Protokoły wizualizacji narządów steroidogennych i ich interaktywnych narządów z barwieniem immunologicznym u muszki owocowej Drosophila melanogaster

Ogólnym celem tej procedury jest wizualizacja organów steroidogennych oraz ich organów interaktywnych u larw lub dorosłych samic muszki owocówki, Drosophila melanogaster. Metoda ta może pomóc w zrozumieniu biosyntezy hormonów steroidowych u owadów oraz neuronalnego mechanizmu regulacyjnego leżącego u podstaw kopulacji i przeobrażenia. Główną zaletą tej techniki jest to, że unerwienie organów steroidogennych oraz względna część ich organów interaktywnych pozostają nienaruszone.

Zazwyczaj osoby rozpoczynające pracę z tą metodą napotykają trudności, ponieważ organy steroidogenne w larwach much są bardzo małe i przezroczyste. Moje laboratorium i ja z przyjemnością dzielimy się naszymi protokołami sekcji. Zatem zaczynajmy.

Po przygotowaniu larw rozpocznij sekcję w naczyniu o średnicy trzech centymetrów wypełnionym PBS, pod mikroskopem stereologicznym. Najpierw uchwyć haczyk gębowy pęsetą. Następnie, używając mikronapędnych nożyczek, przetnij ciało w odległości około jednej trzeciej długości od przedniego końca.

Następnie przytrzymaj przednią część ciała jedną parą pęset i użyj drugiej pary, aby delikatnie wcisnąć wierzchołek głowy do wnętrza ciała, co w efekcie spowoduje wywinięcie ciała larwy na drugą stronę. W ten sposób przygotuj do 20 larw w ciągu 10 minut, a następnie przenieś je do roztworu utrwalającego. Po 30 minutach przemyj preparaty i przystąp do immunobarwienia.

Na początek pozostaw larwy zanurzone w wodzie przez około jedną godzinę, aby doprowadzić do ich uduszenia, a tym samym unieruchomienia. Następnie umieść larwę grzbietem do góry w kropli PBS na naczyniu powlekanym silikonem. Strona grzbietowa posiada dwie tchawki.

Pod mikroskopem stereoskopowym, używając pęsety, wprowadź szpilkę entomologiczną w przednią część ciała. Następnie rozciągnij ciało w stronę tylną i wprowadź drugą szpilkę w tylną część. Następnie, za pomocą mikronożyczek, wykonaj niewielkie nacięcie w pobliżu ogona.

Od miejsca nacięcia ostrożnie przetnij kutykulę grzbietową wzdłuż linii środkowej grzbietu w kierunku głowy, uważając, aby nie uszkodzić tkanek znajdujących się pod kutykulą. Po wykonaniu nacięcia rozszerz ściany ciała i zabezpiecz je szpilkami entomologicznymi w narożnikach. Następnie, używając pęsety, usuń przednie ciało tłuszczowe oraz gruczoły ślinowe, odsłaniając na powierzchni kompleks pierścienia mózgowo-gruczołowego.

Następnie odessać PBS i zanurzyć preparat w roztworze fixatywy. Po 30 minutach użyć pęsety, aby usunąć szpilki entomologiczne i przenieść preparat do mikroprowetki wypełnionej 0,3% PBT. Następnie przejść do immunostaining.

Po przeprowadzeniu immunohistochemicznego barwienia larw, za pomocą pipety jednorazowej przenieść próbki do naczynia wypełnionego 0,3% PBT. Pod mikroskopem stereoskopowym uchwycić kutykulę lub haczyk gębowy jedną parą pęset. Następnie, używając igły o rozmiarze 27 G przymocowanej do strzykawki o pojemności 1 ml w sposób przypominający posługiwanie się nożem, oddzielić kompleks gruczołu pierścieniowego mózgu i tarczek ocznych od kutykuli ciała, odcinając przednią część przełyku oraz tarczki oczne.

Następnie, używając pęsety, ostrożnie oddziel przełyk i jelito od kompleksu mózg-pierścień gruczołowy-tarcza oka. Wyciągnij jelito na stronę tylną, ponieważ przełyk przebiega przez mózg powyżej brzusznego sznura nerwowego. Na koniec, aby wyizolować kompleks mózg-pierścień gruczołowy, ostrożnie przetnij nożem igłowym połączenia między tarczą mózgową, tarczami ocznymi a tarczami odnóży.

Podczas sekcji niezbędne jest użycie precyzyjnych pincet z ostrymi krawędziami. Zdecydowanie zalecam naostrzenie pincety za pomocą kamienia szlifierskiego, aby krawędzie ściśle do siebie przylegały, bez żadnych szczelin. Do przenoszenia próbek należy użyć mikropipety z końcówką o szerokim otworze.

Umieść próbki na środku szkiełka przedmiotowego. Następnie, za pomocą pęsety, ułóż próbki stroną brzuszną do dołu, aby możliwe było obrazowanie gruczołu pierścieniowego, który znajduje się po stronie grzbietowej mózgu. Następnie przechyl szkiełko i usuń pęsetą tyle nadmiaru PBT, ile to możliwe.

Następnie nanieś kroplę medium montażowego obok próbek i za pomocą pęsety powoli opuść szkiełko nakrywką nad medium, a następnie nad próbkami. Aby wypreparować jajnik dorosłej samicy, znieczul muchy gazem dwutlenku węgla. Następnie odetnij ich głowy i przenieś ciała do naczynia o średnicy 3 cm wypełnionego PBS.

