Name: Zoptymalizowane barwienie ujemne: wysokoprzepustowy protokół do badania małej i asymetrycznej struktury białka za pomocą mikroskopii elektronowej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-08-15T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 37 s
Description: Poznaj zoptymalizowany protokół barwienia ujemnego do wysokoprzepustowej mikroskopii elektronowej małych i asymetrycznych białek. Ta metoda umożliwia uzyskanie obrazów wysokiej rozdzielczości z redukcją artefaktów strukturalnych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dziękujemy Dr. Mickey'emu Yangowi za edycję i komentarze, a Dr. Lei Zhang i Bo Peng za pomoc. Prace te były wspierane przez Biuro Nauki, Biuro Podstawowych Nauk Energetycznych Departamentu Energii Stanów Zjednoczonych (kontrakt nr. DE-AC02-05CH11231), Narodowy Instytut Serca, Płuc i Krwi Narodowych Instytutów Zdrowia (nr R01HL115153) oraz Narodowy Instytut Ogólnych Nauk Medycznych Narodowych Instytutów Zdrowia (nr R01GM104427).

1. Przygotowanie świeżego roztworu do barwienia negatywnego o stężeniu 1% (w/v)
<ol>
	<li>Umieść 1 mg proszku mrówczanu uranylu (UF) w szklanej butelce zawierającej 100 ml wody dejonizowanej w ciemnym pomieszczeniu lub pudełku.</li>
	<li>Wymieszaj roztwór O/N w temperaturze RT w ciemnym pomieszczeniu/pudełku. Owiń butelkę z roztworem folią aluminiową, aby zapobiec wpadaniu światła do roztworu.</li>
	<li>Delikatnie przefiltrować roztwór przez filtr 0,2 μm (wielkość porów) zamontowany na strzykawce o pojemności 5 ml. Przefiltrowany roztwór zebrano do kilku rurek Falcon pokrytych folią aluminiową. Strzykawka z filtrem musi być również owinięta folią aluminiową, aby zapobiec ekspozycji na światło.</li>
	<li>Przefiltrować roztwór ponownie przez filtr 0,02 μm (wielkość porów) zamontowany na strzykawce o pojemności 1 ml. Przefiltrowany roztwór zebrano i podwielokrotniono do fiolek o pojemności 2 ml. Strzykawki i fiolki należy przykryć folią aluminiową przed użyciem.</li>
	<li>Zamrozić podwielokrotne fiolki za pomocą kleszczy o długich uchwytach, zanurzając fiolki w pojemniku wypełnionym ciekłym azotem natychmiast po przefiltrowaniu roztworu.</li>
	<li>Przenieść zamrożone fiolki do zamrażarki o temperaturze -80 °C w celu przechowywania i wykorzystania w przyszłości.</li>
</ol>
2. Przygotowanie stanowiska do barwienia negatywnego i stanowiska do inkubacji
<ol>
	<li>Rozmrozić fiolkę z 1% roztworem UF w łaźni wodnej ustawionej na suchą temperaturę (RT). Upewnij się, że folia aluminiowa pozostaje owinięta wokół fiolki, aby zapobiec ekspozycji na światło.</li>
	<li>Przefiltruj roztwór po całkowitym rozmrożeniu za pomocą owiniętej folią aluminiową strzykawki o pojemności 1 ml z filtrem 0,02 μm. Zbierz przefiltrowany roztwór do nowej fiolki owiniętej folią aluminiową i umieść go na lodzie w pojemniku na lód pokrytym nakrętką, czekając na użycie.</li>
	<li>Przygotuj płytki roztworu, naciskając palcem arkusz Parafilmu o długości ~ 8 cali na powierzchnię pustej płytki krystalizacyjnej białka. Wygeneruje rzędy okrągłych płytek o średnicy ~5 mm. Wykonaj 6 płytek w każdym rzędzie, umieść płytki Parafilm na powierzchni spłaszczonego lodu w pokrywie pojemnika na lód, jako stację roboczą do barwienia.</li>
	<li>Odpipetować ~35 μl wody dejonizowanej na każdą z trzech lewych płytek w każdym rzędzie, a pipetą ~35 μl przefiltrowanego roztworu UF na prawe trzy płytki w każdym rzędzie. Przykryj stację roboczą barwienia pokrywką, aby zapobiec ekspozycji na światło przed barwieniem białek.</li>
	<li>Przygotuj stację inkubacyjną z siatką EM, wypełniając puste pudełko do połowy lodem i przyklejając obok wieszaka, który można zamontować na podstawie nośnej. Umieść pęsetę do próbek w wieszaku, w którym końcówki pęsety znajdują się blisko powierzchni lodu. Zakryj do połowy końcówki pęsety na wysokości krawędzi pudełka. Idealnym pojemnikiem na lód do wykonania stacji inkubacyjnej jest użycie pustego pojemnika na końcówki do pipet.</li>
</ol>
3. Operacja OpNS
<ol>
	<li>Wyładowanie jarzeniowe cienkich siatek miedzianych EM o oczkach 300 pokrytych folią węglową przez 10 sekund.</li>
	<li>Podnieś siatkę za pomocą pęsety i zaczep pęsetę o wieszak, trzymając siatkę pod kątem 45° i 1 cal nad powierzchnią lodu wewnątrz stacji inkubacyjnej.</li>
	<li>Rozcieńczyć próbkę białka solą fizjologiczną buforowaną fosforanem (DBPS) firmy Dulbecco przy końcowym stężeniu białka od ~0,01 do ~0,005 mg/ml. Natychmiast po rozcieńczeniu rozcieńczyć ~4 μl rozcieńczonej próbki po stronie węglowej siatki EM. (DPBS może zostać zamieniony na inny bufor, jeśli białko jest wrażliwe na DPBS)</li>
	<li>Inkubować próbkę na siatkach EM przez ~1 minutę w stacji inkubacji.</li>
	<li>Usuń nadmiar roztworu, szybko dotykając krawędzi siatki bibułą filtracyjną.</li>
	<li>Szybko przyłóż siatkę do pierwszej kropli (~35 μl) powierzchni czystej wody na powierzchni arkusza Parafilm zaraz po usunięciu nadmiaru roztworu z siatki EM. A następnie natychmiast usuń nadmiar wody za pomocą bibuły filtracyjnej.</li>
	<li>Powtórzyć krok 3.6 przez kolejne dwa razy, myjąc siatkę EM na pozostałych dwóch kropelkach wody na Parafilm (kroki 3.6 i 3.7 można pominąć, jeśli próbka jest bardzo wrażliwa na wodę).</li>
	<li>Umieść siatkę EM natychmiast na powierzchni pierwszej kropli roztworu UF zaraz po usunięciu nadmiaru wody z siatki EM. A następnie inkubować przez 10 sekund. Upewnij się, że procedury mycia wodą zostały zakończone w ciągu 3 sekund przed uniesieniem siatki na powierzchni roztworu UF. Im krótszy czas prania, tym lepsza będzie jakość.</li>
	<li>Wyczyść pęsetę, wbijając końcówki w bibułę filtracyjną ~2 - 3 razy.</li>
	<li>Usuń nadmiar roztworu z siatki, stykając krawędź siatki z bibułą filtracyjną, a następnie unieś siatkę na drugiej kropli UF.</li>
	<li>Kontynuuj powyżej kroku 3.10 na drugiej kropli.</li>
	<li>Spławić siatkę na trzeciej kropli roztworu UF i przykryć stację barwienia na ~1 min.</li>
	<li>Opcjonalny krok: szybko umyć ruszt na powierzchni wody, jak opisano w ppkt 3.6. Ten dodatkowy krok będzie korzystny dla próbek zawierających nadmiernie załadowane wolne cząstki złota lub plamy tła.</li>
	<li>Usuń nadmiar roztworu, dotykając bibuły filtracyjnej do całego tyłu siatki (po przeciwnej stronie węglowej). Wysuszyć siatkę pod delikatnym strumieniem azotu gazowego o temperaturze pokojowej zaraz po zaobserwowaniu, jak roztwór wchłania się do bibuły filtracyjnej.</li>
	<li>Umieść siatkę na arkuszu bibuły filtracyjnej wewnątrz szalki Petriego i częściowo przykryj naczynie nakrętką, aby wyschło przez co najmniej 30 minut w temperaturze pokojowej. W przypadku niektórych próbek umieść siatkę w inkubatorze o temperaturze 40 °C i piecz przez godzinę.</li>
	<li>Przechowuj siatkę w skrzynce siatki EM do przyszłego badania EM.</li>
</ol>
4. Egzamin EM
<ol>
	<li>Prawidłowo wyrównaj TEM przed badaniem EM małych białek na siatce.
	<ol>
		<li>Sprawdź rozdzielczość najwyższego widocznego pierścienia Thona, który jest widmem mocy amorficznej warstwy węglowej, aby określić, czy TEM został prawidłowo wyrównany. Ponieważ TEM jest współdzielony przez wielu różnych użytkowników, TEM często nie był odpowiednio wyrównany.</li>
		<li>Dokładnie sprawdź widmo mocy w obszarze folii węglowej próbki, aby dostosować warunki wyrównania maszyny. Najwyższe widoczne pierścienie Thon są lepsze niż rozdzielczość docelowa. 
		UWAGA: Jako przykład prawidłowego ustawienia TEM filamentu LaB6 pracującego pod wysokim napięciem 120 kV, można zwizualizować ponad 20 pierścieni Thon, w których odpowiednia rozdzielczość może być lepsza niż 5,0 A. Ten pierścień Thona został osiągnięty przez transfer Fouriera amorficznej warstwy węgla zobrazowanej pod rozogniskowaniem ~1,6 μm i dawką 20,4 e-/Å2 (Ryc. 5). 
		UWAGA: Obserwacja pierścienia Thon-ring o wysokiej rozdzielczości jest warunkiem koniecznym, ale niewystarczającym do prawidłowego ustawienia. Aby faktycznie uzyskać obrazy o wysokiej rozdzielczości, ważnych jest również wiele innych parametrów, takich jak jakość próbki, uszkodzenia spowodowane promieniowaniem, ładowanie i dryfowanie, a także szybkość dawki oświetlenia.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Ustaw ostrość z powrotem na ogniskową bliską Scherzerowi, aby zobrazować małe białka na idealnie wybarwionym obszarze.</li>
	<li>Wyszukaj "zachmurzony" obszar do zobrazowania. Idealnie zabarwiony obszar znajduje się zwykle w pobliżu krawędzi grubszego obszaru plamy, który wygląda jak "mętny" obszar na siatce, ponieważ grubość plamy zwykle nie jest równomiernie rozłożona na siatce pokrytej węglem (rysunek 6). Zazwyczaj małe powiększenie (<100x) miało pomóc w znalezieniu tych mętnych obszarów przed zbliżeniem w celu zobrazowania.</li>
</ol>

