Name: Wizualizacja zależnego od cytoszkieletu transportu organelli zawierających lipidy w zarodkach Drosophila (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-12-13T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 55 s
Description: Poznaj metodę mikroinjekcji sond fluorescencyjnych do zarodków Drosophila w celu wizualizacji ruchu organelli. Technika ta umożliwia analizę dynamiki lipidowych kropel i retikulum endoplazmatycznego przy użyciu mikroskopii konfokalnej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Pakinee Phromsiri, Brianowi Jencikowi, Jinghongowi (Jamesowi) Tangowi i Rogerowi White'owi za ich komentarze do manuskryptu. Dziękujemy Patrickowi Oakesowi, Stefano Di Talii i Victorii Deneke za podzielenie się swoją wiedzą na temat przeprowadzania analizy PIV. Prace te były wspierane przez granty National Institutes of Health: F31 HD100127 (dla M. D. K.) i R01 GM102155 (dla M. A. W).

<ol><li>Chowdhary, S., Tomer, D., Dubal, D., Sambre, D., Rikhy, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+mitochondrial+organization+and+function+in+the+Drosophila+blastoderm+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Analysis of mitochondrial organization and function in the Drosophila blastoderm embryo.</a> Scientific Reports. 7 (1), 5502(2017).</li>
<li>Mavor, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rab8+directs+furrow+ingression+and+membrane+addition+during+epithelial+formation+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Rab8 directs furrow ingression and membrane addition during epithelial formation in Drosophila melanogaster.</a> Development. 143 (5), 892-903 (2016).</li>
<li>Riggs, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Actin+cytoskeleton+remodeling+during+early+Drosophila+furrow+formation+requires+recycling+endosomal+components+Nuclear-fallout+and+Rab11%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Actin cytoskeleton remodeling during early Drosophila furrow formation requires recycling endosomal components Nuclear-fallout and Rab11.</a> Journal of Cell Biology. 163 (1), 143-154 (2003).</li>
<li>Welte, M. A., Gross, S. P., Postner, M., Block, S. M., Wieschaus, E. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+regulation+of+vesicle+transport+in+Drosophila+embryos%3A+forces+and+kinetics%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Developmental regulation of vesicle transport in Drosophila embryos: forces and kinetics.</a> Cell. 92 (4), 547-557 (1998).</li>
<li>Welte, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((As+the+fat+flies%3A+The+dynamic+lipid+droplets+of+Drosophila+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta%22%5BJournal%5D)">As the fat flies: The dynamic lipid droplets of Drosophila embryos.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1851 (9), 1156-1185 (2015).</li>
<li>Deneke, V. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-organized+nuclear+positioning+synchronizes+the+cell+cycle+in+Drosophila+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Self-organized nuclear positioning synchronizes the cell cycle in Drosophila embryos.</a> Cell. 177 (4), 925-941 (2019).</li>
<li>Welte, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+lipid-droplet+transport+by+the+perilipin+homolog+LSD2%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Regulation of lipid-droplet transport by the perilipin homolog LSD2.</a> Current Biology. 15 (14), 1266-1275 (2005).</li>
<li>Bailey, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antioxidant+role+for+lipid+droplets+in+a+stem+cell+niche+of+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Antioxidant role for lipid droplets in a stem cell niche of Drosophila.</a> Cell. 163 (2), 340-353 (2015).</li>
<li>Johnson, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((H2Av+buffering+via+dynamic+sequestration+to+lipid+droplets+in+Drosophila+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">H2Av buffering via dynamic sequestration to lipid droplets in Drosophila embryos.</a> Elife. 7, 36021(2018).</li>
<li>Lowe, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+the+expression+patterns%2C+subcellular+localisations+and+interaction+partners+of+Drosophila+proteins+using+a+pigP+protein+trap+library%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Analysis of the expression patterns, subcellular localisations and interaction partners of Drosophila proteins using a pigP protein trap library.</a> Development. 141 (20), 3994-4005 (2014).</li>
<li>Rambold, A. S., Cohen, S., Lippincott-Schwartz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fatty+acid+trafficking+in+starved+cells%3A+regulation+by+lipid+droplet+lipolysis%2C+autophagy%2C+and+mitochondrial+fusion+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">Fatty acid trafficking in starved cells: regulation by lipid droplet lipolysis, autophagy, and mitochondrial fusion dynamics.</a> Developmental Cell. 32 (6), 678-692 (2015).</li>
<li>Rand, M. D., Kearney, A. L., Dao, J., Clason, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Permeabilization+of+Drosophila+embryos+for+introduction+of+small+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+Biochemistry+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Permeabilization of Drosophila embryos for introduction of small molecules.</a> Insect Biochemistry and Molecular Biology. 40 (11), 792-804 (2010).</li>
<li>Tran, S. L., Welte, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In-vivo+centrifugation+of+Drosophila+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">In-vivo centrifugation of Drosophila embryos.</a> Journal of Visualized Experiments. (40), (2010).</li>
<li>Rothwell, W. F., Sullivan, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+embryo+collection%5BTitle%5D)+AND+%22CSH+Protocols%22%5BJournal%5D)">Drosophila embryo collection.</a> CSH Protocols. 2007, (2007).</li>
<li>Wieschaus, E., Nüsslein-Volhard, C. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWieschaus%2C+E+%22Drosophila%3A+A+Practical+Approach%22">Drosophila: A Practical Approach</a>. Roberts, D. B. , Oxford University Press. 179-214 (1998).</li>
<li>Brody, T. B. The Interactive Fly: Stages of Development and Mitotic Domains. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.sdbonline.org/sites/fly/aimain/2stages.htm">https://www.sdbonline.org/sites/fly/aimain/2stages.htm</a> (1999).</li>
<li>Liberzon, A., et al. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLiberzon%2C+A+%22OpenPIV%2Fopenpiv-python%3A+OpenPIV+-+Python+%28v0.22.2%29+with+a+new+extended+search+PIV+grid+option%22">OpenPIV/openpiv-python: OpenPIV - Python (v0.22.2) with a new extended search PIV grid option</a>. , (2020).</li>
<li>Markow, T. A., Beall, S., Matzkin, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Egg+size%2C+embryonic+development+time+and+ovoviviparity+in+Drosophila+species%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Evolutionary+Biology%22%5BJournal%5D)">Egg size, embryonic development time and ovoviviparity in Drosophila species.</a> Journal of Evolutionary Biology. 22 (2), 430-434 (2009).</li>
<li>Gross, S. P., Welte, M. A., Block, S. M., Wieschaus, E. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynein-mediated+cargo+transport+in+vivo.+A+switch+controls+travel+distance%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Dynein-mediated cargo transport in vivo. A switch controls travel distance.</a> Journal of Cell Biology. 148 (5), 945-956 (2000).</li>
<li>Debarre, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+lipid+bodies+in+cells+and+tissues+using+third-harmonic+generation+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Imaging lipid bodies in cells and tissues using third-harmonic generation microscopy.</a> Nature Methods. 3 (1), 47-53 (2006).</li>
<li>Dou, W., Zhang, D., Jung, Y., Cheng, J. X., Umulis, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Label-free+imaging+of+lipid-droplet+intracellular+motion+in+early+Drosophila+embryos+using+femtosecond-stimulated+Raman+loss+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Label-free imaging of lipid-droplet intracellular motion in early Drosophila embryos using femtosecond-stimulated Raman loss microscopy.</a> Biophysical Journal. 102 (7), 1666-1675 (2012).</li>
<li>Barry, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Injecting+Gryllus+bimaculatus+Eggs%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Injecting Gryllus bimaculatus Eggs.</a> Journal of Visualized Experiments. (150), (2019).</li>
<li>Le Trionnaire, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+integrated+protocol+for+targeted+mutagenesis+with+CRISPR-Cas9+system+in+the+pea+aphid%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+Biochemistry+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">An integrated protocol for targeted mutagenesis with CRISPR-Cas9 system in the pea aphid.</a> Insect Biochemistry and Molecular Biology. 110, 34-44 (2019).</li>
</ol>

