Name: Charakterystyka bakteryjnych substancji lotnych za pomocą spektrometrii mas z jonizacją wtórną i rozpylaniem (SESI-MS) (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-06-08T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 54 s
Description: Poznaj metodę SESI-MS do szybkiej analizy lotnych związków organicznych z kultur bakteryjnych bez przygotowania próbek. Technika ta umożliwia uzyskanie charakterystycznych profili lotnych metabolitów w ciągu pięciu minut.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Praca ta jest finansowana z grantu NIH P20 RR021905-01, grantu CF RPD STANTO07R0 oraz grantu NASA NNH09ZNE002C.

<img src="/files/ftp_upload/2664/2664fig1.jpg" alt="Schemat spektrometru mas SESI, konfiguracja wlotu CO2, analiza emisji, wyniki widma masowego." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1. Schemat analizy lotnych związków bakteryjnych metodą SESI-MS. Gaz z przestrzeni nad kulturą bakterii jest wypierany przez CO2 (1) do komory reakcyjnej SESI (2). Przechodząc przez komorę reakcyjną SESI, substancje lotne przechodzą przez chmurę elektrosprayową i ulegają jonizacji (3). Po zjonizowaniu substancje lotne są zasysane do spektrometru mas w celu analizy (4). Nadmiar gazu nośnego i nieprzereagowane lotne związki bakteryjne przechodzą przez filtr 0,22 μm (5), jako dodatkowy środek ochronny, i są odprowadzane do dygestorium. Wstawka: Igła elektrosprayowa SESI to kapilara krzemionkowa (40 μm ID) z zaostrzoną końcówką igły.
W celu zademonstrowania zastosowania SESI-MS do charakterystyki lotnych związków bakteryjnych, szczepy E. coli K12 oraz P. aeruginosa PAO1 hodowano tlenowo przez 24 h w 50 mL pożywki LB-Lennox w temperaturze 37 °C, a następnie w ciągu 2 minut zarejestrowano widma SESI-MS lotnych związków z przestrzeni nad próbką. Jako gaz nośny do transportu związków lotnych do komory reakcyjnej zastosowano dwutlenek węgla (99,99 %) z przepływem 2 L/min. Komora reakcyjna SESI została zbudowana na zamówienie i zamontowana w urządzeniu API-3000 (SCIEX), zastępując oryginalne źródło jonizacji przez elektrorspray. Widma zbierano w trybie jonów dodatnich, wykorzystując roztwór do elektrorspray składający się z 0,1 % kwasu mrówkowego, 5,0% metanolu i 94,9 % wody (v/v), podawany z prędkością 5 nL/s przez nieprzewodzącą kapilarę krzemionkową z zaostrzonym końcem igły (40 μm ID). Zastosowane napięcie wyniosło 2,5 kV. Do gromadzenia danych wykorzystano oprogramowanie Analyst 1.4.2 (Applied Biosystems) z następującymi parametrami: zakres 20 – 500 Da, tryb MCA, 40 skanów, 3 s/skan oraz całkowity czas analizy wynoszący 2 min.
1. System hodowlany
<ol>
 <li>Wybierz odpowiednie naczynie do hodowli kultur, biorąc pod uwagę wymagania wzrostowe gatunków w Twoim eksperymencie (np. napowietrzanie, światło, 
 temperaturę itp.) oraz wydajny dopływ lotnych związków do spektrometru mas. W tym przypadku wykorzystano standardowe butelki Pyrex 
 o pojemności 100 mL z nakrętkami gwintowymi wyposażonymi w co najmniej dwa porty luer. Przez jeden port luer wprowadza się linię wlotową do doprowadzania gazu nośnego do butelki z próbką, a przez drugi port linię wylotową do transportu VOC do instrumentu (Rycina 1). Pozostałe porty zostają zatkane.</li>
 <li>Przed rozpoczęciem hodowli próbek należy poddać naczynia ciśnieniu i zanurzyć w wodzie w celu sprawdzenia szczelności. Wycieki gazu są główną przyczyną nietypowych 
 wyników w postaci słabych lub nieobecnych sygnałów jonów lotnych.</li>
</ol>
2. Eksperyment biologiczny: konfiguracja i kwestie bezpieczeństwa
<ol>
 <li>Hoduj kultury w warunkach odpowiednich dla postawionej hipotezy. Zaleca się zastosowanie co najmniej dwóch powtórzeń biologicznych, z których każde obejmuje dwa powtórzenia techniczne dla każdej zmiennej.</li>
 <li>Przygotuj próbę ślepą dla każdego z warunków hodowli (pożywka, antybiotyki itp.) i inkubuj ją w tych samych warunkach co próbki.</li>
 <li>Stosuj środki ostrożności odpowiednie dla używanych czynników biologicznych, biorąc pod uwagę poziom bezpieczeństwa biologicznego danego gatunku.</li>
