Modele eksperymentalne do badania neuroprotekcji kwaśnego kondycjonowania końcowego przeciwko niedokrwieniu mózgu
31 lipca 2017
Kwaśne kondycjonowanie końcowe chroni przed niedokrwieniem mózgu. Poniżej przedstawiamy dwa modele do uruchamiania APC. Osiąga się je odpowiednio poprzez przeniesienie wycinków korowo-prążkowych do buforu kwaśnego po deprywacji tlenu i glukozy in vitro oraz przez wdychanie 20% CO2 po niedrożności tętnicy środkowej mózgu in vivo.
Ogólnym celem leczenia kwasicy w modelu wycinka korowo-prążkowiowego w modelu niedrożności tętnicy środkowej mózgu jest zbadanie neuroprotekcyjnego działania kwaśnego kondycjonowania końcowego przeciwko niedokrwieniu mózgu. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania dotyczące tego, w jaki sposób kwasica po kondycjonowaniu może chronić przed niedokrwiennym uszkodzeniem mózgu oraz opracować nową strategię terapii udaru mózgu. Główną zaletą tej techniki jest możliwość wykorzystania powszechnie dostępnych modeli eksperymentalnych do badania neuroprotekcji kwasicy po kondycjonowaniu.
Procedurę zademonstruje Yarong Zheng, doktorant z mojego laboratorium. Zacznij od usunięcia mózgu z czaszki odciętej myszy za pomocą cienkiej szpatułki i ostrożnego wrzucenia go do zlewki zawierającej lodowaty zwykły ACSF zrównoważony pięcioprocentowym dwutlenkiem węgla i 95% tlenem. Nałóż klej krioprecypitacyjny na płytkę wibracyjną w dwóch paskach.
Umieść kawałek trzyprocentowej agarozy na pasku kleju najbardziej oddalonym od ostrza, aby podeprzeć mózg. Następnie użyj kleszczy, aby przenieść mózg na bibułę filtracyjną. Odetnij ostrzem biegun czołowy i móżdżek.
Umieść tkankę mózgową pionowo na wolnym pasku kleju, tak aby mózg opierał się o agarozę. Dodaj lodowaty ACSF do zbiornika tnącego, aby zanurzyć mózg i dodaj lód do obszaru uchwytu lodu. Utrzymuj ACSF w zbiorniku z bąbelkami pięcioprocentowego dwutlenku węgla i 95% tlenu.
Po ustawieniu wibratonu na cięcie odcinków o grubości 400 mikronów i prawidłowym ustawieniu mózgu względem ostrza tnącego, naciśnij przycisk start-stop, aby rozpocząć automatyczne cięcie. Użyj pipety Pasteura z odciętą końcówką, aby przenieść pięć wycinków mózgu jeden po drugim i umieść je w uchwycie na chusteczki w lodowatym zwykłym ACSF z bąbelkami pięcioprocentowego dwutlenku węgla i 95% tlenu. Po 30 minutach w temperaturze pokojowej umieść plastry mózgu w łaźni wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza na dziesięć minut, aby odzyskać funkcję synaptyczną.
Umieść bezglukozowy ACSF i kwaśny ACSF w łaźni wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza i bąbelkuj roztwory odpowiednio pięcioprocentowym dwutlenkiem węgla i 95% azotem oraz 20% dwutlenkiem węgla i 80% tlenem przez 30 minut. Ostrożnie przenieś cztery z pięciu wycinków mózgu do podgrzanego do 37 stopni Celsjusza, wolnego od glukozy ACSF i inkubuj przez 15 minut. Aby zbadać okno czasowe dla kwaśnego kondycjonowania wstępnego, przenieś jeden plasterek bezpośrednio z bezglukozowego ACSF do kwaśnego ACSF, a pozostałe trzy wycinki przenieś do zwykłego ACSF w celu reperfuzji.
Po trzech minutach przenieś plasterek w kwaśnym ACSF do zwykłego ACSF. Następnie, po pięciu minutach w zwykłym ACSF, przenieś jeden z plasterków ze zwykłego ACSF do uchwytu na tkankę w kwaśnym ACSF na trzy minuty. Przenieś kolejny plasterek w ten sam sposób 15 minut po reperfuzji.
