Name: Ocena funkcji mikrokrążenia tkanki tłuszczowej człowieka za pomocą wideomikroskopii (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-09-29T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 24 s
Description: Poznaj technikę wideomikroskopii do badania funkcji mikrokrążenia w tkance tłuszczowej człowieka. Ta metoda pozwala analizować właściwości fizjologiczne izolowanych naczyń krwionośnych i identyfikować zmienione szlaki w chorobach.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Autorzy chcieliby podziękować ochotnikom za udział w tych badaniach oraz personelowi chirurgicznemu w Boston Medical Center za wykonanie biopsji tkanki tłuszczowej. Dr Gokce jest wspierany przez granty National Institutes of Health (NIH) HL081587, HL114675, oraz HL126141. Dr Farb jest wspierany przez grant HL135394 K23 z NIH.

Protokół i przykłady opisane tutaj zostały zatwierdzone przez Boston University School of Medicine Institutional Review Board (IRB, protokół #H-25644) i zostały przeprowadzone zgodnie z Deklaracją Helsińską. Wszyscy uczestnicy wyrazili pisemną świadomą zgodę przed uczestnictwem.
1. Przygotowanie roztworów i kaniul mikroszklanych
<ol>
	<li>Przygotować roztwór kwaśnej soli fizjologicznej 4-2-hydrosyetylo-1-piperazynoetanosulfonowej (HEPES). Na 1 l rozpuścić 8,059 g NaCl, 0,298 g KCl, 0,296 g MgSO4•7H2O, 0,235 g CaCl2•2H2O, 0,16 g KH2PO4, 0,01 g EDTA, 1,081 g D-glukozy i 2,383 g kwasu HEPES w 950 ml wody dejonizowanej. Uzupełnić objętość do 1 l wodą dejonizowaną. Dostosuj pH do 7,4 za pomocą NaOH. Bufor HEPES może być przechowywany do 7 dni w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Przygotuj 20x zapas bufora solnego. Na 1 l dodać 143,8 g NaCl, 7,0 g KCl, 5,9 gMgSO4 i 7,4 g CaCl2•2H2O do 900 ml wody destylowanej. Uzupełnić objętość do objętości 1 l wodą dejonizowaną. Przechowywać roztwór podstawowy w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Przygotuj 20-krotny zapas buforowy. Na 1 l dodać 26,8 g NaHCO3 i 0,2 g EDTA·2H2O do 900 ml wody dejonizowanej. Uzupełnić objętość do objętości 1 l wodą dejonizowaną. Przechowywać roztwór podstawowy w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Przygotować roztwór KREBS do użycia podczas eksperymentów fizjologicznych. Na 1 l dodaj 900 ml wody dejonizowanej, 50 ml 20x bulionu buforowego, 50 ml 20x roztworu buforu solnego, 0,99 g D-glukozy i 0,16 g KH2PO4. Dostosuj pH do 7,4 za pomocą HCl. Aby utrzymać pH buforu, ciągle mieszaj i przykrywaj parafiną lub bąbelkami w sposób ciągły.
	<ol>
		<li>Sprawdzaj pH co 20 minut. Roztwór KREBS należy codziennie przygotowywać w stanie świeżym.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wykonać kaniule z mikroszkła o średnicy wewnętrznej 40 - 240 μm za pomocą dostępnego w handlu ściągacza do igieł/pipet. Wielkość kaniul szklanych zależy od wielkości wewnętrznej średnicy izolowanych naczyń krwionośnych (50-350 μm). Alternatywnie można zakupić kaniule z mikroszkła o ustalonym wcześniej rozmiarze.</li>
</ol>
2. Przygotowanie odczynników
<ol>
	<li>Przygotować acetylocholinę (Ach, 10-2 M, roztwór podstawowy). Rozpuścić 18,29 g w 10 ml wody dejonizowanej. Przechowywać 1 ml porcji roztworu podstawowego (10-2 M) w temperaturze -80 °C. W dniu doświadczenia rozcieńczyć seryjnie do uzyskania następujących stężeń roboczych: 10-5, 10-6, 10-7,10-8, 10-9 M.</li>
	<li>Przygotuj papawerynę (2 x 10-2 M, roztwór podstawowy). Rozpuścić 0,07517 g w 10 ml wody dejonizowanej. Przygotować 10 μl podwielokrotności roztworu podstawowego i przechowywać w temperaturze -80 °C. Seryjnie rozcieńczyć do uzyskania 10-4, 10-5, 10-6, 10-7, 10-8 M w dniu doświadczenia.</li>
