Analiza oddechu w czasie rzeczywistym przy użyciu wtórnej jonizacji nanoelektronizacyjnej sprzężonej ze spektrometrią mas o wysokiej rozdzielczości
9 marca 2018
Pokazano protokół charakteryzujący skład chemiczny wydychanego powietrza w czasie rzeczywistym za pomocą wtórnej jonizacji nanoelectrospray sprzężonej ze spektrometrią mas o wysokiej rozdzielczości.
Ogólnym celem tego eksperymentu jest scharakteryzowanie składu chemicznego wydychanego powietrza za pomocą wtórnej jonizacji nanoelektronrozpylania sprzężonej ze spektrometrią mas o wysokiej rozdzielczości. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie medycyny, takie jak wczesna diagnoza chorób, monitorowanie kontroli terapeutycznej i narażenie środowiskowe. Główną zaletą tej techniki jest to, że pomiar może być wykonywany w czasie rzeczywistym.
Technika jest również wydajna, czuła, specyficzna i przyjazna dla użytkownika. Implikacje tej techniki zostały rozszerzone na diagnostykę raka płuc. Ponieważ szansa na kandydatów na biomarkery została znaleziona w wydychanym oddechu pacjentów z chorobą płuc na różnych etapach.
Ogólnie rzecz biorąc, osoby, które są nowe w tej metodzie, będą miały trudności, ponieważ źródło jonizacji jest zwykle współwytwarzane. Demonstracja wizualna ma kluczowe znaczenie, ponieważ nie ma jeszcze standardowego protokołu dla tej metody. Na początek ustaw wtórne źródło nano ESI zgodnie z procesem jonizacji wtórnej elektrospary, w którym gaz oddechowy jest wprowadzany do przecięcia pióropusza elektrorozpylania i jonizowany przez naładowane kropelki.
Źródła dla poszczególnych laboratoriów zależą od użytego spektrometru masowego. W tym przypadku wtórne źródło nano ESI jest oparte na komercyjnym źródle nano ESI. I przymocowałem go do spektrometru masowego z pułapką orbitalną typu quarter pull.
Głównym korpusem źródła jest sześcienna komora ze stali nierdzewnej z wlotem do wprowadzenia kapilary nano ESI do komory. Po każdej stronie komory zainstalowane są dwie rurki ze stali nierdzewnej do dostarczania gazu. Dwa okienka kwarcowe są wyposażone w górną i dolną część komory, aby sprawdzić położenie końcówki kapilary nano ESI i sprayu nano ESI za pomocą oczu lub mikroskopu cyfrowego.
Na koniec komora jest przyspawana do stożka zamiatającego spektrometru masowego. Należy pamiętać, że konstrukcja może ulec zmianie w zależności od konkretnej geometrii interfejsu ciśnienia atmosferycznego spektrometru masowego używanego w poszczególnych laboratoriach. Skalibruj spektrometr mas zarówno w trybie wykrywania jonów dodatnich, jak i ujemnych zgodnie z instrukcjami producenta.
Stosując kalibrację, parametry spektrometru masowego, takie jak potencjały soczewek i warunki detekcji, są optymalizowane w celu uzyskania dobrej czułości i kształtu piku przy określonej wartości rozdzielczości. Wykonaj pełne kalibracje przy użyciu komercyjnego źródła ESI. Używana jest tutaj rozdzielczość masy 70 000
.Wzorcowanie wzorców masy można przeprowadzić przy użyciu dowolnych kompatybilnych źródeł, w tym niestandardowych. Ustaw temperaturę rurki przesyłowej jonów spektrometru mas na więcej niż 100 stopni Celsjusza. Chociaż najwyższą temperaturę można ustawić na 350 stopni Celsjusza, może to spowodować rozkład niektórych związków.
Dla rozpuszczalnika ESI i natężenia przepływu należy wybrać odpowiedni rozpuszczalnik ESI na podstawie właściwości rozpuszczalnika i docelowych związków. W tym eksperymencie użyj wody zawierającej 0,1% kwasu mrówkowego, aby uzyskać wysoką wydajność jonizacji. Ustaw natężenie przepływu rozpuszczalnika ESI w zakresie od 0 1,5 mikrolitra na minutę, do 200 nanolitrów na minutę.
Zoptymalizuj parametry wtórnego źródła nano ESI, głównie napięcie nano ESI i położenie końcówki kapilarnej nano ESI. Napięcie zwykle waha się od 2,0 do 4,5 kilowolta. Użyj tutaj 2,5 kilowolta.
Zastosuj czysty gaz do źródła, aby zmniejszyć wpływ lotnych związków organicznych lub LZO z powietrza w pomieszczeniach. Stosowany jest tutaj azot o wysokiej czystości i dostarczany w ilości 0,8 litra na minutę. Przy obecności czystego gazu znormalizowany poziom intensywności obserwowany w widmie masowym powinien być większy niż 1 x 10 do 5, a zmiana TIC powinna być mniejsza niż 10% zarówno w trybie wykrywania jonów dodatnich, jak i ujemnych.