 <li>Aby zapobiec kontaminacji instrumentu oraz linii przesyłu gazu żywymi czynnikami biologicznymi, zainstaluj w linii gazu nośnego filtry o odpowiedniej wielkości porów. Filtry nie będą zakłócać transportu substancji lotnych do komory reakcyjnej SESI, ale mogą nieznacznie wpłynąć na wydajność transportu aerozolu.6</li>
 <li>Podczas mocowania nakrętki przesyłowej gazu do butelki z kulturą stosuj wtórne zabezpieczenie lub komorę z laminarnym przepływem powietrza, aby zapewnić właściwą izolację w przypadku rozlania czynników biologicznych.</li>
 <li>Uruchamiaj i zatrzymuj przepływ gazu nośnego do butelki z próbką w sposób, który nie doprowadzi do wzrostu ciśnienia wewnątrz butelki.</li>
</ol>
3. Optymalizacja instrumentu
UWAGA: Metoda SESI-MS jest zaprojektowana specjalnie do pobierania próbek substancji lotnych, dlatego przed użyciem instrumentu należy ograniczyć stosowanie pachnących kosmetyków i artykułów higienicznych (np. wód kolońskich, płynów do płukania jamy ustnej, balsamów, płynów do płukania tkanin), żucia gumy, palenia papierosów itp. Wszystkie lotne odczynniki chemiczne w laboratorium powinny być szczelnie zamknięte, a podczas testów należy w maksymalnym stopniu kontrolować przeciągi w pomieszczeniu.
Następujące parametry aparatury, które wpływają na intensywność i stabilność sygnału, będą wymagały optymalizacji dla Twojego urządzenia i eksperymentu.
<ol>
 <li>Roztwór do elektrorozpylania i szybkość przepływu: Wybierz odpowiedni roztwór do elektrorozpylania dla klasy cząsteczek, które chcesz analizować, biorąc pod uwagę polaryzację instrumentu (tryb jonów dodatnich lub ujemnych) oraz charakter chemiczny związków docelowych. W tym doświadczeniu roztwór do elektrorozpylania to 0,1% kwasu mrówkowego, 5,0% metanolu, 94,9% wody (v/v), co zwiększa intensywność sygnału mniej polarnych cząsteczek, zapewniając jednocześnie dobrą stabilność sygnału. Roztwór jest podawany z szybkością przepływu 5 nL/s.</li>
 <li>Szybkość przepływu gazu nośnego: Szybkość przepływu gazu nośnego może wpływać na stabilność elektrorozpylania i intensywność sygnału. W tym przypadku stosuje się CO2 (≥ 99,99%) z szybkością przepływu 2 L/min.</li>
 <li>Kształt i pozycja igły: Kształt końcówki igły i jej pozycja silnie wpływają na intensywność i stabilność sygnału. Podczas instalacji nowej igły należy zoptymalizować jej pozycję, aby uzyskać równowagę między niskim tłem, wysoką intensywnością sygnału analitycznego a stabilnością sygnału. Aby odtworzyć widma SESI po wymianie igły, konieczne jest okresowe gromadzenie widm podczas regulacji pozycji igły, aż do momentu dopasowania obserwowanego widma do zapisów. Odległość od końcówki igły do elektrorozpylania do wlotu spektrometru mas wynosi 1 – 5 mm.</li>
 <li>Przyłożone napięcie: Napięcie przyłożone do układu wpływa na intensywność jonów sygnału oraz stabilność stożka Taylora w procesie elektrorozpylania. 
 Ponadto optymalne napięcie zależy od zastosowanego roztworu do elektrorozpylania i kształtu końcówki igły. 
 Na początku serii doświadczeń należy określić napięcie, które zapewnia optymalne widmo i stabilność sygnału dla danego układu, a następnie stosować to napięcie we wszystkich kolejnych badaniach. W naszym układzie napięcia w zakresie 2,0 - 5,0 kV zapewniają optymalną intensywność sygnału i stabilność elektrorozpylania. W tym doświadczeniu zastosowano napięcie 2,5 kV.</li>
</ol>
4. Włączanie i strojenie układu SESI-MS do analizy
<ol>
 <li>Zacznij od upewnienia się, że zasilacz jest wyłączony, a system jest rozładowany elektrycznie. Zrób to poprzez: 1) sprawdzenie, czy kontrolki na zasilaczu są wyłączone, 2) upewnienie się, że multimetr wskazuje wartość zero oraz 3) uziemienie przewodów elektrycznych.</li>
 <li>Wprowadź odpowiedni roztwór do elektrosprayu dla swojego eksperymentu.</li>
 <li>Włącz gaz nośny i ustaw przepływ na wartość odpowiednią dla Twojego eksperymentu.</li>
 <li>Przyłoż ciśnienie do zbiornika elektrosprayu, aby rozpocząć podawanie roztworu do komory reakcyjnej.</li>
 <li>Włącz zasilacz i dostosuj napięcie do wartości odpowiedniej dla Twoich eksperymentów.</li>
</ol>
UWAGA: Na tym etapie metalowe powierzchnie źródła jonizacji mogą doprowadzić do niebezpiecznego porażenia prądem. Zachowaj szczególną ostrożność podczas pracy z urządzeniem po włączeniu zasilania wysokiego napięcia.
