Wizualizacja zależnego od cytoszkieletu transportu organelli zawierających lipidy w zarodkach Drosophila

We wczesnym zarodku Drosophila wiele organelli ulega ruchowi na dużą skalę. Nasz protokół opisuje, jak monitorować ten ruch za pomocą barwników fluorescencyjnych opracowanych do hodowli komórkowych. W porównaniu z białkami fluorescencyjnymi, dostępne na rynku sondy fluorescencyjne są jaśniejsze i obejmują szerszy zakres spektrum.

Pozwalają one na wielokrotne znakowanie i mogą być stosowane w dowolnym tle genetycznym. Potrzeba praktyki oraz prób i błędów, aby wiedzieć, jak długo należy suszyć zarodki, tak aby albo pękły podczas wstrzyknięcia, albo wyschły i przestały się rozwijać. Aby rozpocząć, należy rozpocząć przygotowywanie igieł iniekcyjnych, umieszczając kapilar w uchwycie kapilarnym na ściągaczu igieł i zabezpieczając je za pomocą nakrętek motylkowych.

Wyrównaj środek kapilary z elementem grzejnym. Zgodnie z instrukcjami producenta wybierz odpowiednie ustawienia na ściągaczu igłowym. Za pomocą mikroskopu preparacyjnego wykonaj test kontroli jakości.

Wciśnij igły w kit poziomo z końcówkami igieł zawieszonymi w powietrzu. Przykryj igły pokrywką i przechowuj do czasu użycia. Używając końcówek do ładowania igłą dołączonych do mikropipety, pobrać jeden mikrolitr roztworu iniekcyjnego do końcówki, nie zatrzymując pęcherzyków powietrza.

Używając rękawiczek, trzymaj igłę w jednej ręce z końcówką skierowaną na zewnątrz i włóż do niej końcówkę ładującą. Dozuj płyn w pobliżu końcówki igły, wyjmij pipetę i trzymaj igłę pionowo, aż płyn spłynie do końcówki. Przykryj pojemnik folią aluminiową, nie uszkadzając końcówek igieł, aby zapobiec wybielaniu barwników.

Za pomocą pipety transferowej lub mikropipetera umieść małą kroplę kleju heptanowego na środku prostokątnego szkiełka nakrywkowego i pozwól mu odparować. W celu mechanicznego usunięcia kosmówki należy przykryć odpowiednio starą płytkę zarodkową cienką warstwą oleju halowęglowego 27, aby skorupka jaja stała się przezroczysta. Obejrzyj płytkę pod mikroskopem preparacyjnym z oświetleniem trans, aby potwierdzić stadium zarodka i wybrać zarodki w fazie rozszczepienia.

Za pomocą cienkiej pęsety podnieś zarodek w pożądanym stadium, chwytając za przydatki grzbietowe i przenieś go na przygotowane szkiełko pokryte taśmą dwustronną. Umieść zarodek na taśmie i zminimalizuj przenoszenie oleju. Delikatnie przetocz zarodek po powierzchni taśmy, szturchając go bokiem końcówki pęsety, nie szturchając go bezpośrednio.

Kontynuuj zwijanie zarodka, aż kosmówka przylgnie do taśmy i pęknie. Po pęknięciu kosmówki kontynuuj zwijanie zarodka, aby oddzielić go od kosmówki, która pozostaje przyklejona do taśmy. Zwiń zarodek z powrotem na kosmówkę, która jest mniej przyczepna niż taśma.

Delikatnie pocieraj zarodek pęsetą, aż przyczepi się do pęsety w celu transferu. Następnie przenieś zarodek na szkiełko nakrywkowe i doprowadź go do kontaktu z klejem, aby utrzymać zarodek na miejscu, oddzielając go od pęsety. Dostosować ułożenie zarodka na szkiełku nakrywkowym.

