Name: Wizualizacja proprioceptorów u larw i poczwarek Drosophila (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-06-13T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 51 s
Description: Poznaj metodę immunobarwienia i wizualizacji organów chordotonalnych u larw i poczwarek Drosophila melanogaster. Technika obejmuje preparowanie, barwienie przeciwciałami i mikroskopię konfokalną.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy chcieliby podziękować Developmental Studies Hybridoma Bank na Uniwersytecie w Iowa za przesłanie przeciwciał. Praca ta była wspierana przez grant (nr 29/08) z Israel Science Foundation. A.S. otrzymuje również wsparcie z grantu badawczego od DFG (Deutsche Forschungsgemeinschaft).

Przed rozpoczęciem
<ol>
	<li>Hoduj pożądane kultury much. Dbaj o to, aby w fiolkach nie było zbyt dużego zagęszczenia (około 30 much na fiolkę 50 ml). Pozostaw muchy do składania jaj w każdej fiolce tylko przez jeden dzień. Zapewni to larwom wystarczającą ilość pokarmu i pozwoli im osiągnąć maksymalny rozmiar przed opuszczeniem podłoża. Przechowuj fiolki w odpowiedniej temperaturze do momentu, gdy larwy trzeciego stadium zaczną wędrować po ściankach fiolki.</li>
	<li>Przygotuj świeży zapas soli fizjologicznej z buforem fosforanowym (PBS) oraz PBT (0,1% Tween w PBS). Przechowuj 10 ml PBS w lodzie.</li>
	<li>Przygotuj 1-5 ml świeżego utrwalacza (4% formaldehydu w PBT) i przechowuj go w lodzie. Jako roztwór zapasowy stosujemy butelkowany formaldehyd 37-38%.</li>
</ol>
1. Disekcja i utrwalenie larw trzeciego stadium rozwojowego
<ol>
	<li>Wybrać wędrującą larvę trzeciego stadium z ścianki fiolki i umieścić ją w 50 μl kropli lodowatego PBS na płytce do sekcji Sylgard (wykonanej z zestawu elastomeru silikonowego Sylgard 184, DOW Corning Corporation, w naczyniu do hodowli tkanek).</li>
	<li>Przytrzymać larvę stroną grzbietową do góry w pobliżu haczyków gębowych za pomocą precyzyjnej pęsety (pęseta Dumont #5) i przebić mózg larwy szpilką entomologiczną (minutien, 0,1 mm, stal nierdzewna).</li>
	<li>Chwycić tylny koniec larwy pęsetą, delikatnie pociągnąć i rozciągnąć larvę wzdłuż jej osi. Wbić drugą szpilkę entomologiczną pomiędzy dwa tylne przetchlinki.</li>
	<li>Za pomocą nożyczek sprężynowych wykonać dwa poziome nacięcia w ścianie ciała (prostopadle do osi przednio-tylnej), blisko przedniej i tylnej szpilki.</li>
	<li>Za pomocą nożyczek sprężynowych przeciąć ścianę ciała larwy wzdłuż linii środkowej grzbietu od nacięcia przedniego do tylnego.</li>
	<li>Usunąć narządy wewnętrzne (jelita, gruczoły ślinowe, cewki Malpighiego itp.) oraz tchawki za pomocą precyzyjnej pęsety. Przemyć delikatnie raz lub dwa razy PBS.</li>
	<li>Chwycić dwie płaty ściany ciała pęsetą, rozciągnąć je i przytwierdzić do płytki za pomocą dwóch szpilek entomologicznych na każdą stronę.</li>
	<li>Usunąć PBS i dodać 50 μl roztworu utrwalającego (4% formaldehyd w PBT). Inkubować przez 20 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Usunąć utrwalacz. Przemyć dwukrotnie PBS. Wyjąć szpilki entomologiczne. Za pomocą nożyczek sprężynowych odciąć głowę i ogon larwy, pozostawiając prostokątny płat tkanki. Przenieść utrwaloną tkankę do schłodzonej probówki Eppendorf z PBS.</li>
	<li>Po utrwaleniu odpowiedniej liczby larw można przejść bezpośrednio do barwienia przeciwciałami. Jeśli natychmiastowe barwienie nie jest planowane, utrwalone larwy należy przemyć 3 razy, po 5 minut każdorazowo, w 95% etanolu i przechowywać w 95% etanolu w temperaturze -20 °C.</li>
</ol>
2. Disekcja i utrwalanie poczek
Część I
<ol>
	<li>Obsługuj fiolki w taki sam sposób jak podczas utrwalania larw, aż larwy trzeciego stadium zaczną się przepoczwarzać. Przeglądaj fiolki co godzinę i zaznaczaj poczwarki, które przeszły proces przepoczwarczania. Pozostaw zaznaczone poczwarki do rozwoju przez 30-40 godzin w temperaturze 24 °C lub przez 24-27 godzin w temperaturze 29 °C.</li>