	<li>Przygotuj endotelinę-1 (ET-1, 2 x 10-5 M, roztwór podstawowy). Rozpuścić 50 μg endoteliny-1 w 1 ml 1% BSA/PBS. Przechowywać 1 ml podwielokrotności roztworu podstawowego (2 x 10-5 M) w temperaturze -80 °C. W dniu doświadczenia rozcieńczyć do uzyskania stężenia roboczego 10-10M w dniu doświadczenia.</li>
	<li>Odczynniki należy przechowywać w temperaturze od -20 °C do -80 °C, w zależności od rodzaju dostępnej zamrażarki, ale nie dłużej niż 6 miesięcy.</li>
</ol>
3. Pobieranie tkanki tłuszczowej i przygotowanie naczyń
<ol>
	<li>Rekrutacja otyłych mężczyzn i kobiet (wskaźnik masy ciała (BMI) ≥ 35 kg/m², wiek ≥18 lat) zapisanych na program chirurgii bariatrycznej w Boston Medical Center (BMC). W sumie w eksperymentach tych wzięło udział 40 osób.</li>
	<li>Pobieranie próbek tkanki tłuszczowej podskórnej i trzewnej podczas planowanych operacji bariatrycznych przez chirurga wykonującego operację.
	<ol>
		<li>Zbierz podskórną tkankę tłuszczową odpowiednio z dolnej ściany brzucha i tłuszcz trzewny z sieci większej. Typowa wielkość próbki tkanki tłuszczowej waha się od 3 do 10 mg tkanki.</li>
		<li>Natychmiast umieścić tkanki w zimnym roztworze buforowym HEPES o pH 7,4 i przechowywać w temperaturze 4 °C do 24 godzin 
		UWAGA: Dodatkowo, tętniczki tłuszczowe można uzyskać od osób szczupłych, a także podczas innych rodzajów operacji, takich jak naprawa przepukliny lub chirurgia plastyczna, a także można je wykonać biopsję z depochody podskórnej za pomocą przezskórnej biopsji poduszeczki tłuszczowej jamy brzusznej6.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Za pomocą mikroskopu do wycinki tkanek, mikronożyczek i mikrokleszczyków ostrożnie usuń otaczający tłuszcz i tkankę łączną z małych tętniczek tłuszczowych (50 - 350 μm średnicy śródświetlnej, 2 - 3 mm długości).</li>
	<li>Zwiąż wszystkie gałęzie na tętniczkach za pomocą maleńkich nylonowych lub jedwabnych szwów przed kaniulacją na szklanych pipetach kapilarnych. Ostrożnie wypreparuj tętniczki, ponieważ nawet niewielkie uszkodzenie ściany tętniczki powoduje znaczne zmiany funkcjonalne.
	<ol>
		<li>Zminimalizuj narażenie naczyń na światło i ciepło, ponieważ może to spowodować rozszerzenie naczyń krwionośnych. Ponieważ czasami może być trudno odróżnić tętniczki od żyłek, zidentyfikuj rozmiar i napięcie mięśni gładkich naczyń, ściskając końcówki naczyń. Tętniczki są zwykle mniejsze i wykazują większy ton w porównaniu z żyłkami.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotuj komorę organową. Powoli napełnij szklane pipety kapilarne i gumowe rurki roztworem KREBS za pomocą strzykawki o pojemności 10 ml.</li>
	<li>Po napełnieniu gumowej rurki i zanurzeniu szklanych pipet kapilarnych w roztworze KREBS w komorze narządu, należy bezpiecznie naciąć tętniczki na zabezpieczonych pipetach i ostrożnie związać oba końce tętniczki węzłami szwów nylonowych lub jedwabnych.</li>
	<li>Napełnić komorę narządową roztworem KREBS do objętości 2 ml.</li>
	<li>Przymocuj komorę organową do sceny za pomocą odwróconego mikroskopu (obiektyw o powiększeniu 10x/0,25) i kamery wideo.</li>
	<li>Włącz oprogramowanie do wykrywania krawędzi, które jest przesyłane strumieniowo w czasie rzeczywistym z częstotliwością próbkowania 1 kHz (1 klatka/s).</li>
	<li>Podłącz jedną stronę rurki pod ciśnieniem do zbiorników ciśnieniowych wypełnionych roztworem KREBS wolnych od mikropęcherzyków, ponieważ pęcherzyki mogą powodować błąd eksperymentalny. Podłącz drugą stronę rurki pod ciśnieniem do komory organowej.</li>