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

Zarodek Drosophila jest potężnym i wygodnym modelem do badania podstawowych pytań z zakresu biologii komórkowej i organizmu. Jego względna prostota, potężna genetyka i niewielkie rozmiary sprawiają, że jest to doskonały system do obrazowania zarówno procesów komórkowych, jak i rozwoju. W tym przypadku standardowy protokół mikroiniekcji jest dostosowany do możliwości stosowania FP w zarodkach. Takie podejście pozwala na obrazowanie fluorescencyjne określonych struktur komórkowych bez konieczności stosowania genetycznie kodowanych fluoroforów, co otwiera wiele środowisk genetycznych na obrazowanie. Połączenie wielu barwników oraz strategicznie dobranych białek znakowanych fluorescencyjnie może otworzyć wielokanałowe obrazowanie na żywo obejmujące całe spektrum światła widzialnego.
Krytyczne kroki w protokole: Ten protokół używa BODIPY 493/503 do oznaczania LD. Takie podejście można łatwo dostosować do oznaczania innych struktur komórkowych. Dla późniejszej analizy obrazu jednym z najważniejszych czynników jest stosunek sygnału do szumu, czyli jasność barwnika w porównaniu z sygnałem tła. Lizosomy zostały z powodzeniem zobrazowane (LysoTracker Red, 1 mM), a także mitochondria (Mitoview 633, 200 μM), ER (ER tracker Green, 10 μM) i mikrotubule (tubulina SiR, 200 nM w DMSO), jak pokazano na rysunku 2, rysunku 3, rysunku 4, rysunku 5. Ponadto pęcherzyki żółtkowe są autofluorescencyjne i emitują niebieskie światło po wzbudzeniu UV (obraz wykorzystujący 405 nm jako długość fali wzbudzenia (ryc. 6)). W przypadku innych barwników należy dążyć do tego, aby stężenie barwnika było 100-1,000 razy większe niż to, co byłoby potrzebne do barwienia żywych komórek hodowanych; Jest to podobne do stężenia roztworu podstawowego, który zostałby rozcieńczony w pożywce do hodowli komórkowych. Ponieważ protokół ten wymaga wstrzyknięcia 100 fL, a zarodek Drosophila ma około 9 nL w objętości18, te stężenia barwnika uśrednią się do wewnętrznego stężenia embrionalnego poniżej 1/100 tego, co jest obecne w pożywce do hodowli komórkowych. Tymczasowo stężenie miejscowe będzie wyższe w miejscu wstrzyknięcia, co jest najbardziej istotne w przypadku FP, które nie dyfundują dobrze (tj. Barwniki mitochondrialne i tubulina SiR). W przypadku tych FP zacznij od zalecanych wysokich stężeń; W przypadku zaobserwowania nieoczekiwanej śmierci, należy stopniowo rozcieńczyć dwukrotnie, aż do osiągnięcia akceptowalnego kompromisu między przeżyciem a siłą sygnału.
W przypadku jednoczesnego wstrzykiwania wielu barwników, oba barwniki powinny być albo w tym samym rozpuszczalniku, albo zarówno rozpuszczalniki, jak i barwniki powinny być kompatybilne z mieszaniną (stężenia alkoholu przekraczające ~10% nie są zalecane).
Jakość igieł ma zasadnicze znaczenie dla powodzenia tej procedury, ponieważ końcówka musi być tak delikatna, jak to tylko możliwe. W przeciwnym razie uszkodzenie rany po wstrzyknięciu może zagrozić późniejszemu rozwojowi zarodka. Ponieważ komercyjne ściągacze igieł różnią się między sobą, ważne jest, aby postępować zgodnie z sugestiami producenta i wypróbowywać wiele parametrów ciągnięcia, aż do uzyskania pożądanego kształtu. Bardzo ważne jest, aby wykonać krok kontroli jakości 1.1.3, ponieważ praca z pękniętą, postrzępioną lub dużą końcówką igły sprawi, że udane wstrzyknięcie będzie trudniejsze lub nawet niemożliwe.
Zarodek musi zostać częściowo wysuszony, aby podczas wstrzyknięcia można było dodać dodatkowe objętości płynu. Jeśli zarodek jest niedostatecznie wysuszony, igła nie wejdzie łatwo, a cytoplazma wytryśnie podczas penetracji igły lub wstrzykiwania roztworu. Jeśli zarodek jest nadmiernie wysuszony, będzie wyglądał na opróżniony i nie będzie się prawidłowo rozwijał. Dokładny czas schnięcia zależy od lokalnych warunków, np. wilgotności powietrza, i może się zmieniać z dnia na dzień. Musi być ona określona empirycznie dla każdej sesji.
Zdolność zarodka do przeżycia po mikroiniekcji zależy w decydującym stopniu od jakości igły, prawidłowego wysuszenia i ograniczenia objętości wstrzyknięcia do mniej niż 1 pL (najlepiej 100 fL). Dopóki te parametry są zoptymalizowane, nie widać znaczącej toksyczności, gdy opisane barwniki są wstrzykiwane w zalecanych stężeniach. Jeśli zarodki przetrwają etapy suszenia i wstrzykiwania, zazwyczaj rozwijają się pomyślnie do wydłużenia pasma zarodkowego, wyjątkiem są sondy mikrotubul i ER, które powodowały defekty celularyzacji na wysokich poziomach (wstrzyknięcie 100 fL stężenia wyjściowego każdego z nich). Testy nie wykazały żadnych oczywistych wad rozwojowych, gdy DMSO, woda i mieszaniny tych dwóch substancji zostały wstrzyknięte w zalecanych ilościach, ze wskaźnikiem przeżycia zarodka poprzez wydłużenie pasma zarodkowego o ~ 75% lub więcej. Objętości iniekcji większe niż ponad 1 pL powodowały ubytki i zarodki, którym wstrzyknięto ~4 objętości pL, rozwijały się krócej niż 1 h. W związku z tym objętości iniekcji muszą być utrzymywane na niskim poziomie, co oznacza, że stężenia barwnika muszą być wysokie.
Ogólnie rzecz biorąc, zaleca się wstrzyknięcia wzdłuż bocznej krawędzi zarodka, ponieważ powodują one najmniejsze uszkodzenia. Jednak może być konieczne dostosowanie miejsca wstrzyknięcia w zależności od właściwości dyfuzyjnych zastosowanych FP. BODIPY 493/503 i LysoTracker dyfundują szybciej po całym zarodku niż Lipid Spot 610 (inny barwnik do oznaczania LD), podczas gdy SiR-Tubulin i Mitoview 633 nigdy nie dyfundują w pełni przez zarodek (obrazowanie dopiero po 7 godzinach od wstrzyknięcia). W związku z tym może być konieczne wstrzyknięcie w miejsce zainteresowania lub w jego pobliżu. Podczas wstrzykiwania w przednią lub tylną część skóry zaleca się użycie szczególnie cienkiej igły.
Akwizycja obrazu opiera się na mikroskopii konfokalnej w celu optycznego przekrojenia i rozdzielenia małych organelli i wszystkich składników cytoszkieletu. Techniki wymagające analizy wielu obrazów (np. STORM lub PALM) nie zadziałają, ponieważ zawartość embrionalna jest w ruchu, a fluorofory nie są zoptymalizowane pod kątem fotoprzełączania. Mikroskopia epifluorescencyjna nie ma rozdzielczości bocznej i osiowej, aby dostrzec większość organelli i mniejszych struktur komórkowych. Z tych powodów zdecydowanie zaleca się użycie mikroskopu konfokalnego lub zastosowanie technologii arkuszy świetlnych.
Powtarzalność analizy obrazu zależy w dużej mierze od spójnych danych obrazowych. Aby uzyskać jak największe szanse na sukces, konieczna jest optymalizacja techniki iniekcji i pozyskiwania obrazu. Ustalenie i przećwiczenie techniki, w której interesujący nas barwnik (barwniki), miejsce wstrzyknięcia, wiek zarodka, objętość wstrzyknięcia i konfiguracja akwizycji są spójne, pozwoli wygenerować najbardziej wiarygodne dane do analizy obrazu.
Modyfikacje i rozwiązywanie problemów z metodą Protokół ten demonstruje metodę analizy masowego przepływu LD w zarodkach w fazie rozszczepienia przy użyciu prędkości obrazu cząstek. To samo podejście można zastosować do innych organelli, innych etapów rozwoju i innych metod analizy. Na przykład rycina 2 przedstawia analizę LD i organelli kwaśnych przepływających w syncytialnych etapach embriogenezy, uwidocznionych przez jednoczesne wstrzyknięcie BODIPY 493/503 i LysoTracker Red. Osiągnięto dalsze udane obrazowanie ruchu LD u zarodków do 7 godzin po zapłodnieniu; Zarodki te zachowują ranę po wstrzyknięciu, ale są w stanie rozwijać się przez kilka godzin.