Pozostały wycinek, który został umieszczony w ACSF bez glukozy, ale nie w kwaśnym ACSF, jest ustawiany jako grupa pozbawiona tlenu glukozy. Przenieść plastry z ACSF do studzienek 24-dołkowej płytki zawierającej roztwór TTC. Rozciągnij plasterek w roztworze.
A następnie inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza w płytkiej kąpieli wodnej przez 30 minut. Następnie przenieś plastry do czystych, zważonych 1,5 mililitrowych probówek wirówkowych pokrytych folią i zmierz suchą masę plastrów. Po zważeniu wyekstrahować Formazan poprzez dodanie do probówek roztworu etanolu i dimetylosulfotlenku w stosunku 10 do 1.
Inkubować z dala od światła przez 24 godziny. Następnego dnia przenieś roztwór dimetylosulfotlenku etanolu z probówek na płytkę 96-dołkową i zmierz absorbancję przy 490 nanometrach za pomocą czytnika płytek. Najpierw potwierdź prawidłowe znieczulenie poprzez brak odruchu szczypania palca u nogi.
Następnie umieść znieczuloną mysz z sondą LDF przymocowaną do czaszki w pozycji leżącej na plecach i przymocuj za pomocą sterylnych nici bawełnianych. Zdezynfekuj ogoloną skórę szyi 75% alkoholem etylowym. Następnie, po wykonaniu nacięcia skóry okołośrodkowej na szyi, tępo wypreparuj tkanki miękkie kleszczami, aby odsłonić naczynia krwionośne.
Dodaj jedną kroplę soli fizjologicznej do odsłoniętych tkanek, aby je nawodnić. Następnie użyj kleszczy okulistycznych, aby wypreparować wspólną tętnicę szyjną z otaczającej tkanki i nerwu błędnego. Uważaj, aby nie uszkodzić nerwu błędnego.
Umieść zacisk mikronaczynia na dystalnym końcu tętnicy szyjnej wspólnej. I zawiąż martwy węzeł za pomocą jedwabnych szwów 6-0 na bliższym końcu. Następnie zawiąż luźny węzeł proksymalnie do zacisku jako szew tymczasowy.
Następnie użyj mikro nożyczek okulistycznych, aby wykonać małe podłużne nacięcie między dwoma węzłami jak najbliżej martwego węzła. Teraz włóż 12-milimetrowy, stępiony monofilament z końcówką przez nacięcie do światła tętnicy i przesuń go o kilka milimetrów. Zaciśnij luźny węzeł wokół końcówki żyłki, a następnie zdejmij zacisk.
Następnie użyj kleszczyków okulistycznych, aby przesunąć włókno do tętnicy szyjnej wewnętrznej, aż oprogramowanie LDF wykaże gwałtowny spadek przepływu krwi. Zapisz czas rozpoczęcia okluzji. Następnie odetnij sondę LDF i umieść mysz w inkubatorze o temperaturze 30 stopni Celsjusza na godzinę trwania okluzji.
55 minut po rozpoczęciu okluzji należy ponownie znieczulić zwierzę izofluranem i ustawić zwierzę jak poprzednio. Następnie otwórz nacięcie szyi i ponownie odsłonij tętnicę szyjną wspólną. Po okresie okluzji użyj kleszczyków okulistycznych, aby delikatnie wyciągnąć włókno, aby uzyskać reperfuzję.
Następnie zamień szew tymczasowy w stały, zaciskając węzeł. W leczeniu kwasicy zmień gaz wdychany przez stożek nosowy na 20% dwutlenku węgla, 20% tlenu i 60% azotu przez pięć minut. Po zamknięciu nacięcia przerwanym szwem chirurgicznym umieść mysz w klatce ogrzewanej do 30 stopni Celsjusza, aż mysz odzyska przytomność.
Ten histogram przedstawia wyniki testu TTC przeprowadzonego na wycinkach kory mózgowej po pozbawieniu tlenu, glukozy i kwaśnym kondycjonowaniu końcowym, jak pokazano w tym filmie. Trzy minuty leczenia kwasicy były neuroprotekcyjne, jeśli leczenie rozpoczęto natychmiast lub pięć minut po pozbawieniu tlenu glukozy, ale nie jeśli plastry były ponownie perperfundowane przez 15 minut. Myszy poddano 60-minutowemu zamknięciu tętnicy środkowej mózgu i leczono przez wdychanie 20% dwutlenku węgla przez pięć minut po pięciu, 50 lub 100 minutach po reperfuzji.
