PG muszki owocowej jest relatywnie mniejsza niż u innych owadów (np. jedwabnika i muchy muchowej), dlatego trzeba ćwiczyć istotną umiejętność preparowania muszek owocowych w celu pobrania próbek. Ponadto oba narządy ekdysteroidogenne otrzymują unerwienie z ośrodkowego układu nerwowego (OUN)17,18,19,20. Tak więc, aby uzyskać dokładne analizy anatomiczne, narządy ecdysteroidogenne powinny być nienaruszone wraz z OUN i innymi narządami, aby nie zakłócać ich połączeń neuronalnych.
Tutaj udostępniamy protokoły do preparowania i wizualizacji narządów steroidogennych w D. Melanogaster. Poznanie techniki preparacji jest kluczowym punktem wyjścia dla tych eksperymentów. Ponadto można z powodzeniem oznaczać narządy steroidogenne, a także ich narządy interaktywne kilkoma przeciwciałami i liniami napędowymi GAL4. Korzystając z tych technik, materiałów i genetyki, można badać kompleksowe mechanizmy biosyntezy hormonów steroidowych.

<table><tbody><tr><td>egg collection</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>naczynie do hodowli tkankowych (55 mm)</td><td>AS ONE</td><td>1-8549-02</td><td>&nbsp; do talerzy agarowych z sokiem winogronowym</td></tr><tr><td>kubek do zbierania</td><td>HIKARI KAGAKU</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pasta drożdżowa</td><td>Drożdże orientalne suszone, Tokio</td><td></td><td></td></tr><tr><td>100% sok winogronowy</td><td>Welch Food Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td><silne> larwy hodowlane</mocne></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>małe fiolki (12 ml, 40 razy; 23,5 mm, PS)</td><td>SARSTEDT</td><td>58.487</td><td></td></tr><tr><td>jednorazowa pętelka</td><td>AS ONE</td><td>6-488-01</td><td></td></tr><tr><td>standardowy pokarm</td><td></td><td></td> na <td>muchy&nbsp; Polecamy nas na stronie internetowej centrum zapasów w Blooington.</td></tr><tr><td><silny>preparacyjny</silny></td><td></td><td></td><td></td></tr>mikroskop <tr><td>preparacyjny</td><td>Carl Zeiss</td><td>Stemi 2000-C</td><td></td></tr> Naczynie do hodowli tkankowych <tr><td></td><td>Leica</td><td>S8 AP0</td><td></td></tr><tr><td>(35 x 10 mm, niepoddane obróbce)</td><td>IWAKI</td><td>1000-035</td><td></td></tr><tr><td>Sylgard</td><td>TORAY</td><td></td><td>koarting silikonowy wewnątrz naczyń</td></tr><tr><td>Igła Terumo (27G, 0,40 x 19 mm)&nbsp;</td><td>TERUMO</td><td>NN-2719S</td><td>"nóż" do cięcia kleszczy tkankowych</td></tr><tr><td>, Inox, #5</td><td>Dumont, Szwajcaria</td><td></td><td></td></tr><tr><td>szpilka do owadów (średnica 0,18 mm)</td><td>Shiga Marka</td><td></td> do mikronożyczek do <td>preparowania filetów</td></tr><tr><td></td><td>NATSUME SEISAKUSHO CO LTD.&nbsp;</td><td>MB-50-10</td><td></td></tr><tr><td><mocne>mocne</mocne></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ultraczyste wody</td><td>Merck Sól</td> fizjologiczna buforowana fosforanem miliporowym <td></td><td></td></tr><tr><td>(PBS)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Formaldehyd</td><td>Nacalai tesque</td><td>16222-65</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyd</td><td>Nacalai tesque</td><td>02890-45</td><td></td></tr><tr><td>Triton-X100</td><td>Nacalai tesque</td><td>35501-15</td><td></td></tr><tr><td>mikroprobówek (1,5 ml)</td><td>INA OPTIKA</td><td>CF-0150</td><td></td></tr><tr><td>Inkubacja</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Jako jeden mikser swist TM-300 (rocker)</td><td>Jako jeden</td><td>TM-300</td><td>rocker</td></tr><tr><td>Albumina surowicy bydlęcej</td><td>SIGMA</td><td>9048-46-8</td><td></td></tr><tr><td><silne>przeciwciało