	<li>Podłącz zbiorniki ciśnieniowe wypełnione roztworem KREBS do przetwornika ciśnienia za pomocą czystego przewodu.</li>
	<li>Kontroluj przepływ wewnątrz światła poprzez regulację wysokości tych dwóch zbiorników; w ten sposób, gdy zbiorniki są umieszczone na tej samej wysokości, nie wystąpi przepływ wewnątrz światła.</li>
	<li>Po zakończeniu wszystkich tych procesów włącz blok grzewczy i oprogramowanie, aby utrzymać temperaturę na poziomie 37 °C. Nieustannie perfundować naczynie roztworem KREBS i napowietrzać mieszaniną gazów o stężeniach 5% CO2, 21% O2 i 74% N2 7,8 przez cały czas trwania procedury doświadczalnej.</li>
	<li>Aby osiągnąć pożądane ciśnienie wewnątrz światła izolowanych naczyń, stopniowo zwiększaj ciśnienie śródświetlne (5 mmHg, co 5 minut) za pomocą jednostki sterującej ciśnieniem w panelu interfejsu myo, robiąc to powoli, aby uniknąć uszkodzenia warstwy śródbłonka. 
	UWAGA: Gdy ciśnienie osiągnie 60 mmHg, wymagany jest 20-30 minutowy okres równowagi, aby ustabilizować naczynie. Wszystkie badania funkcji naczyń krwionośnych przeprowadza się przy 60 mmHg i 37 °C przy pH 7,4. 7</li>
</ol>
4. Ocena funkcji mikrokrążenia tłuszczowego
UWAGA: Ogólnie rzecz biorąc, rozszerzenie naczyń krwionośnych tętniczki tłuszczowej zależne od śródbłonka może być wywołane w odpowiedzi na bodźce fizjologiczne (wywołane przepływem) i farmakologiczne (wywołane przez Ach).
<ol>
	<li>Zależne od przepływu, zależne od śródbłonka rozszerzenie naczyń krwionośnych
	<ol>
		<li>Po zwiększeniu ciśnienia zapisz średnicę tętniczki tłuszczowej w spoczynku (Di). Nazywa się to spoczynkową średnicą linii podstawowej.</li>
		<li>Wstępnie zwęź naczynia krwionośne do ~55% spoczynkowej średnicy podstawowej (Dp), dodając 1 μl endoteliny-1 (ET-1, 10−10 M) bezpośrednio do kąpieli i odczekaj 5 minut na efekt. Powtarzaj ten proces, aż osiągniesz pożądany ~55% stan wstępnie zwężony.</li>
		<li>Po wstępnym zwężeniu indukować ciągły przepływ do przestrzeni śródświetlnej tętniczek tkanki tłuszczowej, w równych i przeciwnych kierunkach, tak aby można było wytworzyć różnicę ciśnień w całym naczyniu bez zmiany średniego ciśnienia śródświetlnego wynoszącego 60 mmHg. 
		UWAGA: Na przykład, jeśli jeden zbiornik przesunie się o 10 cm wysokości, drugi musi zostać przesunięty w dół o 10 cm, aby zmienić gradienty ciśnienia, a tym samym zmienić natężenie przepływu w świetle wewnętrznym. Jeśli pożądane są dokładniejsze pomiary natężenia przepływu, w konfiguracji eksperymentalnej można zastosować ilościowy system przepływomierzy.</li>
		<li>Zmierzyć dylatację za pośrednictwem przepływu 3 - 5 minut po rozpoczęciu indukcji przepływu. Poziomy przepływu śródświetlnego (gradienty ciśnienia) mogą mieścić się w zakresie 0 - 100 cmH2O. Zwiększaj każdy przyrost gradientu ciśnienia o Δ10 cmH2O co 5-6 minut, aż do maksymalnie 100 cmH2O. 
		UWAGA: Aby wywołać stabilny przepływ laminarny w świetle, oba rozmiary końcówek kaniuli mikroszklanych muszą być bardzo zbliżone do wewnętrznej średnicy tętniczek; W przeciwnym razie spowoduje to turbulentny przepływ wewnątrz światła i wywoła niepożądane błędy pomiaru.</li>
		<li>Po ocenie dylatacji za pośrednictwem przepływu, zbiorniki ciśnieniowe powinny powrócić do tej samej wysokości (60 mmHg).</li>
		<li>Następnie przemyć tętniczkę i komorę, natychmiast wyjmując roztwór z komory i zastąpić świeżym roztworem KREBS. Odbywa się to z ostrożnością, aby nie zakłócić zawieszonej tętniczki w komorze.</li>