Nie mamy nic do ujawnienia.

W porównaniu z konwencjonalnymi technikami NS, OpNS może zapobiegać artefaktom rouleaux (ryc. 1 i 9), zapewniając wiarygodne i rozsądne szczegóły strukturalne małych białek o wysokiej rozdzielczości (~1 nm) (ryc. 2). W porównaniu z cryo-EM, OpNS zapewnia metodę o wysokiej przepustowości i może badać szeroką gamę białek i interakcji białko-białko6. Jednak OpNS nadal ma swoje wady. W porównaniu z konwencjonalnym NS, OpNS pociąga za sobą: i) bardziej skomplikowane etapy przygotowania próbki; ii) przy użyciu substancji promieniotwórczej, UF; iii) utrzymanie świeżości plamy ze względu na krótszą siłę działania plamy UF ze względu na jej wrażliwość na światło; iv) w celu zapobieżenia wytrącaniu się osadów, roztwór UF musi być przechowywany w temperaturze -80 °C i wymaga rozmrożenia przed użyciem; v) i wreszcie wszystkie UF muszą być traktowane jako odpady niebezpieczne. W porównaniu do cryo-EM, OpNS zapewnia obrazy o stosunkowo niższej rozdzielczości i nie ma gwarancji na jakikolwiek jeszcze nie odkryty artefakt w przyszłości.
Działanie NS Wpływ proceduralny na tworzenie lipoprotein rouleaux
Protokoły NS przygotowania białek do badania16,29-36,55 można podzielić na trzy główne grupy metod50: mieszanie55, kropla po kropli16 i procedury płukania29. i) Protokół mieszania wymaga wstępnego wymieszania próbki barwienia i białka w określonym stosunku, a następnie nałożenia zmieszanego roztworu na folię węglową pokrytą na siatce, ostatecznie usuwając nadmiar roztworu bibułą filtracyjną przed wysuszeniem na powietrzu w celu badania EM55. ii) Protokół kropla po kropli polega na nałożeniu kropli próbki (~ 4 μl) bezpośrednio na siatkę EM pokrytą węglem, pozostawiając na ~ 1 minutę, a następnie usuwając nadmiar roztworu próbki przed nałożeniem kropli (~ 4 μl) roztworu barwie po tej samej stronie siatki. Po ~1 min inkubacji usunąć nadmiar plamy poprzez kontakt z czystą bibułą filtracyjną, ostatecznie poddając do suszenia na powietrzu16,56-58. iii) Protokół płukania (rysunek 7) wymagający nałożenia roztworu próbki na siatkę EM pokrytą węglem przez 1 minutę, a następnie trzykrotne przemycie wodą dejonizowaną zaraz po usunięciu nadmiaru roztworu za każdym razem za pomocą bibuły filtracyjnej3,29,30. Protokół OpNS został zmodyfikowany w stosunku do tej procedury mycia.
Rodzaje barwienia NS i wpływ na tworzenie lipoprotein rouleaux
W NS silniejsze rozpraszanie elektronów spowodowane barwieniem metalami ciężkimi zapewnia kontrast z białkami17-20,59. Próbki NS mogą dodatkowo cierpieć na większe dawki promieniowania i wzmacniać cechy białka poprzez ostrzejszy kontrast ujemny8,9,60. Barwniki metali ciężkich można podzielić na: anionowe, w tym kwas fosfowolframowy (PTA)16, wolframian metyloaminy14 i wolfracian krzemu61; i kationowe, takie jak octan uranylu (UA)62, UF3,29,30 i azotan uranylu (UN)63. Jednym z najczęściej stosowanych anionowych barwników NS jest PTA33,64-67. PTA to kwas heteropoli, który jest zwykle stosowany o pH około 7,0 - 7,5. PTA może być również stosowany do barwienia dodatniego3,16,68. Ujemne ładunki PTA mogą pośredniczyć w oddziaływaniach elektrostatycznych z nienasyconymi lipidami dodatnio naładowanymi grupami głowy, takimi jak POPC, zarówno na powierzchniach lipoprotein, jak i liposomów. PTA może powodować tworzenie się ruleaux poprzez tę interakcję 29,30 nawet przy regularnym zasoleniu buforu29,30 (ryc. 1). Barwienia uranylowe, takie jak UA, UF i UN, są alternatywnym wyborem dla kationowych barwników metali ciężkich, a w szczególności UA jest często stosowany do NS różnych próbek biologicznych62,69,70. Eksperymenty wykazały, że UF nie powoduje ruleaux lipoprotein zawierających nienasycone lipidy kwasów tłuszczowych, takich jak POPC. Jednak UF może nadal indukować tworzenie rouleaux na lipoproteinach, które zawierają nasycone lipidy kwasów tłuszczowych, takie jak dimyrystoylfosfatydylocholina (DMPC) i 1-heksadekanoilo-2-oktadekanoilo-sn-glicero-3-fosfocholina (PSPC). Szczegółowy mechanizm tej interakcji nie jest znany. UA/UF/UN mogą pracować przy niższych wartościach pH w zakresie od 3,5 do 4,6. Tak niższe wartości pH mogą nie być odpowiednie dla niektórych makrocząsteczek biologicznych, które są wrażliwe na pH14,71. Co ciekawe, UA/UF może naprawić strukturę białka w ciągu kilku milisekund za pomocą nieznanego mechanizmu72. W przeciwieństwie do PTA, UA/UF jest bardziej podobny do soli niż kwasu.
UF podobno może zapewnić lepsze wyniki niż UA73, w którym plamy UF i UN mają mniejsze rozmiary ziaren niż UA (UF: 0,3 nm, UN: ~0,5 nm)3,74. Interesującym przykładem są drugorzędowe szczegóły przypominające strukturę małego białka (53 kDa CETP) bezpośrednio wizualizowane na podstawie surowych mikrofotografii, gdy UF został użyty jako odczynnik barwienia ujemnego, postępując zgodnie z wcześniej opisaną metodą barwienia krio-dodatniego (cryo-PS) (Figura 8)6. W cryo-PS wybarwiona próbka została błyskawicznie zamrożona poprzez zastosowanie procedury przygotowania próbki cryo-EM zamiast procedury suszenia w protokole OpNS, co może spowodować wtórne zapadnięcie się struktury. Cryo-PS to metoda obrazowania małych białek o wysokim kontraście i wysokiej rozdzielczości75. Ponieważ obrazy cryo-PS mają odwrócony kontrast w porównaniu z tymi z raportowanego protokołu cryo-NS 22, ale mają stały kontrast obrazu z tymi z konwencjonalnych obrazów cryo-EM, dlatego nazwano ją metodą cryo-PS. Obrazy cryo-PS pokazują, że odczynnik barwiący, mrówczan uranylu, wnika w powierzchnię molekularną, kwestionując konwencjonalny pogląd, że barwienie może uwidocznić tylko zewnętrzną strukturę powierzchni. Mechanizm przenikania mrówczanu uranylu do powierzchni molekularnej jest nieznany. Jedną z możliwości jest to, że kation Uranyl wiąże dostępne białkowe grupy karboksylowe, a zatem otaczający lód szklisty ma mniejszą gęstość niż barwienie białka i grup Uranyl, działając w ten sposób jako barwienie dodatnie. Metoda cryo-PS jest podobna do metody wielokrotnej wymiany izomorficznej (MIR), która była powszechnym podejściem do rozwiązania problemu fazowego w krystalografii rentgenowskiej 76-78. W MIR próbki kryształów są nasączane roztworem ciężkich atomów, w tym uranu, aby uzyskać formę izomorficzną do formy natywnej. Dodanie ciężkiego atomu czasami nie wpływa na tworzenie się kryształów ani wymiary komórki elementarnej, ale dostarcza dodatkowych informacji na temat określania struktury krystalicznej76-78. Korzystając z małego ziarna UF, cryo-PS może zapewnić obraz pojedynczego białka o wysokim kontraście i wysokiej rozdzielczości, co jest ważne dla badań struktury białka, zwłaszcza biorąc pod uwagę, że prawie wszystkie białka są naturalnie dynamiczne i niejednorodne w roztworze. W celu walidacji tej metody cryo-PS otwieramy się na dowolny ślepy test z pola EM.
