Protokoły wizualizacji narządów steroidogennych i ich interaktywnych narządów z barwieniem immunologicznym u muszki owocowej Drosophila melanogaster

Ogólnym celem tej procedury jest wizualizacja narządów steroidogennych i ich interaktywnych narządów u larw lub dorosłych samic muszki owocowej, Drosophila melanogaster. Metoda ta może pomóc w zrozumieniu biosyntezy hormonów steroidowych owadów oraz neuronalnego mechanizmu regulacyjnego leżącego u podstaw krycia i metamorfozy. Główną zaletą tej techniki jest to, że unerwienie narządów steroidogennych i względna część ich interaktywnych narządów pozostaje nienaruszona.

Ogólnie rzecz biorąc, osoby, które są nowe w tej metodzie, będą miały trudności, ponieważ narządy steroidogenne u larw much są dość małe i przezroczyste. Moje laboratorium i ja mamy przyjemność podzielić się naszymi protokołami preparacyjnymi. Więc zacznijmy.

Po przygotowaniu larw rozpocznij sekcję kursu w trzycentymetrowym naczyniu wypełnionym PBS, pod mikroskopem preparacyjnym. Najpierw chwyć haczyk na usta kleszczami. Następnie za pomocą mikronożyczek odetnij ciało na około jednej trzeciej długości od przedniego końca.

Następnie przytrzymaj przednią część za pomocą jednej pary kleszczy i użyj drugiej pary, aby delikatnie wepchnąć czubek głowy w ciało, aby ostatecznie wywrócić ciało larwy na lewą stronę. Przygotuj w ten sposób do 20 larw w ciągu 10 minut, a następnie przenieś je do roztworu utrwalającego. Po 30 minutach umyj preparaty i przystąp do barwienia immunologicznego.

Na początek pozostaw larwy zanurzone w wodzie na około godzinę, aby udusić, a tym samym unieruchomić larwy. Następnie umieść larwę grzbietową do góry w kropli PBS na naczyniu pokrytym silikonem. Po stronie grzbietowej znajdują się dwie rurki dotchawicze.

Pod mikroskopem preparacyjnym użyj kleszczy, aby wprowadzić szpilkę do owadów w przednią końcówkę. Następnie rozciągnij ciało do tylnej strony i włóż drugą szpilkę do tylnej końcówki. Następnie wykonaj małe nacięcie w pobliżu ogona za pomocą mikronożyczek.

Od nacięcia ostrożnie odetnij naskórek grzbietowy wzdłuż grzbietowej linii środkowej, w kierunku głowy, nie uszkadzając żadnej z tkanek pod naskórkiem. Po wykonaniu nacięcia rozciągnij ścianki korpusu i zabezpiecz je szpilkami przeciw owadom w rogach. Następnie za pomocą kleszczy usuń przedni obszar tłuszczowy i gruczoły ślinowe, odsłaniając w ten sposób kompleks gruczołów mózgowo-pierścieniowych na powierzchni.

Teraz odessać PBS i zanurzyć preparat w roztworze utrwalającym. Po 30 minutach za pomocą kleszczyków usuń szpilki owadów i przenieś preparat do mikroprobówki wypełnionej 0,3%PBT. Następnie przystąp do barwienia immunologicznego.

Po barwieniu immunologicznym larw należy użyć jednorazowej pipety, aby przenieść próbki do naczynia wypełnionego 0,3% PBT. Pod mikroskopem preparacyjnym chwyć naskórek lub haczyk do ust jedną parą kleszczy. Następnie użyj igły o rozmiarze 27 przymocowanej do jednomililitrowej strzykawki, jak nóż, aby usunąć kompleks krążka ocznego gruczołu mózgowego z naskórka ciała, odcinając przedni koniec przełyku i krążki oczne.

Następnie za pomocą kleszczy ostrożnie oddziel przełyk i jelito od kompleksu krążka oka gruczołu mózgowego. Wyciągnij jelito na tylną stronę, ponieważ przełyk przechodzi przez mózg powyżej brzusznego rdzenia nerwowego. Na koniec, aby wyizolować kompleks gruczołu pierścieniowego mózgu, ostrożnie przeciąć połączenia między dyskiem mózgowym, dyskiem ocznym i dyskiem nóg za pomocą noża

Podczas sekcji bardzo ważne jest używanie cienkich kleszczy o ostrych krawędziach. Zdecydowanie polecam naostrzenie kleszczy kawałkiem kamienia szlifierskiego, aby ich krawędzie zbliżyły się do siebie bez żadnych szczelin. Do przenoszenia próbek należy użyć mikropipety z końcówką o szerokim otworze.

Umieść próbki na środku szkiełka podstawowego. Następnie użyj kleszczy, aby umieścić próbki na ich brzusznych stronach, aby można było zobrazować gruczoł pierścieniowy, który znajduje się po grzbietowej stronie mózgu. Następnie przechyl szkiełko i zetrzyj jak najwięcej nadmiaru PBT.

