Name: Zróżnicowane działanie leków obniżających poziom lipidów w modulowaniu morfologii cząstek cholesterolu (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-11-10T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 15 s
Description: Poznaj metodę płytkową do oceny wpływu leków obniżających poziom lipidów na morfologię cząstek cholesterolu. Technika ta umożliwia wizualizację cząstek VLDL i LDL oraz identyfikację potencjalnych biomarkerów miażdżycy.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca została sfinansowana z grantu badawczego Plaxgen przyznanego SM (PLX-1008). Dziękujemy Instytutowi Badawczemu Fundacji Badań Medycznych Palo Alto za pobranie próbek surowicy od osób cierpiących na miażdżycę na podstawie zgody IRB.

1. Przygotowanie cholesterolu znakowanego fluorescencyjnie oraz leków obniżających poziom lipidów
UWAGA: Cholesterol znakowany fluorescencyjnie, agregaty oraz statyny przygotowano zgodnie z opisem w naszym poprzednim artykule21. Szczegółowe informacje na temat odczynników, cytometru przepływowego z obrazowaniem, analizatorów chemicznych oraz oprogramowania do analizy danych wykorzystanych w niniejszym badaniu znajdują się w Tabeli materiałów.
<ol>
	<li>Rozpuścić liofilizowany proszek cholesterolu znakowanego fluorescencyjnie (1 mg, Ex/Em = 495 nm/507 nm) w 1 mL 100% alkoholu.</li>
	<li>Wirować próbkę przez 3 min przy 2,040 x g i wykorzystać nadosady zawierające rozpuszczalne agregaty cholesterolu znakowanego fluorescencyjnie w teście matrycy blaszek miażdżycowych.</li>
	<li>W celu przygotowania leków, rozpuścić oddzielnie proszki (2 mg) symwastatyny, lowastatyny, atorwastatyny, ezetymibu oraz kwasów tłuszczowych omega-3 w 1 ml 100% alkoholu.</li>
	<li>Po wirowaniu przez 3 min przy 2,040 x g wykorzystać nadosady zawierające leki w teście.</li>
	<li>Analogicznie, rozpuścić oddzielnie proszki (2 mg) fluwastatyny, rozuwastatyny, niacyny i fibratu w 1 mL wody dejonizowanej, aby przygotować roztwór zapasowy o stężeniu 2 mg/mL.</li>
	<li>Po wirowaniu przez 3 min przy 2,040 x g wykorzystać nadosady zawierające leki w teście matrycy blaszek miażdżycowych.</li>
</ol>
2. Test macierzy plackowej do badania formowania cząsteczek cholesterolu in vitro
<ol>
	<li>Użyć analizatora chemicznego-1 (patrz Tabela materiałów) do przygotowania testu z macierzą placków w celu badania tworzenia się cząsteczek cholesterolu. Test należy przeprowadzić w 96-dołkowej płytce o okrągłych dnach i niskim wiązaniu białek, wykorzystując odczynniki przygotowane w Sekcji 1. Końcową objętość reakcji w każdym dołku należy utrzymać na poziomie 200 µL i przeprowadzić wszystkie pomiary w trzech powtórzeniach.
	<ol>
		<li>Najpierw do każdego dołka należy nalać 194,5 µL soli fizjologicznej w buforze fosforanowym (PBS).</li>
		<li>Do każdego dołka należy dodać 2,5 µL (5 µg) roztworu każdego z leków obniżających poziom lipidów, a następnie wstrząsać płytką przez 30 s, umieszczając ją na platformie reakcyjnej analizatora chemicznego-1, aby równomiernie wymieszać lek w roztworze. Do próbek kontrolnych negatywnych nie dodaje się leku.</li>
		<li>Na koniec do każdego dołka należy dodać 2 µL (2 µg) roztworu agregatów cholesterolu znakowanych fluorescencyjnie i wstrząsać płytką przez 30 s, umieszczając ją na platformie reakcyjnej analizatora chemicznego-1.</li>
		<li>Płytkę należy inkubować na wytrząsarce laboratoryjnej przez 2 h w temperaturze 37 °C i przy 200 rpm.</li>
		<li>Po inkubacji należy pozyskać obrazy cząsteczek za pomocą przepływowej cytometrii obrazowej.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Przechwytywanie obrazów cząsteczek cholesterolu z użyciem cytometrii przepływowej z obrazowaniem
<ol>
	<li>Otwórz szablon akwizycji danych, aby załadować odpowiednie ustawienia instrumentu. Kliknij „File”, następnie wybierz „Open Template…” i wskaż plik szablonu.</li>
	<li>Kliknij „Flush, Lock, Load”, aby przygotować instrument do załadunku próbek.</li>
	<li>Po pojawieniu się okna dialogowego „Load Sample” kliknij „OK”, aby załadować do cytometru przepływowego z obrazowaniem 50 µL próbek z każdej studni przygotowanej w sekcji 2.</li>
	<li>Kliknij „Run|Setup”, aby w czasie rzeczywistym wyświetlić cząstki w obszarze obrazowania.</li>
	<li>Gdy cząstki w obszarze obrazowania będą dobrze ostro ustawione, kliknij „Run|Acquire”, aby w trybie wysokoprzepustowym jednocześnie pozyskać obrazy każdego obiektu w ciemnym polu (rozproszenie boczne/SSC), jasnym polu (BF), fluorescencji zielonej i fluorescencji żółtej.</li>
	<li>Powtórz kroki 3.2 – 3.5, aby pozyskać od 5 000 do 10 000 cząstek z każdej próbki.</li>
	<li>Przeanalizuj wszystkie surowe pliki obrazów za pomocą oprogramowania do analizy obrazu w celu określenia intensywności fluorescencji obiektów oraz zmienności morfologicznej.
	<ol>
		<li>Kliknij przycisk „Tools” u góry oprogramowania do analizy obrazu, a następnie wybierz z menu rozwijanego opcję „Batch Data Files”, co otworzy okno „Batches”.</li>
		<li>W oknie „Batches” kliknij przycisk „Add Batch”, co otworzy okno „Define a Batch”.</li>
		<li>W oknie „Define a Batch” kliknij przycisk „Add Files” i wybierz surowe pliki obrazów, kliknij przycisk „Template” i wybierz odpowiedni plik szablonu analizy danych, a następnie wybierz „OK” i „Submit Batches”, aby rozpocząć przetwarzanie i analizę surowych plików obrazów.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Ocena wpływu leków obniżających poziom lipidów na oczyszczone cząsteczki cholesterolu z wykorzystaniem testu macierzy placków
<ol>
	<li>Zgodnie z opisem w kroku 2.1, przeprowadź test formowania cząsteczek cholesterolu przy użyciu oczyszczonych lipoprotein/cząsteczek VLDL, LDL i HDL. Przeprowadź test macierzy blaszek w płytce 96-dołkowej.
	<ol>
		<li>Najpierw napełnij wszystkie dołki PBS; użyj objętości końcowej 200 µL dla każdego dołka.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Jako kontrolę negatywną dodaj do każdego dołka oddzielnie 4 µg białek/cząsteczek VLDL, LDL lub HDL bez dodatku leków i wstrząśnij płytką przez 30 s.
	<ol>
		<li>Aby zbadać efekt leku obniżającego poziom lipidów, dodaj do każdego dołka oddzielnie 4 µg białek/cząsteczek VLDL, LDL lub HDL i wstrząśnij płytką przez 30 s.</li>
		<li>Do dołków, do których dodano 4 µg VLDL, LDL lub HDL, dodaj 2,5 µL (5 µg) roztworu ezetymibu, lowastatyny, simwastatyny lub kwasu nikotynowego i wstrząśnij płytką przez 30 s, umieszczając ją w analizatorze chemicznym-1.</li>