Wpływ stężenia soli na tworzenie rouleaux w lipoproteinach
Używając tradycyjnego odczynnika barwiącego PTA ujemnego, obserwowane tworzenie się rouleaux jest bardziej prawdopodobne związane z interakcjami lipidów niż z interakcją z białkami. Obrazując próbki pęcherzyków liposomowych POPC przygotowanych przy znacznym zasoleniu (0,5 M NaCl), umiarkowanym zasoleniu (0,25 M NaCl), stosunkowo słabym zasoleniu (0,1 M NaCl) i czystej wodzie (Figura 9), mikrofotografie elektronowe pokazują, że tworzenie rouleaux było skorelowane ze stężeniem soli (Figura 9A - D). Stosując UF jako ujemny odczynnik barwiący, nie zaobserwowano rouleaux w próbce pęcherzyków liposomowych POPC30 (ryc. 2L), co sugeruje, że procedura mycia w celu szybkiego zmniejszenia stężenia soli tuż przed barwieniem jest koniecznym, ale nie wystarczającym samodzielnie krokiem do zapobiegania rouleaux w próbkach związanych z POPC.
Obrazowanie małego białka TEM wymaga warunku ogniskowego zbliżonego do scherzera.
Udane obrazowanie TEM małych białek w wyższej rozdzielczości wymaga dwóch krytycznych warunków: prawidłowego ustawienia wiązki i warunków akwizycji ostrości zbliżonej do Scherzera. i) Prawidłowe ustawienie wiązki można ocenić na podstawie liczby widocznych pierścieni Thona (widmo mocy) na transferze Fouriera obrazu filmu węglowego uzyskanego przy stosunkowo dużym rozogniskowaniu. Im lepszy stan wyrównania belki, tym więcej pierścieni Thon można zwizualizować i zmierzyć. ii) Uzyskanie obrazu w ognisku zbliżonym do Scherzera jest kolejnym krytycznym warunkiem. Tradycyjna standardowa strategia obrazowania próbek biologicznych zazwyczaj wykorzystuje wysokie rozogniskowanie (1 - 2 μm, a nawet więcej), co może zwiększyć kontrast obrazu próbki biologicznej 79. Strategia ta znacznie różni się od typowej strategii obrazowania struktury rozdzielczości atomowej twardych materiałów, która często wykorzystuje ognisko bliskie Scherzerowi (rozogniskowanie ~50 nm). Chociaż większe rozogniskowanie mogłoby wzmocnić kontrast próbki biologicznej, sygnały o wysokiej rozdzielczości zostałyby częściowo wyeliminowane. W rezultacie, udział sygnału o wysokiej rozdzielczości byłby niższy w warunkach obrazowania z wyższym rozmyciem. Powodem jest to, że obraz TEM jest splotem struktury próbki i instrumentu CTF. CTF jest krzywą oscylacyjną w stosunku do częstotliwości, w której krzywa często oscylowała, przecinając zerową amplitudę przy wysokiej częstotliwości. Za każdym razem, gdy CTF przekroczy zero, próbkowany sygnał strukturalny o tej określonej częstotliwości zostanie wyeliminowany (zero razy dowolna liczba będzie równa zero). Wyeliminowany sygnał o tej częstotliwości nigdy nie może być odzyskany przez żaden algorytm korekcji CTF (zero podzielone przez zero może być dowolną liczbą losową zamiast oryginalnego sygnału strukturalnego). Przy obrazowaniu z wyższym rozogniskowaniem CTF będzie oscylował znacznie bardziej agresywnie, dzięki czemu CTF częściej przekracza zerową amplitudę, w wyniku czego sygnały strukturalne o większej liczbie określonych częstotliwości zostaną wyeliminowane. Im więcej sygnałów zostanie wyeliminowanych, tym mniejszy będzie współudział w obrazie. Warto zauważyć, że współudział obrazu nie może być odzyskany ani skorygowany przez żadną korektę CTF. Jednak pewna liczba nieukończonych obrazów uzyskanych przy różnych rozogniskowaniach może być wykorzystana do wypełnienia ich luk względem siebie, aby uzyskać kompletny sygnał strukturalny struktury próbki za pomocą metody uśredniania, w której można osiągnąć nawet rozdzielczość atomową 9-12 .
Metoda uśredniania jest skutecznym podejściem do uzyskania struktury niektórych wysoce symetrycznych białek i strukturalnie powiązanych sztywnych białek. Jednak nadal pozostaje wyzwaniem w badaniach strukturalnych małych i asymetrycznych białek, zwłaszcza w przypadku dynamiki strukturalnej i elastycznych białek, takich jak przeciwciała i HDL. Uśrednianie opiera się na założeniu, że cząstki białka są identyczne pod względem struktury i konformacji, ale różnią się orientacją, jednak wiadomo, że wiele białek ulega wahaniom termodynamicznym w roztworze. Stosując metodę uśredniania bez wcześniejszej znajomości fluktuacji termodynamicznych białek, uśredniona struktura może często powodować brakujące domeny 10,80 lub lokalną zmienność rozdzielczości 81 w rekonstrukcjach krio-EM.
Sukces w osiągnięciu rekonstrukcji 3D małego białka, takiego jak CETP 53 kDa, oraz struktury 3D pojedynczego białka, takiego jak przeciwciało IgG1 160 kDa, jest korzystny dzięki zastosowaniu warunków obrazowania ogniskowego zbliżonego do Scherzera w odpowiednich warunkach wyrównania. Chociaż kontrast obrazu wydaje się niski na obrazach o ostrości zbliżonej do Scherzera, kontrast można łatwo poprawić, po prostu stosując filtrowanie dolnoprzepustowe w celu zmniejszenia szumów o wysokiej częstotliwości w tle. Uważamy, że obrazy ostrości zbliżone do Scherzera przenoszą maksymalne sygnały strukturalne i mogą zwiększyć dokładność wyrównania cząstek oraz zwiększyć wydajność w rekonstrukcji 3D pojedynczych cząstek i rekonstrukcji tomografii elektronowej pojedynczych cząstek.