<ol start="6">
 <li>Skonfiguruj metodę strojenia w celu monitorowania widma SESI-MS podczas wprowadzania precyzyjnych korekt przyłożonego napięcia. Użyj parametrów akwizycji, które zostały zoptymalizowane dla Twojego systemu i eksperymentu. Odznacz pole wyboru Multiple Channel Acquisition (MCA) (jeśli jest dotyczy), aby każdy skan generował niezależne widmo, ustaw czas akwizycji na 10 – 15 min i rozpocznij pomiar. Powinny być teraz widoczne widma tła gazu nośnego.</li>
 <li>Wprowadź precyzyjne korekty przyłożonego napięcia, aby uzyskać stabilny całkowity chromatogram jonowy (TIC) oraz powtarzalne skany zgodne ze skanami CO2 z poprzednich eksperymentów. Po dokonaniu korekt napięcia kontynuuj zbieranie widm i TIC przez pięć minut, aby upewnić się, że instrument uległ stabilizacji.</li>
 <li>Po zapewnieniu stabilności instrumentu skonfiguruj metodę akwizycji odpowiednio dla Twoich próbek, dostosowując czas akwizycji, zakres danych oraz wybór MCA zgodnie z potrzebami. Zbierz widmo tła gazu nośnego do dokumentacji.</li>
</ol>
5. Uzyskiwanie profilu lotnych związków organicznych hodowli bakteryjnej
<ol>
 <li>Aby zarejestrować widmo tła, skieruj przepływ gazu nośnego przez linie obejściowe, a następnie podłącz próbkę tła (przy zamkniętych zaworach) do linii przesyłowych gazu w urządzeniu.</li>
 <li>Otwórz zawory prowadzące do butelki z próbką i zamknij zawory linii obejściowych.</li>
 <li>Pozostaw system do wyrównania przez 30 s, podczas których wilgotność w komorze reakcyjnej ulega stabilizacji. Ten okres wyrównywania jest niezbędny do uzyskania powtarzalnych widm. Aby upewnić się, że system osiągnął stan równowagi, można monitorować TIC, który będzie ulegał zmianom w okresie wyrównywania, a następnie ustabilizuje się.</li>
 <li>Po wyrównaniu systemu rozpocznij rejestrację widma.</li>
 <li>Po zarejestrowaniu widma usuń butelkę z próbką, najpierw otwierając linie obejściowe gazu nośnego, następnie zamykając zawory próbki i na koniec odłączając butelkę z próbką. Przepłucz system gazem nośnym przez 2 – 4 min, aby usunąć wilgoć i zaadsorbowane substancje lotne z linii przesyłowych, co zapobiegnie przenoszeniu zanieczyszczeń między próbkami.</li>
 <li>Powtórz kroki 5.2 - 5.5 dla każdej próbki bakteryjnej, okresowo rejestrując dodatkowe widma tła, aby zapewnić dokładne odjęcie tła. Niepełne odjęcie tła doprowadzi do pojawienia się w przetworzonym widmie pików tła chemicznego, które są powszechne w technikach jonizacji pod ciśnieniem atmosferycznym (np. ftalany, silikony itp.).9</li>
 <li>Podczas rejestracji widm upewnij się, że sygnały jonowe nie przekraczają liniowych limitów detekcji urządzenia, co można określić na podstawie TIC i maksymalnej intensywności poszczególnych pików. Jony przekraczające górne limity detektora urządzenia mogą generować piki artefaktowe, które nie są reprezentatywne dla próbki.</li>
</ol>
6. Reprezentatywne wyniki
Jako przykład widm SESI-MS, które można uzyskać dla lotnych związków bakteryjnych, przedstawiono odciski palców substancji lotnych w trybie jonów dodatnich dla E. coli oraz P. aeruginosa hodowanych tlenowo w pożywce LB-Lennox przez 24 h w temperaturze 37 °C (Ryc. 2). W widmie lotnych związków E. coli dominuje indol przy m/z = 118, który nadaje kulturom E. coli charakterystyczny zapach, podczas gdy widmo P. aeruginosa zawiera większą różnorodność pików podatnych na protonowanie.
Należy pamiętać, że względne intensywności pików w widmie substancji lotnych zależą od parametrów instrumentalnych opisanych w Sekcji 3. Parametry te muszą być ściśle kontrolowane pomiędzy poszczególnymi eksperymentami, aby uzyskać powtarzalne widma.
<img src="/files/ftp_upload/2664/2664fig2.jpg" alt="Analiza spektrometrii masowej; E. coli vs P. aeruginosa; intensywność vs m/z; wykres porównawczy." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2. Widma SESI-MS w trybie jonów dodatnich (20 – 150 m/z) po odjęciu tła dla substancji lotnych E. coli K12 i P. aeruginosa PAO1 po 24 h wzrostu tlenowego w podłożu LB-Lennox w temperaturze 37 °C. Więcej szczegółów na temat pików zaobserwowanych w widmach SESI znajduje się w pracy Zhu, et al. 8.