		<li>Na koniec dodaj do wszystkich dołków 2 µL (2 µg) roztworu agregatu cholesterolu znakowanego fluorescencyjnie i wstrząśnij płytką przez 30 s, umieszczając ją na płytce reakcyjnej analizatora chemicznego-1.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Inkubuj płytkę przez 2 h w wytrząsarce laboratoryjnej ustawionej na 37 °C i 200 rpm.</li>
	<li>Pobierz próbki za pomocą obrazującej cytometrii przepływowej zgodnie z krokami 3.1 – 3.5.</li>
	<li>Przeanalizuj surowe pliki obrazów za pomocą oprogramowania do analizy obrazu, jak opisano w kroku 3.7.</li>
	<li>W szablonie analizy zastosuj następujący schemat bramkowania w celu identyfikacji subpopulacji cząsteczek cholesterolu.
	<ol>
		<li>Na wykresie liczby pikseli nasyconych w kanale zielonym (oś x) i liczby pikseli nasyconych w kanale ciemnego pola (oś y) odrzuć obiekty posiadające jeden lub więcej pikseli nasyconych w którymkolwiek z kanałów.</li>
		<li>Przedstaw obiekty/cząsteczki bez pikseli nasyconych, używając intensywności kanału zielonego (oś x) i intensywności SSC (oś y): obiekty zostaną podzielone na jeden z trzech obszarów (VLDL, LDL, HDL) na podstawie intensywności kanału zielonego i SSC. 
		UWAGA: Bramki te zostały utworzone na podstawie danych uzyskanych z eksperymentów kontrolnych przeprowadzonych z użyciem oczyszczonych cząsteczek/białek VLDL, LDL i HDL bez dodatku leku.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Aby określić efekt leku obniżającego poziom lipidów dla każdej próbki, oblicz całkowite stężenia cząsteczek lipoprotein oraz procentowy udział każdej subpopulacji (VLDL, LDL, HDL), zgodnie z opisem w kroku 6.5.
	<ol>
		<li>Oblicz stężenia cząsteczek (cząsteczek/mL), korzystając z następującego równania: 
		<img alt="Wzór na stężenie cząsteczek, [Particle] = liczba cząsteczek/(szybkość przepływu próbki×czas akwizycji)." src="/files/ftp_upload/56596/56596eq1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Równanie"> 
		UWAGA: Obszary bramkowania VLDL, LDL i HDL na wykresie kropkowym fluorescencji wykrywają ~ 80% ich odpowiednich subpopulacji, a pozostałe ~ 20% cząsteczek nakłada się na inne obszary bramkowania.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. Pomiar stężeń lipidów w próbkach surowicy
<ol>
	<li>W celu oznaczenia stężeń LDL, HDL, cholesterolu i triglicerydów za pomocą analizatora chemicznego-2, należy wykorzystać próbki surowicy pobrane od zdrowych osób oraz osób z dyslipidemią w tej samej grupie wiekowej.</li>
	<li>Nieprawidłowe stężenie LDL, HDL, cholesterolu i triglicerydów należy zdefiniować jako stężenie wykraczające poza górne i dolne wartości referencyjne w próbkach surowicy.</li>
	<li>Należy zastosować standardowe wartości referencyjne zalecane przez producenta odczynników: cholesterol (4 - 200 mg/dL), HDL (3.0 - 65 mg/dL), LDL (4 - 100 mg/dL) oraz triglicerydy (9 - 200 mg/dL).</li>
	<li>Próbki surowicy o wartościach nieprawidłowych, czyli poniżej dolnej lub powyżej górnej wartości referencyjnej dla cholesterolu i triglicerydów, należy wytypować i wykorzystać do przesiewu w obecności i przy braku leków obniżających poziom lipidów.</li>
</ol>
6. Analiza wpływu leków na tworzenie cząsteczek cholesterolu w próbkach surowicy
<ol>
	<li>Użyj analizatora chemicznego-1 do przygotowania testu matrycy blaszek dla tworzenia cząsteczek cholesterolu w próbkach surowicy. Test należy przeprowadzić w 96-dołkowej płytce o okrągłym dnie i niskim wiązaniu białek. Zastosuj końcową objętość reakcji 200 µL/dołek i wykonaj wszystkie analizy w trzech powtórzeniach.</li>
	<li>Przygotuj płytkę, dozując odczynniki etapowo.
	<ol>
		<li>Przygotuj dołki kontrolne.</li>
		<li>Do każdego dołka wprowadź 193 µL PBS.</li>
		<li>Dodaj 2,5% (v/v) surowicy pacjenta (tylko jedna próbka surowicy na dołek) i wstrząśnij płytką przez 30 s, umieszczając ją na płytce reakcyjnej analizatora chemicznego.</li>
		<li>Do każdego dołka dodaj 2 µL (2 µg) roztworu agregatów cholesterolu znakowanych fluorescencyjnie i wstrząśnij płytką przez 30 s, umieszczając ją na płytce reakcyjnej analizatora chemicznego-1.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotuj dołki z lekami.
	<ol>
		<li>Do każdego dołka wprowadź 191 µL PBS.</li>
		<li>Dodaj 2,5% (v/v) surowicy pacjenta (tylko jedna próbka surowicy na dołek) i wstrząśnij płytką przez 30 s, umieszczając ją na płytce reakcyjnej analizatora chemicznego-1.</li>
		<li>Do wszystkich dołków, z wyjątkiem dołków kontroli negatywnej, dodaj 2 µL roztworu ezetymibu, lowastatyny, symwastatyny lub kwasu nikotynowego (4 µg). Dodaj tylko jeden lek na dołek i wstrząśnij płytką przez 30 s, umieszczając ją na płytce reakcyjnej analizatora chemicznego-1.</li>
		<li>Do każdego dołka dodaj 2 µL roztworu agregatów cholesterolu znakowanych fluorescencyjnie (2 µg) i wstrząśnij płytką przez 30 s, umieszczając ją na płytce reakcyjnej analizatora chemicznego-1.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Leki należy dozować dopiero po wypełnieniu wszystkich dołków (kontrolnych i traktowanych lekami) odpowiednimi próbkami surowicy, a cholesterol znakowany fluorescencyjnie dodać na koniec tego etapu.</li>
	<li>Inkubuj płytkę przez 2 h w wytrząsarku laboratoryjnym ustawionym na 37 °C i 200 rpm.</li>
	<li>Nabyj próbki za pomocą obrazującego cytometru przepływowego zgodnie z ustawieniami opisanymi w krokach 3.1 - 3.6.</li>
	<li>Użyj oprogramowania do analizy obrazów w celu przetwarzania wsadowego wszystkich plików obrazów przy użyciu tego samego szablonu, który opisano w kroku 3.7.
	<ol>
		<li>Przeprowadź analizę danych, wyznaczając bramki na wykresie zgodnie z opisem w krokach 4.5 i 4.6.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Aby określić efekt/odpowiedź leku obniżającego poziom lipidów (niski, umiarkowany i wysoki) dla każdej próbki, oblicz całkowite stężenie cząsteczek lipoprotein oraz procent całkowitej liczby cząsteczek tworzących subpopulacje VLDL, LDL i HDL.</li>
	<li>Przedstaw populacje VLDL, LDL i HDL na histogramie obrazu obiektu w jasnym polu, gdzie od długości odjęto szerokość (długość - szerokość), a następnie przypisz je do regionów globularnych lub liniowych: obiekty o wartości (długość - szerokość) ≤2 µm trafiają do regionu globularnego w celu obliczenia procentu cząsteczek o kształcie globularnym i liniowym.</li>
	<li>Porównaj procent cząsteczek cholesterolu LDL i HDL o kształcie globularnym i liniowym zidentyfikowanych dla każdej próbki surowicy inkubowanej z każdym lekiem i bez niego. spośród wartości uzyskanych w trzech powtórzeniach dla każdej próbki surowicy, przyjmij procent cząsteczek LDL i HDL o kształcie globularnym i liniowym mieszczący się w zakresie SD ±2 w celu określenia efektu leku.</li>
</ol>