Zrozumienie funkcji białka wymaga znajomości struktury białka. Określenie strukturalne jest wyzwaniem w przypadku białek, których masy cząsteczkowe mieszczą się w zakresie 40 - 200 kDa. Krystalografia rentgenowska jest ograniczona przez krystalizację białek; Spektroskopia magnetycznego rezonansu jądrowego (NMR) jest ograniczona do mas cząsteczkowych mniejszych niż 40 KDa, podczas gdy mikroskopia krioelektronowa (cryo-EM) ma trudności zarówno w akwizycji obrazu, jak i trójwymiarowych (3D) rekonstrukcjach małych białek, których masy cząsteczkowe są mniejsze niż 200 kDa. Warto zauważyć, że ponad 50% białek ma masę cząsteczkową w zakresie 40 - 200 kDa1,2, ponieważ obecne metody stanowią wyzwanie w badaniu białek tej wielkości, potrzebna jest nowa metoda.
Chociaż większość transmisyjnych mikroskopów elektronowych (TEM) jest zdolna do rozdzielczości atomowej, tj. lepszej niż 3 A, osiągnięcie nawet zbliżonej do nanometrowej rozdzielczości struktury z próbek biologicznych jest raczejtrudne7. Uszkodzenia spowodowane promieniowaniem, niski kontrast, odchylenia strukturalne, a także artefakty, takie jak odwodnienie, utrudniają obrazowanie TEM w wysokiej rozdzielczości3,8.
Wśród różnych podejść TEM, cryo-EM jest zaawansowaną i najnowocześniejszą metodą osiągania struktur o rozdzielczości atomowej wysoce symetrycznych dużych makrocząsteczek w warunkach zbliżonych do fizjologicznych9-12. Próbka cryo-EM jest przygotowywana w wyniku błyskawicznego zamrażania roztworu próbki, osadzania makrocząsteczek w szklistym lodzie, który jest następnie obrazowany w temperaturach kriogenicznych, takich jak temperatury ciekłego azotu lub helu13. Zaletą Cryo-EM jest to, że próbki nie wykazują żadnych artefaktów i są prawie natywne w strukturze8-12. Cryo-EM ma swoje wady: i) wymagane jest zainstalowanie lub zakupienie dodatkowych urządzeń w celu ulepszenia standardowego instrumentu TEM do funkcji cryo-EM. Do urządzeń zalicza się: anty-concyminator, kriouchwyt, oprogramowanie w trybie niskiej dawki i kamerę CCD o niskiej dawce, chociaż ceny tych urządzeń są znacznie niższe niż cena samego instrumentu TEM; ii) operacja cryo-EM wymaga dłuższego czasu niż operacja NS. Badanie próbki cryo-EM często wymaga więcej czasu na przygotowanie próbek i obsługę przyrządu TEM niż w przypadku NS, ponieważ cryo-EM wymaga rozwiązania dodatkowych trudności, w tym: działania temperatury ciekłego azotu, ładowania próbki, dryftu obrazowania, gradientów temperatury, pracy modelu niskiej dawki, wrażliwości próbki na promieniowanie i ograniczeń dawkowania. Te dodatkowe kroki spowolnią szybkość pozyskiwania użytecznych danych w porównaniu z akwizycją danych NS, chociaż kilka obrazów krio-EM z pewnością może zostać uzyskanych w ciągu 1 godziny lub krócej przez ekspertów krio-EM z instrumentem przygotowanym ze zrównoważonym gradientem temperatury; iii) użytkownicy wymagają dodatkowego szkolenia, takiego jak obchodzenie się z ciekłym azotem, zamrażanie siatek krioelektromagnetycznych, obsługa niskich dawek, pomiar dawki, obsługa ładowania, dryfowanie i wiedza w zakresie przetwarzania obrazu; iv) brak powtarzalnego obrazowania dla tej samej próbki krio podczas różnych sesji TEM. Próbki Cryo-EM łatwo ulegają uszkodzeniu przez zanieczyszczenie lodem podczas załadunku i rozładunku próbek do/z przyrządu TEM. Uszkodzenie to jest szczególnie niepokojące, gdy próbki są trudne do wyizolowania/oczyszczenia14; v) małe białka (masa cząsteczkowa <200 kDa) są trudne do zobrazowania ze względu na niski kontrast; vi) niski kontrast i wysoki szum obrazów krio-EM zmniejszają wartość korelacji krzyżowej między obrazami, zmniejszając w ten sposób ogólną dokładność w określaniu orientacji, konformacji i klasyfikacji białek, szczególnie w przypadku białek, które są strukturalnie elastyczne i naturalnie ulegają wahaniom w roztworze4,5.
Barwienie ujemne (NS) jest stosunkowo "starożytną" i historyczną metodą, którą każde laboratorium, z dowolnym typem EM, może wykorzystać do zbadania struktury białka. Brenner i Horne po raz pierwszy opracowali koncepcję barwienia negatywnego pół wieku temu do badania wirusów15. NS uzyskuje się poprzez pokrycie próbki naładowanymi solami metali ciężkich. Koncepcja ta wywodzi się z mikroskopii świetlnej i praktyki osadzania bakterii w roztworze barwienia, zapewniając ciemność wokół próbek, umożliwiając wyższy kontrast obrazu podczas oglądania obrazu negatywowego16. Ponieważ jony metali ciężkich mają większą zdolność do rozpraszania elektronów w porównaniu z mniej gęstymi atomami w białkach17-20, a powlekanie barwnikiem metali ciężkich pozwala na większe ograniczenie dawki przy lepszym kontraście. Próbka NS może dostarczać obrazy o wysokim kontraście8 w celu łatwiejszego określenia orientacji cząstek i rekonstrukcji 3D niż obrazy z cryo-EM.
Tradycyjny NS, niestety, może wytwarzać artefakty wywołane przez interakcje barwnik-białko, takie jak ogólna agregacja, dysocjacja molekularna, spłaszczanie i układanie8,21,22. W przypadku białek związanych z lipidami, takich jak lipoproteiny16,23-30, powszechnym artefaktem są cząsteczki, które są ułożone w stos i upakowane razem w ruleaux (ryc. 1) 31-36. Wiele badań lipoprotein, takich jak niedenaturująca elektroforeza w żelu gradientowym poliakrylamidowym, badania krio-EM13,29,37-40, spektrometria mas39,41 i dane dyfrakcji rentgenowskiej pod małym kątem42 pokazują, że cząstki lipoprotein są izolowanymi cząstkami, a nie naturalnie ułożonymi razem, tworząc rouleaux 21,29,30,35,42-45. Obserwacja powstawania rouleaux przez konwencjonalny NS jest prawdopodobnie spowodowana dynamicznymi oddziaływaniami między lipoproteinami złożonymi z apolipoprotein (apo) i fosfolipidów, które są strukturalnie elastyczne w roztworze 13,29,30,46-49 i wrażliwością na standardowy protokół NS. Aby zidentyfikować ten artefakt, jako próbkę testową wykorzystano próbkę lipoproteiny (HDL) apolipoproteiny E4 (apoE4) palmitoilo-oleoilofosfatydylocholiny (POPC) o wysokiej gęstości jako próbki testowej i obrazy krio-EM dla wolnego od artefaktów standardu 29, przesiewając próbki NS przygotowane w szeregu warunków. Porównując rozmiary i kształty cząstek uzyskanych z NS i cryo-EM, stwierdzono, że specyficzny rodzaj odczynnika barwiącego i stężenie soli są dwoma kluczowymi parametrami powodującymi dobrze znane zjawiska rouleaux. W związku z tym zgłoszono zoptymalizowany protokół barwienia ujemnego (OpNS).
Przez OpNS, dobrze znane zjawisko rouleaux apoE4 HDL zostało wyeliminowane przez OpNS (Rysunek 2A). Analiza statystyczna wykazała, że OpNS daje bardzo podobne obrazy (mniej niż 5% odchylenia) pod względem wielkości i kształtu w porównaniu do tych z cryo-EM, jednak kontrast został wyeliminowany. Walidacje OpNS przeprowadzono poprzez zbadanie eliminacji artefaktu rouleaux prawie wszystkich klas lub podklas próbek lipoprotein 6,29,30,50,51, w tym apoA-I 7,8 nm (figura 2B), 8,4 nm (figura 2C), dyskoidalnie odtworzona HDL (ryc. 2D), sferyczny rHDL 9,3 nm (figura 2E), HDL ludzkiego osocza (figura 2F), apoA-I wolny od lipidów (rysunek 2G), HDL osocza (Figura 2H), lipoproteina o niskiej gęstości (LDL) (Figura 2I), lipoproteina o średniej gęstości (IDL) (Figura 2J), lipoproteina o bardzo niskiej gęstości (VLDL) (Figura 2K) i liposom POPC (Figura 2L) 30. Dodatkowe walidacje przeprowadzono poprzez obrazowanie małych i asymetrycznych białek, w tym białka przenoszącego estry cholesterolu cholesterolu o masie 53 kDa (CETP) (Figura 3A - C)6,29 i wysoce elastycznego przeciwciała IgG 160 kDa (Figura 4A i B)4,5,29,52 oraz dwóch dobrze znanych strukturalnie białek, GroEL i proteasom (Figura 2M i N). W celu wymagania dodatkowej walidacji od współpracowników, jesteśmy otwarci na wszelkie ślepe testy tej metody OpNS.
OpNS jako protokół o wysokiej przepustowości został również wykorzystany do badania mechanizmu białkowego poprzez badanie setek próbek małych białek, takich jak CETP, które wiązały się z różnymi białkami w warunkach serii (w tym CETP oddziałujące z 4 klasami lipoprotein, rekombinowanym HDL, HDL w osoczu, LDL i VLDL, z/bez 2 przeciwciał, H300 i N13, poniżej 9 czasów inkubacji, w tym 3 min, 20 min, 1 godz., 2 godz., 4 godz., 8 godz., 24 godz., 48 godz. i 72 godz., w 4 proporcjach molowych, tj. 1:0,5, 1:1, 1:2, 1:4 i 3 rozcieńczeniach, tj. 0,1 mg/ml, 0,01 mg/ml i 0,001 mg/ml, plus dodatkowe próbki kontrolne, w tym sam CETP, sam LDL, i sam VLDL, z potrójnymi testami powyższych eksperymentów przeprowadzonymi przez różne osoby)6,29. Obrazy CETP wykonane przez OpNS dostarczyły obrazów o wysokim kontraście z dość drobnymi szczegółami strukturalnymi; co pozwoliło nam z powodzeniem zrekonstruować mapę gęstości 3D małego białka CETP o masie 53 kDa (Rysunek 3D - F) poprzez rekonstrukcję pojedynczej cząstki. Co więcej, obrazy OpNS o wysokim kontraście dostarczają nam wystarczającego sygnału z pojedynczego białka (Figura 4A - C), co pozwoliło nam osiągnąć pośrednią rozdzielczość (~1,5 nm) pojedynczej (jeden obiekt, brak średniej) struktury 3D przeciwciała IgG za pomocą metody tomografii elektronowej pojedynczych cząstek (IPET) (Figura 4E - J)5. Szczegółowy opis strategii rekonstrukcji IPET, metodologii, procesów krok po kroku i analizy zmienności strukturalnej został wcześniej przedstawiony4. Film o procedurach rekonstrukcji przeciwciał IPET, w tym surowe obrazy i wyniki pośrednie, mapa gęstości 3D i dokowanie strukturalne, był również dostępny publicznie po umieszczeniu na YouTube5. Porównanie rekonstrukcji 3D z różnych pojedynczych cząstek przeciwciał może ujawnić dynamikę białek i zmiany konformacyjne podczas reakcji chemicznych4,5.
Biorąc pod uwagę, że ponad 50% białek ma masę cząsteczkową w zakresie od 40 do 200 kDa1,2, sukces w obrazowaniu tych małych białek dowodzi, że metoda OpNS jest użytecznym narzędziem do przesuwania konwencjonalnej granicy EM w kierunku małych i asymetrycznych oznaczeń strukturalnych i odkryć mechanizmów. W związku z tym szczegółowy protokół jest dostarczony jak poniżej.

