Zoptymalizowane barwienie ujemne: wysokoprzepustowy protokół do badania małej i asymetrycznej struktury białka za pomocą mikroskopii elektronowej

Ogólnym celem niniejszej procedury jest obrazowanie małych i asymetrycznych białek z wykorzystaniem zoptymalizowanego, wysokoprzepustowego protokołu elektronowej mikroskopii z barwieniem negatywowym. W pierwszej kolejności białko inkubuje się w przygotowanej stacji inkubacyjnej, podczas gdy przygotowywane jest stanowisko do barwienia negatywowego. Drugim krokiem procedury jest szybkie, sekwencyjne przemycie próbki w trzech kroplach wody.

Trzecim krokiem jest ostrożne barwienie próbki w trzech kolejnych kroplach barwnika. Ostatnim etapem jest usunięcie nadmiaru roztworu poprzez odsączenie go z tylnej strony siatki EM, a następnie delikatne osuszenie pod strumieniem gazu azotowego. W rezultacie możliwe jest uzyskanie obrazów o wysokiej rozdzielczości małych białek za pomocą obrazowania TEM w warunkach niskiego defocusu.

Główną zaletą tej techniki w porównaniu z kriomikroskopią elektronową jest możliwość wysokoprzepustowego badania oraz obrazowania z wysokim kontrastem małych i asymetrycznych struktur białkowych, przy jednoczesnym ograniczeniu artefaktów strukturalnych typowych dla konwencjonalnego barwienia negatywowego. Metoda ta może dostarczyć informacji na temat podstaw strukturalnych mechanizmów działania małych białek, takich jak białko transferu estrów cholesterolu.

Metodę tę można zastosować również do innych białek o znacznych różnicach w wielkości, takich jak przeciwciało IgG1, lipoproteiny o wysokiej gęstości oraz proteasom. Wizualna demonstracja tej metody jest kluczowa, ponieważ etapy płukania i barwienia są trudne do opanowania ze względu na zmienność czasu trwania, a nawet samo osuszanie próbek może mieć drastyczny wpływ na końcowy efekt zabarwionego białka. Prezentacja procedury zostanie przeprowadzona dla współpracowników naukowych z mojego laboratorium. Podczas przygotowań do tego protokołu konieczne jest sporządzenie 1% roztworu urfoformu z zachowaniem szczególnej ostrożności, aby zminimalizować jego ekspozycję na światło.

Obejmuje to owinięcie folią części filtra strzykawkowego 0,2 micron przed rozpoczęciem pierwszej filtracji roztworu. Po przefiltrowaniu, w dniu eksperymentu, należy przechowywać dwumililitrowe alikwoty w owiniętych folią fiolkach w temperaturze -80 °C. Alikwot należy rozmrozić w łaźni wodnej o temperaturze pokojowej i użyć po całkowitym rozmrożeniu.

Przefiltruj roztwór ponownie przez filtr 0,02 mikrona, owijając poszczególne elementy folią. Probówka zbiorcza również powinna być owinięta folią. Przenieś barwnik negatywowy do lodówki do momentu jego użycia.

Przygotuj arkusz do utrzymywania kropel, dociskając ośmiocalowy odcinek param do podpórki końcówek pipetowych. W ten sposób powstaną wciśnięcia, które pełnią funkcję dołków o średnicy 5 mm. Po wykonaniu sześciu rzędów dołków, wyrównaj lód na powierzchni tacy styropianowej, a następnie umieść na lodzie przygotowany arkusz.

Następnie do trzech pierwszych studzienek płytki po lewej stronie należy dodać 35 µL wody dejonizowanej. Następnie do trzech prawych studzienek płytki należy wlać 35 µL przygotowanego roztworu do barwienia negatywnego. Przykryć kuwetę, aby zminimalizować ekspozycję roztworu na światło.

Służyć to będzie jako stanowisko do barwienia. Teraz przygotuj stanowisko do inkubacji siatek EM z pustego pudełka na końcówki do pipet z uchwytem, na którym można zamocować pęsetę. Wypełnij pudełko lodem do połowy, tak aby powierzchnia lodu znajdowała się blisko końcówki zamocowanej pęsety.

Najpierw poddaj cienko powlekane węglem miedziane siatki EM o gęstości 300 mesh działaniu wyładowań żarowych przez około 10 sekund. Następnie za pomocą pęsety chwyć siatkę z przystanki do inkubacji siatek EM. Zawieś pęsetę z siatką tak, aby siatka znajdowała się pod kątem 45 stopni, pół cala nad lodem.

Następnie rozcieńcz próbkę białka w DPBS do stężenia od 50 do 100 µg białka na ml roztworu. Natychmiast nanieś około 4 µl rozcieńczenia na siatkę EM. Pozostaw próbkę do inkubacji przez około minutę.

Po jednej minucie szybko osusz siatkę papierem filtracyjnym, aby usunąć nadmiar roztworu. Następnie, w stacji barwienia, dotknij siatką pierwszej kropli wody na folii parafilm. Szybko powtórz proces osuszania filtra i zwilżania go kolejną kroplą.