	<li>Używając precyzyjnej pęsety, wybierz 20-30 poczwarek w odpowiednim wieku i umieść je w ciemnej porcelanowej wielokomorowej szalce sekcyjnej. Należy uważać, aby nie uszkodzić badanych tkanek.</li>
	<li>Wyjmij poczwarki z pochewek. Zacznij od odłupania operculum i kontynuuj, aż poczwarka zostanie uwolniona. Umieść poczwarkę w komorze wypełnionej PBT. Kontynuuj wyjmowanie pozostałych poczwarek. Kroki 2.4-2.6 należy wykonywać w małych partiach po pięć poczwarek jednocześnie.</li>
	<li>Umieść pięć poczwarek na płaskiej powierzchni między komorami szalki sekcyjnej. Używając mikronoża sekcyjnego, odetnij wierzchołek głowy oraz tylny koniec odwłoka (alternatywnie można użyć dwóch pęset, aby wyrwać otwory na obu końcach poczwarek).</li>
	<li>Przytrzymaj poczwarkę w miejscu za pomocą precyzyjnej pęsety i użyj strzykawki 1 ml, aby wypłukać organy wewnętrzne poczwarki, wstrzykując PBT przez otwór przedni.</li>
	<li>Krótko opłucz zdysekowaną poczwarkę, zanurzając ją w komorze wypełnionej PBS, a następnie przenieś ją do zimnego utrwalacza w probówce Eppendorf trzymanej na lodzie.</li>
	<li>Inkubuj przez noc (ON) w temperaturze 4 °C.</li>
</ol>
Część II
<ol start="8">
	<li>Wylać utrwalacz i przemyć poczwarki trzykrotnie, po 5 minut każdorazowo, za pomocą PBT. Przemyte poczwarki przechowywać w lodzie.</li>
	<li>Napełnić dwa dołki naczynia do sekcji roztworem PBT. Za pomocą polietylenowej pipety Pasteura przenieść kilka poczwarek do jednego z dołków.</li>
	<li>Przenosić po jednej poczwarcze do drugiego dołka. Używając dwóch par ostrych pęset z idealnie dopasowanymi końcówkami, usunąć przezroczystą kutykulę poczwarki z poziomu skrzydła: unieruchomić poczwarkę na dnie dołka jedną pęsetą i delikatnie rozdarć kutykulę drugą pęsetą. Po rozdarciu kutykuli, oddzielić ją od skrzydła. Należy uważać, aby nie oddzielić skrzydła od poczwarki. Po usunięciu kutykuli z płytki skrzydła, kontynuować usuwanie kutykuli z przegubu skrzydła (gdzie znajdują się ChOs skrzydła).</li>
	<li>Po usunięciu kutykuli skrzydła można spróbować w podobny sposób usunąć kutykulę z odnóży. W procesie tym prawdopodobnie utraci się wiele odnóży, jednak mimo niskiej wydajności, krok ten jest wysoce zalecany, ponieważ znacznie poprawia barwienie ChOs odnóży. ChOs halthere i odwłoka można wizualizować bez dalszego usuwania kutykuli.</li>
	<li>Umieścić „oczyszczoną” poczwarkę w probówce Eppendorf wypełnionej metanolem i przechowywać w temperaturze pokojowej. Kontynuować usuwanie kutykuli ze wszystkich poczwarek i dodawać je do tej samej probówki. Na każde barwienie należy zebrać co najmniej 10 starannie oczyszczonych poczwarek.</li>
	<li>Usunąć metanol i przemyć trzykrotnie, po 5 minut każdorazowo, 95% Etanolem. Utrwalone poczwarki można przechowywać przez dłuższy czas w 95% Etanolu w temperaturze -20 °C.</li>
</ol>
3. Immunobarwienie larw i poczek
<ol>
	<li>Utrwaloną tkankę przemyć trzy razy PBT, po 30 minut każdego płukania, w temperaturze pokojowej. Larwy można płukać przy delikatnym wstrząsaniu na rotatorze. Poczwarki płukać bez wstrząsania.</li>
	<li>Zastąpić PBT buforem blokującym (PBT + 5% normalnego surowicy koziej) i inkubować przez noc (ON) w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Usunąć bufor blokujący i inkubować z przeciwciałami pierwszorzędowymi (rozcieńczonymi w buforze blokującym) przez noc (ON) w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Przemyć cztery razy PBT zgodnie z opisem w kroku 3.1.</li>
	<li>Usunąć PBT i inkubować z przeciwciałami drugorzędowymi (rozcieńczonymi w buforze blokującym) przez noc (ON) w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Przemyć dwukrotnie PBT i raz PBS zgodnie z opisem w kroku 3.1.</li>
	<li>Zastąpić PBS medium montażowym (Dako Fluorescent Mounting Medium (Dako Cytomation, Glostrup, Denmark)) i inkubować przez noc (ON) w temperaturze 4 °C.</li>
</ol>
4. Montowanie larw
<ol>