		<li>Powtórz ten proces 3 - 4 razy przez 20 - 30 minut lub do momentu, gdy izolowane naczynie powróci do spoczynkowej średnicy linii podstawowej.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Acetylocholina, zależna od śródbłonka, rozszerzenie naczyń krwionośnych
	<ol>
		<li>Gdy tętniczka tłuszczowa powróci do spoczynkowej średnicy podstawowej, należy wstępnie zwęzić naczynie ~55%, podając endotelinę-1 (ET-1, 10−10 M) bezpośrednio do kąpieli, jak opisano powyżej w sekcji 4.1.2.</li>
		<li>Po wstępnym zwężeniu należy kolejno podawać rosnące dawki (2 μl) acetylocholiny, która jest agonistą tlenku azotu za pośrednictwem receptora (Ach, 10-9 do 10-5 M) bezpośrednio do kąpieli. Należy odnotować zmianę średnicy tętniczki po 5 minutach od podania każdej dawki.</li>
		<li>Gdy naczynie osiągnie plateau po podaniu ostatniej dawki Ach, należy przemyć naczynie 3 - 4 razy roztworem KREBS. Odczekać 20 - 30 minut, aż naczynie się zregeneruje i powróci do spoczynkowej średnicy podstawowej. Aby pomóc w utrzymaniu pH w narządzie, należy zmieniać roztwór KREBS co 15 minut.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Inkubować tętniczkę z estrem metylowym N w-nitro-l-argininy (L-NAME, 10-4 M), inhibitorem syntazy tlenku azotu przez 30 minut, a następnie powtórzyć 4.2.1 i 4.2.2 w celu scharakteryzowania względnego udziału tlenku azotu w rozszerzeniu naczyń krwionośnych za pośrednictwem Ach.</li>
	<li>Ocenić niezależne od śródbłonka rozszerzenie naczyń krwionośnych (funkcja mięśni gładkich naczyń krwionośnych) i żywotność naczyń poprzez sekwencyjne podawanie rosnących dawek papaweryny (10-8 do 10-4 M) bezpośrednio do kąpieli. Jeśli średnica naczynia nie powraca do spoczynkowej średnicy podstawowej (Di) lub jej nie przekracza w odpowiedzi na papawerynę (tj. odpowiednie rozszerzenie naczyń krwionośnych), należy uznać naczynie za niezdolne do życia i odrzucić punkty danych.</li>
</ol>
5. Analiza danych i obliczenia
<ol>
	<li>Oblicz reaktywność naczyniową. Użyj procentowego rozszerzenia naczyń krwionośnych dla wyrażenia danych, aby uwzględnić podstawowe różnice w średnicy naczynia i oblicz przy użyciu następującego równania: 
	% rozszerzenia naczyń krwionośnych = (DT-Dp/Di-Dp) ×100 
	gdzie DT jest zarejestrowaną średnicą w danym punkcie czasowym (średnica maksymalna), Dp jest średnicą zarejestrowaną po dodaniu środka zwężającego naczynia krwionośne (tj. Średnica zwężenia indukowanego ET-1), a Di jest średnicą zarejestrowaną bezpośrednio przed dodaniem środka zwężającego naczynia krwionośne (spoczynkowa średnica wyjściowa). 9</li>
	<li>Zdefiniuj rozszerzenie naczyń krwionośnych i wrażliwość na zwężenie naczyń krwionośnych (dawka-odpowiedź) na agonistę jako stężenie Ach, papaweryny lub ET-1, które wywołuje 50% maksymalnej odpowiedzi (EC50), którą można zdefiniować za pomocą parametru sigmoidalnego i wykreślić, jak opisano wcześniej. 10 
	UWAGA: Badania odtwarzalności między obserwatorami rozszerzenia naczyń krwionośnych mikronaczyń tłuszczowych mają wysoki współczynnik korelacji (CC) wynoszący 0,99 (n = 10 eksperymentów naczyniowych) w naszym laboratorium.</li>
</ol>
6. Analiza statystyczna
<ol>
	<li>Wyrażaj pomiary ciągłe jako średnią ± SEM. Mają one tendencję do normalnego rozkładu. Analizuj reaktywność naczyniową w tętniczkach tłuszczowych za pomocą dwukierunkowej ANOVA z powtarzanymi pomiarami.</li>
	<li>Alternatywnie, należy porównać pole pod krzywą (AUC) wykresu dla skumulowanego rozszerzenia naczyń krwionośnych z odpowiedziami na dawkę między grupami leczonymi. We wszystkich przypadkach należy wziąć pod uwagę, że P <0,05 jest statystycznie istotne.</li>
</ol>

