Wizualizacja proprioceptorów u larw i poczwarek Drosophila

Ogólnym celem tej procedury jest uwidocznienie proprioceptywnych narządów kortonowych u larw i puchów drosophila. Osiąga się to poprzez pierwszy odchów i zebranie trzecich larw gwiaździstych lub puby po rozbiorze larw lub poczwarek. Są one utrwalone do barwienia immunologicznego.

Następnie utrwalone larwy lub poczwarki są barwione immunologicznie odpowiednimi przeciwciałami. Ostatnim krokiem jest zamontowanie barwionych próbek do mikroskopii. Ostatecznie mikroskopia konfokalna służy do wizualizacji narządów kortonu.

Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania dotyczące rozwoju postsymbionicznego i wzorcowania receptorów rekwizytów w ofie. Chociaż procedura ta może dostarczyć informacji na temat rozwoju receptorów podpukłości, może być również stosowana do innych narządów, takich jak inne rodzaje narządów zmysłów i ścięgien. Najpierw zbierz niezbędne narzędzia, roztwory i fiolkę wędrówki.

Po trzecie w przypadku larw gwiazd, roztwory PBS i FIXATIVE należy przechowywać na lodzie. Wybierz wędrującą trzecią larwę gwiazdy ze ścianki fiolki i umieść ją w 50-mikrolitrowej kropli lodowatego PBS na płytce preparacyjnej wykonanej z elastomeru cygarowego w naczyniu do hodowli tkankowej. Za pomocą mikroskopu preparacyjnego trzymaj larwy grzbietową stroną do góry w pobliżu ust, zaczepia się cienkimi kleszczami i wbijaj szpilkę do owadów przez mózg.

Chwyć tylny koniec larw kleszczami. Delikatnie pociągnij i delikatnie rozciągnij larwy wzdłuż. Wbij kolejną szpilkę do owadów między dwie tylne kuliste kule za pomocą nożyczek sprężynowych.

Wytnij dwa poziome nacięcia w ścianie ciała prostopadłe do przedniej osi tylnej, trzymając się blisko przednich i tylnych szpilek. Następnie przetnij ścianę ciała larwy wzdłuż grzbietowej linii środkowej od przedniego do tylnego nacięcia. Usuń narządy wewnętrzne i tchawicę za pomocą cienkich kleszczy.

Następnie umyj delikatnie raz lub dwa razy za pomocą PBS. Chwyć dwie klapy ścienne ciała za pomocą kleszczy. Rozciągnij je i przypnij do talerza za pomocą dwóch szpilek przeciw owadom z każdej strony.

Usunąć PBS i dodać 50 mikrolitrów roztworu utrwalającego. Inkubować przez 20 minut w temperaturze pokojowej. Po wyjęciu utrwalacza i dwukrotnym umyciu PBS wyciągnij szpilki przeciw owadom za pomocą nożyczek sprężynowych.

Odetnij głowę i ogon larwy, pozostawiając prostokątny filet. Przenieść utrwaloną tkankę do schłodzonej probówki einor z PBS. Po utrwaleniu wystarczającej liczby larw można przejść bezpośrednio do barwienia przeciwciał.

Jeśli natychmiastowe barwienie nie jest pożądane, utrwalone larwy należy umyć trzykrotnie po pięć minut każdy, 95% etanolem, a następnie przechowywać w etanolu w temperaturze minus 20 stopni. Zwróć uwagę na fiolki, tak jak w przypadku utrwalenia larw, aż larwy w trzecim stadium zaczną jeść. Badać fiolki co godzinę i oznaczać larwy, które się zjadły.

Pozwól oznaczonemu krążkowi rozwijać się przez 30 do 40 godzin w temperaturze 24 stopni Celsjusza lub od 24 do 27 godzin w temperaturze 29 stopni Celsjusza za pomocą cienkich kleszczy. Wybierz od 20 do 30 sztuk w odpowiednim wieku i umieść je w ciemnym porcelanowym naczyniu preparacyjnym. Uważaj, aby nie uszkodzić interesujących tkanek.

Następnie wyjmij poczwarki z ich skrzynek źrenic. Zacznij od oderwania wieczka i kontynuuj, aż poczwarka będzie wolna. Wyciągnij wszystkie poczwarki i włóż je do studzienki wypełnionej PBT.

Umieść pięć puy na płaskiej powierzchni między dołkami naczynia preparacyjnego za pomocą noża do mikropreparowania. Odetnij czubek głowy i tylny czubek brzucha. Przytrzymaj poczwarkę na miejscu za pomocą cienkich kleszczy i użyj jednomililitrowej strzykawki, aby wypłukać narządy wewnętrzne poczwarki, wstrzykując PBT przez przedni otwór.

Umyj krótko wypreparowaną poczwarkę, zanurzając ją w studzience wypełnionej PBS i przenieś do zimnego utrwalacza w probówce einor trzymanej na lodzie. Inkubuj puy przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Następnego dnia.