Dane zebrane za pomocą tego protokołu zostały wykorzystane do pomiaru prędkości obrazu cząstek, ale dostępnych jest wiele innych technik analizy. Na przykład programy do śledzenia cząstek, takie jak te, które można znaleźć w ImageJ, Imris lub śledzenie ręczne, mogą być używane do uzyskiwania prędkości i kierunków poruszających się struktur. Należy pamiętać, że większość takich programów śledzących jest zbudowana do pracy z danymi z planarnych systemów hodowli komórek i nie zawsze dobrze dostosowuje się do struktur 3D, takich jak zarodek Drosophila . Ponadto, aby wygenerować najlepszej jakości dane śledzenia cząstek, konieczne byłoby zobrazowanie wielu płaszczyzn Z; Powinno to być wykonalne, jeśli czasy akwizycji stosu obrazów są mniejsze niż ~2 s. Ten punkt odniesienia powinien być osiągalny na konfokalnych płytach wirujących, kratownicowych arkuszach świetlnych i najnowszych systemach konfokalnych ze skanowaniem laserowym. Jednak możliwość śledzenia cząstek dla licznych organelli, takich jak LD, mitochondria i lizosomy, jest niska, ponieważ ilość pozytywnego sygnału w polu widzenia jest zbyt wysoka dla obecnych metod śledzenia. Możliwe może być śledzenie mniej obfitych struktur, takich jak jądra lub pęcherzyki żółtkowe. PIV do analizy przepływu działa dobrze w przypadku LD i organelli kwaśnych w fazach rozszczepienia, ponieważ oba organelle poruszają się swobodnie. Organelle, takie jak jądra komórkowe, ER i mitochondria, są przywiązane do innych struktur komórkowych, a zatem nie poruszają się swobodnie i nie nadają się do analizy oprogramowania, która zakłada swobodny ruch. Badacz powinien wybrać techniki najlepiej dopasowane do interesujących go organelli.
Podczas etapów blastodermy syncytialnej i komórkowej LD (a także niektóre inne organelle) poruszają się wzdłuż promieniście zorientowanych mikrotubul5. W związku z tym możliwe jest znalezienie widoków przekrojowych (jak na rysunku 5), w których pojedyncze mikrotubule są ostre na duże odległości, co umożliwia śledzenie cząstek w 2D. Ponieważ te płaszczyzny optyczne znajdują się głęboko w zarodku, ogólna siła sygnału jest zmniejszona, a stosunek sygnału do szumu jest zmniejszony.
W celu analizy śledzenia, obrazowanie tak szybkie, jak to możliwe, może ujawnić kluczowe szczegóły ruchu, a tym samym ruchliwej maszynerii. Na przykład ruch kropelek lipidowych jest mieszaniną dwóch stanów ruchliwych, zwolnionego-krótkiego ruchu (~200 nm/s; średnia odległość podróży ~100 nm) i ruchu szybkiego-długiego (~450 nm/s; średnia odległość podróży ~1,000 nm)19; Tak więc, jeśli zdjęcia są wykonywane co sekundę lub nawet rzadziej, stan wolny-krótki staje się niewykrywalny. Jednak częste obrazowanie powoduje również bielenie fluoroforem i fototoksyczność. W związku z tym warunki obrazowania muszą być dostosowane w zależności od konkretnego pytania, na które należy odpowiedzieć.
Ograniczenia metody W zależności od pożądanego barwnika, metoda może być ograniczona przez zgodność między rozpuszczalnością barwnika a toksycznością roztworu do wstrzykiwań. Alkohole takie jak izopropanol i etanol są trudne do przenoszenia w igle ze względu na ich niższą lepkość i wydają się uszkadzać składniki komórkowe i zabijać zarodek.
Metoda ta nie nadaje się również do wizualizacji najwcześniejszych etapów embriogenezy, ponieważ przygotowanie zarodków do wstrzyknięcia zajmuje 30+ minut. W temperaturze pokojowej początkowe cykle komórkowe zarodka trwają zaledwie ~10 minut każdy; Tak więc, nawet jeśli ktoś miałby wybrać nowo zapłodnioną komórkę jajową w kroku 5.2.3, pierwsze kilka cykli komórkowych byłoby już zakończonych, zanim zarodek byłby gotowy do obrazowania.
Oświetlenie światłem w zakresie UV/niebieskim jest znacznie bardziej fototoksyczne niż w przypadku dłuższych fal. W takich warunkach (np. w celu śledzenia autofluorescencyjnych pęcherzyków żółtka; Rysunek 6) należy ograniczyć czas obrazowania (co prowadzi do krótszych szeregów czasowych) lub użyć mniejszej mocy lasera (co skutkuje zmniejszonym stosunkiem sygnału do szumu).
Po celularyzacji barwniki wstrzyknięte w określone miejsce mają tendencję do słabej dyfuzji, ponieważ muszą przechodzić przez wiele błon komórkowych. Ogranicza to obszar obserwacji w późniejszych stadiach rozwojowych.
Znaczenie metody w odniesieniu do istniejących/alternatywnych metod Ruch LD i innych organelli zawierających lipidy we wczesnych zarodkach można uwidocznić za pomocą genetycznie kodowanych fluoroforów, technik bezznacznikowych oraz poprzez wprowadzenie FP. To ostatnie można osiągnąć poprzez przepuszczalność błony witeliny12 lub omówione tutaj podejście do mikroiniekcji.
Genetycznie kodowane fluorofory są wszechstronnymi markerami, których poziomy są zazwyczaj wysoce powtarzalne z zarodka na zarodek. Mają jednak niższą wydajność kwantową i łatwiej wybielają niż FP. Zazwyczaj są one dostępne tylko w jednej lub dwóch oznaczonych wersjach (np. GFP lub mCherry), co ogranicza wybór, które struktury mogą być obrazowane jednocześnie. Z drugiej strony FP często występują w dużej różnorodności; na przykład dostępne są różne barwniki specyficzne dla kropelek lipidów z widmami emisyjnymi od Autodot w widmie UV/niebieskim do Lipidtox i LipidSpot 610 w widmie dalekiej czerwieni. FP mogą być również bezpośrednio stosowane do dowolnego szczepu będącego przedmiotem zainteresowania, a zatem nie wymagają budowy szczepu, aby na przykład wprowadzić pożądany marker organelli do zmutowanego szczepu będącego przedmiotem zainteresowania. Ta zaleta jest szczególnie wyraźna, gdy wiele struktur ma być etykietowanych jednocześnie; Zamiast czasochłonnych krzyżówek obejmujących wiele pokoleń, można to osiągnąć w ciągu jednego dnia, mieszając odpowiednie barwniki i wprowadzając je w tym samym czasie. Wreszcie, jeśli procesy komórkowe mają być badane za pomocą hamowania farmakologicznego, leki i barwniki mogą być wprowadzane razem.
Metody bezznacznikowe są bardzo skutecznymi metodami wykrywania określonych struktur komórkowych. Na przykład, LD mogą być specyficznie wykryte we wczesnych zarodkach za pomocą mikroskopii trzeciej generacji20 lub mikroskopii im. Femtosekundowej Stymulowanej Utraty Ramanowskiej21. Podobnie jak FP, podejścia te mogą być stosowane w dowolnym tle genetycznym, a ponieważ nie powodują wybielania, potencjalnie pozwalają na szybsze pozyskiwanie obrazu. Jednak są one zazwyczaj ograniczone do określonych organelli, a zatem same w sobie nie obsługują obrazowania multipleksowego; Wymagają również specjalistycznych mikroskopów.
Istnieją dwie ogólne strategie wprowadzania małych cząsteczek do zarodków. Jednym z nich jest zastosowane tutaj podejście oparte na mikroiniekcjach; Drugi to obróbka chemiczna (terpenowa) w celu przepuszczalności błony witelinowej. To ostatnie podejście12 jest mniej skomplikowane niż mikroiniekcja, ale również bardziej zmienne w zależności od zarodka. Ponadto po przepuszczalności ochrona zapewniana przez błonę witeliny jest zagrożona, a właściwy zarodek jest dostępny dla podłoża zewnętrznego, co utrudnia utrzymanie go przy życiu. Mikroiniekcja jest znacznie mniej podatna na wykolejenie rozwoju embrionalnego niż przepuszczalność. Przepuszczalność jest jednak zalecana, jeśli wiele zarodków musi być monitorowanych jednocześnie, np. w celu przeprowadzenia badań przesiewowych leków. Aby śledzić ruch struktur komórkowych i uzyskać powtarzalne serie obrazów nadające się do analizy obrazu, metodą z wyboru jest mikroiniekcja.
Znaczenie i potencjalne zastosowania metody w poszczególnych obszarach badawczych Zarodek Drosophila jest ważnym systemem modelowym do badania wielu procesów komórkowych, biologicznych i rozwojowych 1,5,6. Znakowanie organelli białkami fluorescencyjnymi w znacznym stopniu przyczyniło się do zrozumienia, w jaki sposób rozwija się wczesny zarodek, jak przemieszczają się różne organelle i jak taki transport jest modulowany rozwojowo i genetycznie. Jednak ich skłonność do wybielania i wyzwania związane z generowaniem szczepów, w których wiele organelli jest oznaczonych różnymi kolorami, ograniczają zastosowanie tego podejścia. Zastosowanie FP wprowadzonych przez mikroiniekcję rozwiązuje wiele z tych wyzwań i może być nawet łączone z białkami znakowanymi fluorescencyjnie. Technika ta pozwala na obrazowanie wielu organelli, struktur komórkowych i składników cytoszkieletu w dowolnym tle genetycznym. W rezultacie za pomocą obrazowania na żywo można porównać kilka genotypów, co umożliwia określenie wpływu mutacji na transport wielu organelli.
Protokół ten demonstruje podejście polegające na wstrzykiwaniu FP w przypadku zarodków Drosophila melanogaster, ale zasadniczo podejście to ma zastosowanie do wszystkich jaj owadów, dla których ustalono techniki mikroiniekcji, w tym innych gatunków Drosophila, świerszczy22 i mszyc23.