<ol><li>Pahan, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid-lowering+drugs%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Mol+Life+Sci%22%5BJournal%5D)">Lipid-lowering drugs.</a> Cell Mol Life Sci. 63, 1165-1178 (2006).</li>
<li>Laforest, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prevalence+of+low+high-density+lipoprotein+cholesterol+and+hypertriglyceridaemia+in+patients+treated+with+hypolipidaemic+drugs%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Cardiovasc+Dis%22%5BJournal%5D)">Prevalence of low high-density lipoprotein cholesterol and hypertriglyceridaemia in patients treated with hypolipidaemic drugs.</a> Arch Cardiovasc Dis. 102, 43-50 (2009).</li>
<li>Roberts, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preventing+and+arresting+coronary+atherosclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Am+Heart+J%22%5BJournal%5D)">Preventing and arresting coronary atherosclerosis.</a> Am Heart J. 130, 580-600 (1995).</li>
<li>Goldstein, J. L., Brown, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+century+of+cholesterol+and+coronaries%3A+from+plaques+to+genes+to+statins%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A century of cholesterol and coronaries: from plaques to genes to statins.</a> Cell. 16, 161-172 (2015).</li>
<li>Drexel, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Statins%2C+fibrates%2C+nicotinic+acid%2C+cholesterol+absorption+inhibitors%2C+anion-exchange+resins%2C+omega-3+fatty+acids%3A+which+drugs+for+which+patients%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Fundam+Clin+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Statins, fibrates, nicotinic acid, cholesterol absorption inhibitors, anion-exchange resins, omega-3 fatty acids: which drugs for which patients?</a> Fundam Clin Pharmacol. 23, 687-692 (2009).</li>
<li>Camelia, S., Anca, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Statins%3A+Mechanism+of+action+and+effects%5BTitle%5D)+AND+%22J.Cell.Mol.Med%22%5BJournal%5D)">Statins: Mechanism of action and effects.</a> J.Cell.Mol.Med. 5, 378-387 (2001).</li>
<li>Schaefer, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparisons+of+effects+of+statins+%28atorvastatin%2C+fluvastatin%2C+lovastatin%2C+pravastatin%2C+and+simvastatin%29+on+fasting+and+postprandial+lipoproteins+in+patients+with+coronary+heart+disease+versus+control+subjects%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Cardiol%22%5BJournal%5D)">Comparisons of effects of statins (atorvastatin, fluvastatin, lovastatin, pravastatin, and simvastatin) on fasting and postprandial lipoproteins in patients with coronary heart disease versus control subjects.</a> Am J Cardiol. 93, 31-39 (2004).</li>
<li>Meyers, C. D., Kamanna, V. S., Kashyap, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Niacin+therapy+in+atherosclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+in+Lipid%22%5BJournal%5D)">Niacin therapy in atherosclerosis.</a> Curr Opin in Lipid. 15, 659-665 (2004).</li>
<li>Phan, B. A., Dayspringm, T. D., Toth, P. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ezetimibe+therapy%3A+mechanism+of+action+and+clinical+update%5BTitle%5D)+AND+%22Vasc+Health+Risk+Mana%22%5BJournal%5D)">Ezetimibe therapy: mechanism of action and clinical update.</a> Vasc Health Risk Mana. 8, 415-427 (2012).</li>
<li>Leitersdorf, E., Fruchart, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+of+action+of+fibrates+on+lipid+and+lipoprotein+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Mechanism of action of fibrates on lipid and lipoprotein metabolism.</a> Circulation. 98, 2088-2093 (1998).</li>
<li>Backes, J., Anzalone, D., Hilleman, D., Catini, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+clinical+relevance+of+omega-3+fatty+acids+in+the+management+of+hypertriglyceridemia%5BTitle%5D)+AND+%22Lipids+Health+Dis%22%5BJournal%5D)">The clinical relevance of omega-3 fatty acids in the management of hypertriglyceridemia.</a> Lipids Health Dis. 15, 118(2016).</li>
<li>Davidson, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+Significance+of+Statin+Pleiotropic+Effects+Hypotheses+Versus+Evidence%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Clinical Significance of Statin Pleiotropic Effects Hypotheses Versus Evidence.</a> Circulation. 111, 2280-2281 (2005).</li>
<li>Chinetti-Gbaguidi, G., Fruchart, J. C., Staels, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pleiotropic+effects+of+fibrates%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Atheroscler+Rep%22%5BJournal%5D)">Pleiotropic effects of fibrates.</a> Curr Atheroscler Rep. 7, 396-401 (2005).</li>
<li>McTaggart, F., Jones, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+Statins+on+High-Density+Lipoproteins%3A+A+Potential+Contribution+to+Cardiovascular+Benefit+Effects+of+Statins+on+High-Density+Lipoproteins%3A+A+Potential+Contribution+to+Cardiovascular+Benefit%5BTitle%5D)+AND+%22CardiovascDrugs+Ther%22%5BJournal%5D)">Effects of Statins on High-Density Lipoproteins: A Potential Contribution to Cardiovascular Benefit Effects of Statins on High-Density Lipoproteins: A Potential Contribution to Cardiovascular Benefit.</a> CardiovascDrugs Ther. 22, 321-338 (2008).</li>
<li>Quehenberger, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Human+Plasma+Lipidome%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">The Human Plasma Lipidome.</a> N Engl J Med. 365, 1812-1823 (2011).</li>
<li>Lund-Katz, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+responsible+for+the+compositional+heterogeneity+of+nascent+high+density+lipoprotein%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Mechanisms responsible for the compositional heterogeneity of nascent high density lipoprotein.</a> J. Biol Chem. 288, 23150-23160 (2013).</li>
