Ocena funkcji mikrokrążenia tkanki tłuszczowej człowieka za pomocą wideomikroskopii

Ogólnym celem tej techniki videomikroskopii jest badanie właściwości funkcjonalnych wyizolowanych mikronaczyń w odpowiedzi na bodźce farmakologiczne i fizjologiczne, co pozwala na poznanie patofizjologii i mechanizmów molekularnych przyczyniających się do dysfunkcji naczyniowej u ludzi. Metoda ta jest użyteczna w zrozumieniu mechanizmów molekularnych prowadzących do dysfunkcji lokalnego mikrokrążenia w tkance tłuszczowej, co wiąże się z chorobami ogólnoustrojowymi. Głównymi zaletami tej techniki są fakt, że naczynia krwionośne pozostają funkcjonalne przez pewien czas po usunięciu z organizmu człowieka oraz łatwość badania ich właściwości fizjologicznych.

Znaczenie kliniczne tego podejścia eksperymentalnego polega na tym, że pozwala ono zidentyfikować szlaki, które ulegają różnicowym zmianom w stanach chorobowych, oraz potencjalnie odkryć nowe cele terapeutyczne. Pod stereomikroskopem, używając mikronożyczek i mikro pęsety, ostrożnie usuń otaczający tłuszcz i tkankę łączną z małych tętniczek w próbce tkanki tłuszczowej. Niezbędne jest odróżnienie tętniczek od żyłek.

Tętniczki mają zazwyczaj mniejszą średnicę, wykazują większy tonus i reagują silniej niż żyłki. Po wyizolowaniu tętniczki należy użyć szwów nylonowych lub jedwabnych do związania wszystkich odgałęzień. Następnie, używając strzykawki o pojemności 10 ml, należy powoli wypełnić cewkę świeżym roztworem Krebsa.

Następnie podłącz rurki gumowe do zbiorników ciśnieniowych i szklanych pipet kapilarnych wewnątrz komory. Potem przenieś wypreparowaną tętnicę do komory organu i przeprowadź kanulację naczynia na szklanych pipetach kapilarnych. Ostrożnie zabezpiecz oba końce tętnicy na pipetach za pomocą szwów nylonowych.

Po zabezpieczeniu naczynia powoli usuń bufor Krebsa z komory i dodaj do niej dwa mililitry świeżego roztworu Krebsa. Następnie przymocuj komorę organową do stolika mikroskopu odwróconego wyposażonego w kamerę wideo. Uruchom oprogramowanie do detekcji krawędzi z częstotliwością próbkowania jeden kilohertz.

Podłącz pozostałe oprzymowane rurki do drugiego zbiornika ciśnienia wypełnionego roztworem Krebsa, a następnie podłącz zbiorniki ciśnienia do przetwornika ciśnienia. Po podłączeniu wszystkich rurek ustaw blok grzewczy na 37 °C. Następnie, używając jednostki sterowania ciśnieniem, stopniowo zwiększaj ciśnienie wewnątrz światła naczynia o 5 mmHg co pięć minut, aby uzyskać odpowiednie ciśnienie eksperymentalne w świetle izolowanego naczynia krwionośnego.

Po osiągnięciu ciśnienia 60 mmHg należy pozwolić naczyniu na equilibrację przez 20 do 30 minut i zapisać średnicę tętnicyy tłuszczowej w spoczynku. Po zakończeniu okresu equilibracji należy wstępnie skurczyć naczynie krwionośne do około 55% średnicy spoczynkowej, dodając jeden µL endoteliny 1 bezpośrednio do kąpieli co pięć minut, aż do uzyskania odpowiedniego stopnia skurczenia naczynia. W celu wywołania zależnej od śródbłonka wazodylatacji indukowanej przepływem, należy wprowadzić ciągły przepływ do przestrzeni wewnątrzświatłowej tętnicy w równych i przeciwstawnych kierunkach, aby można było wytworzyć różnicę ciśnień w obrębie naczynia, nie zmieniając średniego ciśnienia wewnątrzświatłowego wynoszącego 60 mmHg.

Po trzech do pięciu minutach zmierz rozszerzenie naczyniowe zależne od przepływu. Zwiększaj każdy przyrost gradientu ciśnienia o 10 cm H₂O co pięć do sześciu minut, aż do osiągnięcia maksymalnej wartości 100 cm H₂O. Po ocenie rozszerzenia naczyniowego zależnego od przepływu, przywróć zbiorniki ciśnieniowe do tej samej wysokości, aby zatrzymać indukcję przepływu.

Następnie niezwłocznie, lecz ostrożnie, należy zastąpić roztwór w komorze świeżym roztworem Krebsa, nie naruszając zawieszonej tętnicy, i pozwolić naczyniu na powrót do średnicy bazowej przez 20 do 30 minut. Gdy tętnica powróci do spoczynkowej średnicy bazowej, można ocenić subtelne, zależne od śródbłonka rozszerzenie naczyń wywołane choliną. Procedurę tę rozpoczyna się od wstępnego zwężenia naczynia do około 55% jego spoczynkowej średnicy za pomocą endoteliny 1, zgodnie z wcześniej opisaną metodą.

Po uzyskaniu wstępnego skurczu należy dodać do kąpieli dwie mikrolitry zwiększających się dawek acetylocholiny. Zmianę średnicy tętnicy należy zarejestrować pięć minut po podaniu każdej dawki. Po zakończeniu badania odpowiedzi naczyniowej na acetylcholinę należy ocenić niezależną od śródbłonka wazodylatację oraz żywotność naczynia poprzez sekwencyjne podanie papaweryny i niezależnego od śródbłonka wazodylatatora bezpośrednio do kąpieli.

Odpowiedzi rozszerzenia naczyń zależne od śródbłonka na zwiększony przepływ i stres ścinający lub acetylocholinę są znacznie osłabione w tętnicach tkanki tłuszczowej trzewnej w porównaniu do podskórnej u ludzi z otyłością. Jednak rozszerzenie naczyń niezależne od śródbłonka w odpowiedzi na papawerynę nie wykazuje różnic między tymi dwiema tkankami tłuszczowymi, co sugeruje, że dysfunkcja naczyniowa w obszarach trzewnych jest w dużej mierze wynikiem dysfunkcji na poziomie śródbłonka, przynajmniej we wczesnych stadiach choroby. Po opanowaniu ta technika może zostać wykonana w ciągu od trzech do pięciu godzin, jeśli zostanie przeprowadzona prawidłowo.

Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby pracować powoli i z należytą starannością, ponieważ nawet niewielkie uszkodzenia naczyń krwionośnych mogą zafałszować wyniki. Po zastosowaniu tej procedury można przeprowadzić inne metody, takie jak transfekcja siRNA naczyń krwionośnych, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania dotyczące wpływu konkretnych genów na funkcję naczynioruchową w chorobach ludzi. Po opracowaniu technika ta utorowała drogę badaczom w dziedzinie biologii tkanki tłuszczowej i mikrokrążenia do badania wpływu mikrośrodowiska tkanki tłuszczowej na stan lokalnych naczyń krwionośnych w przebiegu otyłości u ludzi.

Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo dobrze zrozumieć, w jaki sposób bezpośrednio badać patofizjologię całych, nienaruszonych segmentów ludzkich naczyń krwionośnych pobranych od żyjących obiektów, co jest procesem niemożliwym do odtworzenia za pomocą obrazowania nieinwazyjnego.