Niezbędne barwniki i sondy molekularne są potężnymi narzędziami do obrazowania na żywo określonych struktur komórkowych i organelli. W zarodku Drosophila wiele różnych organelli wykazuje lokalizację sterowaną przez cytoszkielet1,2,3,4, ale zastosowanie tych małych cząsteczek jest trudne, ponieważ skorupka jaja jest nieprzepuszczalna dla wielu z nich. Protokół ten opisuje metodę stosowania sond fluorescencyjnych (FP) w żywych zarodkach za pomocą mikroiniekcji w celu wykrycia transportu organelli na dużą skalę. Procedura obejmuje przygotowanie roztworu do wstrzykiwań, pobranie komórek jajowych i przygotowanie zarodków, mikroiniekcję, obrazowanie i analizę obrazu.
Dramatyczne przestrzenne przegrupowania organelli są powszechne w wielu zwierzęcych oocytach, jajach i zarodkach, częściowo z powodu dużych rozmiarów tych komórek. Na przykład w zarodku Drosophila kropelki lipidów (LD) i pęcherzyki żółtkowe przemieszczają się w kierunku środka zarodka tuż przed komórkowaniem5. Ruch ten zależy od mikrotubul i pozostawia obszar ~40 μm na całym obwodzie zarodka pozbawiony dwóch organelli. Podczas wcześniejszych etapów rozszczepienia wiele organelli jest transportowanych przez przepływy cytoplazmatyczne, które są napędzane przez skurcze oparte na aktynie i miozynie na powierzchni zarodka6. Chociaż zarodki wielu gatunków wykazują podobne przegrupowania, zarodek Drosophila jest szczególnie odpowiedni do śledzenia tych procesów za pomocą obrazowania, ponieważ rozwija się zewnętrznie w standardowej laboratoryjnej "temperaturze pokojowej", jest stosunkowo przezroczysty, wystarczająco mały, aby zmieścić się w większości zestawów mikroskopowych i może być manipulowany za pomocą potężnych narzędzi genetycznych.
Dla niektórych organelli dostępne są fluorescencyjnie znakowane białka, które specjalnie opisują te struktury. Na przykład LSD-2 (znany również jako dPLIN2) jest białkiem, które w zarodkach jest specyficznie ukierunkowane na LDs7. Dostępne są linie muchowe, które przenoszą albo indukowane transgeny kodujące fuzję między białkiem zielonej fluorescencji (GFP) a LSD-28, albo pułapkę genową, w której żółte białko fluorescencyjne (YFP) jest wprowadzane do regionu kodującego endogennego genu LSD-29,10. Podejście to ma jednak ograniczenia, w tym to, że te białka fuzyjne mają niską wydajność kwantową i mają tendencję do łatwego wybielania. Ponadto jednoczesne znakowanie wielu różnych struktur może być trudne: w przypadku wielu organelli obecnie dostępny jest tylko jeden rodzaj znacznika fluorescencyjnego (często GFP lub mCherry), więc obrazowanie dwóch organelli w tym samym czasie może wymagać nowych transgenów lub insercji; Ponadto, nawet jeśli dostępne są kompatybilne znaczniki, wprowadzenie ich do jednego szczepu może wymagać czasochłonnych krzyżówek. Sprawia to również, że korzystanie z wielu potężnych zasobów genetycznych jest mniej wygodne, np. jeśli dwa markery organelli, czynnik napędzający Gal4 i indukowalny konstrukt RNAi muszą być obecne u tej samej matki.
Zasadniczo, te ograniczenia można przezwyciężyć za pomocą FPs, w tym niezbędnych barwników (np. LysoTracker do oznaczania lizosomów), sond molekularnych (np. SiR-tubulina do oznaczania mikrotubul) i fluorescencyjnie znakowanych cząsteczek biologicznych (np. C12 BODIPY do badania metabolizmu kwasów tłuszczowych11). Ze względu na zastosowanie w hodowanych komórkach, są one zazwyczaj dobrze zweryfikowane jako potężne narzędzia do badania biologii komórkowej. FP są wszechstronne, mają doskonałe właściwości fotograficzne i są kompatybilne z białkami fluorescencyjnymi. Wiele barwników można mieszać i nakładać jednocześnie, często z korzyścią płynącą z separacji na fioletowo-niebieskie i dalekie czerwone obszary widma oraz małych przesunięć Stokesa, zapobiegając przedostawaniu się kanału. Małe przesunięcia Stokesa pozwalają na jednoczesne uchwycenie wielu kanałów obrazowania, umożliwiając śledzenie kilku organelli jednocześnie. Wreszcie, można je również stosować do znakowania organelli w zarodkach innych gatunków Drosophila, a nawet innych owadów, w których nie są dostępne białka znakowane fluorescencyjnie.
Jednak większość z tych FP nie może przejść przez skomplikowaną skorupę jajową zarodka Drosophila. Składa się z pięciu warstw: trzech zewnętrznych warstw kosmówkowych (kosmówki), które zapobiegają uszkodzeniom mechanicznym, oraz woskowej warstwy otaczającej błonę witelinową, która tworzy barierę chemiczną12. Dla uproszczenia połączenie warstwy woskowej i membrany witelinowej będzie poniżej określane jako "membrana witelinowa". Aby ominąć skorupkę jaja, protokół ten dostosowuje sprawdzone podejście do mikroiniekcji zarodka w celu wprowadzenia FP do zarodka Drosophila. Protokół opisuje, w jaki sposób monitorować przepływ cytoplazmatyczny LD w zarodkach w fazie rozszczepienia. Obejmuje przygotowanie igieł iniekcyjnych i klatek do pobierania komórek jajowych, proces pobierania komórek jajowych oraz mechaniczne usuwanie kosmówki. Omówiono w nim, jak mikrowstrzykiwać i obrazować zarodki oraz jak analizować masowy przepływ LD za pomocą prędkości obrazowania cząstek (PIV, zaadaptowane z6). Zawiera porady dotyczące rozwiązywania problemów, aby zapewnić przeżycie zarodka i stworzyć najlepszy system do obrazowania. Omówiono również, w jaki sposób protokół może być modyfikowany w celu jednoczesnego obrazowania LD i mikrotubul lub zastosowania go do badania innych organelli, w tym lizosomów, mitochondriów, pęcherzyków żółtkowych i retikulum endoplazmatycznego (ER).

