Modele eksperymentalne do badania neuroprotekcji kwaśnego kondycjonowania końcowego przeciwko niedokrwieniu mózgu
31 lipca 2017
Kwaśne kondycjonowanie końcowe chroni przed niedokrwieniem mózgu. Poniżej przedstawiamy dwa modele do uruchamiania APC. Osiąga się je odpowiednio poprzez przeniesienie wycinków korowo-prążkowych do buforu kwaśnego po deprywacji tlenu i glukozy in vitro oraz przez wdychanie 20% CO2 po niedrożności tętnicy środkowej mózgu in vivo.
Ogólnym celem leczenia kwasicy w modelu wycinka korowo-prążkowiowego w modelu niedrożności tętnicy środkowej mózgu jest zbadanie neuroprotekcyjnego działania kwaśnego kondycjonowania końcowego przeciwko niedokrwieniu mózgu. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania dotyczące tego, w jaki sposób kwasica po kondycjonowaniu może chronić przed niedokrwiennym uszkodzeniem mózgu oraz opracować nową strategię terapii udaru mózgu. Główną zaletą tej techniki jest możliwość wykorzystania powszechnie dostępnych modeli eksperymentalnych do badania neuroprotekcji kwasicy po kondycjonowaniu.
Procedurę zademonstruje Yarong Zheng, doktorant z mojego laboratorium. Zacznij od usunięcia mózgu z czaszki odciętej myszy za pomocą cienkiej szpatułki i ostrożnego wrzucenia go do zlewki zawierającej lodowaty zwykły ACSF zrównoważony pięcioprocentowym dwutlenkiem węgla i 95% tlenem. Nałóż klej krioprecypitacyjny na płytkę wibracyjną w dwóch paskach.
Umieść kawałek trzyprocentowej agarozy na pasku kleju najbardziej oddalonym od ostrza, aby podeprzeć mózg. Następnie użyj kleszczy, aby przenieść mózg na bibułę filtracyjną. Odetnij ostrzem biegun czołowy i móżdżek.
Umieść tkankę mózgową pionowo na wolnym pasku kleju, tak aby mózg opierał się o agarozę. Dodaj lodowaty ACSF do zbiornika tnącego, aby zanurzyć mózg i dodaj lód do obszaru uchwytu lodu. Utrzymuj ACSF w zbiorniku z bąbelkami pięcioprocentowego dwutlenku węgla i 95% tlenu.
Po ustawieniu wibratonu na cięcie odcinków o grubości 400 mikronów i prawidłowym ustawieniu mózgu względem ostrza tnącego, naciśnij przycisk start-stop, aby rozpocząć automatyczne cięcie. Użyj pipety Pasteura z odciętą końcówką, aby przenieść pięć wycinków mózgu jeden po drugim i umieść je w uchwycie na chusteczki w lodowatym zwykłym ACSF z bąbelkami pięcioprocentowego dwutlenku węgla i 95% tlenu. Po 30 minutach w temperaturze pokojowej umieść plastry mózgu w łaźni wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza na dziesięć minut, aby odzyskać funkcję synaptyczną.
Umieść bezglukozowy ACSF i kwaśny ACSF w łaźni wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza i bąbelkuj roztwory odpowiednio pięcioprocentowym dwutlenkiem węgla i 95% azotem oraz 20% dwutlenkiem węgla i 80% tlenem przez 30 minut. Ostrożnie przenieś cztery z pięciu wycinków mózgu do podgrzanego do 37 stopni Celsjusza, wolnego od glukozy ACSF i inkubuj przez 15 minut. Aby zbadać okno czasowe dla kwaśnego kondycjonowania wstępnego, przenieś jeden plasterek bezpośrednio z bezglukozowego ACSF do kwaśnego ACSF, a pozostałe trzy wycinki przenieś do zwykłego ACSF w celu reperfuzji.
Po trzech minutach przenieś plasterek w kwaśnym ACSF do zwykłego ACSF. Następnie, po pięciu minutach w zwykłym ACSF, przenieś jeden z plasterków ze zwykłego ACSF do uchwytu na tkankę w kwaśnym ACSF na trzy minuty. Przenieś kolejny plasterek w ten sam sposób 15 minut po reperfuzji.