Wyrzuć utrwalacz i umyj puby PBT trzy razy przez pięć minut na pranie. Trzymaj pranie na lodzie. Napełnij dwie studzienki naczynia preparacyjnego PBT.

Za pomocą pipety do makaronu z polietylenu. Przenieś kilka puby do jednej ze studni. Następnie przenoś jedną poczwarkę na raz do drugiej. Studnia.

Za pomocą dwóch par ostrych kleszczy z idealnie wyrównanymi końcówkami przymocuj poczwarkę do dna studzienki, a następnie delikatnie rozerwij naskórek. Usunięcie naskórka skrzydła jest najtrudniejszym aspektem tego zabiegu. Na tym etapie zawsze tracimy część skrzydeł, dlatego zabieg rozpoczynamy ze stosunkowo dużą liczbą poczwarek.

Po zerwaniu naskórka oderwij go od skrzydła. Uważając, aby nie odłączyć skrzydła od poczwarki. Po oderwaniu naskórka od ostrza skrzydła, kontynuuj obieranie naskórka zawiasu skrzydła.

Po obraniu naskórka skrzydła można spróbować w podobny sposób zdjąć naskórek nogi. Wiele nóg może zostać utraconych w tym procesie, ale pomimo niskiej wydajności, ten krok jest wysoce zalecany, ponieważ znacznie poprawia barwienie narządów kortonowych nóg. Umieść poczwarkę w probówce einor wypełnionej metanolem i utrzymuj ją w temperaturze pokojowej.

Kontynuuj obieranie naskórka ze wszystkich puy i dodaj je do tej samej tuby, aby uzyskać w sumie co najmniej 10 ładnie obranych puy. Dla każdego barwienia usuń metanol i przemyj go trzy razy po pięć minut, każdy 95% etanolem. Stały puy może być przechowywany przez długi czas w 95% etanolu w temperaturze minus 20 stopni przed barwieniem immunologicznym.

Aby zamontować larwy, umieść kroplę podłoża mocującego na szkiełku mikroskopowym, a następnie ustaw larwy tak, aby skórki były skierowane w dół, a mięśnie ściany ciała skierowane do góry. Umieść niewielką kroplę podłoża montażowego na czystym szkiełku nakrywkowym i użyj go do przykrycia preparatu bez wywierania nacisku na zamontowane larwy. Aby zamontować łono.

Najpierw przygotuj dwa szkiełka mikroskopowe z kroplą podłoża montażowego, jedno do sekcji, a drugie do montażu. Umieść kilka pu na jednym ze szkiełek, a następnie użyj nożyczek sprężynowych, aby usunąć głowę i tylną część brzucha. Następnie oddziel grzbietową połowę klatki piersiowej od brzusznej, przecinając między skrzydłami a nogami.

Umieść wypreparowane części ciała poczwarki w kropli podłoża montażowego. Na drugim slajdzie upewnij się, że skrzydła i nogi są rozciągnięte i staraj się jak najbardziej zminimalizować nakładanie się tkanek. Na koniec umieść kroplę podłoża montażowego na szkiełku nakrywkowym i umieść ją na próbce bez wywierania nadmiernego nacisku.

Ten konfokalny mikrograf narządów kortonu barwienia immunologicznego u jednej trzeciej larw gwiaździstych pokazuje ładnie rozciągnięty segment brzuszny, w którym wyraźnie widać siedem z ośmiu narządów kortonu. Widocznych jest pięć narządów bocznych, które razem tworzą narząd lipidowy penasco, pojedynczy narząd boczny i jeden z dwóch brzusznych narządów kortonu. Neurony narządu kortonu są oznaczone markerem neuronalnym, przeciwciałem monoklonalnym 22 C 10 i pokazane na czerwono.

Czapeczka więzadła i komórki przyczepowe są oznaczone tubuliną Antifa 85 E i są pokazane na niebiesko. Komórki czapeczki i więzadła są dodatkowo oznaczone narządem korowo-tonalnym. Specjalny sprawozdawca GFP zawierający element regulacyjny dla locus Delilah.

Tutaj narządy tonalne skrzydeł w brzusznej żyle promieniowej są pokazane na tym konfokalnym mikrozdjęciu 35-godzinnej poczwarki. Neurony są oznaczone markerem neuronalnym 22 C 10 i pokazane na czerwono oraz w panelu B. Komórki więzadła i czapeczki są znakowane przeciwciałami Antifa tubulina 85 E pokazanymi na niebiesko i w panelu C, a także narządem kory tonalnej. Specyficzny transgen reporterowy GFP pokazany na zielono.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak wizualizować proprioceptywne narządy kortonu zarówno u larwy, jak i poczwarki w oku. Podejmując próbę wykonania tej procedury, należy pamiętać, że została ona zoptymalizowana pod kątem stosowania opisanych przeciwciał. Różne przeciwciała mogą wymagać nieco innych warunków wiązania i barwienia.

Tak więc, stosując tę procedurę z różnymi przeciwciałami, należy znaleźć optymalne warunki dla stosowanych przeciwciał.