Następnie, pod mikroskopem dissectingowym, chwyć pęsetą grzbietową stronę tułowia i za pomocą drugiej pęsety uchwyć segment odwłoka A-5 lub A-6. Następnie odważ kutykulę odwłoka w kierunku strony tylnej. Przed kontynuacją oczyść pęsety z lepkiej kutykuli.

Następnie należy odcisnąć przylewiec i wyizolować jajnik. Potem za pomocą pęsety należy rozdzielić i rozprostować końcówki jajnika. Po rozprostowaniu jajnik zanurza się w roztworze utrwalającym na 30 minut, aby przygotować go do barwienia.

Aby przygotować preparat zachowujący unerwienie jajnika, przenieś znieczulone samice much do powlekanego silikonem naczynia wypełnionego PBS. Pod mikroskopem sekcyjnym uchwyć trąbkę i usuń kutykulę głowy, aby odsłonić mózg. Z obszaru mózgu usuń przymocowaną tchawicę, pozostawiając mózg połączonym z brzusznym sznurem nerwowym.

Następnie przytrzymaj tułów za stronę grzbietową i usuń odnóża oraz skrzydła. Po czym odwarstw kutykulę brzuszną tułowia, zaczynając od podstawy każdego odnóża. Po odsłonięciu VNC bardzo ostrożnie usuń pęsetą pozostałości kutykuli grzbietowej oraz mięśnie przytwierdzone do VNC.

Należy uważać, aby nie uszkodzić połączeń między mózgiem a VNC. Następnie, używając pęsety, należy odsunąć kutykulę odwłoka, aby odsłonić jajniki i organy z nimi współpracujące, w tym prop, jelito, jajowód, macicę oraz gruczoł akcesoryjny. Na koniec należy usunąć wszelkie pozostałe tkanki, w tym tchawki oraz ciało tłuszczowe.

Następnie zanurz próbki w roztworze utrwalającym na 30 minut, aby przygotować je do immunobarwienia. Po przeprowadzeniu immunobarwienia przenieś próbki za pomocą mikropipety na szkiełko przedmiotowe z 0,1% PBT. Następnie obejrzyj preparat pod mikroskopem i rozdziel od siebie poszczególne nici owarioli za pomocą pincety.

Podczas tego procesu należy uważać, aby nie uszkodzić końców owarioli, ponieważ znajdują się w nich germaria. Podczas przygotowywania kompleksu mózgu i organów rozrodczych należy usunąć wszelkie pozostałości kutykuli, a następnie rozłożyć struktury na szkiełku.

Następnie usuń większość nadmiaru PBT, a potem nałóż kroplę medium montażowego na próbkę. Dalej, powoli nałóż szkiełko nakrywkę na preparat za pomocą pęsety i przechowuj preparat w temperaturze 4 °C w ciemności. Później obserwuj próbki pod mikroskopem, wprowadzając organy steroidogenne w pole widzenia.

Po ustaleniu pola widzenia przełącz system obrazowania w tryb akwizycji obrazu. Na etapach larwalnych gruczoł przedpiersiowy oznakowano przeciwciałami przeciwko enzymom ecdysteroidogenicznym, w tym przeciwciałem anty-shroud. Aby zwizualizować połączenie neuronalne między gruczołem przedpiersiowym a mózgiem, przeprowadzono dysekcję kompleksu mózg-pierścień gruczołowy.

Metoda preparacji typu filet ukazuje stomatogastryczny układ nerwowy, w którym grupa neuronów serotonergicznych rzutuje do gruczołu przedpiersiowego, żołądka przedniego oraz mięśni gardła. U dorosłych samic ecdysteroidy jajnikowe wpływają na wiele aspektów owogenezy, takich jak proliferacja GSC. GSC znajdują się w germarium na szczycie każdego owariola w jajniku.

W obrębie germarium komórki macierzyste linii zarodkowych (GSCs) zostały specyficznie oznakowane przy użyciu dwóch przeciwciał: 1B1 oraz DE-cadherin. Aby zwizualizować unerwienie jajnika, wypreparowano jajnik wraz z mózgiem, VNC, jelitem, proctodaeum, macicą i spermateką. Neurony zwizualizowano za pomocą mCD8:GFP pod kontrolą sterownika n-Synaptobrevin GAL4.

Dodatkowo strukturę mięśni zabarwiono za pomocą koniugatu falloidyny. Choć sekcja organów steroidogennych może początkowo wydawać się trudna, należy wykorzystać ten film, aby zapoznać się z punktami cięcia tkanek, co pozwoli na łatwiejszą izolację organu bez uszkodzeń. Mamy nadzieję, że nasz protokół okaże się pomocny nie tylko dla osób początkujących, ale także dla doświadczonych badaczy.

Po opanowaniu tej metody można ją zastosować w swoich badaniach i dostosować do własnych potrzeb. Mamy nadzieję, że niniejszy protokół przyczyni się do kompleksowego zrozumienia biosyntezy hormonów steroidowych. Bardziej szczegółowe protokoły krok po kroku są dostępne w manuskrypcie.

Prosimy o zapoznanie się z tym materiałem.