Zróżnicowane działanie leków obniżających poziom lipidów w modulowaniu morfologii cząstek cholesterolu

Ogólnym celem tego badania jest ocena wpływu leków obniżających stężenie lipidów w modulowaniu cech morfologicznych cząstek cholesterolu za pomocą metody płytki nazębnej oraz identyfikacja potencjalnych biomarkerów do diagnozy miażdżycy i określania działania leków. Rola leków obniżających poziom lipidów w modulowaniu tworzenia cząsteczek cholesterolu jest słabo poznana. Tutaj pokazujemy, że leki obniżające poziom lipidów odgrywają bezpośrednią rolę w zmianie profili i cech morfologicznych tworzenia cząsteczek cholesterolu.

Główną zaletą metody obrazowania in vitro opartej na tablicy płytek nazębnych w porównaniu z innymi metodami wykrywania cząstek jest to, że umożliwia ona wizualizację cząsteczek cholesterolu w celu oceny wpływu leków obniżających poziom lipidów w surowicy. Jason Lundry, technik laboratoryjny firmy Plaxgen, zademonstruje, w jaki sposób konfigurujemy test tablicowy za pomocą analizatora biochemicznego. Raymond Kong, starszy naukowiec w Millipore Sigma, zademonstruje, w jaki sposób przetwarzamy próbki za pomocą obrazowej cytometrii przepływowej.

Na koniec David Liu, technik laboratoryjny Plaxgen, zademonstruje analizę danych dla obrazów cząsteczek cholesterolu. Użyj analizatora biochemicznego-1, aby skonfigurować test tablicy płytkowej do tworzenia cząstek cholesterolu. Przez cały czas trwania testu utrzymuj końcową objętość reakcji w każdym studzience na poziomie 200 mikrolitrów i wykonaj wszystkie testy w trzech

Najpierw załaduj 194 punkty pięć mikrolitrów soli fizjologicznej buforowanej fosforanem lub PDS do każdej studzienki 96-dołkowej płytki o okrągłym dnie, niskiej zawartości białka. Do każdej studzienki dodać dwa punkty pięć mikrolitrów każdego roztworu leku obniżającego poziom lipidów, do próbek kontroli ujemnej nie dodaje się żadnego leku. Następnie potrząsaj płytką przez 30 sekund, umieszczając ją na płytce reakcyjnej analizatora biochemicznego-1, aby równomiernie wymieszać lek z roztworem.

Na koniec dodaj dwa mikrolitry znakowanego fluorescencyjnie roztworu cholesterolu do każdej studzienki. Potrząsać płytką przez 30 sekund, umieszczając ją na płytce reakcyjnej analizatora biochemicznego-1, tak jak poprzednio. Następnie inkubuj płytkę na wytrząsarce laboratoryjnej przez dwie godziny w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 200 obr./min.

Po inkubacji uzyskaj obrazy cząstek za pomocą obrazowania cytometrii przepływowej. Otwórz szablon akwizycji danych, aby załadować poprawne ustawienia instrumentu. Kliknij pozycję Plik, a następnie wybierz opcję Załaduj szablon i wybierz plik szablonu.

Kliknij przycisk Load (Załaduj), aby przygotować urządzenie do załadunku próbki. Po otwarciu okna dialogowego Załaduj próbkę kliknij przycisk OK, aby załadować 50 mikrolitrów próbek do obrazowego cytometru przepływowego. Poczekaj, aż cząstki będą widoczne w obszarze obrazowania w czasie rzeczywistym.

Gdy cząstki w obszarze obrazowania są dobrze ostre, kliknij przycisk Uzyskaj, aby uzyskać obrazy każdego obiektu jednocześnie w sposób wysokoprzepustowy dla ciemnego pola, jasnego pola, zielonej fluorescencji i żółtej fluorescencji. Na końcu pobierania kliknij przycisk Zwróć, aby zwrócić próbkę. Powtórz te kroki, aby uzyskać od 5 000 do 10 000 cząstek z każdej próbki.

Analizuj wszystkie surowe pliki obrazów za pomocą oprogramowania do analizy obrazu w celu określenia intensywności fluorescencji obiektu i zmian morfologicznych, zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Przygotować okrągłodenną płytkę 96-dołkową o niskiej zawartości wiązania białek, ładując odczynniki w sposób krokowy, używając końcowej objętości reakcji 200 mikrolitrów na studzienkę. Najpierw przygotuj studzienki kontrolne.