	<li>Larwy montuje się na szkiełku przedmiotowym w kropli medium montażowego, tak aby kutykula była skierowana w dół, a mięśnie ściany ciała w górę. Należy nanieść małą kroplę medium montażowego na czysty szkiełko nakrywkowe i przykryć nią preparat. Nie należy wywierać żadnego nacisku na zamontowane larwy.</li>
</ol>
5. Montowanie poczek
<ol>
	<li>Przygotować dwa szkiełka przedmiotowe z kroplą medium montażowego: jedno do sekcji, a drugie do przygotowania trwałego.</li>
	<li>Umieścić kilka poczek na jednym ze szkiełek.</li>
	<li>Za pomocą nożyczek sprężynowych usunąć głowę oraz tylną część odwłoka.</li>
	<li>Oddzielić grzbietową połowę klatki piersiowej od połowy brzusznej, przecinając tkanki między skrzydłami a nogami.</li>
	<li>Umieścić rozczłonkowane części ciała poczki na drugim szkiełku przedmiotowym w kropli roztworu montażowego. Należy upewnić się, że skrzydła i nogi są rozpostarte, i maksymalnie ograniczyć nakładanie się tkanek.</li>
	<li>Nanieść kroplę medium montażowego na szkiełko nakrywkę i położyć ją na próbce. Nie należy wywierać nacisku na zamontowaną próbkę.</li>
</ol>
6. Reprezentatywne wyniki
Przykład ChOs w trzecim stadium larwalnym po barwieniu immunologicznym przedstawiono na Rysunku 1. Przykład ten ukazuje odpowiednio rozciągnięty segment brzuszny, w którym wyraźnie widocznych jest siedem z ośmiu ChOs. Neurony zostały znakowane przeciwciałem MAb22C10 (1:20, otrzymanym z Developmental Studies Hybridoma Bank na University of Iowa); komórki czapki, więzadła, przyczepu czapki i przyczepu więzadła zostały znakowane przeciwciałem anti-αTub85E (1:10, Klein et al., 2010). Jako przeciwciała wtórne do barwienia fluorescencyjnego zastosowano przeciwciała anty-mysie/królicze sprzężone z Cy3 lub Cy5 (1:200, Jackson Immunoresearch Laboratories). Próbki analizowano przy użyciu mikroskopii konfokalnej (LSM 510, Zeiss).
Grupę komórek ChO skrzydła w brzusznej żyłce promienistej poczwarki w 35. godzinie rozwoju pokazano na Rysunku 2.
<img alt="Schemat sieci neuronalnej, mapowanie białek; mikroskopia fluorescencyjna, analiza połączeń neuronalnych." src="/files/ftp_upload/3846/3846fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1. (A) Schematyczny rysunek sześciu typów komórek tworzących pojedynczy organ Ch: przyczep czepka (CA), czepek (C), skolopale (S), neuron (N), więzadło (L) i przyczep więzadła (LA). Organ LCh5, w którym zgrupowane jest pięć ChOs, rozciąga się przez grupę bocznych mięśni poprzecznych (LT1-4). Przedstawiono również boczny mięsień podłużny (LL1), brzuszne mięśnie podłużne (VL1-4) oraz boczny mięsień ukośny (LO1). Komórki ścięgniste zaznaczono jako brązowe sfery (zapożyczono z Klein et al., 2010). (B) Jeden segment odwłoka larwy trzeciego stadium widoczny przy powiększeniu 10X. Widocznych jest siedem z ośmiu ChOs obecnych w każdym segmencie odwłoka: pięć organów bocznych, które razem tworzą organ pentaskolopidialny (LCh5), pojedynczy organ boczny (LCh1) oraz jeden z dwóch brzusznych ChOs (VChB). Neurony (N) organów ChOs są znakowane neuronalnym markerem MAb 22C10 (czerwony). Więzadło (L), czepek (C) i komórki przyczepu (LA, CA) są znakowane przeciwciałem anti-αTub-85E (niebieski). Komórki czepka i więzadła są dodatkowo znakowane specyficznym dla ChO reporterem GFP zawierającym element regulacyjny z locus dei (Nachman et al., dane nieopublikowane).
<img alt="Mikroskopia fluorescencyjna struktury neuronów; białka 22C10, αTub85E, GFP w układzie spektroskopowym." src="/files/ftp_upload/3846/3846fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2. Organy chordotonalne skrzydła przy brzusznej żyłce promienistej widziane przy powiększeniu 40X. Neurony (N) są znakowane markerem neuronalnym 22C10 (czerwony, B). Komórki więzadła (L) i czepki (C) są współznakowane przeciwciałami anty-αTub85E (niebieski, C) oraz specyficznym dla ChO transgenem reporterowym GFP (Nachman et al., niepublikowane dane).