<ol><li>Schubert, R., Mulvany, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+myogenic+response%3A+established+facts+and+attractive+hypotheses%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Sci+%28Lond%29%22%5BJournal%5D)">The myogenic response: established facts and attractive hypotheses.</a> Clin Sci (Lond). 96 (4), 313-326 (1999).</li>
<li>Jadeja, R. N., Rachakonda, V., Bagi, Z., Khurana, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessing+Myogenic+Response+and+Vasoactivity+In+Resistance+Mesenteric+Arteries+Using+Pressure+Myography%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Assessing Myogenic Response and Vasoactivity In Resistance Mesenteric Arteries Using Pressure Myography.</a> J Vis Exp. (101), e50997(2015).</li>
<li>Gutterman, D. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Human+Microcirculation%3A+Regulation+of+Flow+and+Beyond%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">The Human Microcirculation: Regulation of Flow and Beyond.</a> Circ Res. 118 (1), 157-172 (2016).</li>
<li>Fuster, J. J., Ouchi, N., Gokce, N., Walsh, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Obesity-Induced+Changes+in+Adipose+Tissue+Microenvironment+and+Their+Impact+on+Cardiovascular+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Obesity-Induced Changes in Adipose Tissue Microenvironment and Their Impact on Cardiovascular Disease.</a> Circ Res. 118 (11), 1786-1807 (2016).</li>
<li>Farb, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reduced+adipose+tissue+inflammation+represents+an+intermediate+cardiometabolic+phenotype+in+obesity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Coll+Cardiol%22%5BJournal%5D)">Reduced adipose tissue inflammation represents an intermediate cardiometabolic phenotype in obesity.</a> J Am Coll Cardiol. 58 (3), 232-237 (2011).</li>
<li>Farb, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((WNT5A-JNK+regulation+of+vascular+insulin+resistance+in+human+obesity%5BTitle%5D)+AND+%22Vasc+Med%22%5BJournal%5D)">WNT5A-JNK regulation of vascular insulin resistance in human obesity.</a> Vasc Med. 21 (6), 489-496 (2016).</li>
<li>Durand, M. J., Phillips, S. A., Widlansky, M. E., Otterson, M. F., Gutterman, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+vascular+renin-angiotensin+system+contributes+to+blunted+vasodilation+induced+by+transient+high+pressure+in+human+adipose+microvessels%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Heart+Circ+Physiol%22%5BJournal%5D)">The vascular renin-angiotensin system contributes to blunted vasodilation induced by transient high pressure in human adipose microvessels.</a> Am J Physiol Heart Circ Physiol. 307 (1), H25-H32 (2014).</li>
<li>Farb, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cyclooxygenase+inhibition+improves+endothelial+vasomotor+dysfunction+of+visceral+adipose+arterioles+in+human+obesity%5BTitle%5D)+AND+%22Obesity+%28Silver+Spring%29%22%5BJournal%5D)">Cyclooxygenase inhibition improves endothelial vasomotor dysfunction of visceral adipose arterioles in human obesity.</a> Obesity (Silver Spring). 22 (2), 349-355 (2014).</li>
<li>Park, S. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+age+on+the+vasodilatory+function+of+human+skeletal+muscle+feed+arteries%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Heart+Circ+Physiol%22%5BJournal%5D)">Impact of age on the vasodilatory function of human skeletal muscle feed arteries.</a> Am J Physiol Heart Circ Physiol. 310 (2), H217-H225 (2016).</li>
<li>Ives, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+skeletal+muscle+feed+arteries+studied+in+vitro%3A+the+effect+of+temperature+on+alpha%281%29-adrenergic+responsiveness%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Physiol%22%5BJournal%5D)">Human skeletal muscle feed arteries studied in vitro: the effect of temperature on alpha(1)-adrenergic responsiveness.</a> Exp Physiol. 96 (9), 907-918 (2011).</li>
<li>Grizelj, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reduced+flow-and+acetylcholine-induced+dilations+in+visceral+compared+to+subcutaneous+adipose+arterioles+in+human+morbid+obesity%5BTitle%5D)+AND+%22Microcirculation%22%5BJournal%5D)">Reduced flow-and acetylcholine-induced dilations in visceral compared to subcutaneous adipose arterioles in human morbid obesity.</a> Microcirculation. 22 (1), 44-53 (2015).</li>
<li>Farb, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arteriolar+function+in+visceral+adipose+tissue+is+impaired+in+human+obesity%5BTitle%5D)+AND+%22Arterioscler+Thromb+Vasc+Biol%22%5BJournal%5D)">Arteriolar function in visceral adipose tissue is impaired in human obesity.</a> Arterioscler Thromb Vasc Biol. 32 (2), 467-473 (2012).</li>
<li>Tanner, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamin-Related+Protein+1+Mediates+Low+Glucose-Induced+Endothelial+Dysfunction+in+Human+Arterioles%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Heart+Circ+Physiol%22%5BJournal%5D)">Dynamin-Related Protein 1 Mediates Low Glucose-Induced Endothelial Dysfunction in Human Arterioles.</a> Am J Physiol Heart Circ Physiol. , (2016).</li>
<li>Ives, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((alpha1-Adrenergic+responsiveness+in+human+skeletal+muscle+feed+arteries%3A+the+impact+of+reducing+extracellular+pH%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Physiol%22%5BJournal%5D)">alpha1-Adrenergic responsiveness in human skeletal muscle feed arteries: the impact of reducing extracellular pH.</a> Exp Physiol. 98 (1), 256-267 (2013).</li>
<li>Dharmashankar, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nitric+oxide+synthase-dependent+vasodilation+of+human+subcutaneous+arterioles+correlates+with+noninvasive+measurements+of+endothelial+function%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Hypertens%22%5BJournal%5D)">Nitric oxide synthase-dependent vasodilation of human subcutaneous arterioles correlates with noninvasive measurements of endothelial function.</a> Am J Hypertens. 25 (5), 528-534 (2012).</li>
<li>Truran, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adipose+and+leptomeningeal+arteriole+endothelial+dysfunction+induced+by+beta-amyloid+peptide%3A+a+practical+human+model+to+study+Alzheimer%27s+disease+vasculopathy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">Adipose and leptomeningeal arteriole endothelial dysfunction induced by beta-amyloid peptide: a practical human model to study Alzheimer's disease vasculopathy.</a> J Neurosci Methods. 235, 123-129 (2014).</li>
<li>Karki, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Forkhead+box+O-1+modulation+improves+endothelial+insulin+resistance+in+human+obesity%5BTitle%5D)+AND+%22Arterioscler+Thromb+Vasc+Biol%22%5BJournal%5D)">Forkhead box O-1 modulation improves endothelial insulin resistance in human obesity.</a> Arterioscler Thromb Vasc Biol. 35 (6), 1498-1506 (2015).</li>
<li>Shahid, M., Buys, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessing+murine+resistance+artery+function+using+pressure+myography%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Assessing murine resistance artery function using pressure myography.</a> J Vis Exp. (76), (2013).</li>
</ol>