<table><tbody><tr><td>Barwienie: Mrówczan uranylu</td><td>SPI Dział Dostaw Sondy Strukturalnej, Inc.</td><td>02545-AA</td><td>http://www.2spi.com/catalog/chem/Uranyl_Formate.shtml</td></tr><tr><td>Strzykawka: 1 ml NORM-JECT</td><td>VWR</td><td>89174-491</td><td>https://us.vwr.com/store/catalog/product.jsp?catalog_number=89174-491</td></tr><tr><td>Filtr strzykawkowy: 0,2 &mu; m&nbsp;</td><td>VWR</td><td>28145-487</td><td>https://us.vwr.com/store/catalog/product.jsp?catalog_number=28145-487</td></tr><tr><td>Filtr strzykawkowy: 0,02 &mu; m filtr (Anotop 10)</td><td>Whatman</td><td>6809-1002</td><td>http://www.whatman.com/AnotopSyringeFilters.aspx</td></tr><tr><td>Dulbecco' s Sól fizjologiczna buforowana fosforanami</td><td>SIGMA-Aldrich</td><td>D8537</td><td>http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/d8537?lang=en&region=US</td></tr><tr><td>Parafilm: 4 cale x 125 stóp</td><td>VWR</td><td>470152-246</td><td>https://us.vwr.com/store/catalog/product.jsp?catalog_number=WLS65710-A</td></tr><tr><td>Siatka TEM pokryta folią węglową: 300 oczek</td><td>Pacific Grid-Tech</td><td>Cu-300CN</td><td>http://www.grid-tech.com/catalog.htm#1-thincarbon</td></tr><tr><td>Siatka TEM pokryta folią węglową: 200 oczek</td><td>EMS (Electro Microscopy Sciences)</td> <td>CF200-Cu</td><td>http://www.emsdiasum.com/microscopy/products/grids/support.aspx</td></tr><tr><td>Pęseta: Pęseta Dumont L5</td><td>EMS (Electro Microscopy Sciences)</td><td>72882-D</td><td>http://www.emsdiasum.com/microscopy/products/tweezers/dumont_clamping.aspx#02-L5</td></tr><tr><td>Milli-Q Advantage A10 System oczyszczania wody ultraczystej</td><td>EMD Millipore</td><td>Milli-Q Advantage A10</td><td>http://www.millipore.com/catalogue/module.do?id=C10117</td></tr><tr><td>Bibuła filtracyjna: koła klasy 1</td><td>Whatman</td><td>1001-090</td><td>http://www.whatman.com/QualitativeFilterPapersStandardGrades.aspx</td></tr><tr><td>Folia</td><td></td><td></td> aluminiowa <td>Dowolny rodzaj</td></tr><tr><td>Końcówki filtrów: Końcówki filtrów aerozolowych o niskiej retencji do 10 i mikro; L Pipety</td><td>VWR</td><td>89174-520</td><td>https://us.vwr.com/store/catalog/product.jsp?catalog_number=89174-520</td></tr><tr><td colspan="4">[nagłówek]</td></tr><tr><td>Jednostka wyładowcza jarzeniowa</td><td>Ted Pella</td><td>91000</td><td>http://www.tedpella.com/easiglow_html/Glow-Discharge-Cleaning-System.htm</td></tr><tr><td>Końcówki filtrów: Końcówki filtrów aerozolowych o niskiej retencji do 40 i mikro; L Pipety</td><td>VWR</td><td>89174-524</td><td>https://us.vwr.com/store/catalog/product.jsp?catalog_number=89174-524</td></tr><tr><td>Końcówki filtrów: VWR Signature 200 &micro; L Końcówki do pipet</td><td>VWR</td><td>37001-528</td><td>https://us.vwr.com/store/catalog/product.jsp?catalog_number=37001-528</td></tr><tr><td>Pipet</td><td>Pipetman</td><td>F161201 i F167300</td><td>http://www.pipetman.com/Pipettes/Single-Channel/PIPETMAN-Classic.aspx</td></tr></tbody></table>