Podczas wykonywania pomiaru należy wdychać powietrze w pomieszczeniu i wykonywać normalny wydech, aby wydychać całe powietrze z płuc przy stałym natężeniu przepływu. Monitoruj natężenie przepływu wydechu za pomocą manometru lub przepływomierza widocznego dla obiektu. Podłącz wlot przepływomierza do rurki nafionowej, aby usunąć parę wodną z wydychanego powietrza.
Następnie podłącz wylot przepływomierza do rurki PTFE, aby dostarczyć gaz oddechowy. W tym eksperymencie badany wydychał powietrze z prędkością 0,4 litra na minutę, co było kontrolowane przez przepływomierz. Jeden pomiar wydechu zajmuje mniej niż 30 sekund.
Wykonaj od czterech do sześciu powtórzonych pomiarów. Aby zminimalizować efekty zakłócające, poproś uczestników, aby powstrzymali się od jedzenia, picia i mycia zębów co najmniej 30 minut przed pomiarami. Podczas pomiaru sprawdzaj, czy intensywność żelaza przekracza liniową granicę wykrywalności przyrządu, czy nie.
Nasycenie sygnału może prowadzić do piku artefaktu, który nie wynika ze związku w próbce. Wdychanie przez nos spowodowałoby, że część otaczających LZO i cząstek zostałaby usunięta. Warto jednak zauważyć, że można również wykryć związki w przewodach nosowych.
Używaj oprogramowania do nagrywania chromatagramów i widm masowych. Ponieważ jest to bezpośrednia analiza MS i nie jest wykonywana separacja chromatograficzna, TIC faktycznie wskazuje ślad czasowy wszystkich sygnałów wykrytych w widmach masowych. A EIC pokazuje ślad czasowy określonego związku.
Poniżej przedstawiono reprezentatywne wyniki pomiarów wydychanego powietrza w czasie rzeczywistym. Ślad czasowy endolu, typowego związku endogennego, pokazuje sześć powtórzonych pomiarów w czasie krótszym niż siedem minut. Dla wszystkich pomiarów uzyskano powtarzalne odciski palców oddechu odjęte w tle w trybie detekcji jonów dodatnich.
Zaobserwowano 291 związków. Związki te to najprawdopodobniej aldehydy, ketony i alkiny. W przypadku odcisków palców oddechu w trybie detekcji jonów ujemnych prezentowane są 173 związki, które wynikają głównie z kwasów tłuszczowych.
Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak skonfigurować domowe źródło CESI i przeprowadzić analizę procesu w czasie rzeczywistym. Po opanowaniu pomiaru można go wykonać w ciągu kilku minut. Jeśli zostanie wykonany prawidłowo.
Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać o unikaniu zakłóceń związków z rurki do pobierania próbek i powietrza endodontycznego. Wiedz, że ta miara może zapewnić wgląd w ludzki oddech i może być również stosowana do innych systemów, takich jak modelowe alkilize, modele jonowe i systemy retrokomórkowe. Zgodnie z tą procedurą można wykonać inne pomiary, takie jak GCMS, HPRCMS, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, takie jak potwierdzenie zdjęć, ilość analizy.
Po jej opracowaniu, technika ta utorowała drogę naukowcom w dziedzinie medycyny do badania za pomocą tej diagnozy efektów leczenia u pacjentów.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
W niniejszym artykule przedstawiono protokół analizy składu chemicznego wydychanego powietrza w czasie rzeczywistym z wykorzystaniem wtórnej nanoelektrosprayowej jonizacji sprzężonej z wysokorozdzielczą spektrometrią mas. Ta innowacyjna metoda ma istotne znaczenie dla wczesnego rozpoznawania chorób oraz monitorowania przebiegu terapii.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Biochemia
- Diagnostyka medyczna
Wprowadzenie
- Wydychane powietrze zawiera biomarkery, które mogą wskazywać na różne stany zdrowotne.
- Analiza w czasie rzeczywistym umożliwia natychmiastowe uzyskanie wyników i podejmowanie decyzji.
- Wysokorozdzielcza spektrometria mas dostarcza szczegółowych danych o składzie chemicznym.
- Technika ta jest łatwa w obsłudze i wykazuje wysoką czułość.
Cel badania
- Opracowanie metody analizy wydychanego powietrza w czasie rzeczywistym.
- Zbadanie możliwości jej zastosowania w wczesnej diagnostyce chorób.
- Ocena potencjału tej metody w monitorowaniu odpowiedzi terapeutycznej.
Zastosowane metody
- Wtórna nanojonizacja przez rozpylanie elektrostatyczne.
- Spektrometria mas o wysokiej rozdzielczości.
- Gromadzenie i analiza danych w czasie rzeczywistym.
- Ocena próbek wydychanego powietrza od pacjentów z rakiem płuc.
Główne wyniki
- Metoda ta skutecznie charakteryzuje skład chemiczny wydychanego powietrza.
- Zidentyfikowano potencjalne biomarkery raka płuc na różnych etapach.
