Charakterystyka bakteryjnych substancji lotnych za pomocą spektrometrii mas z jonizacją wtórną i rozpylaniem (SESI-MS)

Wtórna jonizacja elektroniczna, spektrometria mas lub CS EMS umożliwia analizę substancji lotnych bakterii bez konieczności pobierania jakiejkolwiek próbki. Obróbka wstępna. Przestrzeń nad powierzchnią kultury bakteryjnej jest przemieszczana przez dwutlenek węgla do komory reakcyjnej cssi. Gdy substancje lotne przechodzą przez komorę reakcyjną SSI, przechodzą przez chmurę elektrorozpylania i ulegają jonizacji.

Po zjonizowaniu substancje lotne są wciągane do spektrometru mas w celu analizy. Nadmiar gazu nośnego i niereaktywnych substancji lotnych bakterii jest przepuszczany przez filtr o średnicy 0,22 mikrona w celu usunięcia wszelkich czynników bakteryjnych jako dodatkowy środek ochronny przed kapturem chemicznym. Ostatecznie ten protokół CSI MS oferuje bakteryjne lotne odciski palców w ciągu kilku minut.

Przewidujemy, że technologia ta może być wykorzystana w wielu zastosowaniach, w tym w wydechu, analizie wydychanego powietrza w przypadku chorób zakaźnych, a nawet w systemach żywnościowych, w których możemy być w stanie szybko wykryć patogeny znajdujące się na naszej żywności lub w niej. Technika ta ma kilka głównych zalet. W porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak przesiewanie GCMS, MS i PT, najpierw RM S, substancje lotne nie wymagają żadnej obróbki wstępnej przed analizą.

Po drugie, możliwe jest fragmentowanie określonych jonów w lotnej mieszaninie, co ułatwia identyfikację związku. I po trzecie, jest szybki. Zwykle zajmuje to mniej niż pięć minut.

Aby przeanalizować każdą próbkę, wybierz odpowiednie naczynie do uprawy kultury, biorąc pod uwagę wymagania dotyczące wzrostu gatunku, a także efektywne dostarczanie substancji lotnych do spektrometru masowego. W tej demonstracji wybraliśmy standardowe 100-mililitrowe butelki ze stosem. Lotne substancje bakteryjne są dostarczane do spektrometru mas przez strumień gazu nośnego w celu złożenia nośnika.

Przewody gazowe pasują do butelek hodowlanych z gwintowanymi nakrętkami, które mają co najmniej dwa otwory na przynętę. Przewody wlotowe i wylotowe gazu przez porty przynęty i zatkaj wszelkie dodatkowe porty przed hodowlą próbek. Zwiększ ciśnienie w naczyniach i zanurz się w wodzie, aby sprawdzić, czy nie ma wycieków.

Wycieki gazu są główną przyczyną nietypowych wyników w postaci słabych lub nieobecnych. Lotne sygnały jonowe rosną z dnia na dzień. Kultury E coli, K 12 i Pseudomonas aerogen, PAO jedna w LB Lennox przygotowuje dwie repliki biologiczne dla każdego gatunku.

Przygotować dziewięć sterylnych butelek do hodowli zawierających 50 mililitrów LB Lennox i jedną niezaszczepioną butelkę do użycia jako ślepa próba zaszczepiania każdej nocnej kultury do dwóch butelek na próbki. Tworząc kontrpróby techniczne, inkubuj kultury i ślepą próbę przez 24 godziny w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Ponieważ CEMS jest specjalnie zaprojektowany do pobierania próbek substancji lotnych, przed ścisłym użyciem urządzenia należy ograniczyć stosowanie pachnących produktów do higieny osobistej.

Zakryj wszystkie lotne chemikalia w laboratorium i kontroluj ciągi powietrza w jak największym stopniu podczas testowania, aby zapobiec zanieczyszczeniu instrumentu i przewodów przesyłowych gazu. W przypadku żywotnych czynników biologicznych zainstaluj filtry o odpowiedniej wielkości porów w przewodzie gazu nośnego. Filtry nie będą przeszkadzać w przenoszeniu substancji lotnych do komory reakcyjnej sesi, ale mogą nieznacznie wpłynąć na efektywność transferu aerozolu.

W celu sprawdzenia, czy napięcie zasilania jest wyłączone i czy system jest rozładowany z energii elektrycznej, sprawdź, czy lampki kontrolne na dostawcy napięcia są wyłączone. Upewnij się, że napięcie na multimetrze wynosi zero i uziemić przewody elektryczne. W tym momencie zainstaluj roztwór do elektronatrysku do analizy.