pierwotne</silne></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>anty-Sro (świnka morska), 1:1000</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>anty-GFP (królik), 1:1000</td><td>Sondy molekularne</td><td>A6455</td><td>Shimada-Niwa i Niwa, 2014</td></tr><tr><td>anty-GFP (mysi mAb, GF200), 1:100</td><td>Nakarai tesque</td><td>04363-66</td><td></td></tr><tr><td>anty-5HT (królik), 1:500</td><td>SIGMA</td><td>S5545</td><td></td></tr><tr><td>anty-Hts 1B1 (mysz)</td><td>Badania rozwojowe Hybridoma Bank (DSHB)</td><td>1B1</td><td></td></tr><tr><td>anty-DE-kadheryna (szczur), 1:20</td><td>DSHB</td><td>DCAD2</td><td></td></tr><tr><td>anty-nc82 (mysz), 1:50</td><td>DSHB</td><td>nc82</td><td></td></tr><tr><td><silne>przeciwciało wtórne</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>kozie przeciwciało anty-królicze IgG (H+L), koniugat Alexa Fluor 488</td><td>Life Technologies</td><td>A-11008</td><td></td></tr><tr><td>Kozie przeciwciało drugorzędowe anty-mysie IgG (H+L), koniugat Alexa Fluor 488</td> Life <td>Technologies</td><td>A-11001</td><td></td></tr><tr><td>Kozie przeciwciało anty-szczurze IgG (H+L) Przeciwciało drugorzędowe, Alexa Fluor 546 sprzężone</td><td>Life Technologies</td><td>A-11081</td><td></td></tr><tr><td>Kozie przeciwciało anty-gwinejskie IgG (H+L), koniugat Alexa Fluor 555</td> Life <td>Technologies</td><td>A-21435</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 546 falloidyna sprzężona z barwnikiem</td><td>Life Technologie</td><td>A-22283</td><td></td></tr><tr><td>Odczynniki montażowe</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Micro slide glass</td><td>Matsunami Glass Ind., Ltd.</td><td>SS7213</td><td></td></tr><tr><td>Kwadratowa szklana osłona mikroskopu</td><td>Matsunami Glass Ind., Ltd.</td><td></td><td></td>C218181</tr><tr><td>Odczynnik FluorSave (Odczynnik montażowy)</td><td>Pipeta transferowa Calbiochem</td><td>345789</td><td></td></tr><tr><td>1 ml (jednorazowy zakraplacz)</td><td>System laserowego</td> mikroskopu skaningowego WATSON <td>5660-222-1S</td><td></td></tr><tr><td>imaging</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>LSM700</td> Carl <td>Zeiss</td><td></td><td>odwrócony obserwator Axio. Z1 SP left</td></tr><tr><td>image processing</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>LSM700 ZEN</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td>Jest to specjalny interfejs użytkownika oparty na 64-bitowym systemie operacyjnym Microsoft Windows7</td></tr><tr><td>ImageJ</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fly stocks</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>w; GMR45C06-GAL4</td><td></td><td></td><td>&nbsp; z Bloomington Drosophila Stock Center. (#46260)</td></tr><tr><td>UAS&ndash; Dobra praktyka rolnicza; UAS&ndash; mCD8::GFP</td><td></td><td></td><td>prezenty od K. Ito, Uniwersytet Tokijski.</td></tr><tr><td>w[1118]</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>w; phantom-GAL4#22/UAS-turboRFP</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>w; UAS-mCD8::GFP; TRH-GAL4</td><td></td><td></td><td>patrz w Ref29, Alekseyenko, O. V, Lee, C. & Kravitz, E. A.(2010)</td></tr><tr><td>w; UAS-mCD8::GFP</td><td></td><td></td><td>&nbsp; z Bloomington Drosophila Stock Center. (#32188)</td></tr><tr><td>yw;; nSyb-GAL4</td><td></td><td></td><td>&nbsp; z Bloomington Drosophila Stock Center. (#51941)</td></tr></tbody></table>

protokoły wizualizacji narządów steroidogennych i ich interaktywnych narządów z barwieniem immunologicznym u muszki owocowej drosophila melanogaster