Załaduj 193 mikrolitry PBS do każdej studzienki. Dodaj 2,5% surowicy pacjenta, ładując tylko jedną próbkę surowicy na studzienkę. Następnie potrząsaj płytką przez 30 sekund, umieszczając ją na płytce reakcyjnej analizatora biochemicznego.

Następnie dodaj dwa mikrolitry znakowanego fluorescencyjnie roztworu agregatu cholesterolu do każdej studzienki. Ponownie potrząsaj płytką przez 30 sekund, umieszczając ją na płytce reakcyjnej analizatora biochemicznego-1. Aby przygotować studzienki z lekami, załaduj 191 mikrolitrów PBS do każdej studzienki.

Następnie dodaj 2,5% każdej surowicy pacjenta na studzienkę i potrząsaj płytką przez 30 sekund, umieszczając ją na płytce reakcyjnej analizatora biochemicznego-1. Dodać dwa mikrolitry roztworu ezetymibu, lowastatyny, symwastatyny lub niacyny do wszystkich studzienek z wyjątkiem studzienek kontroli ujemnej. Dodawanie tylko jednego leku na studzienkę.

Potrząsaj płytką przez 30 sekund, tak jak poprzednio. Następnie dodaj dwa mikrolitry znakowanego fluorescencyjnie roztworu cholesterolu do każdej studzienki przed potrząsaniem płytką przez 30 sekund. Następnie inkubuj płytkę przez dwie godziny w wytrząsarce laboratoryjnej, ustawionej na 37 stopni Celsjusza i 200 obr./min.

Po inkubacji pobrać próbki za pomocą obrazowej cytometrii przepływowej zgodnie z tymi samymi ustawieniami, co poprzednio. Użyj oprogramowania do analizy obrazów do przetwarzania wsadowego wszystkich plików obrazów zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Przedstawiono reprezentatywne wyniki pokazujące identyfikację kulistych i liniowych cząstek cholesterolu w kształcie pasma, indukowanych przez statyny, przez mechanizm nieenzymatyczny.

Wykazano potwierdzenie dwóch odrębnych morfologii powstawania cząstek cholesterolu, indukowanych przez inne leki obniżające stężenie lipidów. W tym ezetymib, niacyna, fibrat i kwasy tłuszczowe omega-3. Pokazane są tutaj wykresy punktowe, na których oś X wyświetla widmo cząsteczek cholesterolu wykrytych w zielonym kanale fluorescencji.

Oś Y wyświetla rozproszenie boczne, bramkowanie pokazuje obszary lipoprotein o bardzo niskiej gęstości, lipoprotein o niskiej gęstości i cząstek lipoprotein o dużej gęstości, wykrytych na fluorescencyjnych wykresach punktowych. Wyniki te pokazują, w jaki sposób efekt obniżania poziomu lipidów zmienia profile oczyszczonych cząsteczek cholesterolu VLDL i LDL w obecności nieobecności leku, ezemidu, lowastatyny, symwastatyny i niacyny. Pokazano tutaj ekran trzech różnych próbek surowicy w celu identyfikacji zróżnicowanego efektu różnych leków obniżających poziom lipidów, które modulują profile tworzenia cząsteczek cholesterolu VLDL, LDL i HDL.

Profile te wskazują również, że istnieje różnica w poziomach odpowiedzi między trzema różnymi próbkami surowicy. Badanie przesiewowe pierwszej próbki surowicy pod kątem kulistych i liniowych cząstek cholesterolu powstałych bez leku i w obecności różnych leków obniżających poziom lipidów, potwierdza dwie odrębne morfologie cząstek cholesterolu pochodzących z surowicy, wykazujących zarówno kuliste, jak i liniowe kształty nici. W związku z tym udało nam się zademonstrować metodę obrazowania in vitro w celu identyfikacji działania leków obniżających poziom lipidów, które modulują związek z powstawaniem cząstek cholesterolu i ich znaczenia klinicznego.

Nasze wstępne wyniki są obiecujące i jesteśmy w trakcie dalszej walidacji tego testu tablicowego przy użyciu próbek klinicznych na dużą skalę. Twój standardowy panel lipidowy mierzy poziom cholesterolu LDL i HDL w surowicy. Nasz test tablicy nazębnej ma nadzieję poprawić dokładność ryzyka miażdżycy i przewiduje odpowiedź na lek obniżający poziom lipidów za pomocą surowicy.