Wizualizacja struktury 3D białej tkanki tłuszczowej za pomocą barwienia całościowego

Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie biologii tkanki tłuszczowej, takie jak to, jak interakcje międzykomórkowe i fizjologia tkanki tłuszczowej zmieniają się w różnych warunkach metabolicznych, takich jak post i otyłość. Główną zaletą tej techniki jest to, że optymalnie zachowuje oryginalną strukturę tłuszczu 3D i pozwala uniknąć długich etapów przetwarzania, które są zwykle wymagane w konwencjonalnej immunohistochemii. Chociaż metoda ta może zapewnić wgląd w strukturę tkanki tłuszczowej, może być również stosowana do innych układów narządów, takich jak układ nerwowy, poprzez barwienie mózgu w całości.

Ogólnie rzecz biorąc, osoby, które są nowe w tej metodzie, będą miały trudności z uzyskaniem właściwych miejsc tkankowych, znalezieniem odpowiedniego okresu wiązania i optymalnych stężeń przeciwciał. Po zakończeniu sekcji przenieś naczynie zawierające próbki tkanek w 1% paraformaldehydzie z lodu do temperatury pokojowej na jedną godzinę. Następnie przenieś tkanki na 12- lub 24-dołkową płytkę do hodowli komórkowej w celu szybszego umycia.

Ważne jest, aby pamiętać, że procedura barwienia całego mocowania musi rozpocząć się natychmiast po sekcji i że nie ma punktów przerwy między każdym krokiem. Chusteczki myć PBS-0,3T na wytrząsarce przechylonej pod kątem 22 stopni z prędkością od 20 do 25 przechyleń na minutę w temperaturze pokojowej przez pięć minut. Powtórz to pranie jeszcze dwa razy.

Następnie dodać około 0,5 do jednego mililitra buforu blokującego zawierającego 5% surowicy zwierzęcej. Inkubować płytkę na wytrząsarce, stosując poprzednie warunki przez jedną godzinę. Odessać roztwór blokujący i dodać mililitr przeciwciał pierwszorzędowych rozcieńczonych w PBS-0,3T z 1% surowicą zwierzęcą do każdej studzienki.

Inkubować płytkę przez noc na wytrząsarce w temperaturze czterech stopni Celsjusza z nachyleniem 22 stopni i prędkością od 20 do 25 przechyleń na minutę. Następnego dnia użyj PBS-0,3T do mycia chusteczek w temperaturze pokojowej przez pięć minut. Powtórz to pranie jeszcze dwa razy.

Następnie dodaj od 0,5 do jednego mililitra odpowiednich i rozcieńczonych roztworów przeciwciał drugorzędowych do każdej studzienki. Zawiń płytkę w folię aluminiową i inkubuj ją na shakerze w temperaturze pokojowej przez godzinę. Następnie umyj płytkę dwukrotnie PBS-0,3T w temperaturze pokojowej przez pięć minut na pranie.

Jeśli podczas barwienia neutralnym lipidem potrzebna jest wizualizacja kropelek cieczy, przemyj dwukrotnie 1x PBS, przy czym każde pranie trwa pięć minut. Dodaj neutralny barwnik lipidowy rozcieńczony w PBS i inkubuj w temperaturze pokojowej przez 30 minut. Aby rozpocząć obrazowanie, użyj kleszczyków, aby położyć tkankę płasko na szklanym szkiełku nakrywkowym o wymiarach 24 na 60 milimetrów.

Jeśli pożądane jest barwienie jąder za pomocą DAPI, dodaj jedną lub dwie krople podłoża montażowego zawierającego DAPI, aby całkowicie zanurzyć tkankę i zapobiec jej wyschnięciu. Następnie umieść szkiełko w systemie odwróconego konfokalnego mikroskopu laserowego. Aby uzyskać obrazy barwionej tkanki w całości w wielu płaszczyznach ogniskowych, wykonaj stosy Z o głębokości od 100 do 150 mikrometrów z krokiem o wielkości od czterech do sześciu mikrometrów przy żądanym powiększeniu.

W tym badaniu stosuje się barwienie całościowe w celu zachowania architektury tkanki tłuszczowej. W przeciwieństwie do metod, które obejmują wiele etapów przetwarzania i sekcji, które mogą prowadzić do zniekształcenia morfologii tkanki tłuszczowej, metoda barwienia całego mocowania może zachować morfologię adipocytów, zapewniając dokładność podczas interpretacji wyników. Nadmierna fiksacja tkanki tłuszczowej prowadzi do fluorescencji indukowanej utrwalaczem, na co może wskazywać nakładanie się identycznych obszarów, takich jak widoczne tutaj sygnały hydroksylazy tyrozynowej i PECAM-1.

Prawidłowo utrwalone, całościowe próbki plam wykazują jednak oddzielne i wyraźne sygnały, co wskazuje, że sygnały te nie są autofluorescencyjne. Obrazowanie całej zabarwionej tkanki tłuszczowej pozwala na ilościowe określenie zmian morfologicznych w różnych warunkach eksperymentalnych. W szczególności tkanka tłuszczowa jest silnie unaczyniona, co jest ważne w pośredniczeniu w homeostazie metabolicznej przy gwałtownych zmianach poziomu energii.

Na przykład czarne myszy C57 6J, które przechodzą 24-godzinny post, wykazują znacznie mniejszy rozmiar adipocytów, co wskazuje na lipolizę i tendencję do podwyższonej gęstości naczyń krwionośnych w porównaniu z myszami karmionymi w sposób ciągły. Oczyszczanie tkanki tłuszczowej za pomocą iDISCO+ sprawia, że tkanka tłuszczowa staje się optycznie przezroczysta. Znakowanie immunologiczne tkanki tłuszczowej, która przeszła oczyszczanie tkanki, wykazuje znacznie gęstszą arboryzację neuronalną w porównaniu do obserwowanej w barwieniu całej góry bez oczyszczania tkanki w tym samym powiększeniu.

Podczas próby wykonania tej procedury należy pamiętać, aby nie przesadzać z próbkami przez ponad godzinę w temperaturze pokojowej w PFA, w przeciwnym razie zwiększy to autofluorescencję tła. Okres utrwalenia może jednak zostać przedłużony, jeśli próbki zostaną utrwalone w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Po tej procedurze można przeprowadzić inne metody, takie jak kwantyfikacja za pomocą ImageJ, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, takie jak to, jak zmienia się architektura komórkowa, taka jak miejsca adipocytów i gęstość naczyń krwionośnych, w odpowiedzi na różne warunki fizjologiczne.