<ol><li>Fuerstenau, S., Kiselev, P., Fenn, J. B. ESI-MS in the analysis of trace species in gases. Proceedings of the 47th ASMS Conference on Mass Spectrometry Allied Topics, Dallas, TX, , (1999).</li>
<li>Wu, C., Siems, W. F., Hill, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Secondary+electrospray+ionization+ion+mobility+spectrometry%2Fmass+spectrometry+of+illicit+drugs%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Secondary electrospray ionization ion mobility spectrometry/mass spectrometry of illicit drugs.</a> Anal. Chem. 72, 396-403 (2000).</li>
<li>Tam, M., Hill, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Secondary+electrospray+ionization-ion+mobility+spectrometry+for+explosive+vapor+detection%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Secondary electrospray ionization-ion mobility spectrometry for explosive vapor detection.</a> Anal. Chem. 76, 2741-2747 (2004).</li>
<li>Martinez-Lozano, P., Rus, J., de la Mora, G. F., Hernandez, M., de la Mora, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Secondary+electrospray+ionization+%28SESI%29+of+ambient+vapors+for+explosive+detection+at+concentrations+below+parts+per+trillion%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Soc.+Mass+Spectrom%22%5BJournal%5D)">Secondary electrospray ionization (SESI) of ambient vapors for explosive detection at concentrations below parts per trillion.</a> J. Am. Soc. Mass Spectrom. 20, 287-294 (2009).</li>
<li>Martinez-Lozano, P., de la Mora, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On-line+detection+of+human+skin+vapors%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Soc.+Mass+Spectrom%22%5BJournal%5D)">On-line detection of human skin vapors.</a> J. Am. Soc. Mass Spectrom. 20, 1060-1063 (2009).</li>
<li>Martinez-Lozano, P., de la Mora, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrospray+ionization+of+volatiles+in+breath%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Mass+Spectrom%22%5BJournal%5D)">Electrospray ionization of volatiles in breath.</a> Int. J. Mass Spectrom. 265, 68-72 (2007).</li>
<li>Martinez-Lozano, P., de la Mora, J. F., F, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+analysis+of+fatty+acid+vapors+in+breath+by+electrospray+ionization+and+atmospheric+pressure+ionization-mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Direct analysis of fatty acid vapors in breath by electrospray ionization and atmospheric pressure ionization-mass spectrometry.</a> Anal. Chem. 80, 8210-8215 (2008).</li>
<li>Guo, X. H., Bruins, A. P., Covey, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+typical+chemical+background+interferences+in+atmospheric+pressure+ionization+liquid+chromatography-mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Rapid+Commun.+Mass+Spectrom%22%5BJournal%5D)">Characterization of typical chemical background interferences in atmospheric pressure ionization liquid chromatography-mass spectrometry.</a> Rapid Commun. Mass Spectrom. 20, 3145-3150 (2006).</li>
<li>Rudzinski, C. M., Herzig-Marx, R., Lin, J., Szpiro, A., Johnson, B. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRudzinski%2C+CM+%22Pathogen+detection+using+headspace+analysis%22">Pathogen detection using headspace analysis</a>. , Department of the Air Force. 16-16 (2004).</li>
<li>Lechner, M., Fille, M., Hausdorfer, J., Dierich, M., Rieder, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diagnosis+of+bacteria+in+vitro+by+mass+spectrometric+fingerprinting%3A+A+pilot+study%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Diagnosis of bacteria in vitro by mass spectrometric fingerprinting: A pilot study.</a> Curr. Microbiol. 51, 267-269 (2005).</li>
<li>Schulz, S., Dickschat, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+volatiles%3A+The+smell+of+small+organisms%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Prod.+Rep%22%5BJournal%5D)">Bacterial volatiles: The smell of small organisms.</a> Nat. Prod. Rep. 24, 814-842 (2007).</li>
<li>Ligor, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analytical+methods+for+breath+investigation%5BTitle%5D)+AND+%22Crit.+Rev.+Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Analytical methods for breath investigation.</a> Crit. Rev. Anal. Chem. 39, 2-12 (2009).</li>
<li>Cao, W. Q., Duan, Y. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Breath+analysis%3A+Potential+for+clinical+diagnosis+and+exposure+assessment%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Chem%22%5BJournal%5D)">Breath analysis: Potential for clinical diagnosis and exposure assessment.</a> Clin. Chem. 52, 800-811 (2006).</li>
<li>Law, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+characterization+of+complex+viscous+liquids+at+the+molecular+level%5BTitle%5D)+AND+%22Angew.+Chem.+Int.+Ed%22%5BJournal%5D)">Rapid characterization of complex viscous liquids at the molecular level.</a> Angew. Chem. Int. Ed. 48, 8277-8280 (2009).</li>
<li>Wu, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sampling+analytes+from+cheese+products+for+fast+detection+using+neutral+desorption+extractive+electrospray+ionization+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Bioanal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Sampling analytes from cheese products for fast detection using neutral desorption extractive electrospray ionization mass spectrometry.</a> Anal. Bioanal. Chem. 397, 1549-1556 (2010).</li>
<li>Fleming-Jones, M. E., Smith, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Volatile+organic+compounds+in+foods%3A+A+five+year+study%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Agric.+Food+Chem%22%5BJournal%5D)">Volatile organic compounds in foods: A five year study.</a> J. Agric. Food Chem. 51, 8120-8127 (2003).</li>
<li>Calkins, C. R., Hodgen, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+fresh+look+at+meat+flavor%5BTitle%5D)+AND+%22Meat+Sci%22%5BJournal%5D)">A fresh look at meat flavor.</a> Meat Sci. 77, 63-80 (2007).</li>
</ol>