Autorzy nie mają żadnych ujawnień ani konfliktów interesów, które muszą zgłaszać.

Wypreparowanie i odizolowanie tętniczek tłuszczowych od otaczających tkanek może być czasochłonnym i pracochłonnym procesem, wymaganym ze szczególną dbałością o szczegóły i protokołem technicznym. Procedura mikrodysekcji wymaga skrupulatnych umiejętności i specjalistycznych przyborów preparacyjnych, aby zapobiec potencjalnemu uszkodzeniu warstw mięśni gładkich lub komórek śródbłonka mikrokrążenia. Nawet drobne przypadkowe nakłucia w ścianie tętniczki mogą zapobiec wzrostowi ciśnienia w świetle i skutkować nieudanym ekspe...

Wideomikroskopia jest użyteczną techniką wykorzystywaną do badania funkcji naczyniomotorycznych małych tętniczek pobranych od żywych ludzi ex vivo. Nasze laboratorium skupiło się na wypreparowaniu maleńkich mikronaczyń z różnych przedziałów tkanki tłuszczowej, aby scharakteryzować wpływ różnych mikrośrodowisk tłuszczowych na mikrokrążenie. Główną zaletą tej techniki jest to, że naczynia krwionośne usunięte z ludzkiego ciała pozostają funkcjonalne i można je łatwo zbadać w ciągu kilku minut do godzin po biopsji. Warunki fizjologiczne są naśladowane, a stałe ciśnienie przezścienne utrzymywane w przestrzeni śródświetlnej za pomocą kaniul mikroszklanych, które podsumowują wiele cech in vivo. 1,2 Dodatkowo, niezawodna konfiguracja wideomikroskopii z automatycznym oprogramowaniem do wykrywania krawędzi pozwala na jakościową i ilościową ocenę zdolności izolowanych naczyń krwionośnych i rozszerzonych i zwężających naczynia krwionośne zależnych od śródbłonka i niezależnych od nich, umożliwiając szybką ocenę fizjologiczną w odpowiedzi na bodźce fizyczne i farmakologiczne. 3 Dostępne są również inne techniki mikrokrążenia, takie jak miografia drutowa, która zwykle jest mniej czasochłonna i mierzy reakcje napięcia na różnych agonistów za pomocą przetwornika siły.
Nasze laboratorium zastosowało wideomikroskopię do zbadania związku między otyłością a dysfunkcją naczyń krwionośnych, skupiając się na wpływie różnych domen tkanki tłuszczowej na układ naczyniowy. Centralna otyłość z nagromadzeniem tłuszczu trzewnego w jamie brzusznej jest najściślej związana z produkcją adipocytokin, dysfunkcją metaboliczną i ryzykiem kardiometabolicznym. Postuluje się, że dysfunkcja tkanki tłuszczowej z nadmierną produkcją cytokin proaterogennych i dysregulacją adipokiny są silnie zaangażowane w te procesy, ale specyficzne cząsteczki regulatorowe i cele leczenia pozostają w dużej mierze nieodkryte. 4 Ponadto, na poziomie lokalnej tkanki tłuszczowej, rozrzedzenie naczyń włosowatych i upośledzona perfuzja zostały powiązane z pseudoniedotlenieniem tkanki tłuszczowej i dysregulacją metaboliczną. Hipoteza, że choroby układu krążenia mogą być konsekwencją dysfunkcji tkanki tłuszczowej, ewoluuje. Mediatory proaterogenne uwalniane z tłuszczu, szczególnie w związku z otyłością centralną/trzewną, prawdopodobnie sprzyjają dysfunkcji śródbłonka i patogennym zmianom naczyniowym, które mogą objawiać się miejscowo w układzie tłuszczowym i być wykrywane przy użyciu opisanej tu metodologii. 5
Ocena funkcjonalna izolowanych tętniczek tkanki tłuszczowej jest użytecznym podejściem do zrozumienia patofizjologii i mechanizmów molekularnych, które przyczyniają się do dysfunkcji naczyń w ludzkiej otyłości. Aby zbadać mechanizmy, które przyczyniają się do dysfunkcji specyficznej dla odkładania się tłuszczu, opracowaliśmy metody badania zależnych i niezależnych od śródbłonka odpowiedzi rozszerzających naczynia krwionośne mikrokrążenia oraz oceny ekspresji różnych kandydatów regulatorowych w sparowanych trzewnych i podskórnych (SC) próbkach tkanki tłuszczowej uzyskanych od osób otyłych w czasie operacji bariatrycznej.

<table><tbody><tr><td>Nazwa chemiczna</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Acetylcholina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A6625</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek wapnia (CaCl2)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>223506</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-Glukoza</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G5767</td><td></td></tr><tr><td>Endotelina-1</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E7764</td><td></td></tr><tr><td>Glikol etylenowy-bis(2-aminoetyloeter)-N,N,N',N'-tetraoctowy kwas (EGTA)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E3889</td><td></td></tr><tr><td>Kwas etylenodiaminotetraoctowy (EDTA)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E9884</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H3784</td><td></td></tr><tr><td>Nw-nito-L-arginina chlorowodorek estru metylowego</td><td>Sigma Aldrich</td><td>N5751</td><td></td></tr><tr><td>Siarczan magnezu (MgSO4)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M7506</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek potasu (KCL)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P3911</td><td></td></tr><tr><td>Fosforan potasu (KH2PO4)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P5655</td><td></td></tr><tr><td>Papaverine</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P3510</td><td></td></tr><tr><td>Wodorowęglan sodu (NaHCO 3 )</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S6014</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek sodu (NaCl)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>Fosforan sodu jednozasadowy jednowodny (NaH2Po4)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S9638</td><td></td></tr><tr><td>Nazwa</td><td>Firma</td><td>Numer katalogowy</td><td>Komentarze</td></tr><tr><td><mocny>Sprzęt</mocny></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kleszcze</td><td>Narzędzia Finescience</td><td>15000-08</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop odwrócony</td><td>Zeiss Achromat</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rurki laboratoryjne</td><td>Euro-Pharm</td><td>250100306F999</td><td></td></tr><tr><td>Ściągacz do igieł/pipet</td><td>David kopf instruments</td><td>720</td><td></td></tr><tr><td>Okulistyczny monofilamentowy szew nylonowy</td><td>Specjalizacje chirurgiczne</td><td>A7756N</td><td></td></tr><tr><td>Nożyczki</td><td>Narzędzia Finescience</td><td>150000-08</td><td></td></tr><tr><td>Komora naczyń</td><td>DMT</td><td>VAS v.2.1</td><td></td></tr></tbody></table>

ocena funkcji mikrokrążenia tkanki tłuszczowej człowieka za pomocą wideomikroskopii