<table><tbody><tr><td>AUTODO</td><td>abcepta</td><td>SM1000a</td><td>Plami kropelki lipidów na fioletowo-niebiesko</td></tr><tr><td>BODIPY 493/503</td><td>ThermoFisher</td><td>D3922</td><td>Plami kropelki lipidów na zielono</td></tr><tr><td>Kulki osuszające &ndash; Środek osuszający bezwodny wskazujący Drierite</td><td>WA Hammond Drierite Company</td><td>21001</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop preparacyjny SteREO DiscoveryV20 z podstawą transilluminacyjną</td><td>Zeiss</td><td>4350030000000000</td><td></td></tr><tr><td>Taśma dwustronna-Trwała taśma dwustronna</td><td>Scotch (3M)</td><td>-</td><td>Sprzedawana przez wielu dostawców</td></tr><tr><td>ER-Tracker Green (BODIPY FL Glibenclamide)</td><td>ThermoFisher</td><td>E34251</td><td>Plami ER/ koperta jądrowa</td></tr><tr><td>Femptotip II</td><td>Eppendorf</td><td>H129354N</td><td>Gotowy do użycia</td></tr><tr><td>Kapilary szklane -Szkło cienkie z 1,0 mm 4 cale</td><td>World Precision Instruments</td><td>TW100F-4</td><td>Należy pociągnąć</td></tr><tr><td>Szkiełko nakrywkowe</td> <td>-</td><td></td> <td>Kup odpowiedni współczynnik załamania światła dla swojej soczewki</td></tr><tr><td>obiektywu Szkiełka szklane -Podwójnie matowe szkiełka mikroskopowe wstępnie oczyszczone</td><td>FisherBrand</td><td>12-550-343</td><td></td></tr><tr><td>Olej halowęglowy 27</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H8773-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Olej halowęglowy 700</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H8898-50ML</td><td></td></tr><tr><td>Heptan bardziej ekologiczna alternatywa bezwodny, 99%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>246654-1L</td><td>Heptan jest uważany za toksyczny przez amerykański</td></tr><tr><td>mikroskop konfokalny</td> OSHA <td>Leica</td><td>Sp5</td><td>Wiele różnych rodzajów konfokalnych Mikroskopy będą działać.</td></tr><tr><td>LipidSpot 610</td><td>Biotium</td><td>#70069</td><td>Plami kropelki lipidów na daleką czerwień</td></tr><tr><td>LysoTracker Red</td><td>ThermoFisher</td><td>L7528</td><td>Barwi lizosomy na czerwono</td></tr><tr><td>MitoView 633</td><td>Biotium</td><td>#70055</td><td>Plami mitochondria</td></tr><tr><td>Końcówki do pipet z igłą - końcówki do mikroładowarek 20uL</td><td>Eppendorf</td><td># 5242956.003</td><td></td></tr><tr><td>P-1000, ściągacz</td> <td>do mikropipet nowej generacjiSutter Instruments</td><td>P-1000</td><td>Używane ustawienia to ciepło-470, ciąg-70, prędkość-60, opóźnienie-90, ciśnienie-200, rampa-479 przy 1x1. Odnoszą się one do intensywności i długości nagrzewania, czasu siły ciągnącej oraz tego, czy siła jest przykładana liniowo. W tych warunkach jedna kapilara generuje dwie użyteczne igły z drobnymi otworami na końcu.</td></tr><tr><td>SiR-tubulina</td><td>Cytosketon Inc</td><td>CY-SC014</td><td>Wykonane przez Spirochrome; Cytoskeleton Inc. jest dystrybutorem w Ameryce Północnej. Barwi mikrotubule na dalekiej czerwieni</td></tr><tr><td>TransferMan</td><td>Eppendorf</td><td>&nbsp; 5178 NK</td><td></td></tr><tr><td>ViaFluor 405</td><td>Biotium</td><td>#70064</td><td>Mikrotubule barwią się na fioletowo/niebiesko</td></tr></tbody></table>

wizualizacja zależnego od cytoszkieletu transportu organelli zawierających lipidy w zarodkach drosophila

Visualizing Cytoskeleton-Dependent Trafficking of Lipid-Containing Organelles in Drosophila Embryos

Wczesne zarodki Drosophila to duże komórki zawierające szeroki wachlarz konwencjonalnych i specyficznych dla zarodków organelli. W ciągu pierwszych trzech godzin embriogenezy organelle te przechodzą dramatyczne ruchy napędzane przez cytoplazmatyczne strumienie oparte na aktynie i napędzany motorycznie transport wzdłuż mikrotubul. Opracowanie wielu małych, specyficznych dla organelli sond fluorescencyjnych (FP) umożliwia wizualizację szerokiej gamy różnych struktur zawierających lipidy w dowolnym genotypie, umożliwiając obrazowanie na żywo bez konieczności stosowania genetycznie kodowanego fluoroforu. Protokół ten pokazuje, jak wstrzykiwać niezbędne barwniki i sondy molekularne do zarodków Drosophila w celu monitorowania transportu określonych organelli za pomocą obrazowania na żywo. Podejście to demonstruje się poprzez znakowanie kropelek lipidów (LD) i śledzenie ich ruchu masowego za pomocą prędkości obrazu cząstek (PIV). Protokół ten zapewnia strategię podatną na badanie innych organelli, w tym lizosomów, mitochondriów, pęcherzyków żółtkowych i ER, a także do śledzenia ruchu poszczególnych LD wzdłuż mikrotubul. Stosowanie dostępnych na rynku barwników przynosi korzyści płynące z separacji na fioletowo-niebieskie i dalece czerwone obszary spektrum. Dzięki wielokrotnemu znakowaniu organelli i/lub elementów cytoszkieletu za pomocą mikroiniekcji, wszystkie zasoby genetyczne Drosophila są dostępne do badań nad transportem bez konieczności wprowadzania białek znakowanych fluorescencyjnie. W przeciwieństwie do genetycznie kodowanych fluoroforów, które mają niską wydajność kwantową i łatwo wybielają, wiele dostępnych barwników pozwala na szybkie i jednoczesne wychwytywanie kilku kanałów o wysokiej wydajności fotonów.