<ol><li>Brewster, R., Bodmer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Origin+and+specification+of+type+II+sensory+neurons+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Origin and specification of type II sensory neurons in Drosophila.</a> Development. 121, 2923-2936 (1995).</li>
<li>Caldwell, J. C., Miller, M. M., Wing, S., Soll, D. R., Eberl, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+analysis+of+larval+locomotion+in+Drosophila+chordotonal+organ+mutants%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Dynamic analysis of larval locomotion in Drosophila chordotonal organ mutants.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 16053-16053 (2003).</li>
<li>Eberl, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Feeling+the+vibes%3A+chordotonal+mechanisms+in+insect+hearing%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Feeling the vibes: chordotonal mechanisms in insect hearing.</a> Curr. Opin. Neurobiol. 9, 389-393 (1999).</li>
<li>Eberl, D. F., Boekhoff-Falk, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+Johnston%27s+organ+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Development of Johnston's organ in Drosophila.</a> Int. J. Dev. Biol. 51, 679-687 (2007).</li>
<li>Eberl, D. F., Hardy, R. W., Kernan, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetically+similar+transduction+mechanisms+for+touch+and+hearing+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Genetically similar transduction mechanisms for touch and hearing in Drosophila.</a> J. Neurosci. 20, 5981-5988 (2000).</li>
<li>Egoz-Matia, N., Nachman, A., Halachmi, N., Toder, M., Klein, Y., Salzberg, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+regulation+of+cell+adhesion+in+the+Drosophila+wing+is+mediated+by+Delilah%2C+a+potent+activator+of+%CE%B2PS+integrin+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Spatial regulation of cell adhesion in the Drosophila wing is mediated by Delilah, a potent activator of βPS integrin expression.</a> Dev Biol. 351, 99-109 (2011).</li>
<li>Field, L. H., Matheson, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chordotonal+organs+of+insects%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Insect+Physiology%22%5BJournal%5D)">Chordotonal organs of insects.</a> Advances in Insect Physiology. 27, 1-228 (1998).</li>
<li>Gong, Z., Son, W., Chung, Y. D., Kim, J., Shin, D. W., McClung, C. A., Lee, Y., Lee, H. W., Chang, D. J., Kaang, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+interdependent+TRPV+channel+subunits%2C+inactive+and+Nanchung%2C+mediate+hearing+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Two interdependent TRPV channel subunits, inactive and Nanchung, mediate hearing in Drosophila.</a> J. Neurosci. 24, 9059-9066 (2004).</li>
<li>Inbal, A., Volk, T., Salzberg, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recruitment+of+ectodermal+attachment+cells+via+an+EGFR-dependent+mechanism+during+the+organogenesis+of+Drosophila+proprioceptors%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Cell%22%5BJournal%5D)">Recruitment of ectodermal attachment cells via an EGFR-dependent mechanism during the organogenesis of Drosophila proprioceptors.</a> Dev. Cell. 7, 241-250 (2004).</li>
<li>Jarman, A. P., Grau, Y., Jan, L. Y., Jan, Y. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((atonal+is+a+proneural+gene+that+directs+chordotonal+organ+formation+in+the+Drosophila+peripheral+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">atonal is a proneural gene that directs chordotonal organ formation in the Drosophila peripheral nervous system.</a> Cell. 73, 1307-1321 (1993).</li>
<li>Jarman, A. P., Sun, Y., Jan, L. Y., Jan, Y. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+the+proneural+gene%2C+atonal%2C+in+formation+of+Drosophila+chordotonal+organs+and+photoreceptors%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Role of the proneural gene, atonal, in formation of Drosophila chordotonal organs and photoreceptors.</a> Development. 121, 2019-2030 (1995).</li>
<li>Kim, J., Chung, Y. D., Park, D. Y., Choi, S., Shin, D. W., Soh, H., Lee, H. W., Son, W., Yim, J., Park, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+TRPV+family+ion+channel+required+for+hearing+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A TRPV family ion channel required for hearing in Drosophila.</a> Nature. 424, 81-84 (2003).</li>
<li>Klein, Y., Halachmi, N., Egoz-Matia, N., Toder, M., Salzberg, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+proprioceptive+and+contractile+systems+in+Drosophila+are+both+patterned+by+the+EGR+family+transcription+factor+Stripe%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">The proprioceptive and contractile systems in Drosophila are both patterned by the EGR family transcription factor Stripe.</a> Dev. Biol. 337, 458-470 (2010).</li>
<li>Matthews, K. A., Miller, D. F., Kaufman, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+implications+of+the+unusual+spatial+distribution+of+a+minor+alpha-tubulin+isotype+in+Drosophila%3A+a+common+thread+among+chordotonal+ligaments%2C+developing+muscle%2C+and+testis+cyst+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Functional implications of the unusual spatial distribution of a minor alpha-tubulin isotype in Drosophila: a common thread among chordotonal ligaments, developing muscle, and testis cyst cells.</a> Dev. Biol. 137, 171-183 (1990).</li>
<li>Okabe, M., Okano, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-step+induction+of+chordotonal+organ+precursors+in+Drosophila+embryogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Two-step induction of chordotonal organ precursors in Drosophila embryogenesis.</a> Development. 124, 1045-1053 (1997).</li>
<li>Rusten, T. E., Cantera, R., Urban, J., Technau, G., Kafatos, F. C., Barrio, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spalt+modifies+EGFR-mediated+induction+of+chordotonal+precursors+in+the+embryonic+PNS+of+Drosophila+promoting+the+development+of+oenocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Spalt modifies EGFR-mediated induction of chordotonal precursors in the embryonic PNS of Drosophila promoting the development of oenocytes.</a> Development. 128, 711-722 (2001).</li>
<li>Todi, S. V., Sharma, Y., Eberl, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anatomical+and+molecular+design+of+the+Drosophila+antenna+as+a+flagellar+auditory+organ%5BTitle%5D)+AND+%22Microsc.+Res.+Tech%22%5BJournal%5D)">Anatomical and molecular design of the Drosophila antenna as a flagellar auditory organ.</a> Microsc. Res. Tech. 63, 388-399 (2004).</li>
<li>zur Lage, P., Jarman, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antagonism+of+EGFR+and+notch+signalling+in+the+reiterative+recruitment+of+Drosophila+adult+chordotonal+sense+organ+precursors%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Antagonism of EGFR and notch signalling in the reiterative recruitment of Drosophila adult chordotonal sense organ precursors.</a> Development. 126, 3149-3159 (1999).</li>
</ol>