Protocols for Visualizing Steroidogenic Organs and Their Interactive Organs with Immunostaining in the Fruit Fly Drosophila melanogaster

W organizmach wielokomórkowych mała grupa komórek jest wyposażona w wyspecjalizowaną funkcję w swojej aktywności biogennej, wywołując ogólnoustrojową odpowiedź na wzrost i rozmnażanie. U owadów larwalny gruczoł przedpiersiowy (PG) i jajnik dorosłej kobiety odgrywają istotną rolę w biosyntezie głównych hormonów steroidowych zwanych ekdysteroidami. Te ekdysteroidogenne narządy są unerwione od układu nerwowego, przez który na czas biosyntezy wpływają sygnały środowiskowe. W tym miejscu opisano protokół wizualizacji narządów ekdysteroidogennych i ich interaktywnych narządów u larw i dorosłych osobników muszki owocowej Drosophila melanogaster, który zapewnia odpowiedni system modelowy do badania biosyntezy hormonów steroidowych i ich mechanizmu regulacyjnego. Umiejętna sekcja pozwala nam utrzymać pozycje narządów ekdysteroidogennych i ich interaktywnych narządów, w tym mózgu, brzusznego rdzenia nerwowego i innych tkanek. Barwienie immunologiczne przeciwciałami przeciwko enzymom ekdysteroidogennym, wraz z transgenicznymi białkami fluorescencyjnymi napędzanymi przez swoiste tkankowo promotory, jest dostępne do znakowania komórek ekdysteroidogennych. Co więcej, unerwienie narządów ekdysteroidogennych może być również znakowane przez specyficzne przeciwciała lub zbiór sterowników GAL4 w różnych typach neuronów. W związku z tym narządy ekdysteroidogenne i ich połączenia neuronalne mogą być wizualizowane jednocześnie za pomocą technik immunostainingu i transgenicznych. Na koniec opisujemy, jak uwidocznić komórki macierzyste linii zarodkowej, których proliferacja i utrzymanie są kontrolowane przez ekdysteroidy. Metoda ta przyczynia się do kompleksowego zrozumienia biosyntezy hormonów steroidowych i ich neuronalnego mechanizmu regulacyjnego.

Powyższych protokołów użyto do wizualizacji organów steroidogennych oraz organów z nimi oddziałujących u larw i dorosłych samic D. melanogaster. Ogólny schemat protokołów przedstawiono na Rysunku 1.
RG, w tym PG (Rysunek 2D), jest mniejszy i bardziej przezroczysty od mózgu i znajduje się po przednio-grzbietowej stronie mózgu (Rysunek 2A-C oraz 3A-E). Aby oznakować komórki PG, kilka grup badawczych opracowało różne rodzaje przeciwciał przeciwko enzymom ekdyste...

Opisujemy protokół preparacji, utrwalania i barwienia immunologicznego organów steroidogennych u larw Drosophila i dorosłych samic w celu zbadania biosyntezy hormonów steroidowych i ich mechanizmu regulacyjnego. Oprócz narządów steroidogennych wizualizujemy unerwienie narządów steroidogennych, a także steroidogennych komórek docelowych, takich jak komórki macierzyste linii rozrodczej.

Protokoły wizualizacji narządów steroidogennych i ich interaktywnych narządów z barwieniem immunologicznym u muszki owocowej Drosophila melanogaster

In multicellular organisms, a small group of cells is endowed with a specialized function in their biogenic activity, inducing a systemic response ...