Nie zadeklarowano żadnych konfliktów interesów.

Bakterie produkują różne kombinacje związków lotnych, które mogą być wykorzystywane do identyfikacji bakteryjnej10-12 oraz oceny stanu metabolicznego. Opisana tutaj metoda SESI-MS umożliwia szybką charakterystykę lotnych związków bakteryjnych (w czasie dwóch minut lub krócej) bez konieczności przygotowania próbek, generując bakteryjny „odcisk palca” służący do identyfikacji gatunków.8 W ciągu ostatnich kilku dekad do charakterystyki związków lotnych stosowano inne techniki spektrometrii mas z jonizacją pod ciśnieniem atmosferycznym, w tym spektrometrię mas z selektywnym przepływem jonów w rurce (SIFT) oraz spektrometrię mas z reakcją przeniesienia protonu (PTR). Wyraźną przewagą SESI nad tymi innymi metodami jonizacji jest możliwość fragmentacji konkretnych pikuów (pod warunkiem zastosowania odpowiedniego typu spektrometru mas dostosowanego do SESI), co stanowi istotne narzędzie w identyfikacji związków. W powyższym protokole nie omówiono fragmentacji pikuów; przykłady wykorzystania informacji o fragmentacji w charakterystyce lotnych związków bakteryjnych można znaleźć w pracy Zhu, et al.8
SESI-MS znajduje bezpośrednie zastosowanie w detekcji bakteryjnych infekcji płuc in situ poprzez analizę wydychanego powietrza, ale może być również stosowane w każdym środowisku, w którym możliwe jest pobieranie próbek lotnych substancji. Na przykład analizy związków lotnych w moczu, krwi i oddechu, które są istotne w diagnostyce zaburzeń metabolicznych, chorób żołądkowo-jelitowych, nowotworów oraz ekspozycji na czynniki środowiskowe, są odpowiednie dla metody SESI-MS.13,14
SESI-MS posiada również szeroki zakres pozaklinicznych zastosowań w określaniu „odcisków palców” (fingerprinting) LZO, w tym szybką analizę żywności pod kątem charakterystycznych substancji lotnych związanych z dojrzewaniem, starzeniem się lub psuciem produktów.15-18

<table><tbody><tr><td>Potrójny kwadrupol API-3000</td><td>Instrument</td><td>SCIEX</td><td></td><td>Zakupiono wraz z oprogramowaniem Analyst 1.4.2 (Applied Biosystems)</td></tr><tr><td>Źródło jonów SESI</td><td>Instrument</td><td></td><td></td><td>Wykonany na zamówienie; patrz odnośnik 6</td></tr><tr><td>Przepływomierz gazu</td><td>Sprzęt</td><td>Cole-Parmer</td><td>EW-03217-74</td><td></td></tr><tr><td>Dwutlenek węgla</td><td>Wyposażenie</td><td>Airgas</td><td>CD I300</td><td>&amp;#8805; o czystości 99,99%</td></tr><tr><td>Azot</td><td>Sprzęt</td><td>Airgas</td><td>NI UHP300</td><td>Ultra wysoka czystość</td></tr><tr><td>szklane butelki na pożywki o pojemności 100 ml</td><td>Sprzęt</td><td>VWR International</td><td>89012-114</td><td>gwinty GL45</td></tr><tr><td>Korki do butelek z portami Luer</td><td>Sprzęt</td><td>Bio Chem Fluidics</td><td>00945T-3</td><td>Zespół nakrętki</td></tr><tr><td>Zatyczki do portów Luera</td><td>Sprzęt</td><td>Bio Chem Fluidics</td><td>009LP</td><td>Zestaw nakrętki</td></tr><tr><td>Przewód 1/4&quot; (OD) x 1/8&quot; (ID)</td><td>Sprzęt</td><td>Cole-Parmer</td><td>EW-95875-02</td><td>Zespół nakrętki &amp;linie przesyłowe gazów i wzmacniacz</td></tr><tr><td>Przewód 1/8&quot; (OD) x 1/16&quot; (ID)</td><td>Sprzęt</td><td>Cole-Parmer</td><td>EW-06605-27</td><td>Zespół nasadki</td></tr><tr><td>Zawory dwudrożne</td><td>Sprzęt</td><td>Cole-Parmer</td><td>07391-04</td><td>Zespół zakrętki</td></tr><tr><td>Filtr, stopień AAQ</td><td>Wyposażenie</td><td>Filtry Balston</td><td>9922-05</td><td></td></tr><tr><td>Kwas mrówkowy, stopień czystości LC/MS</td><td>Odczynnik</td><td>Fisher Scientific</td><td>A117-05AMP</td><td>Roztwór do elektrosprayu</td></tr><tr><td>Metanol, stopień LC/MS</td><td>Odczynnik</td><td>Fisher Scientific</td><td>A456-500</td><td>Roztwór do rozpylania elektrosprayowego</td></tr><tr><td>Woda, stopień LC/MS</td><td>Odczynnik</td><td>Fisher Scientific</td><td>W6-500</td><td>Roztwór do elektrosprayu</td></tr></tbody></table>

charakterystyka lotnych związków bakteryjnych z wykorzystaniem spektrometrii mas z wtórną jonizacją przez elektroryzację (sesi-ms)

Characterizing Bacterial Volatiles using Secondary Electrospray Ionization Mass Spectrometry (SESI-MS)

Wtórna spektrometria mas z jonizacją z rozpylania elektrostatycznego (SESI-MS) jest metodą opracowaną do szybkiego wykrywania związków lotnych, bez konieczności wstępnego przygotowania próbek. Metoda ta została po raz pierwszy opisana przez Fenna i współpracowników1 i była stosowana do wykrywania nielegalnych narkotyków2 oraz materiałów wybuchowych3-4, charakterystyki substancji lotnych skóry5 oraz analizy wydychanego powietrza6-7.
Jonizacja SESI zachodzi poprzez reakcje przeniesienia protonu pomiędzy roztworem elektrospray a lotnym analitym, w związku z czym jest ona odpowiednia do analizy cząsteczek heteroorganicznych, podobnie jak w tradycyjnej jonizacji z rozpylaniem elektrostatycznym (ESI). Jednak w przeciwieństwie do standardowej metody ESI, proces przeniesienia protonu w SESI odbywa się w fazie par, a nie w roztworze (Rys. 1), dlatego SESI najlepiej nadaje się do wykrywania lotnych związków organicznych i aerozoli.
Rozszerzamy zastosowanie techniki SESI-MS na detekcję lotnych związków bakteryjnych jako metodę identyfikacji i charakterystyki bakterii8. Wykazaliśmy, że tworzenie odcisków palców lotnych związków za pomocą SESI-MS, w połączeniu z metodą analizy statystycznej, może być wykorzystywane do rozróżniania rodzajów, gatunków i kultur mieszanych bakterii w różnych pożywkach wzrostowych.8 W niniejszym opracowaniu przedstawiamy etapy uzyskiwania odcisków palców lotnych związków bakteryjnych przy użyciu SESI-MS, w tym parametry instrumentalne, które należy zoptymalizować, aby zapewnić wiarygodną identyfikację i charakterystykę bakterii.