Po wstrzyknięciu barwnik będzie zlokalizowany wyłącznie w miejscu wprowadzenia końcówki igły. Następnie barwnik będzie dyfundował z miejsca wstrzyknięcia, zależnie od jego właściwości dyfuzyjnych. Rycina 1 przedstawia wstrzyknięcie BODIPY 493/503 krótko po podaniu (panel A) oraz 24 min później (panel B). Po 24 min barwnik dotarł mniej więcej do połowy osi długiej zarodka.
Analizę ruchliwości organelli można przeprowadzić za pomocą iniekcji barwników i obrazowania poklatkowego. W Rycina 2do zarodka wstrzyknięto jednocześnie BODIPY 493/503 (Rysunek 2A) oraz LysoTracker Red (Rycina 2B) i obrazowano przy użyciu wzbudzenia laserowego odpowiednio przy 488 i 596 nm. Następnie wykonano obrazowanie time-lapse tego embrionu (jedna klatka co 30 s przez 30 min, analizowano 5 min). Seria czasowa została następnie poddana analizie PIV, której wynik przedstawiono poprzez linie prądu w Rysunek 2A,BNależy zauważyć, że linie prądu nie reprezentują trajektorii poszczególnych cząstek; przepływ cytoplazmatyczny jest wnioskowany na podstawie analizy wszystkich cząstek w danym obszarze cytoplazmy. Dzięki znakowaniu dwóch niezależnych struktur komórkowych (kropel lipidowych i organelli kwaśnych), analiza PIV wykazuje podobne przepływy, przy czym oba znaczniki zbiegają się w centralnym regionie zarodka, gdzie cytoplazma przepływa do wnętrza zarodka.6.
Obecnie dostępne białka fluorescencyjne (FP) umożliwiają znakowanie wielu innych organelli oraz struktur komórkowych. Rycina 3 przedstawia znakowanie retikulum endoplazmatycznego poprzez ER tracker Green. ER tracker zapewnia dobrą rozdzielczość obrazowania otoczki jądrowej, co umożliwia wizualizację głównych etapów cyklu komórkowego. Obrazowanie ER tracker Green odbywa się przy użyciu wzbudzenia o długości fali 488 nm.
Znakowanie mitochondriów jest trudne, ponieważ większość przetestowanych barwników zdaje się zatrzymywać w pierwszym mitochondrium, do którego wnikną. Z drugiej strony nie wykryto oznak toksyczności barwnika, co umożliwiło śledzenie znakowanych mitochondriów podczas celularyzacji oraz 15. cyklu jądrowego ektodermy. Rysunek 4 przedstawia komórkę ektodermy kilka godzin po wstrzyknięciu Mitoview 633 (długość fali wzbudzenia 633 nm).
Barwniki BODIPY, Lysotracker oraz LipidSpot są stabilne i mogą być wykorzystywane do pozyskania ponad 500 obrazów w rozdzielczości 512 x 512, przy średniej liczbie linii 3 i szybkościach klatek od 1/s do 0,1/s. Marker ER tracker Green, SiR-tubulin oraz wspomniane barwniki mitochondrialne są mniej stabilne i pozwalają na uzyskanie ok. 50–200 obrazów w tych samych warunkach.
Zaczynając od stadiów blastodermy, krople lipidowe (LDs) poruszają się dwukierunkowo wzdłuż mikrotubul, napędzane przez motory o przeciwnej polaryzacji: kinezynę-1 oraz dyneinę cytoplazmatyczną5. Ruch ten można zwizualizować poprzez wspólne znakowanie LDs i mikrotubul poprzez wstrzyknięcie zarówno BODIPY 493/503, jak i SiR-Tubulin (Rysunek 5). Ponieważ LDs często zmieniają kierunek ruchu (przełączając się między kinezyną-1 a dyneiną cytoplazmatyczną), wyższa częstotliwość klatek podczas akwizycji pozwala lepiej uchwycić krytyczne szczegóły motylości LDs.
Obrazowanie na żywo autofluorescencyjnych pęcherzyków żółtka jest możliwe bez konieczności wstrzykiwania barwników (Rycina 6). Jednakże autofluorescencja jest słaba, a laser wzbudzający wykazuje działanie fototoksyczne. W związku z tym obrazowanie na żywo autofluorescencyjnego żółtka charakteryzuje się niskim stosunkiem sygnału do szumu w porównaniu do metody z wstrzykiwaniem barwnika.
<img alt="Obrazy z mikroskopii fluorescencyjnej struktur komórkowych pokazujące rozkład przestrzenny i zmienność gęstości." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63291/63291fig01.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1: Dyfuzja BODIPY 493/503 przez embrion. Barwnik wstrzyknięto wzdłuż krawędzi bocznej w kierunku końca przedniego (prawy górny róg); dyfunduje on z miejsca wstrzyknięcia do wnętrza embrionu, znakując LDs. (A) Barwnik przedyfundował przez fragmenty embrionu sąsiadujące z miejscem wstrzyknięcia. (B) Około 24 min/2 cykle jądrowe później barwnik przedyfundował poza punkt środkowy embrionu. Pasek skali: 100 µm. Klatkę o wymiarach 1024 x 1024 (średnia liniowa 4) pozyskiwano co 30 s. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63291/63291fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Obraz mikroskopowy i schemat analizy struktury komórkowej, badania wzorca fluorescencji, mapowania komórkowego." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63291/63291fig02.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2: Cyfrowa welocymetria obrazowa cząstek (PIV) dla LD i organelli kwaśnych. Zarodek został wstrzyknięty zarówno BODIPY 493/503, jak i LysoTracker Red. (A) Kanał BODIPY. (B) Kanał LysoTracker Red. (A',B') Schematy linii prądu wygenerowane przez analizę PIV dwóch kanałów na podstawie 10 następujących po sobie klatek, w tym tych pokazanych w A i B. A' odpowiada przepływowi LD, a B' odpowiada przepływowi organelli kwaśnych. Należy zauważyć, że zarówno A' , jak i B' wykazują zbieżność po lewej stronie środka, gdzie zawartość zarodka wypływa poza płaszczyznę widzenia, w stronę centrum zarodka. Należy również zauważyć, że BODIPY dyfundował bardziej niż LysoTracker, ponieważ różne barwniki mają różne właściwości dyfuzyjne. Pasek skali: 100 µm. Klatka 1024 x 1024 (średnia liniowa 4) była pozyskiwana co 30 s. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63291/63291fig02large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Obrazy z mikroskopii komórkowej; analiza struktury i rozmieszczenia komórek za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63291/63291fig03.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3: ER tracker znakuje podziały jąder syncytialnych. Zarodek w stadium blastodermy syncytialnej został mikroiniekcyjnie wprowadzony z ER tracker, a fragment jego powierzchni obrazowano w czasie. (A) Formowanie wrzeciona podczas podziału jądra. (B) Odszczepienie otoczki jądrowej podczas tego samego podziału. (C) Następująca po nim interfaza. (D) Początek kolejnego podziału jest sygnalizowany przez pojawienie się centrosomów (wystąpienie okrągłych obszarów wolnych od ER, zaznaczonych grotami strzałek). Zauważalny jest stopniowy blaknięcie barwnika. Długość fali wzbudzenia: 488 nm. Pasek skali: 5 µm. A: klatka początkowa, B: upłynęły 3 min, C: upłynęło 10 min, D: upłynęło 13 min. Klatkę o rozmiarze 1024 x 1024 (uśrednianie linii 4) pozyskiwano co 30 s. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63291/63291fig03large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Struktura komórkowa na obrazie TEM; mikroskopia elektronowa do analizy komórek." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63291/63291fig04.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rycina 4"> 
Rycina 4: Oznakowanie mitochondriów za pomocą Mitoview 633. Zarodek został wstrzyknięty Mitoview 633 podczas stadium blastodermy syncytialnej i obrazowany 4 h później, po celularyzacji. Obraz przedstawia komórkę neuroektodermalną zarodka w fazie wydłużania pasma zarodkowego. Pasek skali: 5 µm. Klatkę o rozmiarze 1024 x 1024 (średnia z 4 linii) pozyskiwano co 30 s. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63291/63291fig04large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Obrazy z mikroskopii fluorescencyjnej; struktury komórkowe z lokalizacją białek; porównanie między próbkami." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63291/63291fig05.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rycina 5"> 
Rycina 5: Współoznaczenie LD i mikrotubul. Zarodek w fazie komórkowania został wstrzyknięty mieszaniną BODIPY 493/503 (żółty A,B,C) i SiR Tubulin (magenta A',B',C'). A'', B'', C'' przedstawiają nałożone kanały. Panele A, A' i A'' pokazują klatkę początkową, panele B, B' i B'' pokazują klatkę po 5 s, a panele C, C' i C'' pokazują klatkę po 10 s. Pasek skali: 5 µm. Klatkę o rozmiarze 512 x 512 (średnia z 3 linii) pozyskiwano co 2,5 s. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63291/63291fig05large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Mikroskopia fluorescencyjna, lokalizacja białek, struktura komórki; trzy panele A-C, zaznaczono paski skali." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63291/63291fig06.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rysunek 6"> 
Rysunek 6: Obrazowanie autofluorescencji pęcherzyka żółtkowego podczas etapów podziałów syncytialnych. (A) Na początku akwizycji. (B) Po 8 min. (C) Po 16 min. Długość fali wzbudzenia: 405 nm. Zastosowano niską intensywność wzbudzenia, aby utrzymać zarodek przy życiu. Pasek skali: 100 µm. Klatkę 1024 x 1024 (średnia linii 4) pozyskiwano co 30 s. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63291/63291fig06large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.</a>
Dane uzupełniające. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63291/PIV_analysis_script_Kilwein_Welte_JoVE_2021.zip" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.</a>