Nie zgłoszono konfliktów interesów.

Protokół opisany w tym filmie umożliwia wizualizację proprioceptywnych ChO w stadiach larwalnym i poczwarki. Badania nad strukturą i rozwojem proprioceptywnych ChO były dotychczas ograniczone głównie do stadiów embrionalnych oraz larwalnych tarcz wyobraźnia. W związku z tym wiele aspektów późniejszych etapów rozwoju, zarówno larwalnych, jak i adultowych ChO, pozostaje w dużej mierze nieznanych. Opisany protokół, w połączeniu z powszechnymi narzędziami genetycznymi u Drosophila, może zostać wykorzystany do identyfikacji i badania nowych genów oraz szlaków, które odgrywają rolę w późniejszych etapach rozwoju ChO. Protokół ten został zoptymalizowany pod kątem wizualizacji ChO, ale można go dostosować do barwienia innych tkanek, takich jak skrzydła poczwarki 6.

<table><tbody><tr><td>Pinceta Dumont #5 (lub #55), końcówka biologiczna</td><td>F.S.T.</td><td>11252-20 lub 11252-10 (lub podobna pinceta)</td><td></td></tr><tr><td>Stalowe szpilki entomologiczne Austerlitz, minutiens 0.1mm </td><td>Roboz Surgical Instruments Co.</td><td>RS-6083-10</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw elastomeru silikonowego Sylgard 184 </td><td>Dow Corning</td><td>240.4019862</td><td></td></tr><tr><td>Mikronóżki Vannasa (proste, 7.5 cm, ostrze 3mm)</td><td>AS Mdeizintechnik GmbH</td><td>11-590-00</td><td>Nożyczki sprężynowe Vannasa o identycznych specyfikacjach można nabyć w Roboz Surgical Instrument Co. </td></tr><tr><td>Mieszadło orbitalne - Rotamax-120</td><td>Heidolph</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Medium montażowe do fluorescencji Dako Fluorescent Mounting Medium </td><td>Dako</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Roztwór PBS X10 </td><td></td><td>Jakość PBS jest krytyczna dla powodzenia tego protokołu</td><td>2 gr/lit KCl, 2 gr/lit KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;, 80 gr/lit NaCl, &lt;br/&gt; 21.7 gr/lit Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO4.7H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td></tr><tr><td>PBT</td><td>X1 PBS + 0.1% Tween 20</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

wizualizacja proprioceptorów w larwach i poczwarkach drosophila

Visualization of Proprioceptors in Drosophila Larvae and Pupae

Propriocepcja to zdolność wyczuwania ruchu lub położenia części ciała poprzez reagowanie na bodźce powstające wewnątrz organizmu. U muszek owocowych i innych owadów propriocepcję zapewniają wyspecjalizowane organy sensoryczne nazywane organami chordotonalnymi (ChOs) 2. Podobnie jak wiele innych organów u Drosophila, ChOs rozwijają się dwukrotnie w cyklu życiowym muchy. Najpierw larwalne ChOs rozwijają się podczas embriogenezy. Następnie dorosłe ChOs zaczynają rozwijać się w larwalnych tarczach imaginalnych i nadal różnicują się podczas metamorfozy.
Rozwój larwalnych ChO podczas embriogenezy był przedmiotem licznych badań 10,11,13,15,16. Centralnym elementem każdego ChO jest jednostka sensoryczna składająca się z neuronu i komórki skolopalnej. Jednostka sensoryczna jest rozciągnięta pomiędzy dwoma typami komórek akcesoryjnych, które przylegają do kutykuli za pomocą wyspecjalizowanych komórek przyczepu epidermalnego 1,9,14. Podczas ruchu larwy muchy względne przemieszczenie komórek przyczepu epidermalnego prowadzi do rozciągnięcia jednostki sensorycznej i w konsekwencji do otwarcia specyficznych kanałów potencjału przejściowego waniloidowego (TRPV) w segmencie zewnętrznym dendrytu 8,12. Wywołany sygnał jest następnie przekazywany do obwodu centralnego generatora wzorców lokomocyjnych w ośrodkowym układzie nerwowym.
U dorosłej muchy opisano wiele ChO 7. Znajdują się one w pobliżu stawów wyrostków dorosłej muchy (nóg, skrzydeł i halterów) oraz w klatce piersiowej i odwłoku. Ponadto kilkaset ChO wspólnie tworzy organ Johnston'a w czułku dorosłego osobnika, który przekształca energię akustyczną w mechaniczną 3,5,17,4.
W przeciwieństwie do rozległej wiedzy na temat rozwoju ChO w stadiach embrionalnych, bardzo niewiele wiadomo o morfologii tych organów w stadiach larwalnych. Co więcej, z wyjątkiem ChO udowych 18 oraz organu Johnstona, nasza wiedza na temat rozwoju i struktury ChO u dorosłej muchy jest bardzo fragmentaryczna.
W niniejszym opracowaniu opisujemy metodę barwienia i wizualizacji ChO u larw trzeciego stadium oraz u poczwarek. Metodę tę można stosować w połączeniu z narzędziami genetycznymi, aby lepiej scharakteryzować morfologię i zrozumieć rozwój różnych ChO u muchy.

Opisano metodę immunobarwienia i wizualizacji organów chordotonalnych w larwach i poczwarkach Drosophila melanogaster.