Wtórna spektrometria mas z jonizacją przez elektrorozpylanie (SESI-MS) umożliwia detekcję lotnych związków organicznych (LZO) bez konieczności wstępnego przygotowania próbek. Niniejszy protokół zawiera instrukcje dotyczące szybkiej (w ciągu kilku minut) charakteryzacji bakteryjnych LZO przy użyciu SESI-MS.

Charakterystyka lotnych związków bakteryjnych z wykorzystaniem spektrometrii mas z wtórną jonizacją przez elektroryzację (SESI-MS)

Wtórna spektrometria mas z jonizacją przez elektroryzowanie (SESI-MS) to metoda opracowana do szybkiego wykrywania związków lotnych, bez konieczności...

Wtórna jonizacja z rozpylaniem elektrostatycznym, spektrometria mas lub CS EMS umożliwia analizę lotnych związków bakteryjnych bez konieczności wstępnego przygotowania próbki. Przestrzeń nad kulturą bakteryjną jest wypierana przez dwutlenek węgla do komory reakcyjnej cssi. Przechodząc przez komorę reakcyjną SSI, substancje lotne przechodzą przez chmurę rozpylania elektrostatycznego i ulegają jonizacji.Po jonizacji lotne związki są wprowadzane do spektrometru mas w celu analizy. Nadmiar gazu nośnego oraz nieaktywne lotne związki bakteryjne przechodzą przez filtr 0,22 mikrona, aby usunąć wszelkie czynniki bakteryjne, co stanowi dodatkowy środek ochrony, a następnie są odprowadzane do dygestorium. W rezultacie protokół CSI MS pozwala na uzyskanie odcisków palców lotnych związków bakteryjnych w ciągu kilku minut.Przewidujemy, że technologia ta mogłaby znaleźć zastosowanie w wielu obszarach, w tym w analizie wydychanego powietrza pod kątem chorób zakaźnych, a nawet w systemach żywnościowych, gdzie moglibyśmy szybko wykrywać patogeny znajdujące się na żywności lub w niej. Technika ta oferuje kilka głównych zalet w stosunku do istniejących metod, takich jak GCMS, sift, MS oraz PT, RM S; po pierwsze, substancje lotne nie wymagają żadnego przygotowania przed analizą.Po drugie, możliwe jest fragmentowanie określonych jonów w mieszaninie lotnej, co ułatwia identyfikację związków. Po trzecie, metoda ta jest szybka. Zazwyczaj zajmuje ona mniej niż pięć minut.Aby przeanalizować każdą próbkę, należy wybrać odpowiednie naczynie do hodowli, biorąc pod uwagę wymagania wzrostowe danego gatunku, a także efektywny transport substancji lotnych do spektrometru mas. W tej demonstracji zastosowano standardowe butelki do pożywek o pojemności 100 mililitrów. Lotne związki bakteryjne są transportowane do spektrometru mas za pomocą strumienia gazu nośnego w celu zestawienia układu nośnego.Linie gazowe dopasowuje się do butelek hodowlanych z nakrętkami gwintowanymi posiadającymi co najmniej dwa porty luer. Przed rozpoczęciem hodowli próbek należy wprowadzić linie dopływu i odpływu gazu przez porty luer oraz zaślepić wszystkie pozostałe porty. Naczynia należy poddać nadciśnieniu i zanurzyć w wodzie w celu sprawdzenia szczelności.Wycieki gazu są główną przyczyną nietypowych wyników w postaci słabych lub nieobecnych sygnałów jonów lotnych pojawiających się w ciągu nocy. Hodowle e coli, K 12 oraz pseudomonas aerogen, PAO one w podłożu LB Lennox, przygotowując dwie repliki biologiczne dla każdego gatunku.Przygotuj dziewięć sterylnych butelek hodowlanych zawierających 50 ml LB Lennox oraz jedną niezaszczepioną butelkę, która będzie służyć jako próbka ślepa. Zaszczep każdą kulturę nocną do dwóch butelek z próbką, tworząc powtórzenia techniczne. Inkubuj kultury oraz próbkę ślepą przez 24 godziny w temperaturze 37 °C. Ponieważ system CEMS jest zaprojektowany specjalnie do pobierania próbek substancji lotnych, ogranicz stosowanie pachnących produktów do higieny osobistej przed szczelnym podłączeniem instrumentu.Należy zakryć wszystkie lotne odczynniki chemiczne w laboratorium i w miarę możliwości ograniczyć ruchy powietrza podczas testowania, aby zapobiec zanieczyszczeniu instrumentu oraz linii przesyłu gazu. W przypadku stosowania żywych czynników biologicznych, w linii gazu nośnego należy zainstalować filtry o odpowiedniej wielkości porów. Filtry te nie będą zakłócać transportu substancji lotnych do komory reakcyjnej sesi, jednak mogą nieznacznie wpłynąć na wydajność przesyłu aerozolu.Aby zweryfikować, że zasilanie napięciem jest wyłączone, a system jest rozładowany elektrycznie, należy sprawdzić lampki kontrolne zasilacza napięcia. Upewnić się, że multimetr wskazuje wartość zero, a następnie uziemić przewody elektryczne. W tym momencie należy wprowadzić roztwór do