We wczesnym zarodku Drosophila wiele organelli jest ruchliwych. Zasadniczo można je obrazować na żywo za pomocą specjalnych sond fluorescencyjnych, ale skorupka jaja uniemożliwia bezpośrednie zastosowanie do zarodka. Protokół ten opisuje, w jaki sposób wprowadzić takie sondy za pomocą mikroiniekcji, a następnie analizować ruch organelli masowych za pomocą prędkości obrazu cząstek.

Wizualizacja zależnego od cytoszkieletu transportu organelli zawierających lipidy w zarodkach Drosophila

Early Drosophila embryos are large cells containing a vast array of conventional and embryo-specific organelles. During the first three hours of ...

We wczesnym zarodku Drosophila wiele organelli ulega ruchowi na dużą skalę. Nasz protokół opisuje, jak monitorować ten ruch za pomocą barwników fluorescencyjnych opracowanych do hodowli komórkowych. W porównaniu z białkami fluorescencyjnymi, dostępne na rynku sondy fluorescencyjne są jaśniejsze i obejmują szerszy zakres spektrum.Pozwalają one na wielokrotne znakowanie i mogą być stosowane w dowolnym tle genetycznym. Potrzeba praktyki oraz prób i błędów, aby wiedzieć, jak długo należy suszyć zarodki, tak aby albo pękły podczas wstrzyknięcia, albo wyschły i przestały się rozwijać. Aby rozpocząć, należy rozpocząć przygotowywanie igieł iniekcyjnych, umieszczając kapilar w uchwycie kapilarnym na ściągaczu igieł i zabezpieczając je za pomocą nakrętek motylkowych.Wyrównaj środek kapilary z elementem grzejnym. Zgodnie z instrukcjami producenta wybierz odpowiednie ustawienia na ściągaczu igłowym. Za pomocą mikroskopu preparacyjnego wykonaj test kontroli jakości.Wciśnij igły w kit poziomo z końcówkami igieł zawieszonymi w powietrzu. Przykryj igły pokrywką i przechowuj do czasu użycia. Używając końcówek do ładowania igłą dołączonych do mikropipety, pobrać jeden mikrolitr roztworu iniekcyjnego do końcówki, nie zatrzymując pęcherzyków powietrza.Używając rękawiczek, trzymaj igłę w jednej ręce z końcówką skierowaną na zewnątrz i włóż do niej końcówkę ładującą. Dozuj płyn w pobliżu końcówki igły, wyjmij pipetę i trzymaj igłę pionowo, aż płyn spłynie do końcówki. Przykryj pojemnik folią aluminiową, nie uszkadzając końcówek igieł, aby zapobiec wybielaniu barwników.Za pomocą pipety transferowej lub mikropipetera umieść małą kroplę kleju heptanowego na środku prostokątnego szkiełka nakrywkowego i pozwól mu odparować. W celu mechanicznego usunięcia kosmówki należy przykryć odpowiednio starą płytkę zarodkową cienką warstwą oleju halowęglowego 27, aby skorupka jaja stała się przezroczysta. Obejrzyj płytkę pod mikroskopem preparacyjnym z oświetleniem trans, aby potwierdzić stadium zarodka i wybrać zarodki w fazie rozszczepienia.Za pomocą cienkiej pęsety podnieś zarodek w pożądanym stadium, chwytając za przydatki grzbietowe i przenieś go na przygotowane szkiełko pokryte taśmą dwustronną. Umieść zarodek na taśmie i zminimalizuj przenoszenie oleju. Delikatnie przetocz zarodek po powierzchni taśmy, szturchając go bokiem końcówki pęsety, nie szturchając go bezpośrednio.Kontynuuj zwijanie zarodka, aż kosmówka przylgnie do taśmy i pęknie. Po pęknięciu kosmówki kontynuuj zwijanie zarodka, aby oddzielić go od kosmówki, która pozostaje przyklejona do taśmy. Zwiń zarodek z powrotem na kosmówkę, która jest mniej przyczepna niż taśma.Delikatnie pocieraj zarodek pęsetą, aż przyczepi się do pęsety w celu transferu. Następnie przenieś zarodek na szkiełko nakrywkowe i doprowadź go do kontaktu z klejem, aby utrzymać zarodek na miejscu, oddzielając go od pęsety. Dostosować ułożenie zarodka na szkiełku nakrywkowym.Pozwól zarodkom wysuszyć się przez pięć do 12 minut, umieszczając szkiełko nakrywkowe z zarodkami w komorze suszenia i uszczelniając je. Zdejmij szkiełko nakrywkowe z komory i wlej kroplę oleju halocarbon 700, przykrywając zarodki, aby zapobiec dalszemu wysuszeniu. Zbadaj je pod lunetą preparacyjną i przystąp do mikroiniekcji, jeśli zarodki zostały prawidłowo wysuszone.Umieść obiektyw 4X na ścieżce światła i za pomocą pokrętła ostrości na mikroskopie ustaw ostrość zarodków. Przesuń zarodki poziomo do środka pola widzenia za pomocą elementów sterujących stolika. Trzymaj zarodki na krawędzi pola widzenia i przesuwaj się, przygotowując się do opuszczenia igły.Pozostając w tej samej płaszczyźnie ogniskowej, opuść końcówkę igły i upewnij się, że jest widoczna w polu view wraz z zarodkami. Sprawdzić, czy igła działa, dozując część roztworu do wstrzykiwań do oleju halowęglowego 700. Jeśli się powiedzie, w oleju w pobliżu końcówki igły pojawi się pęcherzyk roztworu.Za pomocą elementów sterujących stopniem przesuń zarodek w kierunku końcówki igły, aż końcówka delikatnie nakłuje zarodek i wejdzie do niego. Jednocześnie należy rozpocząć przepływ roztworu do wstrzykiwań, aż w miejscu końcówki igły pojawi się przejściowa, wyraźna plamka, wskazująca na pomyślne wprowadzenie roztworu do zarodka. Zamocuj szkiełko nakrywkowe na mikroskopie konfokalnym za pomocą uchwytu na szkiełko.Zachowaj ostrożność, ponieważ szkiełko nakrywkowe jest delikatne. Przed kontynuowaniem należy sprawdzić zarodki za pomocą funkcji epifluorescencji w mikroskopie konfokalnym z obiektywem 40X i upewnić się, że fluoro 4 w zarodku jest widoczny. W przypadku obrazowania na żywo na etapie syncytialnym ustaw rozmiar obrazu 512 na 512 pikseli, średnią liniową trzy i liczbę klatek na sekundę 0,1 klatki na sekundę.Po wstrzyknięciu barwnika BODIPY 493 503 został on zlokalizowany w miejscu wkłucia końcówki igły, a następnie rozprowadzony w pobliżu miejsca wstrzyknięcia. Po 24 minutach barwnik dyfunduje poza środek zarodka. Ruchliwość organelli monitorowano poprzez wstrzyknięcie do zarodka preparatu BODIPY 493 503 i LysoTracker Red.Analiza prędkości obrazu cząstek wykazała, że zawartość zarodka zbiegła się w centralnym obszarze zarodka, gdzie cytoplazma wpływa do wnętrza zarodka. Znakowanie ER, za pomocą ER-Tracker Green, zapewnia żywą rozdzielczość otoczki jądrowej, umożliwiając wizualizację głównych etapów cyklu komórkowego. Zarodkowi wstrzyknięto MitoView 633 w stadium blastodermy i zobrazowano go cztery godziny później.Obraz przedstawia komórkę neuroektodermalną zarodka w przedłużeniu prążka zarodkowego. Do komórkowego zarodka wstrzyknięto mieszaninę BODIPY 493 503 i tubuliny SiR, co pokazuje, że kropelki lipidów poruszają się dwukierunkowo wzdłuż mikrotubul. Zarodek musi być częściowo wysuszony, aby można było wstrzyknąć płyn.Zbyt małe wysuszenie spowoduje, że zarodek będzie przeciekał po wstrzyknięciu, zbyt duże wysuszenie zabije zarodek. Filmy przedstawiające poruszające się organelle można scharakteryzować za pomocą różnych technik analizy obrazu. Śledzenie cząstek ujawnia zachowanie poszczególnych organelli, prędkość obrazowania cząstek ujawnia przepływ masowy.