Pozostały wycinek, który został umieszczony w ACSF bez glukozy, ale nie w kwaśnym ACSF, jest ustawiany jako grupa pozbawiona tlenu glukozy. Przenieść plastry z ACSF do studzienek 24-dołkowej płytki zawierającej roztwór TTC. Rozciągnij plasterek w roztworze.
A następnie inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza w płytkiej kąpieli wodnej przez 30 minut. Następnie przenieś plastry do czystych, zważonych 1,5 mililitrowych probówek wirówkowych pokrytych folią i zmierz suchą masę plastrów. Po zważeniu wyekstrahować Formazan poprzez dodanie do probówek roztworu etanolu i dimetylosulfotlenku w stosunku 10 do 1.
Inkubować z dala od światła przez 24 godziny. Następnego dnia przenieś roztwór dimetylosulfotlenku etanolu z probówek na płytkę 96-dołkową i zmierz absorbancję przy 490 nanometrach za pomocą czytnika płytek. Najpierw potwierdź prawidłowe znieczulenie poprzez brak odruchu szczypania palca u nogi.
Następnie umieść znieczuloną mysz z sondą LDF przymocowaną do czaszki w pozycji leżącej na plecach i przymocuj za pomocą sterylnych nici bawełnianych. Zdezynfekuj ogoloną skórę szyi 75% alkoholem etylowym. Następnie, po wykonaniu nacięcia skóry okołośrodkowej na szyi, tępo wypreparuj tkanki miękkie kleszczami, aby odsłonić naczynia krwionośne.
Dodaj jedną kroplę soli fizjologicznej do odsłoniętych tkanek, aby je nawodnić. Następnie użyj kleszczy okulistycznych, aby wypreparować wspólną tętnicę szyjną z otaczającej tkanki i nerwu błędnego. Uważaj, aby nie uszkodzić nerwu błędnego.
Umieść zacisk mikronaczynia na dystalnym końcu tętnicy szyjnej wspólnej. I zawiąż martwy węzeł za pomocą jedwabnych szwów 6-0 na bliższym końcu. Następnie zawiąż luźny węzeł proksymalnie do zacisku jako szew tymczasowy.
Następnie użyj mikro nożyczek okulistycznych, aby wykonać małe podłużne nacięcie między dwoma węzłami jak najbliżej martwego węzła. Teraz włóż 12-milimetrowy, stępiony monofilament z końcówką przez nacięcie do światła tętnicy i przesuń go o kilka milimetrów. Zaciśnij luźny węzeł wokół końcówki żyłki, a następnie zdejmij zacisk.
Następnie użyj kleszczyków okulistycznych, aby przesunąć włókno do tętnicy szyjnej wewnętrznej, aż oprogramowanie LDF wykaże gwałtowny spadek przepływu krwi. Zapisz czas rozpoczęcia okluzji. Następnie odetnij sondę LDF i umieść mysz w inkubatorze o temperaturze 30 stopni Celsjusza na godzinę trwania okluzji.
55 minut po rozpoczęciu okluzji należy ponownie znieczulić zwierzę izofluranem i ustawić zwierzę jak poprzednio. Następnie otwórz nacięcie szyi i ponownie odsłonij tętnicę szyjną wspólną. Po okresie okluzji użyj kleszczyków okulistycznych, aby delikatnie wyciągnąć włókno, aby uzyskać reperfuzję.
Następnie zamień szew tymczasowy w stały, zaciskając węzeł. W leczeniu kwasicy zmień gaz wdychany przez stożek nosowy na 20% dwutlenku węgla, 20% tlenu i 60% azotu przez pięć minut. Po zamknięciu nacięcia przerwanym szwem chirurgicznym umieść mysz w klatce ogrzewanej do 30 stopni Celsjusza, aż mysz odzyska przytomność.
Ten histogram przedstawia wyniki testu TTC przeprowadzonego na wycinkach kory mózgowej po pozbawieniu tlenu, glukozy i kwaśnym kondycjonowaniu końcowym, jak pokazano w tym filmie. Trzy minuty leczenia kwasicy były neuroprotekcyjne, jeśli leczenie rozpoczęto natychmiast lub pięć minut po pozbawieniu tlenu glukozy, ale nie jeśli plastry były ponownie perperfundowane przez 15 minut. Myszy poddano 60-minutowemu zamknięciu tętnicy środkowej mózgu i leczono przez wdychanie 20% dwutlenku węgla przez pięć minut po pięciu, 50 lub 100 minutach po reperfuzji.