Ogólnym celem tej procedury jest wizualizacja organów steroidogennych oraz ich organów interaktywnych u larw lub dorosłych samic muszki owocówki, Drosophila melanogaster. Metoda ta może pomóc w zrozumieniu biosyntezy hormonów steroidowych u owadów oraz neuronalnego mechanizmu regulacyjnego leżącego u podstaw kopulacji i przeobrażenia. Główną zaletą tej techniki jest to, że unerwienie organów steroidogennych oraz względna część ich organów interaktywnych pozostają nienaruszone.Zazwyczaj osoby rozpoczynające pracę z tą metodą napotykają trudności, ponieważ organy steroidogenne w larwach much są bardzo małe i przezroczyste. Moje laboratorium i ja z przyjemnością dzielimy się naszymi protokołami sekcji. Zatem zaczynajmy.Po przygotowaniu larw rozpocznij sekcję w naczyniu o średnicy trzech centymetrów wypełnionym PBS, pod mikroskopem stereologicznym. Najpierw uchwyć haczyk gębowy pęsetą. Następnie, używając mikronapędnych nożyczek, przetnij ciało w odległości około jednej trzeciej długości od przedniego końca.Następnie przytrzymaj przednią część ciała jedną parą pęset i użyj drugiej pary, aby delikatnie wcisnąć wierzchołek głowy do wnętrza ciała, co w efekcie spowoduje wywinięcie ciała larwy na drugą stronę. W ten sposób przygotuj do 20 larw w ciągu 10 minut, a następnie przenieś je do roztworu utrwalającego. Po 30 minutach przemyj preparaty i przystąp do immunobarwienia.Na początek pozostaw larwy zanurzone w wodzie przez około jedną godzinę, aby doprowadzić do ich uduszenia, a tym samym unieruchomienia. Następnie umieść larwę grzbietem do góry w kropli PBS na naczyniu powlekanym silikonem. Strona grzbietowa posiada dwie tchawki.Pod mikroskopem stereoskopowym, używając pęsety, wprowadź szpilkę entomologiczną w przednią część ciała. Następnie rozciągnij ciało w stronę tylną i wprowadź drugą szpilkę w tylną część. Następnie, za pomocą mikronożyczek, wykonaj niewielkie nacięcie w pobliżu ogona.Od miejsca nacięcia ostrożnie przetnij kutykulę grzbietową wzdłuż linii środkowej grzbietu w kierunku głowy, uważając, aby nie uszkodzić tkanek znajdujących się pod kutykulą. Po wykonaniu nacięcia rozszerz ściany ciała i zabezpiecz je szpilkami entomologicznymi w narożnikach. Następnie, używając pęsety, usuń przednie ciało tłuszczowe oraz gruczoły ślinowe, odsłaniając na powierzchni kompleks pierścienia mózgowo-gruczołowego.Następnie odessać PBS i zanurzyć preparat w roztworze fixatywy. Po 30 minutach użyć pęsety, aby usunąć szpilki entomologiczne i przenieść preparat do mikroprowetki wypełnionej 0,3% PBT. Następnie przejść do immunostaining.Po przeprowadzeniu immunohistochemicznego barwienia larw, za pomocą pipety jednorazowej przenieść próbki do naczynia wypełnionego 0,3% PBT. Pod mikroskopem stereoskopowym uchwycić kutykulę lub haczyk gębowy jedną parą pęset. Następnie, używając igły o rozmiarze 27 G przymocowanej do strzykawki o pojemności 1 ml w sposób przypominający posługiwanie się nożem, oddzielić kompleks gruczołu pierścieniowego mózgu i tarczek ocznych od kutykuli ciała, odcinając przednią część przełyku oraz tarczki oczne.Następnie, używając pęsety, ostrożnie oddziel przełyk i jelito od kompleksu mózg-pierścień gruczołowy-tarcza oka. Wyciągnij jelito na stronę tylną, ponieważ przełyk przebiega przez mózg powyżej brzusznego sznura nerwowego. Na koniec, aby wyizolować kompleks mózg-pierścień gruczołowy, ostrożnie przetnij nożem igłowym połączenia między tarczą mózgową, tarczami ocznymi a tarczami odnóży.Podczas sekcji niezbędne jest użycie precyzyjnych pincet z ostrymi krawędziami. Zdecydowanie zalecam naostrzenie pincety za pomocą kamienia szlifierskiego, aby krawędzie ściśle do siebie przylegały, bez żadnych szczelin. Do przenoszenia próbek należy użyć mikropipety z końcówką o szerokim otworze.Umieść próbki na środku szkiełka przedmiotowego. Następnie, za pomocą pęsety, ułóż próbki stroną brzuszną do dołu, aby możliwe było obrazowanie gruczołu pierścieniowego, który znajduje się po stronie grzbietowej mózgu. Następnie przechyl szkiełko i usuń pęsetą tyle nadmiaru PBT, ile to możliwe.Następnie nanieś kroplę medium montażowego obok próbek i za pomocą pęsety powoli opuść szkiełko nakrywką nad medium, a następnie nad próbkami. Aby wypreparować jajnik dorosłej samicy, znieczul