zoptymalizowane barwienie ujemne: wysokoprzepustowy protokół do badania małej i asymetrycznej struktury białka za pomocą mikroskopii elektronowej

Optimized Negative Staining: a High-throughput Protocol for Examining Small and Asymmetric Protein Structure by Electron Microscopy

Strukturalne określanie białek jest dość trudne dla białek o masach cząsteczkowych między 40 - 200 kDa. Biorąc pod uwagę, że ponad połowa naturalnych białek ma masę cząsteczkową między 40 a 200 kDa1,2, potrzebna jest solidna i wysokoprzepustowa metoda o rozdzielczości nanometrowej. Barwienie ujemne (NS) Mikroskopia elektronowa (EM) jest łatwym, szybkim i jakościowym podejściem, które często jest stosowane w laboratoriach badawczych do badania struktury białka i interakcji białko-białko. Niestety, konwencjonalne protokoły NS często generują artefakty strukturalne na białkach, zwłaszcza w przypadku lipoprotein, które zwykle tworzą artefakty rouleaux. Wykorzystując obrazy lipoprotein z mikroskopii krioelektronowej (cryo-EM) jako standardu, kluczowe parametry w warunkach przygotowania próbek NS zostały niedawno przebadane i przedstawione jako zoptymalizowany protokół NS (OpNS), zmodyfikowany konwencjonalny protokół NS 3 . Artefakty takie jak rouleaux mogą być znacznie ograniczone przez OpNS, dodatkowo zapewniając wysoki kontrast wraz z obrazami o dość wysokiej rozdzielczości (blisko 1 nm) małych i asymetrycznych białek. Te obrazy o wysokiej rozdzielczości i wysokim kontraście są korzystne nawet dla pojedynczej rekonstrukcji 3D białka (pojedynczego obiektu, bez średniej), takiej jak przeciwciało 160 kDa, za pomocą metody tomografii elektronowej4,5. Co więcej, OpNS może być wysokowydajnym narzędziem do badania setek próbek małych białek. Na przykład wcześniej opublikowany mechanizm przenoszenia estru cholesterolu o masie 53 kDa (CETP) obejmował badania przesiewowe i obrazowanie setek próbek 6. Biorąc pod uwagę, że cryo-EM rzadko z powodzeniem obrazuje białka mniejsze niż 200 kDa, nie opublikowano jeszcze żadnego badania obejmującego badanie przesiewowe ponad stu warunków próbki, można śmiało nazwać OpNS wysokoprzepustową metodą badania małych białek. Miejmy nadzieję, że zaprezentowany tutaj protokół OpNS może być użytecznym narzędziem do przesuwania granic EM i przyspieszania badań EM nad strukturą, dynamiką i mechanizmami małych białek.

Ponad połowa białek to małe białka (masa cząsteczkowa <200 kDa), które stanowią wyzwanie zarówno dla obrazowania mikroskopem elektronowym, jak i dla trójwymiarowych rekonstrukcji. Zoptymalizowane barwienie negatywowe to solidny i wysokoprzepustowy protokół umożliwiający uzyskanie obrazów o wysokim kontraście i stosunkowo wysokiej rozdzielczości (~1 nm) małych asymetrycznych białek lub kompleksów w różnych warunkach fizjologicznych.

Zoptymalizowane barwienie ujemne: wysokoprzepustowy protokół do badania małej i asymetrycznej struktury białka za pomocą mikroskopii elektronowej