Wizualizacja proprioceptorów w larwach i poczwarkach Drosophila

Propriocepcja to zdolność do wyczuwania ruchu lub położenia części ciała poprzez reagowanie na bodźce powstające wewnątrz organizmu. U muszek owocowych i innych...

Ogólnym celem tej procedury jest wizualizacja organów kortonowych odpowiedzialnych za propriocepcję u larw i poczwarek drozylowatych. Osiąga się to poprzez hodowlę i zbieranie larw trzeciego stadium lub poczwarek, a następnie przeprowadzenie sekcji larw lub poczwarek. Następnie są one utrwalane do barwienia immunologicznego.Następnie utrwalone larwy lub poczwarki poddaje się immunobarwieniu z użyciem odpowiednich przeciwciał. Ostatnim etapem jest montaż zabarwionych próbek do analizy mikroskopowej. W końcowym kroku wykorzystuje się mikroskopię konfokalną do wizualizacji organów cortone.Ta metoda może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania dotyczące rozwoju po symbiontycznym oraz rozmieszczenia receptorów prop w oph. Chociaż procedura ta może dostarczyć wiedzy na temat rozwoju receptorów prop, można ją również zastosować do innych narządów, takich jak inne rodzaje organów sensorycznych oraz ścięgna. W pierwszej kolejności należy przygotować niezbędne narzędzia, roztwory oraz fiolkę z larwami w stadium wędrówki.Trzeci stadium larw w kształcie gwiazdy: roztwory PBS i FIXATIVE należy przechowywać w lodzie. Wybrać larwę w trzecim stadium w kształcie gwiazdy, która przemieszcza się po ściance fiolki, i umieścić ją w 50 µL kropli lodowatego PBS na płytce sekcyjnej wykonanej z elastomeru cygarowego w naczyniu hodowlanym. Korzystając z mikroskopu sekcyjnego, przytrzymać larwę stroną grzbietową do góry w okolicy haków gębowych za pomocą precyzyjnej pęsety i przebić mózg szpilką entomologiczną.Chwyć tylny koniec larwy za pomocą pęsety. Delikatnie pociągnij i rozciągnij larwę wzdłuż jej osi. Wprowadź drugą szpilkę entomologiczną pomiędzy dwa tylne segmenty sferyczne, używając nożyczek sprężynowych.Wykonaj dwa poziome nacięcia w ścianie ciała prostopadle do osi przednio-tylnej, zachowując niewielki odstęp od szpilek przedniej i tylnej. Następnie przetnij ścianę ciała larwy wzdłuż linii środkowej grzbietowej, od nacięcia przedniego do tylnego. Usuń organy wewnętrzne oraz tchawki, używając precyzyjnej pincety.Następnie należy delikatnie przemyć preparat raz lub dwa razy w PBS. Chwycić dwa płaty ściany ciała za pomocą pęsety. Rozciągnąć je i przytwierdzić do płytki, używając dwóch szpilek entomologicznych na każdą stronę.Usunąć PBS i dodać 50 µL roztworu utrwalającego. Inkubować przez 20 minut w temperaturze pokojowej. Po usunięciu utrwalacza i dwukrotnym przemyciu PBS, wyciągnąć szpilki entomologiczne za pomocą nożyczek sprężynowych.Odciąć głowę oraz ogon larwy, pozostawiając prostokątny płat tkanki. Przenieść utrwaloną tkankę do schłodzonej probówki typu Eppendorf z PBS. Po utrwaleniu odpowiedniej liczby larw można przejść bezpośrednio do barwienia przeciwciałami.Jeśli natychmiastowe barwienie nie jest pożądane, utrwalone larwy należy przemyć trzykrotnie przez pięć minut każdorazowo 95% etanolem, a następnie przechowywać w etanolu w temperaturze -20°C. Należy monitorować fiolki w taki sam sposób jak podczas utrwalania larw, aż do momentu, gdy larwy trzeciego stadium zaczną żerować. Fiolki należy sprawdzać co godzinę i zaznaczać larwy, które zaczęły żerować.Pozostaw zaznaczone poczwarki do rozwoju przez 30 do 40 godzin w temperaturze 24 °C lub przez 24 do 27 godzin w temperaturze 29 °C. Za pomocą precyzyjnej pęsety wybierz 20 do 30 poczwarek w odpowiednim wieku i umieść je w ciemnej porcelanowej wieloodworowej szalce sekcyjnej. Należy uważać, aby nie uszkodzić badanych tkanek.Następnie należy wyodrębnić poczwarki z ich osłonek. Rozpocznij od odwarstwienia operculum i kontynuuj, aż poczwarka zostanie uwolniona. Wyodrębnij wszystkie poczwarki i umieść je w studzience wypełnionej PBT.Używając mikro skalpela do sekcji, umieść pięć poczek na płaskiej powierzchni pomiędzy dołkami naczynia sekcyjnego. Odetnij wierzchołek głowy oraz tylny koniec odwłoka. Przytrzymaj poczek za pomocą precyzyjnej pincety i użyj strzykawki o pojemności 1 mL, aby wypłukać organy wewnętrzne poczek, wstrzykując PBT przez otwór przedni.Krótko opłucz wypreparowaną poczwarkę, zanurzając ją w studzience wypełnionej PBS, a następnie przenieś ją do zimnego utrwalacza w probówce typu eppendorf przechowywanej na lodzie. Inkubuj poczwarkę przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Następnego dnia.Odlej utrwalacz i przemyj puby PBT trzykrotnie przez pięć minut podczas każdego płukania. Przechowuj przemyte puby w lodzie. Napełnij dwa dołki naczynia sekcyjnego PBT.Używając polietylenowej pipety