<li>Krauss, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipoprotein+subfractions+and+cardiovascular+disease+risk%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Lipidol%22%5BJournal%5D)">Lipoprotein subfractions and cardiovascular disease risk.</a> Curr Opin Lipidol. 21, 305-311 (2010).</li>
<li>Krauss, R. M., Burke, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+multiple+subclasses+of+plasma+low+density+lipoproteins+in+normal+humans%5BTitle%5D)+AND+%22J+Lipid+Res%22%5BJournal%5D)">Identification of multiple subclasses of plasma low density lipoproteins in normal humans.</a> J Lipid Res. 23, 97-104 (1982).</li>
<li>Rosenson, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HDL+measures%2C+particle+heterogeneity%2C+proposed+nomenclature%2C+and+relation+to+atherosclerotic+cardiovascular+Events%5BTitle%5D)+AND+%22Clinic+Chemi%22%5BJournal%5D)">HDL measures, particle heterogeneity, proposed nomenclature, and relation to atherosclerotic cardiovascular Events.</a> Clinic Chemi. 57, 392-410 (2011).</li>
<li>Madasamy, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plaque+array+method+and+proteomics-based+identification+of+biomarkers+from+Alzheimer%27s+disease+serum%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Chim+Acta%22%5BJournal%5D)">Plaque array method and proteomics-based identification of biomarkers from Alzheimer's disease serum.</a> Clin Chim Acta. 441, 79-85 (2015).</li>
<li>Madasamy, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonenzymatic+Mechanism+of+Statins+in+Modulating+Cholesterol+Particles+Formation%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Cardiol%22%5BJournal%5D)">Nonenzymatic Mechanism of Statins in Modulating Cholesterol Particles Formation.</a> Am J Cardiol. 118, 1187-1191 (2016).</li>
<li>Peter, O. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+relevance+of+the+biochemical%2C+metabolic%2C+and+genetic+factors+that+influence+low-density+lipoprotein+heterogeneity%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Cardiol%22%5BJournal%5D)">Clinical relevance of the biochemical, metabolic, and genetic factors that influence low-density lipoprotein heterogeneity.</a> Am J Cardiol. 90, 30-47 (2002).</li>
<li>Weissglas-Volkov, D., Pajukanta, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+causes+of+high+and+low+serum+HDL-cholesterol%5BTitle%5D)+AND+%22J+Lipid+Res%22%5BJournal%5D)">Genetic causes of high and low serum HDL-cholesterol.</a> J Lipid Res. 51, 2032-2057 (2010).</li>
<li>Abela, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+statins+on+cholesterol+crystallization+and+atherosclerotic+plaque+stabilization%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Cardiol%22%5BJournal%5D)">Effect of statins on cholesterol crystallization and atherosclerotic plaque stabilization.</a> Am J Cardiol. 107, 1710-1717 (2011).</li>
<li>Nidorf, S. M., Eikelboom, J. W., Thompson, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+cholesterol+crystal-induced+inflammation+for+the+secondary+prevention+of+cardiovascular+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovasc+Pharmacol+Ther%22%5BJournal%5D)">Targeting cholesterol crystal-induced inflammation for the secondary prevention of cardiovascular disease.</a> Cardiovasc Pharmacol Ther. 19, 45-52 (2014).</li>
<li>Thacker, S. G., Zarzour, A., Chen,, et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+density+lipoprotein+reduces+inflammation+from+cholesterol+crystals+by+inhibiting+inflammasome+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol%22%5BJournal%5D)">High density lipoprotein reduces inflammation from cholesterol crystals by inhibiting inflammasome activation.</a> Immunol. 149, 306-319 (2016).</li>
<li>Kim, S. H., Lee, E. S., Lee, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplex+coherent+anti-stokes+Raman+Spectroscopy+images+intact+atheromatous+lesions+and+concomitantly+identifies+distinct+chemical+profiles+of+atherosclerotic+lipids%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Multiplex coherent anti-stokes Raman Spectroscopy images intact atheromatous lesions and concomitantly identifies distinct chemical profiles of atherosclerotic lipids.</a> Circ Res. 106, 1332-1341 (2010).</li>
<li>Lim, R. S., Suhalim, J. L., Miyazaki-Anzai, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+cholesterol+crystals+in+plaques+of+atherosclerotic+mice+using+hyperspectral+CARS+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22J+Lipid+Res%22%5BJournal%5D)">Identification of cholesterol crystals in plaques of atherosclerotic mice using hyperspectral CARS imaging.</a> J Lipid Res. 52, 2177-2186 (2011).</li>
<li>Rothblat, G. H., Phillips, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-density+lipoprotein+heterogeneity+and+function+in+reverse+cholesterol+transport%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Lipidol%22%5BJournal%5D)">High-density lipoprotein heterogeneity and function in reverse cholesterol transport.</a> Curr Opin Lipidol. 21, 229-238 (2011).</li>
<li>Kontush, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HDL+particle+number+and+size+as+predictors+of+cardiovascular+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Front+in+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">HDL particle number and size as predictors of cardiovascular disease.</a> Front in Pharmacol. , (2015).</li>
<li>Karathanasis, S. K., Freeman, L. A., Gordon, S. M., Remaley, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+changing+face+of+HDL+and+the+best+way+to+measure+it%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Chem%22%5BJournal%5D)">The changing face of HDL and the best way to measure it.</a> Clin. Chem. 63, 196-210 (2017).</li>
</ol>