Objętość zawału oznaczono ilościowo za pomocą dwóch, trzech, pięciu barwień chlorowodorku trifenylotetrazolu 24 godziny po reperfuzji, jak wskazują czarne przerywane linie. Ten histogram pokazuje procentową objętość zawału dla każdego stanu. Neuroprotekcja po kwaśnym kondycjonowaniu była silna nawet wtedy, gdy czas rozpoczęcia był opóźniony do 50 minut po reperfuzji.
Jednak leczenie kwasicy rozpoczęte po 100 minutach nie zablokowało uszkodzenia niedokrwiennego. Po obejrzeniu filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak badać neuroprotekcję kwasicy po kondycjonowaniu na modelu OGD wycinków mózgu i na modelu MSO myszy. Przystępując do zabiegów, należy pamiętać, że wydłużenie i czas trwania kwasicy jest bardzo ważny dla odtworzenia efektów ochronnych.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejsze badanie analizuje efekty neuroprotekcyjne zakwaszonego postkondycjonowania (APC) przeciwko niedokrwieniu mózgu z wykorzystaniem dwóch modeli. Pierwszy model polega na przeniesieniu skrawków kory i prążkowia do buforu o niskim pH po deprywacji tlenu i glukozy in vitro, natomiast drugi model wykorzystuje inhalację 20% CO2 po zamknięciu środkowej tętnicy mózgowej in vivo.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neurobiologia
- Terapia udaru
- Neuroprotekcja
Wstęp
- Zakwaszone pokondycjonowanie to nowatorskie podejście mające na celu ochronę przed niedokrwiennym uszkodzeniem mózgu.
- Zrozumienie mechanizmów działania terapii kwasicą może prowadzić do opracowania nowych strategii terapeutycznych.
- W badaniu wykorzystano powszechnie dostępne modele eksperymentalne do celów badawczych.
- Omówiono kluczowe pytania dotyczące neuroprotekcyjnych efektów kwasicy.
Cel badania
- Zbadanie, w jaki sposób kwasowe pokondycjonowanie chroni przed niedokrwieniem mózgu.
- Opracowanie nowych strategii terapii udaru.
- Wykorzystanie modeli eksperymentalnych do badania neuroprotekcji.
Zastosowane metody
- Model in vitro z wykorzystaniem skrawków korowo-prążkowiowych.
- Model in vivo obejmujący zamknięcie tętnicy środkowej mózgu.
- Zastosowanie buforu kwasowego i inhalacja CO2.
- Wykorzystanie kleju z krioprecypitatu w układzie eksperymentalnym.
Główne wyniki
- Wykazano neuroprotekcyjne działanie APC w obu modelach.
- Przedstawiono mechanizmy leczenia kwasicy.
- Wykazano możliwość zastosowania powszechnych modeli eksperymentalnych.
- Wskazano na potencjalne zastosowania w terapii udarów.
Wnioski
- Zakwaszone pokondycjonowanie stanowi obiecujące podejście w celu łagodzenia niedokrwiennego uszkodzenia mózgu.
- Konieczne są dalsze badania w celu pełnego zrozumienia jego mechanizmów.
- Technika ta może doprowadzić do postępów w strategiach leczenia udaru.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Zakwaszone pokondycjonowanie (APC) oferuje mechanistycznie uzasadnione podejście do oceny strategii neuroprotekcyjnych w modelach niedokrwienia mózgu. Wykorzystując szeroko dostępne systemy in vitro i in vivo, APC umożliwia wczesną walidację celów oraz badanie szlaków sygnałowych dla terapii udaru. Wspiera to pewność prognostyczną w identyfikacji głównych kandydatów na leki poprzez powiązanie ochrony pośredniczonej przez kwasicę z redukcją obszaru zawału oraz przeżywalnością tkanek.
Zastosowania strategiczne w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Wartość naukowa: Analizuje hipotezy terapeutyczne dotyczące neuroprotekcji zapśredniczonej przez kwasicę w przypadku uszkodzeń niedokrwiennych.
- Wartość operacyjna: Wykorzystuje modele skrawków korowo prążkowiowych oraz MCAO w celu walidacji zaangażowania celu i ograniczania ryzyka biologicznego.