W trybie jonów dodatnich używamy roztworu elektrorozpylania 0,1% kwasu mrówkowego, 5% metanolu i 94,9% wody Aby uzyskać optymalną intensywność i stabilność sygnału, włącz gaz nośny dwutlenku węgla i ustaw natężenie przepływu na dwa litry na minutę. Zastosować ciśnienie w zbiorniku rozpylania elektrycznego, aby zainicjować dostarczanie roztworu do rozpylania elektrycznego do komory reakcyjnej z natężeniem przepływu pięciu nanolitrów na sekundę. Następnie włącz zasilanie napięciem i dostosuj napięcie do 2,5 kilowolta.

Przyłożone napięcie wpływa na intensywność jonów sygnału i stabilność stożka elektronatrysku Dostosuj do naszych napięć systemowych od dwóch do pięciu kilowoltów. Zapewnij najlepsze wyniki w trybie jonów dodatnich ćwiczenie Ostrożność, ponieważ w tym momencie metalowe powierzchnie źródła jonizacji są w stanie wywołać niebezpieczny wstrząs. Teraz skonfiguruj metodę dostrajania do monitorowania widma SEMS.

Wyczyść pole wyboru Pozyskiwanie wielu kanałów lub MCA. Ustaw czas pobierania na 10 do 15 minut i rozpocznij pobieranie danych. Obserwuj widma tła gazu nośnego i dokonaj precyzyjnych regulacji przyłożonego napięcia, aby uzyskać stabilny chromatogram jonów całkowitych i powtarzalne skany.

Kontynuuj zbieranie widm i A TIC przez pięć minut, aby upewnić się, że instrument jest ustabilizowany z ubezpieczonym instrumentem. Wprowadź parametry pozyskiwania odpowiednie dla eksperymentu. Rejestrowanie widma tła gazu nośnego dla przyszłych eksperymentów.

Aby zebrać puste spektrum. Skierować przepływ gazu nośnego przez przewody obejściowe, a następnie przymocować ślepą próbkę z zaworami zamkniętymi do przewodów przesyłowych przyrządu. Otwórz zawory do butelki na próbkę i zamknij zawory przewodów obejściowych.

Dla powtarzalnych widm. Pozwól systemowi zrównoważyć się przez 30 sekund, w tym czasie wilgotność w komorze reakcyjnej stabilizuje się. Aby upewnić się, że system jest zrównoważony, należy monitorować TIC, który zmieni się w okresie równowagi, po którym nastąpi stabilizacja.

Gdy system zostanie zrównoważony, rozpocznij zbieranie widma. Po zebraniu widma wyjąć butelkę z próbką, otwierając najpierw przewody obejściowe gazu nośnego. Następnie zamykaj zawory próbki.

I na koniec wyjmij butelkę z próbką. Przepłukać układ gazem nośnym przez dwie do czterech minut, aby usunąć wilgoć i wchłonięte substancje lotne z przewodów przesyłowych i zapobiec przenoszeniu próbki do próbki. Zbieraj lotne dane odcisków palców dla każdej próbki bakteryjnej, sporadycznie zbierając dodatkowe widma ślepe, aby zapewnić dokładne odejmowanie ślepej próby.

Lotne odciski palców w trybie jonów dodatnich dla aerogenu E coli i p. Uprawiane tlenowo w LB Lennox przez 24 godziny w temperaturze 37 stopni Celsjusza są różne. Widmo lotne E. coli jest zdominowane przez indu o stosunku masy do ładunku wynoszącym 118, podczas gdy widmo aerogenu Pseudomonas zawiera większą różnorodność pików dodawanych do białek.

Podczas próby wykonania tej procedury ważne jest, aby zapisać parametry instrumentalne, które zostały zoptymalizowane do analizy, takie jak przyłożone napięcie, skład roztworu do elektronatryskiwania i natężenie przepływu gazu nośnego. Ważne jest również, aby prowadzić rejestry reprezentatywnych widm, aby móc odtworzyć swoje analizy w przyszłości. Nie zapominaj, że praca z bakteriami chorobotwórczymi i wysokim napięciem może być bardzo niebezpieczna.

Dlatego zawsze należy podjąć środki ostrożności, takie jak ograniczenie dostępu do CMS css podczas eksperymentu. Więc teraz powinieneś być w stanie w sposób powtarzalny uzyskać widma CSS, EMS dla bakteryjnych substancji lotnych w twoim systemie. Powodzenia.