elektrosprayu przeznaczony do analizy.W trybie jonów dodatnich stosujemy roztwór do elektrorozpylania składający się z 0,1% kwasu mrówkowego, 5% metanolu i 94,9% wody. Aby uzyskać optymalną intensywność i stabilność sygnału, należy włączyć gaz nośny w postaci dwutlenku węgla i ustawić przepływ na 2 l/min. Należy przyłożyć ciśnienie do zbiornika z roztworem do elektrorozpylania, aby rozpocząć podawanie roztworu do komory reakcyjnej z prędkością przepływu 5 nl/s. Następnie należy włączyć zasilacz i ustawić napięcie na 2,5 kV.Przyłożone napięcie wpływa na intensywność sygnału jonowego oraz stabilność stożka Taylora w rozpylaniu elektrostatycznym. Dla naszego systemu napięcia od dwóch do pięciu kilowoltów zapewniają najlepsze wyniki w trybie jonów dodatnich. Należy zachować ostrożność, ponieważ w tym momencie metalowe powierzchnie źródła jonizacji mogą wywołać niebezpieczny wstrząs elektryczny. Teraz należy skonfigurować metodę strojenia do monitorowania widma SEMS.Odznacz pole wyboru wielokanałowego analizatora widm (multiple channel acquisition lub MCA). Ustaw czas akwizycji na 10 do 15 minut i rozpocznij zbieranie danych. Obserwuj widma tła gazu nośnego i dokonuj precyzyjnych korekt przyłożonego napięcia, aby uzyskać stabilny całkowity chromatogram jonowy oraz powtarzalne skany.Kontynuuj zbieranie widm oraz A TIC przez pięć minut, aby upewnić się, że instrument jest ustabilizowany i zabezpieczony. Wprowadź parametry akwizycji odpowiednie dla Twojego eksperymentu. Zarejestruj widmo tła gazu nośnego do przyszłych eksperymentów.Aby zebrać widmo tła. Przekieruj przepływ gazu nośnego przez linie obejścia, a następnie podłącz próbkę ślepą, przy zamkniętych zaworach, do linii przesyłowych urządzenia. Otwórz zawory do butelki z próbką i zamknij zawory linii obejścia.Aby uzyskać powtarzalne widma, należy pozwolić systemowi na wyrównanie parametrów przez 30 sekund, podczas których stabilizuje się wilgotność w komorze reakcyjnej. Aby upewnić się, że system osiągnął stan równowagi, należy monitorować TIC, który będzie się zmieniać w okresie wyrównywania, a następnie ustabilizuje się.Po ustabilizowaniu systemu rozpocznij pomiar widma. Po zebraniu widma usuń butelkę z próbką, najpierw otwierając linie obejścia gazu nośnego, a następnie zamykając zawory próbkowania.I na koniec, wyjęcie butelki z próbką. Przeplucz system gazem nośnym przez dwie do czterech minut, aby usunąć wilgoć i zaabsorbowane substancje lotne z linii przesyłowych oraz zapobiec przenoszeniu zanieczyszczeń między próbkami. Zbierz dane dotyczące profilu lotnych związków dla każdej próbki bakteryjnej, okresowo pobierając dodatkowe widma tła, aby zapewnić dokładne odejmowanie tła.Lotne odciski palców w trybie jonów dodatnich dla E. coli i P. aerogen, hodowanych tlenowo w pożywce LB Lennox przez 24 godziny w temperaturze 37 °C, są odmienne. W widmie lotnym E. coli dominuje indu przy stosunku masy do ładunku 118, natomiast widmo Pseudomonas aerogen zawiera większą różnorodność pików adduktów białkowych.Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby zapisywać parametry instrumentalne zoptymalizowane dla danej analizy, takie jak przyłożone napięcie, skład roztworu do rozpylania elektrostatycznego oraz szybkość przepływu gazu nośnego. Należy również prowadzić dokumentację reprezentatywnych widm, aby umożliwić powtórzenie analiz w przyszłości. Należy pamiętać, że praca z bakteriami patogennymi oraz wysokim napięciem może być niezwykle niebezpieczna.W związku z tym należy zawsze zachować środki ostrożności, takie jak ograniczenie dostępu do css CMS podczas eksperymentu. Teraz powinni Państwo być w stanie w sposób powtarzalny uzyskać widma CSS oraz EMS dla lotnych związków bakteryjnych w Państwa systemie. Powodzenia.

characterizing-bacterial-volatiles-using-secondary-electrospray

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Charakteryzowanie lotnych związków bakteryjnych za pomocą wtórnej spektrometrii mas z jonizacją elektrorozpyłową (SESI-MS)

Nieukierunkowana metabolomika dostarcza hipotezy generującej migawkę profilu metabolicznego.  Protokół ten zademonstruje ekstrakcję i analizę metabolitów z komórek, surowicy lub tkanki.  Szereg metabolitów jest badany za pomocą ekstrakcji ciecz-faza cieczowa, ultraprzepływowej chromatografii cieczowej/spektrometrii mas o wysokiej rozdzielczości (UPLC-HRMS) w połączeniu z oprogramowaniem do analizy różnicowej.