Structural determination of proteins is rather challenging for proteins with molecular masses between 40 - 200 kDa. Considering that more than half of ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest obrazowanie małych i asymetrycznych białek z wykorzystaniem zoptymalizowanego, wysokoprzepustowego protokołu elektronowej mikroskopii z barwieniem negatywowym. W pierwszej kolejności białko inkubuje się w przygotowanej stacji inkubacyjnej, podczas gdy przygotowywane jest stanowisko do barwienia negatywowego. Drugim krokiem procedury jest szybkie, sekwencyjne przemycie próbki w trzech kroplach wody.Trzecim krokiem jest ostrożne barwienie próbki w trzech kolejnych kroplach barwnika. Ostatnim etapem jest usunięcie nadmiaru roztworu poprzez odsączenie go z tylnej strony siatki EM, a następnie delikatne osuszenie pod strumieniem gazu azotowego. W rezultacie możliwe jest uzyskanie obrazów o wysokiej rozdzielczości małych białek za pomocą obrazowania TEM w warunkach niskiego defocusu.Główną zaletą tej techniki w porównaniu z kriomikroskopią elektronową jest możliwość wysokoprzepustowego badania oraz obrazowania z wysokim kontrastem małych i asymetrycznych struktur białkowych, przy jednoczesnym ograniczeniu artefaktów strukturalnych typowych dla konwencjonalnego barwienia negatywowego. Metoda ta może dostarczyć informacji na temat podstaw strukturalnych mechanizmów działania małych białek, takich jak białko transferu estrów cholesterolu.Metodę tę można zastosować również do innych białek o znacznych różnicach w wielkości, takich jak przeciwciało IgG1, lipoproteiny o wysokiej gęstości oraz proteasom. Wizualna demonstracja tej metody jest kluczowa, ponieważ etapy płukania i barwienia są trudne do opanowania ze względu na zmienność czasu trwania, a nawet samo osuszanie próbek może mieć drastyczny wpływ na końcowy efekt zabarwionego białka. Prezentacja procedury zostanie przeprowadzona dla współpracowników naukowych z mojego laboratorium. Podczas przygotowań do tego protokołu konieczne jest sporządzenie 1% roztworu urfoformu z zachowaniem szczególnej ostrożności, aby zminimalizować jego ekspozycję na światło.Obejmuje to owinięcie folią części filtra strzykawkowego 0,2 micron przed rozpoczęciem pierwszej filtracji roztworu. Po przefiltrowaniu, w dniu eksperymentu, należy przechowywać dwumililitrowe alikwoty w owiniętych folią fiolkach w temperaturze -80 °C. Alikwot należy rozmrozić w łaźni wodnej o temperaturze pokojowej i użyć po całkowitym rozmrożeniu.Przefiltruj roztwór ponownie przez filtr 0,02 mikrona, owijając poszczególne elementy folią. Probówka zbiorcza również powinna być owinięta folią. Przenieś barwnik negatywowy do lodówki do momentu jego użycia.Przygotuj arkusz do utrzymywania kropel, dociskając ośmiocalowy odcinek param do podpórki końcówek pipetowych. W ten sposób powstaną wciśnięcia, które pełnią funkcję dołków o średnicy 5 mm. Po wykonaniu sześciu rzędów dołków, wyrównaj lód na powierzchni tacy styropianowej, a następnie umieść na lodzie przygotowany arkusz.Następnie do trzech pierwszych studzienek płytki po lewej stronie należy dodać 35 µL wody dejonizowanej. Następnie do trzech prawych studzienek płytki należy wlać 35 µL przygotowanego roztworu do barwienia negatywnego. Przykryć kuwetę, aby zminimalizować ekspozycję roztworu na światło.Służyć to będzie jako stanowisko do barwienia. Teraz przygotuj stanowisko do inkubacji siatek EM z pustego pudełka na końcówki do pipet z uchwytem, na którym można zamocować pęsetę. Wypełnij pudełko lodem do połowy, tak aby powierzchnia lodu znajdowała się blisko końcówki zamocowanej pęsety.Najpierw poddaj cienko powlekane węglem miedziane siatki EM o gęstości 300 mesh działaniu wyładowań żarowych przez około 10 sekund. Następnie za pomocą pęsety chwyć siatkę z przystanki do inkubacji siatek EM. Zawieś pęsetę z siatką tak, aby siatka znajdowała się pod kątem 45 stopni, pół cala nad lodem.Następnie rozcieńcz próbkę białka w DPBS do stężenia od 50 do 100 µg białka na ml roztworu. Natychmiast nanieś około 4 µl rozcieńczenia na siatkę EM. Pozostaw próbkę do inkubacji przez około minutę.Po jednej minucie szybko osusz siatkę papierem filtracyjnym, aby usunąć nadmiar roztworu. Następnie, w stacji barwienia, dotknij siatką pierwszej kropli wody na folii parafilm. Szybko powtórz proces osuszania filtra i zwilżania go kolejną kroplą.Użyć łącznie trzech kropli wody i wykonać tę czynność tak szybko, jak to możliwe. Płukanie siatki wodą musi odbywać się sprawnie, aby uniknąć niekorzystnego wpływu zmiany buforu na białko. Po odsączeniu ostatniej porcji wody w ciągu trzech sekund, należy umieścić siatkę na pierwszej kropli roztworu do barwienia negatywowego.Pozostaw próbkę w tej pozycji na 10 sekund. W międzyczasie oczyść pęsetę, dociskając jej końcówki do papieru filtracyjnego. Po upływie dziesięciu sekund kilkukrotnie odsącz roztwór za pomocą papieru filtracyjnego, a następnie ponownie zanurz próbkę w kolejnej kropli barwnika na dwie sekundy.Przez dwie sekundy czyść pęsetę. Następnie osusz siatkę poprzez dotknięcie jej papierem i umieść ją w trzeciej kropli. W tym kroku przez pełną minutę przykryj stację barwienia.Usuwanie kontrastu musi zostać wykonane poprzez dotknięcie tylnej strony siatki EM przez precyzyjnie określony czas, aby zapewnić równomierne wyschnięcie siatki. Jeśli papier filtracyjny będzie stykać się z kontrastem zbyt długo, może dojść do usunięcia zbyt dużej jego ilości, co doprowadzi do niskiej jakości obrazowania. Następnie należy przystąpić do suszenia siatki.Najpierw dotknij całej strony niepowlekanej węglem papieru filtrującego, aż roztwór zostanie całkowicie usunięty. Następnie zastosuj łagodny strumień azotu gazowego. Teraz przenieś siatkę do naczynia wyłożonego papierem filtrującym i częściowo przykryj naczynie.Pozostaw siatkę do wyschnięcia w naczyniu przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Alternatywnie, próbki zawierające lipidy można poddać suszeniu w temperaturze 40 °C przez godzinę. Po całkowitym wyschnięciu przenieś siatkę EM do pudełka do przechowywania siatek EM, a następnie przed rozpoczęciem pracy ustaw TEM.Sprawdź rozdzielczość najwyższego widocznego pierścienia Thau, analizując widmo mocy obszaru folii węglowej siatki barwionej negatywowo, która powinna zapewniać lepszą rozdzielczość niż rozdzielczość docelowa. Następnie, aby precyzyjnie dostroić ustawienie, dokładnie sprawdź widmo mocy na obszarze folii węglowej preparatu. Przy prawidłowym ustawieniu możliwe jest zwizualizowanie ponad 20 pierścieni Thau, co odpowiada rozdzielczości lepszej niż pięć angstremów.Pierścienie powstały w wyniku transformacji Fouriera obrazu amorficznego węgla przy defocusie 1,6 µm i dawce 20,4 e⁻/Å². Teraz należy przywrócić ostrość do warunków bliskich ogniskowej Scherzera, około 0,1 µm, aby obrazować małe białka podczas badania siatki EM. Idealnie, obszary barwione znajdują się zazwyczaj w pobliżu krawędzi grubszych, chmurowatych obszarów barwionych przy małym powiększeniu.Strukturę próbek lipoprotein obrazowano za pomocą OPNS. Przykłady obejmowały rekombinowane HDL, ludzką plazmę, LDL, ludzką plazmę IDL oraz ludzką plazmę VLDL. Obrazowano również mniejsze struktury, takie jak CETP o masie 53 kilodalton.Jest to jedno z najmniejszych białek, które udało się obrazować za pomocą eem. Nałożenie struktury krystalicznej CETP bardzo dobrze pasuje do obrazu, wykazując dużą dynamikę. Obrazowano również białka heterogeniczne w przeciwciałach immunoglobulin G o masie 160 kilodalton.Wyraźnie widoczne były trzy poddomeny. W celu przeprowadzenia porównania z jego strukturą krystaliczną poddano dokładniejszej analizie przeciwciało IgG1. Struktura krystaliczna przeciwciała IgG1 w wielu aspektach, takich jak położenie domen oraz ich kształty, jest zgodna z obrazem tych przeciwciał uzyskanym za pomocą EM.Inne obrazowane cząsteczki obejmują 28 kilodaltonowy, wolny od lipidów apo lipoprotein A one grow EL oraz proteasomy. W istocie metoda OPNS znacząco przesuwa granice obrazowania EM dla małych struktur asymetrycznych, jak również powiązanych z nimi badań mechanistycznych. Podczas wykonywania procedury ważne jest, aby maksymalnie ograniczyć ekspozycję odczynnika barwiącego na światło poprzez szybkie przemycie preparatu oraz zastosowanie ostrości w pobliżu punktu skupienia (near treasure focus) podczas obrazowania po zakończeniu tej procedury.W celu odpowiedzi na dodatkowe pytania, takie jak struktury pojedynczych cząsteczek w rozdzielczości nanometrycznej oraz zmiany konformacyjne między nimi, można zastosować inne metody, np. tomografię elektronową. Po tym rozwoju technika ta utorowała drogę badaczom w dziedzinie biologii strukturalnej do zgłębienia mechanizmów transferu estrów cholesterolu między lipoproteinami osocza ludzkiego.