Dr Madasamy otrzymał wsparcie w postaci grantu od firmy Plaxgen, Inc. i ma konkurencyjny interes finansowy. Pozostali autorzy nie mają żadnych konkurencyjnych interesów finansowych, które mogliby ujawnić.

Ogólnie rzecz biorąc, rozmieszczenie i właściwości funkcjonalne cząsteczek cholesterolu VLDL, LDL i HDL w krążeniu krwi są głównie determinowane przez czynniki metaboliczne, genetyczne, epidemiologiczne, komórkowe i osocza22,23. W niniejszym badaniu badanie wpływu leków modyfikujących lipidy w buforze wykazało, że wysoce lipofilne leki, takie jak ezetymib, lowastatyna, symwastatyna i atorwastatyna, indukowały wyższy poziom złożoności morfologii cząstek cholesterolu w porównaniu z efektem niższego poziomu obserwowanym w przypadku wysoce hydrofilowych leków z rozuwastatyną i fluwastatyną. Wyniki te są dobrze zgodne z naszym poprzednim badaniem opisującym nieenzymatyczny wpływ statyn na modulowanie tworzenia cząsteczek cholesterolu LDL i HDL w próbkach buforu i surowicy21. W związku z tym wyniki niniejszego badania ujawniły nieenzymatyczny mechanizm działania leków zawierających ezetymib, niacynę, fibrat i kwasy tłuszczowe omega-3, które mogą odgrywać bezpośrednią rolę w modulowaniu tworzenia cząsteczek cholesterolu. Możliwe jest, że interakcje między lekami a agregatami cholesterolu prowadzą do składania się cząstek cholesterolu o dużych rozmiarach od 2 do 60μm2, wykazujących morfologię pasm kulistych i liniowych.
Poza tym wyniki uzyskane przy użyciu oczyszczonych cząstek lipoprotein sugerują interakcje między agregatami cholesterolu a czynnikami osocza, w tym białkami VLDL, LDL i HDL, które mogą zmieniać skład i właściwości morfologiczne cząstek cholesterolu. Wyniki leczenia farmakologicznego z udziałem oczyszczonych cząstek lipoprotein wykazały wyższy poziom wpływu leku na tworzenie cząstek VLDL w porównaniu z ich wpływem obserwowanym na tworzenie cząstek cholesterolu LDL. Jako proleki stosowano lowastatynę, symwastatynę i ezetymib, a ich dawki w testach mogą być wyższe od stężeń fizjologicznych.
Co ciekawe, badania przesiewowe próbek surowicy wykazały różnice w wpływie leku na zmianę profili tworzenia cząstek cholesterolu VLDL, LDL i HDL, w szczególności ich wpływ na tworzenie się cząstek LDL i HDL o kształcie liniowym. Leki te indukowały zmniejszenie tworzenia się cząsteczek cholesterolu LDL i HDL w kształcie liniowym zarówno w dyslipidemii, jak i w normalnych próbkach surowicy dopasowanych do wieku. Obserwowane działanie leku na zmniejszenie powstawania cząstek o kształcie liniowym było większe w przypadku symwastatyny, ezetymibu, lowastatyny i niacyny. Identyfikacja cząstek cholesterolu o morfologii pasm kulistych i liniowych w próbkach surowicy prawidłowej i dyslipidemii sugeruje, że cząstki o podobnej morfologii mogą tworzyć się w warunkach in vivo. Wcześniejsze badania wykazały obecność kryształów cholesterolu przypominających dysk i igły w blaszkach miażdżycowych w modelach myszy ludzkich i ApoE-/- i LDLR-/- 24,25,26,27,28.
Cząsteczki HDL krążące we krwi występują jako niejednorodna mieszanina, a poziom małych i dużych cząstek HDL wraz z aktywnością funkcjonalną są ważnymi czynnikami wywierającymi ich działanie kardioprotekcyjne poprzez odwrotny szlak transportu cholesterolu29,30. Ostatnie badania podkreśliły znaczenie identyfikacji podfrakcji cząstek cholesterolu HDL w celu wyjaśnienia ich roli w wielu funkcjach biologicznych, takich jak wypływ cholesterolu, działanie przeciwzapalne, przeciwzakrzepowe iprzeciwutleniające. Ponadto w wielu badaniach wykazano wpływ terapii obniżającej stężenie lipidów na zwiększenie niskiego do umiarkowanego poziomu HDL w osoczu 1,5,21. W związku z tym wyniki tego badania dostarczają nowych informacji na temat cech morfologicznych cząsteczek cholesterolu. Warto zauważyć, że wykrycie wyższego poziomu cząstek cholesterolu HDL o kształcie liniowym w próbkach surowicy osób z dyslipidemią sugeruje, że mogą one być wiarygodnym biomarkerem zarówno do diagnozy, jak i oceny efektów leków modyfikujących lipidy u pacjentów. Konieczne są jednak dalsze badania z wykorzystaniem dużych próbek klinicznych, aby lepiej zrozumieć cząsteczki cholesterolu o odrębnej morfologii i ich związek z chorobami układu krążenia.
W teście tablicy płytkowej do badania wpływu leku na gromadzenie się cząstek cholesterolu użyliśmy 2 μg znakowanych fluorescencyjnie agregatów cholesterolu i 5 μg każdego leku, ponieważ: (1) leki kompetycyjnie wiążą się zarówno z cholesterolem znakowanym fluorescencyjnie, jak i endogennymi lipidami obecnymi w próbkach surowicy; (2) Z każdej próbki uzyskaliśmy od 5 000 do 10 000 cząsteczek cholesterolu, które są łączone w duże rozmiary i kształty w zakresie od ~ 2 - 60 μ2; (3) zaobserwowaliśmy duże różnice w odpowiedzi na leki wśród próbek surowicy inkubowanych z lekami (dawki od 300 ng do 5 μg) i ~1 - 5% z nich inkubowanych z wysokimi dawkami nie wykazało wykrywalnych zmian w profilu tworzenia cząstek cholesterolu; oraz (4) interakcja między agregatami cholesterolu a lekami obniżającymi poziom lipidów odbywa się za pośrednictwem procesu nieenzymatycznego. W związku z tym stężenia odczynników użytych w teście mogą być wyższe niż ich poziom fizjologiczny.
Podsumowując, z powodzeniem wykazaliśmy zalety opisanej w tym badaniu metody obrazowania in vitro w celu określenia wpływu szerokiego spektrum leków obniżających stężenie lipidów na modulację morfologii i składu cząsteczek cholesterolu. Podejście polegające na wizualizacji i ilościowym określeniu morfologii cząstek lipidowych za pomocą konstelacji algorytmów analizy obrazu może pomóc zarówno w diagnostyce miażdżycy, jak i w ocenie wyników terapii obniżającej stężenie lipidów u pacjentów.

Liczne badania kliniczne wykazały korzystny wpływ leków obniżających poziom lipidów w obniżaniu poziomu cholesterolu lipoprotein o niskiej gęstości (LDL) w osoczu oraz niskim lub umiarkowanym poziomie wzrostu cholesterolu lipoprotein o wysokiej gęstości (HDL), co zapobiega zarówno pierwotnym, jak i wtórnym występowaniom niepożądanych zdarzeń sercowo-naczyniowych związanych z miażdżycą1,2,3,4,5. Statyny, grupa inhibitorów enzymu reduktazy HMG-CoA, blokują endogenną syntezę cholesterolu w wątrobie, co z kolei prowadzi do obniżenia poziomu krążącego cholesterolu LDL we krwi<klasa sup="xref">6,7. Podobnie, w obniżaniu poziomu lipidów niacyny pośredniczy jej bezpośrednie i niekonkurencyjne hamowanie acylotransferazy diacyloglicerolu hepatocytów-2, kluczowego enzymu wątrobowego biorącego udział w syntezie trójglicerydów<klasa sup = "xref">8. Dla porównania, ezetymib zmniejsza stężenie LDL w osoczu poprzez ograniczenie wchłaniania egzogennego cholesterolu poprzez wiązanie się z białkiem Niemann-Pick C1-Like 1 (NPC1L1) znajdującym się w komórkach nabłonka jelita cienkiego9. Fenofibrat, inny lek obniżający poziom lipidów, znacznie zmniejsza stężenie trójglicerydów w osoczu, a także umiarkowanie obniża poziom cholesterolu LDL poprzez szlak receptorów aktywowanych przez proliferatory peroksysomów10. Poza tym doniesiono, że kwas tłuszczowy omega-3 ma działanie przeciwmiażdżycowe ze względu na jego zdolność do obniżania poziomu LDL11.
Leki obniżające poziom lipidów, oprócz ich głównego wpływu na obniżenie poziomu cholesterolu LDL, mają szereg korzystnych efektów plejotropowych, w tym zwiększenie poziomu HDL, poprawę funkcji śródbłonka, zmniejszenie stanu zapalnego i hamowanie agregacji płytek krwi12,13,14. Jednak mechanizm leżący u podstaw tych leków w zwiększaniu stężenia cząsteczek cholesterolu HDL i modyfikowaniu ich cech strukturalnych nie jest w pełni poznany. Ponieważ leki te są powszechnie przepisywane w leczeniu chorób sercowo-naczyniowych związanych z miażdżycą (CVD), konieczne jest dalsze badanie ich możliwej roli w określaniu cech morfologicznych i rozmieszczenia cząsteczek lipidów. Lipidom ludzkiego osocza składa się z około 600 różnych lipidów i 22 różnych typów molekularnych cholesterolów, które są obecne w różnych rozmiarach, kształtach, gęstościach i składach15,16,17. Metody analityczne, takie jak ultrawirowanie, NMR i gradientowa elektroforeza żelowa, są wykorzystywane do charakteryzowania cząstek LDL i HDL oraz ich podfrakcji18,19. Zastosowanie tych metod ogranicza się jednak do badań mających na celu określenie wpływu leków na modulację morfologii i składania cząsteczek lipidowych. Tablica płytek opartych na cytometrze przepływowym jest funkcjonalnym testem biochemicznym opracowanym do wykrywania i wizualizacji cząstek lipidów i płytek amyloidowych pochodzących z surowicy20. Opisane w niniejszej pracy zalety metody obrazowania in vitro umożliwiają identyfikację działania leków modulujących stężenie lipidów w zmianie morfologii i rozmieszczenia cząsteczek cholesterolu w próbkach buforowych i surowicy.

