Zoptymalizowane barwienie ujemne: wysokoprzepustowy protokół do badania małej i asymetrycznej struktury białka za pomocą mikroskopii elektronowej

Ponad połowa białek to małe białka (masa cząsteczkowa <200 kDa), które stanowią wyzwanie zarówno dla obrazowania mikroskopem elektronowym, jak i dla trójwymiarowych rekonstrukcji. Zoptymalizowane barwienie negatywowe to solidny i wysokoprzepustowy protokół umożliwiający uzyskanie obrazów o wysokim kontraście i stosunkowo wysokiej rozdzielczości (~1 nm) małych asymetrycznych białek lub kompleksów w różnych warunkach fizjologicznych.

Ogólnym celem tej procedury jest zobrazowanie małych i asymetrycznych białek przy użyciu zoptymalizowanego pod kątem przepustowości protokołu mikroskopii elektronowej z barwieniem ujemnym. Osiąga się to poprzez pierwszą inkubację białka w przygotowanej stacji inkubacyjnej podczas przygotowywania stacji roboczej do barwienia ujemnego. Drugim krokiem procedury jest szybkie przemycie próbki na trzech kropelkach wody po kolei.

Trzecim krokiem jest staranne wybarwienie próbki na trzech kropelkach barwienia sekwencyjnie. Ostatnim krokiem jest usunięcie nadmiaru roztworu poprzez osuszenie z tyłu siatki EM, a następnie delikatne wysuszenie pod gazowym azotem. Ostatecznie wyniki mogą pokazać obrazy małych białek o wysokiej rozdzielczości za pomocą obrazowania TEM w warunkach niskiego rozogniskowania.

Główną przewagą tej techniki nad kriomikroskopią jest ustawiona. Może pozwolić na wysokoprzepustowe badanie i obrazowanie małych i asymetrycznych struktur białkowych o wysokim kontraście, jednocześnie redukując artefakty strukturalne wynikające z konwencjonalnego barwienia ujemnego. Chociaż ta metoda może zapewnić wgląd w strukturalne podstawy małych mechanizmów białkowych, takich jak białko przenoszące estry cholesterolu.

Może być również stosowany do innych białek, takich jak przeciwciało IgG one lipoproteina o wysokiej gęstości i proteasom, które różnią się znacznie wielkością. Wizualna demonstracja tej metody ma kluczowe znaczenie, ponieważ etapy mycia i barwienia są trudne do nauczenia się ze względu na różnice w czasie, a nawet blotting próbki może spowodować dramatyczne efekty w gotowym barwionym białku. Demonstracja procedury będzie tęsknić za pracownikiem naukowym Z.A z mojego laboratorium. Przygotowując się do tego protokołu, konieczne jest przygotowanie 1% roztworu do pisuaru z numerem ósmym, zwracając szczególną uwagę na zminimalizowanie jego ekspozycji na światło.

Obejmuje to owijanie części filtra N 0,2 mikrona strzykawki folią, gdy nadejdzie czas na pierwsze przefiltrowanie roztworu. Po przefiltrowaniu przechowywać dwie mililitrowe porcje fiolki owinięte folią w temperaturze ujemnej 80 stopni Celsjusza w dniu eksperymentu. Rozmrozić podwielokrotność w łaźni wodnej o temperaturze pokojowej po całkowitym rozmrożeniu.

Przefiltruj go ponownie przez filtr 0,02 mikrona z częściami owiniętymi folią. Fiolkę do pobierania należy również owinąć folią. Przenieś negatywną plamę do lodówki, aż zostanie zużyta.

Wykonaj arkusz przytrzymujący kropelkę, naciskając parametr o długości ośmiu cali na wspornik końcówki pipety. W ten sposób powstają wgłębienia drogowe, które służą jako studnie o średnicy pięciu milimetrów. Po wykonaniu sześciu rzędów studzienek spłaszcz lód na powierzchni styropianowej tacy, a następnie umieść arkusz na lodzie.

Następnie dodaj 35 mikrolitrów wody DI do pierwszych trzech dołków arkusza po lewej stronie. Następnie załaduj trzy prawe studzienki do arkusza 35 mikrolitrami przygotowanego roztworu negatywnej plamy. Przykryj tacę, aby zminimalizować ekspozycję na światło roztworu.

Będzie to służyć jako stacja barwienia. Teraz przygotuj stację inkubacyjną z siatką EM z pustego pudełka po końcówkach do pipet z nasadką, na której można zamontować pęsetę. Napełnij pudełko do połowy lodem, tak aby powierzchnia lodu znajdowała się blisko końcówki pęsety po ich zamontowaniu.

Najpierw jarzenie rozładowuje cienkie miedziane siatki EM o siatce 300 z oczka węgla przez około 10 sekund. Następnie podnieś siatkę za pomocą pęsety, która zaczepia się o stację inkubacji siatki EM. Zawieś pęsetę z siatką, tak aby siatka była nachylona pod kątem 45 stopni pół cala nad lodem.

Teraz rozcieńczyć próbkę białka w DPBS w ilości od 50 do 100 mikrogramów białka na mililitr roztworu. Natychmiast nanieść około czterech mikrolitrów rozcieńczenia na siatkę EM. Pozostawić próbkę do inkubacji przez około minutę.