Assessment of Human Adipose Tissue Microvascular Function Using Videomicroscopy

Chociaż otyłość jest ściśle związana z rozwojem chorób metabolicznych i sercowo-naczyniowych, niewiele wiadomo o mechanizmach rządzących tymi procesami. Przypuszcza się, że mediatory proaterogenne uwalniane z tkanki tłuszczowej, szczególnie w związku z otyłością centralną/trzewną, mogą lokalnie i ogólnoustrojowo sprzyjać patogennym zmianom naczyniowym, a pogląd, że choroba sercowo-naczyniowa może być konsekwencją dysfunkcji tkanki tłuszczowej, nadal ewoluuje. W tym miejscu opisujemy unikalną metodę wideomikroskopii, która obejmuje analizę reakcji rozszerzających i zwężających naczynia krwionośne nienaruszonych małych tętniczek ludzkich usuniętych z magazynu tłuszczowego żywych ludzi. Wideomikroskopia służy do badania właściwości funkcjonalnych izolowanych mikronaczyń w odpowiedzi na bodźce farmakologiczne lub fizjologiczne za pomocą systemu ciśnieniowego, który naśladuje warunki in vivo. Technika ta jest użytecznym podejściem do zrozumienia patofizjologii i mechanizmów molekularnych, które przyczyniają się do dysfunkcji naczyń krwionośnych lokalnie w środowisku tkanki tłuszczowej. Co więcej, nieprawidłowości w mikrokrążeniu tkanki tłuszczowej są również powiązane z chorobami ogólnoustrojowymi. Zastosowaliśmy tę technikę do zbadania specyficznych dla depot odpowiedzi naczyniowych u osób otyłych. Oceniliśmy zależne od śródbłonka rozszerzenie naczyń krwionośnych zarówno na zwiększony przepływ, jak i acetylocholinę w tętniczkach tłuszczowych (50 - 350 μm średnica wewnętrzna, 2 - 3 mm długości) wyizolowanych z dwóch różnych magazynów tłuszczowych podczas operacji bariatrycznej od tej samej osoby. Wykazaliśmy, że tętniczki z tłuszczu trzewnego wykazują upośledzone rozszerzenie naczyń krwionośnych zależne od śródbłonka w porównaniu z naczyniami wyizolowanymi z depot podskórnego. Wyniki sugerują, że mikrośrodowisko trzewne jest związane z dysfunkcją śródbłonka naczyń krwionośnych, co może być istotne dla obserwacji klinicznej łączącej zwiększoną otyłość trzewną z ogólnoustrojowymi mechanizmami chorobowymi. Technika wideomikroskopii może być wykorzystana do badania fenotypów naczyniowych z różnych magazynów tłuszczu, a także do porównywania wyników u osób z różnym stopniem otyłości i dysfunkcją metaboliczną. Metoda może być również stosowana do badania podłużnych odpowiedzi naczyniowych w odpowiedzi na interwencje kliniczne.

W naszym laboratorium wykorzystano wideomikroskopię do badania rozszerzania naczyń zależnego i niezależnego od śródbłonka, a także funkcji skurczowej tętniczek tkanki tłuszczowej wyizolowanych z tłuszczu podskórnego i trzewnego osób otyłych. Charakterystyczny układ doświadczalny przedstawiono na Ryc. 1A. Tętniczki tkanki tłuszczowej są zawieszone między dwiema szklanymi pipetami kapilarnymi i przymocowane szwami w komorze organowej, jak pokazano na <strong cl...

Systemy videomikroskopii służą do badania funkcjonalnych właściwości izolowanych tętniczek tkanki tłuszczowej w odpowiedzi na bodźce fizjologiczne i farmakologiczne. Technika ta może być stosowana do badania fenotypów mikronaczyniowych w różnych domenach tkanki tłuszczowej u otyłych ludzi.

Ocena funkcji mikrokrążenia tkanki tłuszczowej człowieka za pomocą wideomikroskopii

While obesity is closely linked to the development of metabolic and cardiovascular disease, little is known about mechanisms that govern these processes. ...

Ogólnym celem tej techniki videomikroskopii jest badanie właściwości funkcjonalnych wyizolowanych mikronaczyń w odpowiedzi na bodźce farmakologiczne i fizjologiczne, co pozwala na poznanie patofizjologii i mechanizmów molekularnych przyczyniających się do dysfunkcji naczyniowej u ludzi. Metoda ta jest użyteczna w zrozumieniu mechanizmów molekularnych prowadzących do dysfunkcji lokalnego mikrokrążenia w tkance tłuszczowej, co wiąże się z chorobami ogólnoustrojowymi. Głównymi zaletami tej techniki są fakt, że naczynia krwionośne pozostają funkcjonalne przez pewien czas po usunięciu z organizmu człowieka oraz łatwość badania ich właściwości fizjologicznych.Znaczenie kliniczne tego podejścia eksperymentalnego polega na tym, że pozwala ono zidentyfikować szlaki, które ulegają różnicowym zmianom w stanach chorobowych, oraz potencjalnie odkryć nowe cele terapeutyczne. Pod stereomikroskopem, używając mikronożyczek i mikro pęsety, ostrożnie usuń otaczający tłuszcz i tkankę łączną z małych tętniczek w próbce tkanki tłuszczowej. Niezbędne jest odróżnienie tętniczek od żyłek.Tętniczki mają zazwyczaj mniejszą średnicę, wykazują większy tonus i reagują silniej niż żyłki. Po wyizolowaniu tętniczk

assessment-human-adipose-tissue-microvascular-function-using

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Kapilaroskopia to nieinwazyjna, stosunkowo tania metoda bezpośredniej wizualizacji mikrokrążenia. Technika przepływu krwi w przedramieniu zapewnia akceptowane nieinwazyjne pomiary funkcji śródbłonka.