<table><tbody><tr><td>TopFluor fluorescencyjny cholesterol</td><td>Avanti Polar lipidy</td><td></td><td>magazyn 100 &mikro; l podwielokrotności przy -20 &deg; C</td></tr><tr><td>symwastatyna (pro-lek)</td> <td>Cayman Chemicals</td><td></td><td>sklep 100 & mikro; l podwielokrotności przy -20 &deg; C</td></tr><tr><td>lowastatyna (pro-lek)</td> <td>Cayman Chemicals</td><td></td><td>sklep 100 & mikro; l podwielokrotności przy -20 &deg; C</td></tr><tr><td>rosuwastatyna</td><td>Cayman Chemicals</td><td></td><td>sklep 100 i mikro; l podwielokrotności przy -20 &deg; C</td></tr><tr><td>atorwastatyna</td><td>Cayman Chemicals</td><td></td><td>sklep 100 i mikro; l podwielokrotności przy -20 &deg; C</td></tr><tr><td>fluwastatyna</td><td>Cayman Chemicals</td><td></td><td>sklep 100 i mikro; l podwielokrotności przy -20 &deg; C</td></tr><tr><td>ezetymib (pro-lek)</td><td>Cayman Chemicals</td><td></td><td>store 100 & mikro; l podwielokrotności przy -20 &deg; C</td></tr><tr><td>Niacyna</td><td>MilliporeSigma</td><td></td><td>sklep 100 & mikro; l podwielokrotności przy -20 &deg; Fibrat C</td></tr><tr><td></td><td>MilliporeSigma</td><td></td><td>sklep 100 &mikro; l podwielokrotności przy -20 &deg; C</td></tr><tr><td>kwas tłuszczowy omega-3</td><td>MilliporeSigma</td><td></td><td>store 100 & mikro; l podwielokrotności przy -20 &deg; C</td></tr><tr><td>oczyszczone białka/cząstki VLDL</td><td>Lee Bio</td><td></td><td></td></tr><tr><td>oczyszczone białka/cząsteczki LDL</td><td>Lee Bio</td><td></td><td></td></tr><tr><td>oczyszczone białka/cząsteczki HDL</td><td>Lee Bio</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Human dopasowane do wieku serum</td><td>Dx Biosamples</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ludzka surowica miażdżycowa</td><td>Bioserve</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ludzka normalna surowica</td><td>Stanforda Zestaw</td> odczynników do pomiaru LDL w centrum <td></td><td></td>krwi</tr><tr><td></td><td>Roche Diangostics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zestaw odczynników do pomiaru HDL</td><td>Roche Diangostics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pomiar cholesterolu całkowitego</td><td>Roche Diangostics</td> 96-dołkowe płytki do mikromiareczkowania Roche Diangostics <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Obrazowanie Amnis Cytometr przepływowy</td><td>Oprogramowanie do analizy obrazu Amnis Inc</td><td></td><td></td></tr><tr><td>IDEAS Analizator</td> chemiczny <td>Amnis Inc-1</td><td></td><td></td></tr><tr><td>, ChemWel 2902</td><td>Analizator biochemiczny technologii</td><td></td><td></td>Awarness-2</tr><tr><td>, Intergra 400</td><td>Roche Diangostics</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

zróżnicowane działanie leków obniżających poziom lipidów w modulowaniu morfologii cząstek cholesterolu

Differential Effects of Lipid-lowering Drugs in Modulating Morphology of Cholesterol Particles

Leczenie pacjentów z dyslipidemią lekami obniżającymi poziom lipidów prowadzi do znacznego obniżenia poziomu lipoprotein o niskiej gęstości (LDL) oraz niskiego do umiarkowanego poziomu wzrostu cholesterolu lipoprotein o wysokiej gęstości (HDL) w osoczu. Jednak możliwa rola tych leków w zmianie morfologii i dystrybucji cząsteczek cholesterolu jest słabo poznana. W tym artykule opisano ocenę in vitro działania leków obniżających stężenie lipidów w modulowaniu cech morfologicznych cząstek cholesterolu metodą płytki nazębnej w połączeniu z obrazową cytometrią przepływową. Analizy obrazowe cząsteczek cholesterolu wykazały, że lowastatyna, symwastatyna, ezetymib i atorwastatyna indukują tworzenie zarówno globularnych, jak i liniowych cząstek w kształcie pasma, podczas gdy niacyna, fibraty, fluwastatyna i rosuwastatyna indukują tworzenie tylko cząstek o kształcie kulistym. Następnie oczyszczone cząsteczki lipoprotein o bardzo niskiej gęstości (VLDL) i LDL inkubowane z tymi lekami wykazały zmiany w morfologii i teksturze obrazu subpopulacji cząstek cholesterolu. Ponadto badania przesiewowe 50 próbek surowicy wykazały obecność wyższego poziomu cząstek cholesterolu HDL w kształcie liniowym u osób z dyslipidemią (średnio 18,3%) w porównaniu z próbkami normalnymi w tym samym wieku (średnia 11,1%). Zaobserwowaliśmy również znaczne różnice w wpływie leków obniżających poziom lipidów na zmniejszenie tworzenia się cząstek cholesterolu LDL i HDL w próbkach surowicy. Odkrycia te wskazują, że leki obniżające poziom lipidów, oprócz działania hipolipidemicznego za pośrednictwem komórek, mogą bezpośrednio modulować morfologię cząstek cholesterolu poprzez nieenzymatyczny mechanizm działania. Wyniki tych wyników mogą pomóc w diagnostyce miażdżycy i przewidzieć optymalną terapię obniżającą stężenie lipidów.

Celem tego badania było oszacowanie in vitro wpływu leków obniżających poziom lipidów na modulację morfologii cząsteczek cholesterolu. Porównanie leków obniżających stężenie lipidów ujawniło różnice w ich działaniu w modulowaniu cech morfologicznych cząsteczek cholesterolu.