muchy gazem dwutlenku węgla. Następnie odetnij ich głowy i przenieś ciała do naczynia o średnicy 3 cm wypełnionego PBS.Następnie, pod mikroskopem dissectingowym, chwyć pęsetą grzbietową stronę tułowia i za pomocą drugiej pęsety uchwyć segment odwłoka A-5 lub A-6. Następnie odważ kutykulę odwłoka w kierunku strony tylnej. Przed kontynuacją oczyść pęsety z lepkiej kutykuli.Następnie należy odcisnąć przylewiec i wyizolować jajnik. Potem za pomocą pęsety należy rozdzielić i rozprostować końcówki jajnika. Po rozprostowaniu jajnik zanurza się w roztworze utrwalającym na 30 minut, aby przygotować go do barwienia.Aby przygotować preparat zachowujący unerwienie jajnika, przenieś znieczulone samice much do powlekanego silikonem naczynia wypełnionego PBS. Pod mikroskopem sekcyjnym uchwyć trąbkę i usuń kutykulę głowy, aby odsłonić mózg. Z obszaru mózgu usuń przymocowaną tchawicę, pozostawiając mózg połączonym z brzusznym sznurem nerwowym.Następnie przytrzymaj tułów za stronę grzbietową i usuń odnóża oraz skrzydła. Po czym odwarstw kutykulę brzuszną tułowia, zaczynając od podstawy każdego odnóża. Po odsłonięciu VNC bardzo ostrożnie usuń pęsetą pozostałości kutykuli grzbietowej oraz mięśnie przytwierdzone do VNC.Należy uważać, aby nie uszkodzić połączeń między mózgiem a VNC. Następnie, używając pęsety, należy odsunąć kutykulę odwłoka, aby odsłonić jajniki i organy z nimi współpracujące, w tym prop, jelito, jajowód, macicę oraz gruczoł akcesoryjny. Na koniec należy usunąć wszelkie pozostałe tkanki, w tym tchawki oraz ciało tłuszczowe.Następnie zanurz próbki w roztworze utrwalającym na 30 minut, aby przygotować je do immunobarwienia. Po przeprowadzeniu immunobarwienia przenieś próbki za pomocą mikropipety na szkiełko przedmiotowe z 0,1% PBT. Następnie obejrzyj preparat pod mikroskopem i rozdziel od siebie poszczególne nici owarioli za pomocą pincety.Podczas tego procesu należy uważać, aby nie uszkodzić końców owarioli, ponieważ znajdują się w nich germaria. Podczas przygotowywania kompleksu mózgu i organów rozrodczych należy usunąć wszelkie pozostałości kutykuli, a następnie rozłożyć struktury na szkiełku.Następnie usuń większość nadmiaru PBT, a potem nałóż kroplę medium montażowego na próbkę. Dalej, powoli nałóż szkiełko nakrywkę na preparat za pomocą pęsety i przechowuj preparat w temperaturze 4 °C w ciemności. Później obserwuj próbki pod mikroskopem, wprowadzając organy steroidogenne w pole widzenia.Po ustaleniu pola widzenia przełącz system obrazowania w tryb akwizycji obrazu. Na etapach larwalnych gruczoł przedpiersiowy oznakowano przeciwciałami przeciwko enzymom ecdysteroidogenicznym, w tym przeciwciałem anty-shroud. Aby zwizualizować połączenie neuronalne między gruczołem przedpiersiowym a mózgiem, przeprowadzono dysekcję kompleksu mózg-pierścień gruczołowy.Metoda preparacji typu filet ukazuje stomatogastryczny układ nerwowy, w którym grupa neuronów serotonergicznych rzutuje do gruczołu przedpiersiowego, żołądka przedniego oraz mięśni gardła. U dorosłych samic ecdysteroidy jajnikowe wpływają na wiele aspektów owogenezy, takich jak proliferacja GSC. GSC znajdują się w germarium na szczycie każdego owariola w jajniku.W obrębie germarium komórki macierzyste linii zarodkowych (GSCs) zostały specyficznie oznakowane przy użyciu dwóch przeciwciał: 1B1 oraz DE-cadherin. Aby zwizualizować unerwienie jajnika, wypreparowano jajnik wraz z mózgiem, VNC, jelitem, proctodaeum, macicą i spermateką. Neurony zwizualizowano za pomocą mCD8:GFP pod kontrolą sterownika n-Synaptobrevin GAL4.Dodatkowo strukturę mięśni zabarwiono za pomocą koniugatu falloidyny. Choć sekcja organów steroidogennych może początkowo wydawać się trudna, należy wykorzystać ten film, aby zapoznać się z punktami cięcia tkanek, co pozwoli na łatwiejszą izolację organu bez uszkodzeń. Mamy nadzieję, że nasz protokół okaże się pomocny nie tylko dla osób początkujących, ale także dla doświadczonych badaczy.Po opanowaniu tej metody można ją zastosować w swoich badaniach i dostosować do własnych potrzeb. Mamy nadzieję, że niniejszy protokół przyczyni się do kompleksowego zrozumienia biosyntezy hormonów steroidowych. Bardziej szczegółowe protokoły krok po kroku są dostępne w manuskrypcie.Prosimy o zapoznanie się z tym materiałem.