pasteryzacyjnej, przenieś kilka poczek do jednej z studzienek. Następnie przenoś po jednej poczce do drugiej studzienki.Używając dwóch par ostrych pęset z idealnie dopasowanymi końcówkami, przymocuj poczwarkę do dna dołka, a następnie delikatnie przerwij kutykulę. Usunięcie kutykuli skrzydeł jest najtrudniejszym etapem tej procedury. Na tym kroku zawsze tracimy część skrzydeł, dlatego rozpoczynamy procedurę z relatywnie dużą liczbą poczwarek.Po przerwanym nacięciu kutykuli, należy zdjąć ją ze skrzydła. Należy zachować ostrożność, aby nie oddzielić skrzydła od poczwarki. Po usunięciu kutykuli z płytki skrzydła, należy kontynuować usuwanie kutykuli z zawiasu skrzydła.Po odwarstwieniu kutykuli skrzydła można podjąć próbę odwarstwienia kutykuli odnóg w podobny sposób. W procesie tym prawdopodobnie utraconych zostanie wiele odnóg, jednak mimo niskiej wydajności krok ten jest wysoce zalecany, ponieważ znacznie poprawia barwienie organów cortone w odnogach. Umieść poczwarkę w probówce typu einor wypełnionej metanolem i przechowuj w temperaturze pokojowej.Kontynuuj usuwanie kutykuli ze wszystkich puy i dodawaj je do tej samej probówki, aż uzyskasz łącznie co najmniej 10 dokładnie oczyszczonych puy. Przed każdym barwieniem usuń metanol i przemyj próbki trzykrotnie przez pięć minut każdorazowo etanolm 95%. Utrwalone puy można przechowywać przez dłuższy czas w etanolu 95% w temperaturze minus 20 stopni przed barwieniem immunologicznym.Aby zamontować larwy, należy nanieść kroplę medium montażowego na szkiełko przedmiotowe, a następnie umieścić larwy kutykulą skierowaną w dół, a mięśniami ściany ciała w górę. Nanieść małą kroplę medium montażowego na czyste szkiełko nakrywkowe i przykryć nią preparat, nie wywierając nacisku na zamontowane larwy. Aby zamontować pupy.W pierwszej kolejności przygotuj dwa szkiełka przedmiotowe z kroplą medium montażowego – jedno do sekcji, a drugie do montażu. Umieść kilka poczwerek na jednym ze szkiełek, a następnie za pomocą nożyczek sprężynowych odetnij głowę oraz tylną część odwłoka. Następnie oddziel grzbietową połowę klatki piersiowej od połowy brzusznej, przecinając obszar między skrzydłami a odnóżami.Umieść rozczłonkowane części ciała poczwarki w kropli medium montażowego. Na drugim preparacie upewnij się, że skrzydła i odnóża są rozprostowane, i staraj się maksymalnie ograniczyć nakładanie się tkanek. Na koniec nanieś kroplę medium montażowego na szkiełko zakryjące i nałóż je na próbkę, nie wywierając nadmiernego nacisku.Ta mikrografia konfokalna z immuno-barwieniem organów Chordotonalnych u larwy w trzecim stadium pokazuje dobrze rozciągnięty segment brzuszny, w którym wyraźnie widocznych jest siedem z ośmiu organów Chordotonalnych. Widoczne są pięć organów bocznych tworzących wspólnie organ penasco-lipidowy, pojedynczy organ boczny oraz jeden z dwóch brzusznych organów Chordotonalnych. Neurony organu Chordotonalnego zostały znakowane markerem neuronalnym, przeciwciałem monoklonalnym 22 C 10, i są przedstawione w kolorze czerwonym.Komórki czapeczki więzadła i komórki przyczepu zostały znakowane przeciwciałem Antifa tubulin 85 E i są przedstawione na niebiesko. Komórki czapeczki i więzadła są dodatkowo znakowane specyficznym reporterem GFP zawierającym element regulacyjny dla locus Delilah.Na niniejszym mikrozdjęciu konfokalnym poczwarki w wieku 35 godzin przedstawiono organy kortitonalne skrzydła przy brzusznej żyłce radialnej. Neurony są znakowane markerem neuronalnym 22 C 10 i widoczne są w kolorze czerwonym w panelu B. Komórki więzadła i czepka są współznakowane przeciwciałami Antifa tubulin 85 E, widocznymi w kolorze niebieskim w panelu C, podobnie jak organ kortitonalny. Specyficzny transgen reporterowy GFP przedstawiono w kolorze zielonym.Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać wystarczającą wiedzę na temat wizualizacji proprioceptywnych organów chordotonalnych zarówno w larwie, jak i poczwarka w oph. Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać, że została ona zoptymalizowana pod kątem zastosowania opisanych przeciwciał. Inne przeciwciała mogą wymagać nieco innych warunków fiksacji i barwienia.W związku z tym, stosując tę procedurę z różnymi przeciwciałami, należy dobrać optymalne warunki dla używanych przeciwciał.

visualization-of-proprioceptors-in-drosophila-larvae-and-pupae

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Wizualizacja proprioceptorów w larw Drosophila i poczwarkach

Drosophila melanogaster larwy stanowią idealny model badawczy do analizy mechanizmów transportu aksonalnego w nerwach segmentowych larw. Stosując tę procedurę, 3Badania i rozwój larwy w stadium poczwarki niosące różne mutacje można porównać z larwami typu dzikiego.