- Wykazano wysoką czułość i swoistość wyników.
- Analiza w czasie rzeczywistym umożliwia bezpośrednie zastosowania kliniczne.
Wnioski
- Technika ta oferuje obiecujące podejście do nieinwazyjnej diagnostyki chorób.
- Ma ona istotne znaczenie dla wykrywania i monitorowania raka płuca.
- Dalsze badania są niezbędne w celu rozszerzenia jej zastosowań w innych jednostkach chorobowych.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla Przemysłu
Analiza oddechu w czasie rzeczywistym z wykorzystaniem wtórnej nanoelektrosprayowej jonizacji sprzężonej z wysokorozdzielczą spektrometrią mas (Sec-nanoESI-HRMS) umożliwia szybkie i nieinwazyjne profilowanie wydychanych lotnych związków organicznych (VOCs) z wysoką czułością i swoistością. Możliwość ta wspiera wczesne etapy odkrywania biomarkerów, ograniczanie ryzyka mechanistycznego oraz zapewnia ciągłość translacyjną dla systemów istotnych w kontekście chorób. Podejście to zwiększa pewność prognostyczną w krytycznych punktach zwrotnych w procesach badawczo-rozwojowych (R&D) w branży biofarmaceutycznej.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wstępna faza odkrywania i walidacja celu
- Umożliwia wysokoprzepustową analizę endogennych LZO jako potencjalnych biomarkerów.
- Wspiera ograniczanie ryzyka mechanistycznego poprzez dostarczanie w czasie rzeczywistym molekularnych odcisków palców z ludzkiego oddechu.
- Ułatwia funkcjonalną walidację celów dzięki ilościowemu i powtarzalnemu wykrywaniu LZO.
- Zwiększa pewność prognostyczną w opracowywaniu hipotez dotyczących biomarkerów.
Przesiewy i opracowanie testów
- Przygotowuje zwalidowane biologiczne systemy oparte na wydychanym powietrzu do dalszych etapów procesów przesiewowych.
- Zapewnia standaryzowane, ilościowe wyniki spektrometrii mas do rozwoju testów analitycznych.
- Umożliwia powtarzalne, szybkie cykle pomiarowe odpowiednie do skalowalnych badań przesiewowych.
- Wspiera wiarygodną ocenę wpływu związków lub ekspozycji na profile VOC.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Koreluje profile biomarkerów LZO z istotnymi dla choroby punktami końcowymi badań translacyjnych.
- Zapewnia ciągłość procesu od wczesnego etapu odkrywania po przedkliniczną walidację biomarkerów z wydychanego powietrza.
- Umożliwia podejmowanie decyzji o dalszym rozwoju projektu w oparciu o analizę ryzyka i nieinwazyjne odczyty w czasie rzeczywistym.
- Wspiera redukcję ryzyka mechanistycznego w rozwoju translacyjnych biomarkerów.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda ta obejmuje cały proces, od wczesnego etapu odkrywania, przez identyfikację związków wiodących, aż po badania translacyjne, stanowiąc uniwersalną platformę do analizy biomarkerów VOC u ludzi oraz w systemach modelowych.
- Biologia odkrywcza: Wspiera weryfikację hipotez i wyjaśnianie szlaków metabolicznych poprzez bezpośrednie profilowanie VOC.
- Przesiewy: Dostarcza ilościowe i powtarzalne dane z spektrometrii mas, gotowe do analizy.
- Analityka: Zapewnia wysokorozdzielcze spektra z odjętym tłem, umożliwiając rygorystyczne porównania statystyczne.
- Badania translacyjne: Łączy etap odkryć z walidacją przedkliniczną dzięki ciągłości nieinwazyjnych biomarkerów.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Oferuje elastyczną i adaptowalną platformę dla zróżnicowanych badań biomarkerów w wydychanym powietrzu.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną i redukuje niejednoznaczność mechanistyczną w odkrywaniu biomarkerów.
- Wartość operacyjna: Zapewnia szybkie, standaryzowane i powtarzalne pomiary odpowiednie dla wysokoprzepustowych procesów analizy.
- Wartość strategiczna: Umożliwia podejmowanie świadomych decyzji o kontynuacji lub przerwaniu badań (go/no-go) oraz efektywne pod względem kapitałowym zarządzanie portfelem projektów.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację skorygowaną o ryzyko oraz rozwój programów biomarkerów opartych na analizie wydychanego powietrza.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w zakresie spektrometrii mas oraz protokołów pobierania próbek wydychanego powietrza.
- Zależy od dostępu do aparatury do wysokorozdzielczej spektrometrii mas oraz odpowiedniej infrastruktury analitycznej.
- Konieczna jest standaryzacja procedur pobierania próbek, kalibracji i analizy danych pomiędzy zespołami.
- Metoda jest dostosowywalna do różnych modeli systemowych i kontekstów chorobowych poprzez odpowiednie modyfikacje protokołu.
- Potencjalne ograniczenia obejmują czułość na środowiskowe VOC oraz konieczność rygorystycznego odejmowania tła.