protocols-for-visualizing-steroidogenic-organs-their-interactive

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

Sposób, w jaki nisze i komórki macierzyste tworzą się podczas rozwoju, jest istotnym zagadnieniem o praktycznym znaczeniu. W jajniku Drosophila komórki macierzyste linii zarodkowej oraz ich nisze somatyczne powstają podczas rozwoju larwalnego. Niniejszy film prezentuje sposób preparowania, barwienia i montowania gonad samic larw Drosophila w późnym trzecim stadium larwalnym (LL3).

Disekcja i barwienie jajników larw Drosophila

Opisano metodę immunobarwienia i wizualizacji organów chordotonalnych w larwach i poczwarkach Drosophila melanogaster.

Wizualizacja proprioceptorów w larwach i poczwarkach Drosophila

Ten film opisuje gruczoł pierścieniowy Drosophila, złożoną strukturę endokrynną ważną dla biosyntezy i wydzielania ekdysteroidów i innych hormonów. Przedstawiony protokół demonstruje jego rozwarstwienie, utrwalenie i barwienie immunologiczne.

Rozwarstwienie gruczołu pierścieniowego larw: izolacja rozwojowych narządów endokrynnych od Drosophila

Ten film demonstruje szczegółowy protokół barwienia immunologicznego do wizualizacji defektów fenotypowych w ciałach grzybów zmutowanych mózgów Drosophila. Protokół polega na zastosowaniu przeciwciał przeciwko Fas2, białku biorącemu udział w prowadzeniu aksonów, które ułatwia prawidłowy rozwój morfologiczny i funkcjonalny ciała grzyba.