Nieukierunkowana metabolomika ze źródeł biologicznych przy użyciu ultrasprawnej chromatografii cieczowej ze spektrometrią mas o wysokiej rozdzielczości (UPLC-HRMS)

Spektrometria mas z jonizacją metodą desorpcji (DESI-MS) to metoda otoczenia, za pomocą której próbki, w tym tkanki biologiczne, mogą być obrazowane przy minimalnym przygotowaniu próbki. Poprzez rasterowanie próbki poniżej sondy jonizacyjnej, ta technika oparta na rozpylaniu zapewnia wystarczającą rozdzielczość przestrzenną, aby dostrzec interesujące cechy molekularne w obrębie skrawków tkanki.

Obrazowanie tkanek biologicznych metodą spektrometrii mas z desorpcją i jonizacją metodą elektrorozpylania

Ten film przedstawia protokół do analizy spektrometrycznej mas związków lotnych i wrażliwych na utlenianie za pomocą jonizacji uderzeniowej elektronów. Przedstawiona technika jest szczególnie interesująca dla chemików nieorganicznych, pracujących z metalami organicznymi, silanami lub fosfanami, z którymi należy obchodzić się w warunkach obojętnych, takich jak technika Schlenka.

Analiza związków lotnych i wrażliwych na utlenianie przy użyciu systemu zimnego wlotu i spektrometrii mas z uderzeniem elektronów

Przedstawiono protokół profilowania metabolicznego próbek biologicznych za pomocą elektroforezy kapilarnej - spektrometrii mas z wykorzystaniem projektu interfejsu porowatej końcówki bez osłony.

Elektroforeza kapilarna bez osłonki – spektrometria mas do profilowania metabolicznego próbek biologicznych

Ekstrakcja gazowana to nowa technika laboratoryjna do analizy związków lotnych i półlotnych. Gaz nośny rozpuszcza się w ciekłej próbce poprzez zastosowanie nadciśnienia i wymieszanie próbki. Komora na próbkę jest następnie dekompresowana. Gatunki analitów są uwalniane do fazy gazowej w wyniku musowania.

Ekstrakcja gazowana lotnych związków organicznych w połączeniu z ciśnieniem atmosferycznym Jonizacja chemiczna Kwadrupolowa spektrometria mas

Pokazano protokół charakteryzujący skład chemiczny wydychanego powietrza w czasie rzeczywistym za pomocą wtórnej jonizacji nanoelectrospray sprzężonej ze spektrometrią mas o wysokiej rozdzielczości.

Analiza oddechu w czasie rzeczywistym przy użyciu wtórnej jonizacji nanoelektronizacyjnej sprzężonej ze spektrometrią mas o wysokiej rozdzielczości

Tutaj prezentujemy protokół zbierania substancji lotnych o zapachu kwiatowym z kwitnących kwiatów, przy użyciu nieniszczącej procedury pobierania próbek.

Szybkie zbieranie lotnych substancji zapachowych o kwiatowych zapachach przy użyciu techniki zbierania lotnych substancji w przestrzeni nad powierzchnią do pobierania próbek desorpcji termicznej GC-MS

Tutaj prezentujemy protokół do scharakteryzowania kompletnej korony biomolekularnej, białek i metabolitów, uzyskanych przez nanomateriały z biopłynów przy użyciu elektroforezy kapilarnej - podejścia spektrometrii mas.

Metody spektrometrii mas elektroforezy kapilarnej do charakteryzowania korony białkowej i metabolitowej uzyskanej przez nanomateriały

Ten protokół opisuje ekstrakcję lotnych związków organicznych z próbki biologicznej za pomocą metody ekstrakcji sorbentem wspomaganym próżniowo, chromatografię gazową sprzężoną ze spektrometrią mas przy użyciu szyny Entech Sample Preparation Rail, oraz analizę danych. Opisano również hodowlę próbek biologicznych i sondowanie izotopów stabilnych.

Wychwytywanie aktywnie wytwarzanych mikrobiologicznych lotnych związków organicznych z próbek związanych z człowiekiem za pomocą ekstrakcji sorbentem wspomaganym próżnią

Ten protokół opisuje spektrometrię masową pojedynczych komórek obrazowania komórek OVCAR-8 z wykorzystaniem jonizacji z desorpcji i elektrozrygowania połączonych ze spektrometrami masowymi Orbitrap do metabolomiki wysokiej rozdzielczości przestrzennej.

Obrazowanie spektrometrii masowej pojedynczych komórek z wykorzystaniem jonizacji z dezorpcją za pomocą elektrycznej emisji rozpyłowej połączonej ze spektrometrami masy Orbitrap

Poznaj metodę SESI-MS do szybkiej analizy lotnych związków organicznych z kultur bakteryjnych bez przygotowania próbek. Technika ta umożliwia uzyskanie charakterystycznych profili lotnych metabolitów w ciągu pięciu minut.

Charakterystyka lotnych związków bakteryjnych z wykorzystaniem spektrometrii mas z wtórną jonizacją przez elektroryzację (SESI-MS)

Przeglądaj więcej filmów