Wizualizacja nerwów segmentowych larw w preparatach larw Drosophila w 3rd stadium zasiedlenia

Opisujemy procedurę przygotowania zarodków Drosophila na różnych etapach rozwoju w celu wizualizacji embrionalnego układu nerwowego podczas embriogenezy.

Wizualizacja embrionalnego układu nerwowego w całych zarodkach Drosophila

Niniejszy protokół opisuje niezawodną metodę znieczulania i obrazowania nienaruszonych larw Drosophila melanogaster. Wykorzystaliśmy lotny anestetyk desfluran, aby umożliwić powtarzalne obrazowanie z rozdzielczością podkomórkową oraz ponowną identyfikację struktur przez okres do kilku dni1.

Obrazowanie in vivo nienaruszonych larw Drosophila z rozdzielczością podkomórkową

W tym filmie opisujemy metodę obrazowania żywych komórek w celu obserwacji asymetrycznego podziału komórek progenitorowych organów sensorycznych oraz komórek epidermy w nienaruszonych poczwarkach...

Obrazowanie żywych komórek prekursorowych organów zmysłowych w nienaruszonych poczwarkach Drosophila

Źródło: Jeong, S. Wizualizacja wzorca projekcji aksonalnej embrionalnych neuronów ruchowych u Drosophila. J. Vis. Exp. (2017)Ten film pokazuje wizualizację projekcji aksonalnych w zarodkach Drosophila. Znakowanie immunologiczne neuronów ruchowych, precyzyjna sekcja w celu odsłonięcia struktur neuronalnych oraz mikroskopia kontrastowa z różnicową interferencją łącznie ujawniają szczegółową architekturę neuronów, podkreślając wzorce projekcji aksonalnej.

Wizualizacja wzorców projekcji aksonalnej embrionalnych neuronów ruchowych u Drosophila

Ten protokół przedstawia skuteczną metodę obrazowania żywego nabłonka oka poczwarki Drosophila. Metoda ta kompensuje ruch tkanek i nierówną topologię, poprawia wizualizację granic komórek dzięki zastosowaniu wielu białek połączeniowych znakowanych GFP i wykorzystuje łatwe w montażu urządzenie do obrazowania.

Obrazowanie na żywo oka poczwarki Drosophila

Opisujemy protokół preparacji, utrwalania i barwienia immunologicznego organów steroidogennych u larw Drosophila i dorosłych samic w celu zbadania biosyntezy hormonów steroidowych i ich mechanizmu regulacyjnego. Oprócz narządów steroidogennych wizualizujemy unerwienie narządów steroidogennych, a także steroidogennych komórek docelowych, takich jak komórki macierzyste linii rozrodczej.

Protokoły wizualizacji narządów steroidogennych i ich interaktywnych narządów z barwieniem immunologicznym u muszki owocowej Drosophila melanogaster

Ta praca opisuje standardową metodę immunohistochemiczną do wizualizacji projekcji neuronów ruchowych zarodków Drosophila melanogaster w późnym stadium 16. Wyfiletowany preparat utrwalonych zarodków wybarwionych przeciwciałem FasII stanowi potężne narzędzie do scharakteryzowania genów wymaganych do znajdowania ścieżki aksonów ruchowych i rozpoznawania celów podczas rozwoju neuronalnego.

Wizualizacja wzorca projekcji aksonalnej embrionalnych neuronów ruchowych u Drosophila

Tutaj prezentujemy łatwą w użyciu i wszechstronną metodę do wykonywania na żywo obrazowania procesów rozwojowych w ogóle, a morfogenezy mięśniowo-ścięgnistej w szczególności u żyjących poczwarek Drosophila.

In vivo (in vivo) Obrazowanie morfogenezy mięśniowo-ścięgnistej u poczwarek Drosophila

Tutaj opisujemy protokół wizualizacji celowania aksonalnego za pomocą białka fluorescencyjnego w odnóżach dorosłych Drosophila poprzez etapy fiksacji, montażu, obrazowania i po obrazowaniu.

Wizualizuj aksony neuronu ruchowego nóg Drosophila przez naskórek dorosłego człowieka

Tutaj przedstawiono protokół długoterminowego obrazowania na żywo nogi Drosophila w fazie poczwarki, obejmujący całkowite usunięcie poczwarki. Protokół ten można również zastosować do innych tkanek.

Długoterminowe obrazowanie na żywo rozwoju nogi poczwarki Drosophila po usunięciu pupary

Poznaj metodę immunobarwienia i wizualizacji organów chordotonalnych u larw i poczwarek Drosophila melanogaster. Technika obejmuje preparowanie, barwienie przeciwciałami i mikroskopię konfokalną.

Wizualizacja proprioceptorów w larwach i poczwarkach Drosophila

Przeglądaj więcej filmów