optimized-negative-staining-high-throughput-protocol-for-examining

Research

JoVE Journal

Environment

Środowisko

Optymalizacja Barwienia Negatywnego: protokół przeznaczony do badania małych i asymetrycznych struktur białek za pomocą mikroskopii elektronowej

Niniejszy artykuł opisuje standardową metodę uzyskiwania trójwymiarowej (3D) rekonstrukcji makrocząsteczek biologicznych przy użyciu mikroskopii elektronowej (EM) z barwieniem negatywowym. W tym protokole wyjaśniamy, jak uzyskać strukturę 3D kompleksu egzosomu Saccharomyces cerevisiae w średniej rozdzielczości, stosując metodę rekonstrukcji z losowym nachyleniem stożkowym (RCT).

Rekonstrukcja kompleksu egzosomu metodą kriotomografii elektronowej pojedynczych cząsteczek z wykorzystaniem metody losowych przechyłów stożkowych

Wizualizacja próbek białek za pomocą elektronowej mikroskopii transmisyjnej (EM) z barwieniem negatywowym stała się popularną metodą analizy strukturalnej. Jest ona przydatna zarówno do ilościowej analizy struktury, np. obliczania rekonstrukcji 3D badanych cząsteczek, jak i do jakościowej oceny czystości preparatów białkowych. W niniejszym artykule przedstawiamy szczegółowe protokoły przygotowania siatek do EM, barwienia próbki oraz wizualizacji próbki w mikroskopie elektronowym. Początkujący...

Wizualizacja białek i kompleksów makromolekularnych za pomocą EM z barwieniem negatywowym: od przygotowania siatki do akwizycji obrazów

Ten film opisuje procedurę negatywnego barwienia oczyszczonych egzosomów. Ujemnie barwione egzosomy są obrazowane za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej. Ta technika pomaga uwidocznić morfologię egzosomów.

Barwienie ujemne oczyszczonych egzosomów: procedura wizualizacji morfologii egzosomów za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej

Wiele białek spełnia swoją funkcję, gdy są przyczepione do powierzchni błony. Wiązanie białek zewnętrznych na błonach nanodysków można pośrednio zobrazować za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej. Pokazujemy, że charakterystyczne układanie (rouleau) nanodysków indukowane przez fosforungmian sodu o ujemnym barwieniu jest zapobiegane przez wiązanie białka zewnętrznego.

Metoda wizualizacji i analizy białek oddziałujących z błoną za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej

Negatywna plama EM to potężna technika wizualizacji struktury makromolekularnej, ale różne techniki barwienia mogą dawać różne wyniki w zależności od próbki. W tym miejscu szczegółowo opisano kilka podejść do barwienia negatywnego, aby zapewnić wstępny przepływ pracy w celu rozwiązania problemu wizualizacji trudnych systemów.

Wariacje na temat metod mikroskopii elektronowej w barwieniu ujemnym: narzędzia do radzenia sobie z trudnymi systemami

Przedstawiono instrument i metody do przygotowania objętości próbek o rozmiarach nanolitrów do transmisyjnej mikroskopii elektronowej. Nie są wymagane żadne etapy papierowego blottingu, co pozwala uniknąć szkodliwych konsekwencji, jakie może to mieć dla białek, znacznie zmniejszając utratę próbki i umożliwiając analizę lizatu pojedynczej komórki do wizualnej proteomiki.

Zminiaturyzowane przygotowanie próbki do transmisyjnej mikroskopii elektronowej

Tutaj prezentujemy protokół monitorowania montażu i demontażu toksyny wąglika za pomocą interferometrii biowarstwowej (BLI). Po montażu/demontażu na powierzchni biosensora, duże kompleksy białkowe są uwalniane z powierzchni w celu wizualizacji i identyfikacji składników kompleksów za pomocą odpowiednio mikroskopii elektronowej i spektrometrii mas.

Analiza dynamicznych kompleksów białkowych składanych i uwalnianych z biosensora interferometrii biowarstwowej przy użyciu spektrometrii mas i mikroskopii elektronowej

Ten protokół opisuje techniki używane do określania struktur kanałów jonowych za pomocą mikroskopii krioelektronowej, w tym system bakulowirusa używany do efektywnej ekspresji genów w komórkach ssaków przy minimalnym wysiłku i toksyczności, ekstrakcję białek, oczyszczanie i kontrolę jakości, przygotowanie siatki próbek i badanie przesiewowe, a także zbieranie i przetwarzanie danych.

Ekspresja i oczyszczanie ludzkiego wrażliwego na lipidy kanału kationowego TRPC3 do oznaczania strukturalnego za pomocą mikroskopii krioelektronowej pojedynczych cząstek

Ten protokół opisuje metodę cryoAPEX, w której białko błonowe oznaczone znacznikiem APEX2 może być zlokalizowane za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej w optymalnie zachowanej ultrastrukturze komórki.

Metoda CryoAPEX do analizy mikroskopii elektronowej lokalizacji białek błonowych w komórkach zachowanych ultrastrukturalnie

Określanie struktury kompleksów makromolekularnych za pomocą cryoEM stało się rutyną dla niektórych klas białek i kompleksów. W tym miejscu podsumowano ten proces (przygotowanie próbki, badanie przesiewowe, pozyskiwanie i przetwarzanie danych), a czytelnicy są kierowani do dalszych szczegółowych zasobów i zmiennych, które mogą ulec zmianie w przypadku trudniejszych próbek.

Mikroskopia krioelektronowa pojedynczych cząstek: od próbki do struktury

Ten protokół przedstawia praktyczną metodę wykorzystującą Methanocaldococcus jannaschii (MjsHSP16.5) jako przykład rozwiązania problemu nierównomiernego rozkładu cząstek poprzez optymalizację przygotowania próbki, stanowiąc punkt odniesienia dla badaczy do efektywnego wyjaśniania struktur makromolekularnych za pomocą kriogenicznej mikroskopii elektronowej (cryo-EM).

Optymalizacja przygotowania próbek do kriogenicznej mikroskopii elektronowej

Poznaj zoptymalizowany protokół barwienia ujemnego do wysokoprzepustowej mikroskopii elektronowej małych i asymetrycznych białek. Ta metoda umożliwia uzyskanie obrazów wysokiej rozdzielczości z redukcją artefaktów strukturalnych.

Zoptymalizowane barwienie ujemne: wysokoprzepustowy protokół do badania małej i asymetrycznej struktury białka za pomocą mikroskopii elektronowej (Wideo) | JoVE Journal

Zoptymalizowane barwienie ujemne: wysokoprzepustowy protokół do badania małej i asymetrycznej struktury białka za pomocą mikroskopii elektronowej

Przeglądaj więcej filmów