Zróżnicowane działanie leków obniżających poziom lipidów w modulowaniu morfologii cząstek cholesterolu

Treatment of dyslipidemia patients with lipid-lowering drugs leads to a significant reduction in low-density lipoproteins (LDL) level and a low to ...

Ogólnym celem tego badania jest ocena wpływu leków obniżających stężenie lipidów w modulowaniu cech morfologicznych cząstek cholesterolu za pomocą metody płytki nazębnej oraz identyfikacja potencjalnych biomarkerów do diagnozy miażdżycy i określania działania leków. Rola leków obniżających poziom lipidów w modulowaniu tworzenia cząsteczek cholesterolu jest słabo poznana. Tutaj pokazujemy, że leki obniżające poziom lipidów odgrywają bezpośrednią rolę w zmianie profili i cech morfologicznych tworzenia cząsteczek cholesterolu.Główną zaletą metody obrazowania in vitro opartej na tablicy płytek nazębnych w porównaniu z innymi metodami wykrywania cząstek jest to, że umożliwia ona wizualizację cząsteczek cholesterolu w celu oceny wpływu leków obniżających poziom lipidów w surowicy. Jason Lundry, technik laboratoryjny firmy Plaxgen, zademonstruje, w jaki sposób konfigurujemy test tablicowy za pomocą analizatora biochemicznego. Raymond Kong, starszy naukowiec w Millipore Sigma, zademonstruje, w jaki sposób przetwarzamy próbki za pomocą obrazowej cytometrii przepływowej.Na koniec David Liu, technik laboratoryjny Plaxgen, zademonstruje analizę danych dla obrazów cząsteczek cholesterolu. Użyj analizatora biochemicznego-1, aby skonfigurować test tablicy płytkowej do tworzenia cząstek cholesterolu. Przez cały czas trwania testu utrzymuj końcową objętość reakcji w każdym studzience na poziomie 200 mikrolitrów i wykonaj wszystkie testy w trzech egzemplarzach.Najpierw załaduj 194 punkty pięć mikrolitrów soli fizjologicznej buforowanej fosforanem lub PDS do każdej studzienki 96-dołkowej płytki o okrągłym dnie, niskiej zawartości białka. Do każdej studzienki dodać dwa punkty pięć mikrolitrów każdego roztworu leku obniżającego poziom lipidów, do próbek kontroli ujemnej nie dodaje się żadnego leku. Następnie potrząsaj płytką przez 30 sekund, umieszczając ją na płytce reakcyjnej analizatora biochemicznego-1, aby równomiernie wymieszać lek z roztworem.Na koniec dodaj dwa mikrolitry znakowanego fluorescencyjnie roztworu cholesterolu do każdej studzienki. Potrząsać płytką przez 30 sekund, umieszczając ją na płytce reakcyjnej analizatora biochemicznego-1, tak jak poprzednio. Następnie inkubuj płytkę na wytrząsarce laboratoryjnej przez dwie godziny w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 200 obr./min.Po inkubacji uzyskaj obrazy cząstek za pomocą obrazowania cytometrii przepływowej. Otwórz szablon akwizycji danych, aby załadować poprawne ustawienia instrumentu. Kliknij pozycję Plik, a następnie wybierz opcję Załaduj szablon i wybierz plik szablonu.Kliknij przycisk Load (Załaduj), aby przygotować urządzenie do załadunku próbki. Po otwarciu okna dialogowego Załaduj próbkę kliknij przycisk OK, aby załadować 50 mikrolitrów próbek do obrazowego cytometru przepływowego. Poczekaj, aż cząstki będą widoczne w obszarze obrazowania w czasie rzeczywistym.Gdy cząstki w obszarze obrazowania są dobrze ostre, kliknij przycisk Uzyskaj, aby uzyskać obrazy każdego obiektu jednocześnie w sposób wysokoprzepustowy dla ciemnego pola, jasnego pola, zielonej fluorescencji i żółtej fluorescencji. Na końcu pobierania kliknij przycisk Zwróć, aby zwrócić próbkę. Powtórz te kroki, aby uzyskać od 5 000 do 10 000 cząstek z każdej próbki.Analizuj wszystkie surowe pliki obrazów za pomocą oprogramowania do analizy obrazu w celu określenia intensywności fluorescencji obiektu i zmian morfologicznych, zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Przygotować okrągłodenną płytkę 96-dołkową o niskiej zawartości wiązania białek, ładując odczynniki w sposób krokowy, używając końcowej objętości reakcji 200 mikrolitrów na studzienkę. Najpierw przygotuj studzienki kontrolne.Załaduj 193 mikrolitry PBS do każdej studzienki. Dodaj 2,5% surowicy pacjenta, ładując tylko jedną próbkę surowicy na studzienkę. Następnie potrząsaj płytką przez 30 sekund, umieszczając ją na płytce reakcyjnej analizatora biochemicznego.Następnie dodaj dwa mikrolitry znakowanego fluorescencyjnie roztworu agregatu cholesterolu do każdej studzienki. Ponownie potrząsaj płytką przez 30 sekund, umieszczając ją na płytce reakcyjnej analizatora biochemicznego-1. Aby przygotować studzienki z lekami, załaduj 191 mikrolitrów PBS do każdej studzienki.Następnie dodaj 2,5% każdej surowicy pacjenta na studzienkę i potrząsaj płytką przez 30 sekund, umieszczając ją na płytce reakcyjnej analizatora biochemicznego-1. Dodać dwa mikrolitry roztworu ezetymibu, lowastatyny, symwastatyny lub niacyny do wszystkich studzienek z wyjątkiem studzienek kontroli ujemnej. Dodawanie tylko jednego leku na studzienkę.Potrząsaj płytką przez 30 sekund, tak jak poprzednio. Następnie dodaj dwa mikrolitry znakowanego fluorescencyjnie roztworu cholesterolu do każdej studzienki przed potrząsaniem płytką przez 30 sekund. Następnie inkubuj płytkę przez dwie godziny w wytrząsarce laboratoryjnej, ustawionej na 37 stopni Celsjusza i 200 obr./min.Po inkubacji pobrać próbki za pomocą obrazowej cytometrii przepływowej zgodnie z tymi samymi ustawieniami, co poprzednio. Użyj oprogramowania do analizy obrazów do przetwarzania wsadowego wszystkich plików obrazów zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Przedstawiono reprezentatywne wyniki pokazujące identyfikację kulistych i liniowych cząstek cholesterolu w kształcie pasma, indukowanych przez statyny, przez mechanizm nieenzymatyczny.Wykazano potwierdzenie dwóch odrębnych morfologii powstawania cząstek cholesterolu, indukowanych przez inne leki obniżające stężenie lipidów. W tym ezetymib, niacyna, fibrat i kwasy tłuszczowe omega-3. Pokazane są tutaj wykresy punktowe, na których oś X wyświetla widmo cząsteczek cholesterolu wykrytych w zielonym kanale fluorescencji.Oś Y wyświetla rozproszenie boczne, bramkowanie pokazuje obszary lipoprotein o bardzo niskiej gęstości, lipoprotein o niskiej gęstości i cząstek lipoprotein o dużej gęstości, wykrytych na fluorescencyjnych wykresach punktowych. Wyniki te pokazują, w jaki sposób efekt obniżania poziomu lipidów zmienia profile oczyszczonych cząsteczek cholesterolu VLDL i LDL w obecności nieobecności leku, ezemidu, lowastatyny, symwastatyny i niacyny. Pokazano tutaj ekran trzech różnych próbek surowicy w celu identyfikacji zróżnicowanego efektu różnych leków obniżających poziom lipidów, które modulują profile tworzenia cząsteczek cholesterolu VLDL, LDL i HDL.Profile te wskazują również, że istnieje różnica w poziomach odpowiedzi między trzema różnymi próbkami surowicy. Badanie przesiewowe pierwszej próbki surowicy pod kątem kulistych i liniowych cząstek cholesterolu powstałych bez leku i w obecności różnych leków obniżających poziom lipidów, potwierdza dwie odrębne morfologie cząstek cholesterolu pochodzących z surowicy, wykazujących zarówno kuliste, jak i liniowe kształty nici. W związku z tym udało nam się zademonstrować metodę obrazowania in vitro w celu identyfikacji działania leków obniżających poziom lipidów, które modulują związek z powstawaniem cząstek cholesterolu i ich znaczenia klinicznego.Nasze wstępne wyniki są obiecujące i jesteśmy w trakcie dalszej walidacji tego testu tablicowego przy użyciu próbek klinicznych na dużą skalę. Twój standardowy panel lipidowy mierzy poziom cholesterolu LDL i HDL w surowicy. Nasz test tablicy nazębnej ma nadzieję poprawić dokładność ryzyka miażdżycy i przewiduje odpowiedź na lek obniżający poziom lipidów za pomocą surowicy.