Pozwól zarodkom wysuszyć się przez pięć do 12 minut, umieszczając szkiełko nakrywkowe z zarodkami w komorze suszenia i uszczelniając je. Zdejmij szkiełko nakrywkowe z komory i wlej kroplę oleju halocarbon 700, przykrywając zarodki, aby zapobiec dalszemu wysuszeniu. Zbadaj je pod lunetą preparacyjną i przystąp do mikroiniekcji, jeśli zarodki zostały prawidłowo wysuszone.

Umieść obiektyw 4X na ścieżce światła i za pomocą pokrętła ostrości na mikroskopie ustaw ostrość zarodków. Przesuń zarodki poziomo do środka pola widzenia za pomocą elementów sterujących stolika. Trzymaj zarodki na krawędzi pola widzenia i przesuwaj się, przygotowując się do opuszczenia igły.

Pozostając w tej samej płaszczyźnie ogniskowej, opuść końcówkę igły i upewnij się, że jest widoczna w polu view wraz z zarodkami. Sprawdzić, czy igła działa, dozując część roztworu do wstrzykiwań do oleju halowęglowego 700. Jeśli się powiedzie, w oleju w pobliżu końcówki igły pojawi się pęcherzyk roztworu.

Za pomocą elementów sterujących stopniem przesuń zarodek w kierunku końcówki igły, aż końcówka delikatnie nakłuje zarodek i wejdzie do niego. Jednocześnie należy rozpocząć przepływ roztworu do wstrzykiwań, aż w miejscu końcówki igły pojawi się przejściowa, wyraźna plamka, wskazująca na pomyślne wprowadzenie roztworu do zarodka. Zamocuj szkiełko nakrywkowe na mikroskopie konfokalnym za pomocą uchwytu na szkiełko.

Zachowaj ostrożność, ponieważ szkiełko nakrywkowe jest delikatne. Przed kontynuowaniem należy sprawdzić zarodki za pomocą funkcji epifluorescencji w mikroskopie konfokalnym z obiektywem 40X i upewnić się, że fluoro 4 w zarodku jest widoczny. W przypadku obrazowania na żywo na etapie syncytialnym ustaw rozmiar obrazu 512 na 512 pikseli, średnią liniową trzy i liczbę klatek na sekundę 0,1 klatki na sekundę.

Po wstrzyknięciu barwnika BODIPY 493 503 został on zlokalizowany w miejscu wkłucia końcówki igły, a następnie rozprowadzony w pobliżu miejsca wstrzyknięcia. Po 24 minutach barwnik dyfunduje poza środek zarodka. Ruchliwość organelli monitorowano poprzez wstrzyknięcie do zarodka preparatu BODIPY 493 503 i LysoTracker Red.

Analiza prędkości obrazu cząstek wykazała, że zawartość zarodka zbiegła się w centralnym obszarze zarodka, gdzie cytoplazma wpływa do wnętrza zarodka. Znakowanie ER, za pomocą ER-Tracker Green, zapewnia żywą rozdzielczość otoczki jądrowej, umożliwiając wizualizację głównych etapów cyklu komórkowego. Zarodkowi wstrzyknięto MitoView 633 w stadium blastodermy i zobrazowano go cztery godziny później.

Obraz przedstawia komórkę neuroektodermalną zarodka w przedłużeniu prążka zarodkowego. Do komórkowego zarodka wstrzyknięto mieszaninę BODIPY 493 503 i tubuliny SiR, co pokazuje, że kropelki lipidów poruszają się dwukierunkowo wzdłuż mikrotubul. Zarodek musi być częściowo wysuszony, aby można było wstrzyknąć płyn.

Zbyt małe wysuszenie spowoduje, że zarodek będzie przeciekał po wstrzyknięciu, zbyt duże wysuszenie zabije zarodek. Filmy przedstawiające poruszające się organelle można scharakteryzować za pomocą różnych technik analizy obrazu. Śledzenie cząstek ujawnia zachowanie poszczególnych organelli, prędkość obrazowania cząstek ujawnia przepływ masowy.