Wizualizacja neuronów ciała grzyba w mózgach Drosophila za pomocą barwienia immunologicznego

Barwienie immunologiczne jest skuteczną techniką wizualizacji określonych typów komórek i białek w tkankach. Wykorzystując sonikację, opisany tutaj protokół łagodzi potrzebę preparowania tkanek Drosophila melanogaster z zarodków i larw w późnym stadium przed barwieniem immunologicznym. Zapewniamy skuteczną metodologię barwienia immunologicznego całych larw utrwalonych formaldehydem.

Wspomagane sonikacją barwienie immunofluorescencyjne tkanek drobnoustrojowych i larwalnych drobnoustrojowych i larwalnych Drosophila in situ

Dorosłe struktury Drosophila wywodzą się z workowatych struktur zwanych dyskami imaginalnymi. Analiza tych dysków zapewnia wgląd w wiele procesów rozwojowych, w tym określanie tkanek, ustalanie granic przedziałów, proliferację komórek, specyfikację losu komórki i polaryzację komórek płaskich. Protokół ten służy do przygotowania dysków wyobrażeniowych do mikroskopii świetlnej/fluorescencyjnej.

Rozwarstwienie i barwienie immunologiczne dysków wyobrażonych z Drosophila melanogaster

Ten protokół opisuje sekcję i barwienie immunologiczne tkanek mózgowych dorosłych Drosophila melanogaster. W szczególności protokół ten podkreśla wykorzystanie ciała grzyba Drosophila i neuronów fotoreceptorowych jako przykładowych podzbiorów neuronów, które można dokładnie wykorzystać do odkrycia ogólnych zasad leżących u podstaw wielu aspektów rozwoju neuronów.

Rozwarstwienie i barwienie immunofluorescencyjne neuronów ciała grzyba i fotoreceptorów w mózgach dorosłych Drosophila melanogaster

Jajnik Drosophila jest doskonałym modelem do badania rozwoju nisz komórek macierzystych. Chociaż metody preparowania jajników larwalnych i dorosłych zostały opublikowane, sekcje jajników poczwarki wymagają różnych technik, które nie zostały szczegółowo opublikowane. Tutaj przedstawiamy protokół preparowania, barwienia i montowania jajników poczwarki.

Rozwarstwienie i barwienie jajników poczwarki Drosophila

Prezentujemy tutaj ulepszony protokół przygotowania całego mocowania i barwienia immunologicznego jąder Drosophila, odpowiedni do mikroskopii konfokalnej, a także umożliwiający powtarzalne i wiarygodne znakowanie. Ilustrujemy ten protokół poprzez reprezentację 3D i kwantyfikację eksperymentów kolokalizacyjnych na dużych spermatocytach S4-S5.

Barwienie immunologiczne jąder Drosophila w celu analizy konfokalnej 3D dużych spermatocytów

We wczesnym zarodku Drosophila wiele organelli jest ruchliwych. Zasadniczo można je obrazować na żywo za pomocą specjalnych sond fluorescencyjnych, ale skorupka jaja uniemożliwia bezpośrednie zastosowanie do zarodka. Protokół ten opisuje, w jaki sposób wprowadzić takie sondy za pomocą mikroiniekcji, a następnie analizować ruch organelli masowych za pomocą prędkości obrazu cząstek.

Wizualizacja zależnego od cytoszkieletu transportu organelli zawierających lipidy w zarodkach Drosophila

Poznaj protokół wizualizacji narządów steroidogennych u Drosophila melanogaster z zachowaniem unerwienia. Metoda immunobarwienia umożliwia badanie biosyntezy hormonów steroidowych i mechanizmów neuronalnych.

Protokoły wizualizacji narządów steroidogennych i ich interaktywnych narządów z barwieniem immunologicznym u muszki owocowej Drosophila melanogaster (Wideo) | JoVE Journal

Protokoły wizualizacji narządów steroidogennych i ich interaktywnych narządów z barwieniem immunologicznym u muszki owocowej Drosophila melanogaster

Przeglądaj więcej filmów