differential-effects-lipid-lowering-drugs-modulating-morphology

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Test oznaczania cholesterolu został opracowany w celu ilościowego określenia szybkości odpływu cholesterolu z hodowli komórkowych oraz zdolności akceptorów plazmy do przyjmowania cholesterolu uwalnianego z komórek. Procedura obejmuje znakowanie komórek cholesterolem, wyrównanie poziomu cholesterolu w pulach wewnątrzkomórkowych oraz uwalnianie cholesterolu do akceptora zewnątrzkomórkowego.

Test odpływu cholesterolu

Ponad połowa białek to małe białka (masa cząsteczkowa &lt;200 kDa), które stanowią wyzwanie zarówno dla obrazowania mikroskopem elektronowym, jak i dla trójwymiarowych rekonstrukcji. Zoptymalizowane barwienie negatywowe to solidny i wysokoprzepustowy protokół umożliwiający uzyskanie obrazów o wysokim kontraście i stosunkowo wysokiej rozdzielczości (~1 nm) małych asymetrycznych białek lub kompleksów w różnych warunkach fizjologicznych.

Zoptymalizowane barwienie ujemne: wysokoprzepustowy protokół do badania małej i asymetrycznej struktury białka za pomocą mikroskopii elektronowej

Ten protokół zapewnia skuteczne podejście do pomiaru wychwytu cholesterolu LDL z rzeczywistymi wskaźnikami napływu przy użyciu systemu obrazowania żywych komórek w różnych typach komórek. Technika ta stanowi platformę do badania przesiewowego aktywności farmakologicznej związków wpływających na napływ LDL przy jednoczesnym monitorowaniu morfologii komórek, a tym samym potencjalnej cytotoksyczności.

Test wychwytu cholesterolu LDL przy użyciu analizy obrazowania żywych komórek z monitorowaniem stanu zdrowia komórek

Tutaj przedstawiono ilościowy protokół oparty na reakcji łańcuchowej polimerazy w czasie rzeczywistym do określania natywnej zawartości mikro-RNA (bezwzględnej/względnej) w cząsteczkach lipoprotein. Ponadto przedstawiono metodę zwiększania poziomu mikro-RNA, a także metodę określania szybkości wychwytu komórkowego cząstek lipoprotein.

Wzbogacenie natywnych cząstek lipoprotein w mikroRNA, a następnie określenie ich bezwzględnej/względnej zawartości mikroRNA i szybkości transferu komórkowego

Prezentowane są dwie metody wzbogacania cholesterolu: zastosowanie cyklodekstryny nasyconej cholesterolem do wzbogacenia tkanek i komórek ssaków oraz zastosowanie wzbogaconych cholesterolem dyspersji na bazie fosfolipidów (liposomów) do wzbogacania oocytów Xendopus. Metody te odgrywają zasadniczą rolę w określaniu wpływu podwyższonego poziomu cholesterolu na funkcjonowanie molekularne, komórkowe i narządowe.

Wzbogacanie tkanek ssaków i oocytów Xenopus w cholesterol

Do analizy lipoprotein osocza użyto kilku metod; jednak ultrawirowanie jest nadal jedną z najbardziej popularnych i niezawodnych metod. W tym miejscu opisujemy metodę izolowania lipoprotein z osocza za pomocą sekwencyjnego ultrawirowania o gęstości oraz jak analizować apolipoproteiny zarówno do celów diagnostycznych, jak i badawczych.

Izolacja i analiza lipoprotein osocza metodą ultrawirowania

Tutaj opisujemy protokoły pomiaru ilości fluorescencyjnego fosfolipidu specjalnie usuwanego z cząstek dawcy lipidów za pomocą lipoproteiny o wysokiej gęstości (HDL) obecnej w całym ludzkim osoczu lub surowicy. Wykazaliśmy, że ten wskaźnik funkcjonalności HDL przewiduje występ chorób sercowo-naczyniowych.

Testy wypływu lipoproteiny o wysokiej gęstości

Obecne modele ex vivo glejaka (GBM) nie są zoptymalizowane pod kątem fizjologicznie istotnych badań nad inwazją nowotworów u ludzi. W tym miejscu przedstawiamy protokół generowania i utrzymywania organotypowych kultur warstwowych ze świeżej tkanki ludzkiej GBM. Przedstawiono opis technik mikroskopii poklatkowej i ilościowej analizy migracji komórek.

Organotypowy model hodowli warstwowej glejaka ludzkiego do badania migracji komórek nowotworowych i specyficznych dla pacjenta skutków leków przeciwinwazyjnych

Celem tego protokołu jest ocena specyficzności leków przeciwnowotworowych in vitro przy użyciu mieszanych kultur zawierających zarówno komórki nowotworowe, jak i nienowotworowe.

Ocena swoistości leków przeciwnowotworowych in vitro

Króliki są powszechnie wykorzystywane do badania farmakokinetyki leków podawanych wewnątrzgałkowo. Opisano metodę prowadzenia badań farmakokinetycznych leków wewnątrzgałkowych z wykorzystaniem oczu królika.

Zastosowanie oczu królika w badaniach farmakokinetycznych leków dogałkowych

Poznaj metodę płytkową do oceny wpływu leków obniżających poziom lipidów na morfologię cząstek cholesterolu. Technika ta umożliwia wizualizację cząstek VLDL i LDL oraz identyfikację potencjalnych biomarkerów miażdżycy.

Zróżnicowane działanie leków obniżających poziom lipidów w modulowaniu morfologii cząstek cholesterolu

Przeglądaj więcej filmów