- Wartość prognostyczna: Wspiera selekcję projektów w portfelu poprzez powiązanie czasu podania APC z redukcją objętości zawału i żywotnością tkanki.
Przesiewy i opracowywanie testów
- Wartość naukowa: Przygotowanie zwalidowanych systemów biologicznych do przesiewania związków chemicznych przy użyciu paradygmatów OGD i reperfuzji.
- Wartość operacyjna: Umożliwienie przeprowadzania standaryzowanych, powtarzalnych testów z wykorzystaniem barwienia TTC i ilościowego oznaczania suchej masy.
- Skalowalność: Wsparcie dla ponownego wykorzystania platformy w modelach in vitro na skrawkach tkankowych oraz modelach in vivo u myszy w celu uzyskania spójnych wyników.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Wartość naukowa: Wykazuje istotność w kontekście choroby poprzez modele ogniskowego niedokrwienia indukowanego MCAO oraz modele OGD w obszarze korowo-prążkowiowym.
- Wartość operacyjna: Zapewnia ciągłość translacyjną od mechanizmów badanych na skrawkach do wyników zawałów w całym organizmie zwierzęcia.
- Minimalizacja ryzyka: Uzasadnia decyzje o kontynuacji lub przerwaniu badań (go/no-go), wykazując, że skuteczność APC jest zależna od czasu, z utratą ochrony przy 100-minutowym opóźnieniu reperfuzji.
Integracja rurociągu i przepływu pracy
APC wpisuje się w kontinuum procesów badawczych, od walidacji celu, poprzez identyfikację związku wiodącego, aż po przedkliniczne testy skuteczności, zapewniając powtarzalną metodę oceny kandydatów na leki neuroprotekcyjne.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotezy dotyczącej kwasicy jako modulatora ewolucji zawału w okresie poischemicznym.
- Przesiewy: Dostarcza ilościowych wyników końcowych (absorpcja TTC, objętość zawału) do porównywania związków.
- Analityka: Umożliwia statystyczne porównanie neuroprotekcji w różnych oknach czasowych (natychmiastowa, 5-min, 15-min, 50-min, 100-min reperfuzja).
- Badania translacyjne: Łączy ochronę skrawków in vitro z redukcją zawału in vivo, wspierając postępy zgodne z markerami biomarkerowymi.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Tworzy platformę wielokrotnego użytku do oceny różnych czynników neuroprotekcyjnych w zestandaryzowanych warunkach niedokrwiennych.
Wpływ operacyjny i organizacyjny
- Wartość naukowa: Zapewnia mechanistyczną redukcję ryzyka poprzez wyizolowanie kwasicy jako zmiennej ochronnej w urazie niedokrwienno-reperfuzyjnym.
- Wartość operacyjna: Wykorzystuje dostępne modele (przezcięcia mózgu myszy, MCAO) oraz standardowe odczynniki (ACSF, TTC, CO2) w celu zapewnienia powtarzalności.
- Wartość strategiczna: Poprawia efektywność kapitałową poprzez wczesną identyfikację nieskutecznych interwencji (np. APC w 100 min nie wykazuje działania ochronnego).
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację związków z uwzględnieniem ryzyka, w oparciu o zależne od czasu profile neuroprotekcyjne.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w zakresie chirurgii mysiej, slicingu mózgu oraz protokołów reperfuzji niedokrwiennej.
- Zależy od precyzyjnej kontroli gazów (20% CO2, równowaga O2/N2) oraz roztworów o regulowanej temperaturze (łaźnię wodne 37°C).
- Wymaga standaryzacji czasu reperfuzji i czasu trwania kwasicy w wariantach in vitro oraz in vivo.
- Należy uwzględnić zmienność w barwieniu TTC i kwantyfikacji obszaru zawału podczas porównywania warunków.
- Ograniczone do modeli ostrego niedokrwienia; materiał źródłowy nie obejmuje stanów przewlekłych ani chorób współistniejących.
Najczęściej zadawane pytania (FAQ) dotyczące biofarmacji
Chapters in this video
0:05
Title
0:57
Cortical Slice Preparation
2:43
Oxygen-glucose Deprivation and Acidic Postconditioning
4:03
Determination of Slice Viability
5:04
Middle Cerebral Artery Occlusion
7:22
Reperfusion and Acidic Postconditioning
8:16
Results: Acidic Preconditioning Protects Against Reperfusion Injury
9:32
Conclusion