Nieinwazyjna ocena funkcji mikrokrążenia i śródbłonka

Mikroskopia przyżyciowe może być używana u zwierząt do wizualizacji i pomiaru średnic naczyń krwionośnych siatkówki, prędkości przepływu krwi i całkowitego przepływu krwi w siatkówce.

Przyżyciowe pomiary wideomikroskopii przepływu krwi w siatkówce u myszy

Niniejszy artykuł opisuje metodologiczne rozważania dotyczące kilku nieinwazyjnych ocen funkcji i morfologii naczyń krwionośnych, które są powszechnie stosowane w badaniach medycznych do oceny różnych etapów miażdżycy.

Metodologiczne podejście do nieinwazyjnej oceny funkcji i morfologii naczyń krwionośnych

Wywołane insuliną rozszerzenie naczyń krwionośnych reguluje perfuzję mięśni i zwiększa powierzchnię mikrokrążenia (rekrutację mikronaczyniową) dostępną do wymiany substancji rozpuszczonej między krwią a śródmiąższem tkankowym. Przedstawiono połączoną mikroskopię przyżyciową i ultrasonografię ze wzmocnieniem kontrastowym w celu jednoczesnej oceny działania insuliny na większe naczynia i mikrokrążenie in vivo.

Połączona mikroskopia przyżyciowa i ultrasonografia tylna myszy ze wzmocnieniem kontrastowym w celu zbadania rozszerzenia naczyń krwionośnych i perfuzji mięśni wywołanego insuliną

Ze względu na wysoką zawartość lipidów, tkanka tłuszczowa była trudna do wizualizacji przy użyciu tradycyjnych metod histologicznych. Adipo-Clear to technika oczyszczania tkanek, która umożliwia solidne znakowanie i wolumetryczne obrazowanie fluorescencyjne tkanki tłuszczowej w wysokiej rozdzielczości. W tym miejscu opisano metody przygotowania próbki, obróbki wstępnej, barwienia, czyszczenia i montażu do obrazowania.

Adipo-Clear: metoda oczyszczania tkanek do trójwymiarowego obrazowania tkanki tłuszczowej

Przedmiotem niniejszego badania jest zademonstrowanie techniki barwienia immunologicznego i wizualizacji jako idealnej metody do obrazowania 3D architektury tkanki tłuszczowej i komponentu komórkowego.

Wizualizacja struktury 3D białej tkanki tłuszczowej za pomocą barwienia całościowego

Tworzenie nowych naczyń krwionośnych i unerwienie współczulne odgrywają kluczową rolę w przebudowie tkanki tłuszczowej. Pozostają jednak kwestie techniczne związane z wizualizacją i ilościowym pomiarem tkanki tłuszczowej. Poniżej przedstawiamy protokół, który pozwala skutecznie oznaczyć i ilościowo porównać gęstości naczyń krwionośnych i włókien nerwowych w różnych tkankach tłuszczowych.

Współbarwienie naczyń krwionośnych i włókien nerwowych w tkance tłuszczowej

Protokół opisuje użycie miografii drucianej do oceny przezściennego napięcia izometrycznego tętnic krezkowych wyizolowanych od myszy, ze szczególnym uwzględnieniem modulacji przez czynniki uwalniane z komórek śródbłonka i okołonaczyniowej tkanki tłuszczowej.

Ocena reakcji na napięcie naczyniowe przy użyciu izolowanych tętnic krezkowych z naciskiem na modulację przez okołonaczyniowe tkanki tłuszczowe

Tutaj prezentujemy szczegółowy protokół opisujący wykorzystanie fragmentów mikronaczyniowych wyizolowanych z gryzoni lub ludzkiej tkanki tłuszczowej jako prostego podejścia do inżynierii funkcjonalnej, unaczynionej beżowej tkanki tłuszczowej.

Trójwymiarowa hodowla unaczynionej termogenicznej tkanki tłuszczowej z fragmentów mikronaczyniowych

Tutaj opisujemy protokół izolacji, hodowli i fenotypowania mikronaczyniowych komórek śródbłonka z ludzkiej podskórnej tkanki tłuszczowej (hSATMVECs). Dodatkowo opisujemy eksperymentalny model wzajemnego przenikania się hSATMVEC-adipocytów.

Badanie wzajemnych oddziaływań komórek śródbłonka tkanki tłuszczowej i adipocytów w ludzkiej podskórnej tkance tłuszczowej

Poznaj technikę wideomikroskopii do badania funkcji mikrokrążenia w tkance tłuszczowej człowieka. Ta metoda pozwala analizować właściwości fizjologiczne izolowanych naczyń krwionośnych i identyfikować zmienione szlaki w chorobach.

Ocena funkcji mikrokrążenia tkanki tłuszczowej człowieka za pomocą wideomikroskopii

Przeglądaj więcej filmów