Po minucie szybko przetrzyj siatkę bibułą filtracyjną, aby usunąć nadmiar roztworu. A następnie w stacji barwienia dotknij siatki do pierwszej kropli wody na folii para. Szybko powtórz proces suszenia filtra i roszenia go następną kroplą.

Użyj w sumie trzech kropelek wody i zrób to tak szybko, jak to możliwe. Mycie kratki wodą musi być wykonane szybko, aby uniknąć niekorzystnego wpływu zmiany buforu na białko. Po zetarciu ostatniego prania w ciągu trzech sekund, zacznij unosić siatkę na pierwszej kropli ujemnego roztworu barwiącego.

Pozwól mu unosić się tam przez 10 sekund. W międzyczasie wyczyść pęsetę, wciskając końcówki w bibułę filtracyjną. Kilka razy po dziesięciu sekundach float osusz roztwór bibułą filtracyjną i rozpocznij kolejny float w następnej kropli plamy przez dwie sekundy.

Wyczyść pęsetę w ciągu dwóch sekund. Następnie osusz siatkę do sucha i połóż ją na trzeciej kropli. Na całą minutę przykryj stację barwienia podczas tego kroku.

Usuwanie plamy należy wykonać, dotykając tylnej części siatki EM przez dokładny czas, aby zapewnić równomierne wysuszenie siatki. Jeśli bibuła filtracyjna dotyka plamy zbyt długo, można usunąć zbyt dużo plamy, co prowadzi do słabego obrazowania. Następnie przystąp do suszenia siatki.

Najpierw dotknij całą stroną niewęglową bibuły filtracyjnej, aż roztwór się przeniesie. Po drugie, zastosuj delikatny strumień azotu gazowego. Teraz przenieś siatkę do naczynia wyłożonego bibułą filtracyjną i częściowo przykryj naczynie.

Pozostaw kratkę do wyschnięcia w naczyniu przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Alternatywnie, próbki zawierające lipidy można piec w temperaturze 40 stopni Celsjusza przez godzinę. Po całkowitym wyschnięciu przenieś siatkę EM do skrzynki do przechowywania siatki EM przed rozpoczęciem najpierw wyrównaj TEM.

Sprawdź rozdzielczość najwyższego widocznego pierścienia rozmrażania z widmem mocy obszaru filmu węglowego ujemnie zabarwionej siatki, która powinna być lepsza niż rozdzielczość docelowa. Następnie, aby dokładnie wyregulować wyrównanie, sprawdź widmo mocy w obszarze warstwy węglowej próbki. W prawidłowo ustawionych warunkach można zwizualizować ponad 20 pierścieni T tho, co odpowiada wizualizacji lepszej niż pięć angstremów.

Pierścienie zostały wykonane przez przeniesienie przez kuśnierza obrazu amorficznego węgla pod rozogniskowaniem 1,6 mikrona i dawką 20,4 elektronów na kwadrat. Angstrem. Teraz przywróć ostrość do stanu zbliżonego do Scherzera na około 0,1 mikrometra dla obrazowania małych białek podczas badania siatki EM. Idealnie, poplamione obszary znajdują się zwykle w pobliżu krawędzi grubszych, poplamionych mętnych obszarów przy małym powiększeniu.

Strukturę próbek lipoprotein oglądano za pomocą OPNS. Przykłady obejmują rekombinowany HDL, osocze ludzkie, LDL, osocze ludzkie IDL i osocze ludzkie VLDL. Oglądano również mniejsze konstrukcje, takie jak 53 kilodaltony, CETP.

Jest to jedno z najmniejszych białek z powodzeniem zobrazowanych przez eem. Super nałożenie struktury krystalicznej CETP bardzo dobrze pasuje do obrazu, bardzo dynamicznie. Heterogeniczne białka obserwowano również w przeciwciałach immunoglobuliny G o stężeniu 160 kilodaltonów.

Trzy subdomeny były wyraźnie widoczne. Dokładniejsze badanie przeciwciała IgG one wykorzystano do porównania z jego strukturą krystaliczną. Struktura krystaliczna przeciwciała IgG one jest zgodna z poglądem EM tych przeciwciał pod wieloma względami, na przykład w pozycjach domen i ich kształtach.

Inne obserwowane cząsteczki to 28 kilodalton, lipoproteina A oparta na wolnych od lipidów, lipoproteina A, która rośnie EL i proteasomy. Zasadniczo, metoda OPNS znacznie przesuwa granice obrazowania EM dla małych struktur asymetrycznych, a także powiązanych badań mechanistycznych podczas próby procedury. Ważne jest, aby jak najbardziej zmniejszyć ekspozycję na światło odczynnika do barwienia, aby szybko umyć próbkę i użyć ostrości w pobliżu skarbu do obrazowania Postępuj zgodnie z tą procedurą.

Inne metody, takie jak tomografia elektronowa, mogą być wykonane w celu uzyskania odpowiedzi na dodatkowe pytania, takie jak struktury o rozdzielczości nanometrowej pojedynczych cząsteczek i potwierdzające zmiany między nimi. Po tym rozwoju, ta technika utorowała drogę naukowcom z dziedziny biologii strukturalnej do zbadania magnesów transferu estrów klastrowych między lipoproteinami ludzkiego osocza.