visualizing-cytoskeleton-dependent-trafficking-lipid-containing

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

Drosophila hemocyty rozprzestrzeniają się po całym rozwijającym się embrionie. Niniejszy protokół demonstruje sposób montowania i obrazowania tych migracji z wykorzystaniem embrionów z hemocytami znakowanymi fluorescencyjnie.

Obrazowanie na żywo migracji hemocytów embrionalnych Drosophila melanogaster

Opisujemy metodę rozdzielania organelli według gęstości w żywych embrionach Drosophila. Embriony są zatapiane w agarze i poddawane wirowaniu. Technika ta pozwala na powtarzalne rozdzielenie głównych organelli wzdłuż osi przednio-tylnej embrionu. Metoda ta ułatwia przeprowadzanie eksperymentów kolokalizacyjnych i pozwala na uzyskanie frakcji organelli do analizy biochemicznej oraz eksperymentów z transplantacją.

In-vivo wirowanie zarodków Drosophila

Niniejszy protokół opisuje sekcję larw Drosophila in vivo w celu obrazowania ruchu pęcherzyków aksonalnych znakowanych białkiem GFP wzdłuż szyn mikrotubularnych.

In vivo wizualizacja pęcherzyków synaptycznych w aksonach segmentowych larw Drosophila

Kinetochor jest miejscem, w którym SAC inicjuje swój sygnał monitorujący segregację mitotyczną siostrzanych chromatyd. Opisano metodę wizualizacji rekrutacji i wymiany jednego z białek kinetochoru oraz jej koordynacji z ruchem chromosomów w embrionach Drosophila przy użyciu laserowego skanującego systemu konfokalnego Leica.

Badanie punktu kontrolnego mitozy poprzez obrazowanie dynamicznego zachowania białek kinetochorowych i ruchu chromosomów w żywych zarodkach syncytialnych Drosophila

Źródło: Wagner, K.  i inni., Badanie transportu białek błonowych w komórkach fotoreceptorowych Drosophila przy użyciu białek znakowanych eGFP. J. Vis. Exp. (2022). Ten film przedstawia wizualizację transportu białek błonowych w komórkach fotoreceptorów Drosophila przy użyciu białek TRPL znakowanych eGFP. Szczegółowo opisano w nim przygotowanie transgenicznych muszek do obrazowania, przechwytywanie obrazów fluorescencyjnych komórek fotoreceptorowych oraz ilościowe określenie transportu TRPL...

Badanie transportu białek błonowych w komórkach fotoreceptorowych Drosophila

Komórki S2 Drosophila i hodowane neurony są świetnymi systemami do obrazowania transportu organelli napędzanych motorycznie in vivo. Tutaj opisujemy szczegółowe protokoły hodowli obu typów komórek, ich obrazowania i analizy transportu.

Transport organelli w hodowanych komórkach Drosophila: linia komórkowa S2 i neurony pierwotne.

Opisujemy metody obrazowania, których używamy do badania dystrybucji i ruchliwości transfekowanych białek fluorescencyjnych rezydujących w retikulum endoplazmatycznym (ER) za pomocą konfokalnego obrazowania żywych komórek. Analizujemy również ultrastrukturalnie wpływ ich ekspresji na architekturę tego przedziału subkomórkowego.

Wizualizacja subdomen retikulum endoplazmatycznego w hodowanych komórkach

Tutaj ilustrujemy, jak można przeprowadzić mikroskopię lokalizacyjną aktywowaną fotocząsteczką pojedynczej cząsteczki na zakończeniu nerwu ruchowego żywej larwy Drosophila melanogaster w trzecim stadium rozwojowym.

In vivo (in vivo) Śledzenie pojedynczych cząsteczek na presynaptycznym zakończeniu nerwu ruchowego Drosophila

Tutaj opisano nieinwazyjne metody lokalizacji białek błony fotoreceptorowej i oceny zwyrodnienia siatkówki w oku złożonym Drosophila za pomocą fluorescencji eGFP.

Badanie transportu białek błonowych w komórkach fotoreceptorowych Drosophila przy użyciu białek znakowanych eGFP

Błona podstawna jest niezbędna do morfogenezy tkanek i narządów podczas rozwoju. Aby lepiej zrozumieć mechanizmy prowadzące do prawidłowego umiejscowienia tej struktury, w przedstawionym protokole opisano metody wizualizacji i charakterystyki wewnątrzkomórkowego transportu i wydzielania białek błony podstawnej w komórkach nabłonka za pomocą mikroskopii konfokalnej i superrozdzielczej.

Obrazowanie konfokalne i superrozdzielcze spolaryzowanego transportu wewnątrzkomórkowego i wydzielania białek błony podstawnej podczas oogenezy Drosophila

Ten protokół opisuje spersonalizowane znakowanie fluorescencyjne oparte na przeciwciałach i wstrzykiwanie do wczesnych zarodków Drosophila, aby umożliwić obrazowanie na żywo białek o niskiej obfitości lub modyfikacji potranslacyjnych, które są trudne do wykrycia przy użyciu tradycyjnych metod GFP/mCherry-tag.

Wizualizacja białek o niskiej liczebności i modyfikacji potranslacyjnych w żywych zarodkach Drosophila poprzez wstrzyknięcie przeciwciał fluorescencyjnych

Poznaj metodę mikroinjekcji sond fluorescencyjnych do zarodków Drosophila w celu wizualizacji ruchu organelli. Technika ta umożliwia analizę dynamiki lipidowych kropel i retikulum endoplazmatycznego przy użyciu mikroskopii konfokalnej.

Wizualizacja zależnego od cytoszkieletu transportu organelli zawierających lipidy w zarodkach Drosophila

Przeglądaj więcej filmów