Użyć łącznie trzech kropli wody i wykonać tę czynność tak szybko, jak to możliwe. Płukanie siatki wodą musi odbywać się sprawnie, aby uniknąć niekorzystnego wpływu zmiany buforu na białko. Po odsączeniu ostatniej porcji wody w ciągu trzech sekund, należy umieścić siatkę na pierwszej kropli roztworu do barwienia negatywowego.

Pozostaw próbkę w tej pozycji na 10 sekund. W międzyczasie oczyść pęsetę, dociskając jej końcówki do papieru filtracyjnego. Po upływie dziesięciu sekund kilkukrotnie odsącz roztwór za pomocą papieru filtracyjnego, a następnie ponownie zanurz próbkę w kolejnej kropli barwnika na dwie sekundy.

Przez dwie sekundy czyść pęsetę. Następnie osusz siatkę poprzez dotknięcie jej papierem i umieść ją w trzeciej kropli. W tym kroku przez pełną minutę przykryj stację barwienia.

Usuwanie kontrastu musi zostać wykonane poprzez dotknięcie tylnej strony siatki EM przez precyzyjnie określony czas, aby zapewnić równomierne wyschnięcie siatki. Jeśli papier filtracyjny będzie stykać się z kontrastem zbyt długo, może dojść do usunięcia zbyt dużej jego ilości, co doprowadzi do niskiej jakości obrazowania. Następnie należy przystąpić do suszenia siatki.

Najpierw dotknij całej strony niepowlekanej węglem papieru filtrującego, aż roztwór zostanie całkowicie usunięty. Następnie zastosuj łagodny strumień azotu gazowego. Teraz przenieś siatkę do naczynia wyłożonego papierem filtrującym i częściowo przykryj naczynie.

Pozostaw siatkę do wyschnięcia w naczyniu przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Alternatywnie, próbki zawierające lipidy można poddać suszeniu w temperaturze 40 °C przez godzinę. Po całkowitym wyschnięciu przenieś siatkę EM do pudełka do przechowywania siatek EM, a następnie przed rozpoczęciem pracy ustaw TEM.

Sprawdź rozdzielczość najwyższego widocznego pierścienia Thau, analizując widmo mocy obszaru folii węglowej siatki barwionej negatywowo, która powinna zapewniać lepszą rozdzielczość niż rozdzielczość docelowa. Następnie, aby precyzyjnie dostroić ustawienie, dokładnie sprawdź widmo mocy na obszarze folii węglowej preparatu. Przy prawidłowym ustawieniu możliwe jest zwizualizowanie ponad 20 pierścieni Thau, co odpowiada rozdzielczości lepszej niż pięć angstremów.

Pierścienie powstały w wyniku transformacji Fouriera obrazu amorficznego węgla przy defocusie 1,6 µm i dawce 20,4 e⁻/Ų. Teraz należy przywrócić ostrość do warunków bliskich ogniskowej Scherzera, około 0,1 µm, aby obrazować małe białka podczas badania siatki EM. Idealnie, obszary barwione znajdują się zazwyczaj w pobliżu krawędzi grubszych, chmurowatych obszarów barwionych przy małym powiększeniu.

Strukturę próbek lipoprotein obrazowano za pomocą OPNS. Przykłady obejmowały rekombinowane HDL, ludzką plazmę, LDL, ludzką plazmę IDL oraz ludzką plazmę VLDL. Obrazowano również mniejsze struktury, takie jak CETP o masie 53 kilodalton.

Jest to jedno z najmniejszych białek, które udało się obrazować za pomocą eem. Nałożenie struktury krystalicznej CETP bardzo dobrze pasuje do obrazu, wykazując dużą dynamikę. Obrazowano również białka heterogeniczne w przeciwciałach immunoglobulin G o masie 160 kilodalton.

Wyraźnie widoczne były trzy poddomeny. W celu przeprowadzenia porównania z jego strukturą krystaliczną poddano dokładniejszej analizie przeciwciało IgG1. Struktura krystaliczna przeciwciała IgG1 w wielu aspektach, takich jak położenie domen oraz ich kształty, jest zgodna z obrazem tych przeciwciał uzyskanym za pomocą EM.

Inne obrazowane cząsteczki obejmują 28 kilodaltonowy, wolny od lipidów apo lipoprotein A one grow EL oraz proteasomy. W istocie metoda OPNS znacząco przesuwa granice obrazowania EM dla małych struktur asymetrycznych, jak również powiązanych z nimi badań mechanistycznych. Podczas wykonywania procedury ważne jest, aby maksymalnie ograniczyć ekspozycję odczynnika barwiącego na światło poprzez szybkie przemycie preparatu oraz zastosowanie ostrości w pobliżu punktu skupienia (near treasure focus) podczas obrazowania po zakończeniu tej procedury.

W celu odpowiedzi na dodatkowe pytania, takie jak struktury pojedynczych cząsteczek w rozdzielczości nanometrycznej oraz zmiany konformacyjne między nimi, można zastosować inne metody, np. tomografię elektronową. Po tym rozwoju technika ta utorowała drogę badaczom w dziedzinie biologii strukturalnej do zgłębienia mechanizmów transferu estrów cholesterolu między lipoproteinami osocza ludzkiego.