Objętość zawału oznaczono ilościowo za pomocą dwóch, trzech, pięciu barwień chlorowodorku trifenylotetrazolu 24 godziny po reperfuzji, jak wskazują czarne przerywane linie. Ten histogram pokazuje procentową objętość zawału dla każdego stanu. Neuroprotekcja po kwaśnym kondycjonowaniu była silna nawet wtedy, gdy czas rozpoczęcia był opóźniony do 50 minut po reperfuzji.
Jednak leczenie kwasicy rozpoczęte po 100 minutach nie zablokowało uszkodzenia niedokrwiennego. Po obejrzeniu filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak badać neuroprotekcję kwasicy po kondycjonowaniu na modelu OGD wycinków mózgu i na modelu MSO myszy. Przystępując do zabiegów, należy pamiętać, że wydłużenie i czas trwania kwasicy jest bardzo ważny dla odtworzenia efektów ochronnych.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejsze badanie analizuje efekty neuroprotekcyjne kwaśnego pokondycjonowania (APC) przeciwko niedokrwieniu mózgu z wykorzystaniem dwóch modeli. Pierwszy model polega na przeniesieniu skrawków korowo-prążkowiowych do buforu kwasowego po pozbawieniu tlenu i glukozy in vitro, natomiast drugi model wykorzystuje inhalację 20% CO2 po zamknięciu tętnicy środkowej mózgu in vivo.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Terapia udaru
- Neuroprotekcja
Wstęp
- Kwaśne pokondycjonowanie jest nowatorskim podejściem mającym na celu ochronę przed niedokrwiennym uszkodzeniem mózgu.
- Zrozumienie mechanizmów działania kwasicy może prowadzić do opracowania nowych strategii terapeutycznych.
- W badaniu wykorzystano powszechnie dostępne modele eksperymentalne.
- Odpowiedziano na kluczowe pytania dotyczące neuroprotekcyjnych efektów kwasicy.
Cel badania
- Aby zbadać, w jaki sposób kwasowe pokondycjonowanie chroni przed niedokrwieniem mózgu.
- Aby opracować nowe strategie terapii udarów.
- Aby wykorzystać modele eksperymentalne do badania neuroprotekcji.
Zastosowane metody
- Model in vitro z wykorzystaniem skrawków korowo-prążkowiowych.
- Model in vivo obejmujący okluzję środkowej tętnicy mózgowej.
- Zastosowanie buforu kwaśnego oraz inhalacja CO2.
- Wykorzystanie kleju z krioprecypitatu w układzie eksperymentalnym.
Główne wyniki
- Wykazano neuroprotekcyjne działanie APC w obu modelach.
- Przedstawiono wgląd w mechanizmy leczenia kwasicy.
- Wykazano możliwość zastosowania powszechnie używanych modeli eksperymentalnych.
- Wskazano na potencjalne zastosowania w terapii udarów.
Wnioski
- Zakwaszone warunkowanie ponowne stanowi obiecujące podejście w celu łagodzenia niedokrwiennego uszkodzenia mózgu.
- Konieczne są dalsze badania, aby w pełni zrozumieć mechanizmy tego procesu.
- Technika ta może doprowadzić do postępów w strategiach leczenia udarów.
Często zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Zakwaszone pokondycjonowanie (APC) oferuje oparte na mechanizmach podejście do oceny strategii neuroprotekcyjnych w modelach niedokrwienia mózgu. Wykorzystując szeroko dostępne systemy in vitro i in vivo, APC umożliwia wczesną walidację celów oraz badanie szlaków sygnałowych w terapiach udaru. Wspiera to pewność prognostyczną w identyfikacji wiodących związków poprzez powiązanie ochrony indukowanej kwasicą z redukcją obszaru zawału oraz przeżywalnością tkanki.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Wartość naukowa: Analiza hipotez terapeutycznych dotyczących neuroprotekcji indukowanej kwasicą w urazach niedokrwiennych.
- Wartość operacyjna: Wykorzystanie modeli plastrów korymowarzowych oraz modelu MCAO w celu walidacji zaangażowania celu i biologicznej redukcji ryzyka.
