Ocena funkcji mikrokrążenia tkanki tłuszczowej człowieka za pomocą wideomikroskopii

Ogólnym celem tej techniki wideomikroskopii jest zbadanie właściwości funkcjonalnych izolowanych mikronaczyń w odpowiedzi na bodźce farmakologiczne i fizjologiczne, dostarczając informacji na temat patofizjologii i mechanizmów molekularnych, które przyczyniają się do dysfunkcji naczyń krwionośnych u ludzi. Metoda ta jest przydatna do zrozumienia mechanizmów molekularnych, które przyczyniają się do dysfunkcji lokalnego mikrokrążenia w tłuszczu, co zostało powiązane z chorobami ogólnoustrojowymi. Głównymi zaletami tej techniki jest to, że naczynia krwionośne pozostają funkcjonalne po usunięciu z organizmu ludzkiego przez pewien czas i można je łatwo zbadać pod kątem ich właściwości fizjologicznych.

Kliniczne znaczenie tego eksperymentalnego podejścia polega na tym, że pozwala nam ono zidentyfikować szlaki, które są różnie zmienione w stanach chorobowych i potencjalnie odkryć nowe cele terapeutyczne. Pod mikroskopem do preparowania tkanek użyj mikronożyczek i mikrokleszczy, aby ostrożnie usunąć otaczający tłuszcz i tkankę łączną z małych tętnic w próbce tłuszczu. Konieczne jest odróżnienie tętnic od żyłek.

Tętnice mają zazwyczaj mniejszą średnicę, wykazują większy ton i reagują bardziej stanowczo niż żyłki. Po odizolowaniu tętnicy użyj nylonowych lub jedwabnych szwów, aby związać wszelkie gałęzie. Następnie użyj 10-mililitrowej strzykawki, aby powoli napełnić rurkę świeżym roztworem Krebsa.

Następnie przymocuj gumowe rurki do zbiorników ciśnieniowych i szklanych pipet kapilarnych w komorze. Następnie przenieś wypreparowaną tętnicę do komory narządu i kaniuluj naczynie na szklanych pipetach kapilarnych. Ostrożnie zabezpiecz oba końce tętnicy na pipetach za pomocą nylonowych szwów.

Gdy naczynie jest już zabezpieczone, powoli wyjmij bufor Krebsa z komory i dodaj do komory dwa mililitry świeżego roztworu Krebsa. Następnie przymocuj komorę organową do stolika mikroskopu odwróconego wyposażonego w kamerę wideo. Włącz oprogramowanie do wykrywania krawędzi z częstotliwością próbkowania wynoszącą jeden kiloherc.

Podłącz pozostały przewód ciśnieniowy do drugiego zbiornika ciśnieniowego wypełnionego roztworem Krebsa, a następnie podłącz zbiorniki ciśnieniowe do przetwornika ciśnienia. Po podłączeniu wszystkich przewodów ustaw blok grzejny na 37 stopni Celsjusza. Następnie użyj jednostki sterującej ciśnieniem, aby stopniowo zwiększać ciśnienie śródświetlne do pięciu mililitrów rtęci co pięć minut, aby osiągnąć odpowiednie ciśnienie eksperymentalne w świetle izolowanego naczynia krwionośnego.

Pozwól naczyniu zrównoważyć się przez 20 do 30 minut, gdy ciśnienie osiągnie 60 mililitrów rtęci i zapisz średnicę tętnicy tłuszczowej w spoczynku. Pod koniec okresu równowagi należy wstępnie zwęzić naczynie krwionośne do około 55% spoczynkowej średnicy podstawowej, dodając jeden mikrolitr endoteliny 1 bezpośrednio do kąpieli co pięć minut, aż średnica naczynia zostanie odpowiednio zwężona. W przypadku rozszerzenia naczyń krwionośnych zależnego od śródbłonka wywołanego przepływem, należy indukować ciągły przepływ do przestrzeni śródświetlnej tętnicy w równych i przeciwnych kierunkach, tak aby można było wytworzyć różnicę ciśnień w naczyniu bez zmiany średniego ciśnienia śródświetlnego wynoszącego 60 milimetrów słupa rtęci.

Po trzech do pięciu minutach zmierz dylatację za pośrednictwem przepływu. Zwiększaj każdy przyrost gradientu ciśnienia o 10 centymetrów podmiany wody co pięć do sześciu minut, aż do maksymalnie 100 centymetrów wody. Po dokonaniu oceny dylatacji naczynia zależnego od przepływu, należy przywrócić zbiorniki ciśnieniowe na tę samą wysokość, aby zatrzymać indukcję przepływu.

Następnie natychmiast, ale ostrożnie, zastąp roztwór w komorze świeżym roztworem Krebsa, nie naruszając zawieszonej tętnicy i pozwól, aby naczynie zaczęło wracać do średnicy podstawowej przez 20 do 30 minut. Gdy tętnica powróci do spoczynkowej średnicy podstawowej, można ocenić subtelne rozszerzenie naczyń krwionośnych zależne od śródbłonka za pośrednictwem choliny. Rozpoczyna się to od wstępnego zwężenia naczynia do około 55% jego spoczynkowej średnicy za pomocą endoteliny 1, jak wykazano wcześniej.

Po osiągnięciu wstępnego zwężenia dodaj dwa mikrolitry rosnących dawek acetylocholiny bezpośrednio do kąpieli. Odnotować zmianę średnicy tętnicy pięć minut po podaniu każdej dawki. Po zakończeniu reakcji na dawkę acetylocholiny należy ocenić niezależne od śródbłonka rozszerzenie naczyń krwionośnych i żywotność naczyń krwionośnych poprzez sekwencyjne podawanie papaweryny i niezależnego od śródbłonka środka rozszerzającego naczynia krwionośne bezpośrednio do kąpieli.

Zależne od śródbłonka reakcje rozszerzenia naczyń krwionośnych na zwiększony przepływ i czysty stres lub acetylocholinę są znacznie stępione w trzewnych i podskórnych tętnicach tłuszczowych w ludzkiej otyłości. Niezależne od śródbłonka rozszerzenie naczyń krwionośnych w odpowiedzi na papawerynę nie jest jednak zróżnicowane między tymi dwoma dipozami, co sugeruje, że dysfunkcja naczyń w domenach trzewnych jest w dużej mierze wynikiem dysfunkcji na poziomie śródbłonka, przynajmniej we wczesnych stadiach choroby. Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w ciągu trzech do pięciu godzin, jeśli zostanie wykonana prawidłowo.

Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać, aby nie spieszyć się i być sumiennym, ponieważ nawet niewielkie uszkodzenia naczyń krwionośnych mogą zniekształcić wyniki. Po tej procedurze można wykonać inne metody, takie jak transfekcja naczyń krwionośnych siRNA, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania dotyczące wpływu określonych genów na funkcję naczynioruchową w chorobach człowieka. Po jej opracowaniu technika ta utorowała drogę naukowcom zajmującym się biologią tkanki tłuszczowej i mikrokrążeniem do zbadania wpływu mikrośrodowiska tkanki tłuszczowej na lokalne zdrowie naczyń krwionośnych w otyłości u ludzi.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak bezpośrednio badać patofizjologię całych nienaruszonych odcinków ludzkich naczyń krwionośnych, które są usuwane od żywych osób, procesu, którego nie można odtworzyć za pomocą nieinwazyjnego obrazowania.