Następnie umieść kroplę odczynnika montażowego w pobliżu próbek i za pomocą kleszczy powoli opuść szkiełko nakrywkowe na odczynnik, a następnie na próbki. Aby wypreparować jajnik dorosłej samicy, znieczulenie much gazowym dwutlenkiem węgla. Następnie odetnij im głowy i przenieś ich ciała do trzycentymetrowego naczynia wypełnionego PBS.

Następnie, pod mikroskopem preparacyjnym, chwyć kleszczami grzbietową stronę klatki piersiowej i chwyć segment brzuszny A-5 lub A-6 drugą parą kleszczy. Następnie oderwij naskórek brzucha w kierunku tylnej strony. Zanim przejdziesz dalej, oczyść lepki naskórek z kleszczy.

Następnie uszczypnij owuwód i odizoluj jajnik. Następnie rozczesz i rozprowadź końcówki jajnika za pomocą kleszczy. Po rozprowadzeniu zanurz jajnik w roztworze utrwalającym na 30 minut, aby przygotować je do barwienia.

Aby przygotować preparat, który utrzymuje unerwienie jajnika, przenieś znieczulone samice much do naczynia pokrytego silikonem wypełnionego PBS. Pod mikroskopem preparacyjnym przytrzymaj trąbkę i oderwij naskórek głowy, aby odsłonić mózg. Z mózgu usuń przyczepioną tchawicę, pozostawiając mózg połączony z brzusznym rdzeniem nerwowym.

Następnie przytrzymaj klatkę piersiową za stronę grzbietową i usuń nogi i skrzydła. Następnie oderwij brzuszny naskórek klatki piersiowej, zaczynając od podstawy każdej nogi. Po odsłonięciu VNC bardzo ostrożnie usuń resztki naskórka grzbietowego i mięśnie przyczepione do VNC za pomocą kleszczy.

Nie uszkadzaj połączeń między mózgiem a VNC. Następnie za pomocą kleszczy oderwij naskórek brzucha, aby odsłonić jajniki i ich interaktywne narządy, w tym rekwizyt, jelito, owodnik, macicę i gruczoł dodatkowy. Na koniec usuń wszelkie resztki tkanek, w tym tchawicę i ciało tłuszczowe.

Następnie zanurz próbki w roztworze utrwalającym na 30 minut, aby przygotować je do barwienia immunologicznego. Po barwieniu immunologicznym przenieść próbki do szkiełka podstawowego z 0,1% PBT za pomocą mikropipety. Następnie obejrzyj szkiełko pod mikroskopem i oddziel sznurki jajników od siebie za pomocą kleszczy.

Podczas tego procesu nie uszkadzaj końcówek jajników. Zawierają germaria. Przygotowując mózg do kompleksu narządów rozrodczych, usuń wszelkie resztki naskórka i rozłóż struktury na szkiełku.

Następnie zetrzyj większość nadmiaru PBT, a następnie nałóż kroplę odczynnika montażowego na próbkę. Następnie powoli umieść szkiełko nakrywkowe na szkiełku za pomocą kleszczy i przechowuj szkiełko w temperaturze czterech stopni Celsjusza w ciemności. Później obserwuj próbki pod mikroskopem i umieść narządy steroidogenne w polu widzenia.

Po ustaleniu widoku przełącz system obrazowania w tryb akwizycji obrazu. W stadiach larwalnych gruczoł przedpiersiowy był znakowany przeciwciałami przeciwko enzymom ekdysteroidogennym, w tym przeciwciałem anty-shroud. Aby zobrazować połączenie neuronalne między gruczołem przedpiersiowym a mózgiem, przeprowadzono sekcję kompleksu gruczołu pierścieniowego mózgu.

Metoda rozwarstwienia filetów pokazuje stomato-żołądkowy układ nerwowy, w którym grupa neuronów serotoninergicznych rzutuje na gruczoł przedpiersiowy, przedsionek i mięśnie gardła. U dorosłych kobiet ekdysteroid jajnikowy wpływa na wiele aspektów owogenezy, takich jak proliferacja GSC. GSC znajdują się w germarium na końcu każdego jajnika w jajniku.

W germarium GSC zostały specjalnie oznaczone przy użyciu dwóch przeciwciał, 1B1 i DE-kadheryny. Aby uwidocznić unerwienie jajnika, jajnik został wypreparowany wraz z mózgiem, VNC, jelitem, podporą, macicą i spermateką. Neurony zostały uwidocznione przez mCD8:GFP pod kontrolą sterownika n-Synaptobrevin GAL4.

Dodatkowo strukturę mięśni barwiono za pomocą disprzężonej falloidyny. Chociaż sekcja narządów steroidogennych może początkowo wydawać się trudna, skorzystaj z tego filmu, aby dowiedzieć się, jaki jest punkt cięcia tkanek, aby łatwiej odizolować narząd bez obrażeń. Mamy nadzieję, że nasz protokół jest pouczający, nie tylko dla początkujących, ale także doświadczonych badaczy.

Po opanowaniu możesz zastosować tę procedurę do swoich badań i odświeżyć się, aby dopasować ją do swoich potrzeb. Mamy nadzieję, że ten protokół pomoże w kompleksowym zrozumieniu biosyntezy hormonów steroidowych. Bardziej szczegółowe protokoły krok po kroku są dostępne w manuskrypcie.

Proszę to sprawdzić.