- Wartość prognostyczna: Wsparcie segregacji portfolio poprzez powiązanie czasu podania APC z redukcją objętości zawału i żywotnością tkanek.
Przesiewy i opracowywanie testów
- Wartość naukowa: Przygotowuje zwalidowane układy biologiczne do przesiewania związków za pomocą paradygmatów OGD i reperfuzji.
- Wartość operacyjna: Umożliwia standaryzowane, powtarzalne analizy z wykorzystaniem barwienia TTC i ilościowego oznaczania suchej masy.
- Skalowalność: Pozwala na ponowne wykorzystanie platformy w modelach in vitro na plastrach tkankowych oraz modelach in vivo na myszach w celu uzyskania spójnych wyników.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Wartość naukowa: Wykazuje istotność w kontekście choroby poprzez zastosowanie modeli ogniskowego niedokrwienia wywołanego MCAO oraz modeli OGD w obrębie kory i prążka.
- Wartość operacyjna: Zapewnia ciągłość translacyjną od mechanizmów badanych na wycinkach do wyników zawału u całego zwierzęcia.
- Łagodzenie ryzyka: Dostarcza informacji do decyzji o kontynuacji lub przerwaniu badań (go/no-go), wykazując, że skuteczność APC jest zależna od czasu, a ochrona zostaje utracona przy 100-minutowym opóźnieniu reperfuzji.
Integracja rurociągów i przepływów pracy
APC wpisuje się w kontinuum procesu odkrywania leków, od walidacji celu, poprzez identyfikację związku wiodącego, aż po przedkliniczne testy skuteczności, dostarczając powtarzalnej metody oceny kandydatów o działaniu neuroprotekcyjnym.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez dotyczących kwasicy jako modulatora ewolucji zawału w fazie poischemicznej.
- Przesiewanie: Dostarcza ilościowych wyników końcowych (absorbancja TTC, objętość zawału) do porównywania związków.
- Analityka: Umożliwia statystyczne porównanie neuroprotekcji w różnych oknach czasowych (natychmiastowa, 5-min, 15-min, 50-min, 100-min reperfuzja).
- Badania translacyjne: Łączy ochronę skrawków in vitro z redukcją zawału in vivo, wspierając postępy zgodne z biomarkerami.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Tworzy platformę wielokrotnego użytku do oceny różnorodnych środków neuroprotekcyjnych w zestandaryzowanych warunkach niedokrwiennych.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zmniejsza ryzyko mechanistyczne poprzez wyizolowanie kwasicy jako zmiennej ochronnej w urazie niedokrwienno-reperfuzyjnym.
- Wartość operacyjna: Wykorzystuje dostępne modele (skrawki mózgu mysiego, MCAO) oraz standardowe odczynniki (ACSF, TTC, CO2) w celu zapewnienia powtarzalności.
- Wartość strategiczna: Poprawia efektywność kapitałową poprzez wczesną identyfikację nieskutecznych interwencji (np. APC w 100 min nie wykazuje działania ochronnego).
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację związków z uwzględnieniem ryzyka w oparciu o zależne od czasu profile neuroprotekcyjne.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w chirurgii myszy, przygotowywaniu skrawków mózgu oraz w protokołach niedokrwienia i reperfuzji.
- Zależy od precyzyjnej kontroli składu gazów (20% CO2, równowaga O2/N2) oraz roztworów o regulowanej temperaturze (kąpiele wodne 37°C).
- Wymaga standaryzacji czasu reperfuzji oraz czasu trwania kwasicy w obu wariantach badania: in vitro i in vivo.
- Należy uwzględnić zmienność w barwieniu TTC i ilościowym określaniu obszaru zawału podczas porównywania warunków.
- Ogranicza się do modeli ostrego niedokrwienia; materiał źródłowy nie obejmuje stanów chronicznych ani chorób współistniejących.
Najczęściej zadawane pytania (FAQ) dotyczące biofarmacji
Chapters in this video
0:05
Title
0:57
Cortical Slice Preparation
2:43
Oxygen-glucose Deprivation and Acidic Postconditioning
4:03
Determination of Slice Viability
5:04
Middle Cerebral Artery Occlusion
7:22
Reperfusion and Acidic Postconditioning
8:16
Results: Acidic Preconditioning Protects Against Reperfusion Injury
9:32
Conclusion
