Trójwymiarowe renderowanie i analiza znakowanych immunologicznie, oczyszczonych ludzkich sieci naczyniowych kosmków łożyskowych
March 29th, 2018
To badanie przedstawia protokół odwracalnego oczyszczania tkanek, barwienia immunologicznego, renderowania 3D i analizy sieci naczyniowych w próbkach ludzkich kosmków łożyskowych rzędu 1 - 2 mm3.
Ogólnym celem tej procedury jest wygenerowanie trójwymiarowych renderingów fragmentów kosmków łożyskowych, które nadają się do analizy zawartych w nich sieci naczyniowych. Ta metoda może pomóc nam odpowiedzieć na kluczowe pytania w naszej dziedzinie, takie jak to, dlaczego dziecko może mieć ograniczony wzrost lub jaki stres i jak silny mógł być stres, który doprowadził do przedwczesnego porodu. Główną zaletą naszej procedury jest to, że jesteśmy teraz w stanie znakować immunologicznie przezroczystą tkankę kosmków łożyskowych, a następnie wizualizować ich sieci naczyniowe i wykorzystywać te wizualizacje do charakteryzowania i analizy tych sieci naczyniowych.
Implikacje tej techniki mogą rozciągać się na wiele diagnoz i terapii, ponieważ większość nauk przyrodniczych opiera się na dwuwymiarowej charakterystyce histologicznej. Procedurę zademonstruje Pani Valerie Schwenko, która przeprowadzi znakowanie immunologiczne i oczyszczenie tkanki łożyska, a następnie Pan Phillip Necaise przeprowadzi sekcję tkanki łożyska, a także odwrotne oczyszczenie tkanki. Aby przygotować się do wycięcia kosmków, najpierw spłucz formalną i utrwaloną tkankę łożyska solą fizjologiczną buforowaną fosforanami.
Następnie umieścić na szalce Petriego na stoliku mikroskopu preparacyjnego. Aby zlokalizować kosmkowe drzewo, użyj skalpela i cienkich kleszczy, aby rozerwać tkankę łożyska. Następnie wytnij kawałki kosmków o długości około pięciu milimetrów i przenieś do mikroprobówki zawierającej jeden mililitr soli fizjologicznej buforowanej fosforanami.
Zastąp sól fizjologiczną buforowaną fosforanami świeżą i odczekaj 10 minut, od czasu do czasu mieszając. Następnie zastąp buforowaną fosforanem sól fizjologiczną buforem przepuszczalnym, aby przeniknąć do tkanki i zablokować niespecyficzne wiązanie przeciwciał drugorzędowych. Następnie inkubuj przez 30 minut.
Następnie zastąp permeabilizujący buforem soli fizjologicznej buforowanym fosforanem zawierającym dwa procent koziej surowicy z mysim monoklonalnym anty CD31 i króliczym anty CK7. Pozostaw chusteczkę w temperaturze czterech stopni Celsjusza na noc. Następnego dnia usuń pozostałe przeciwciała za pomocą dodatkowych płukań solą fizjologiczną buforowaną fosforanami z dwuprocentową surowicą kozią.
Następnie usuń buforowaną fosforanem sól fizjologiczną z dwuprocentową surowicą kozią i dodaj ten sam bufor, uzupełniony kozią immunoglobuliną przeciw myszom w połączeniu z zielonym fluoroforem i kozią immunoglobuliną przeciw królikowi G w sprzężoną z fluoroforem w podczerwieni. Inkubować przez 30 minut w ciemności w temperaturze pokojowej. Następnie umyj chusteczkę raz za pomocą PBS-GS i przechowuj oznakowaną chusteczkę w ciemności w temperaturze pokojowej do czasu oczyszczenia.
Przemyć próbki trzykrotnie PBS w odstępach 10-minutowych. Aby odwodnić tkankę, usuń sól fizjologiczną buforowaną fosforanami i dodaj 50% etanolu do tkanki i inkubuj przez 10 minut. Po inkubacji wyrzucić, a następnie przemyć trzy razy 70% etanolem w odstępach 10-minutowych, a następnie trzy razy przemyć 100% etanolem w odstępach 15-minutowych.
Następnie za pomocą kleszczyków z cienką końcówką przenieś tkankę do mikroprobówki wypełnionej jednym mililitrem roztworu przez cztery godziny. Po czterech godzinach przenieś tkankę do mikroprobówki wypełnionej roztworem drugim i inkubuj przez kolejne cztery godziny. Aby zamontować tkankę w komorze Sykesa-Moore'a, użyj kleszczy z cienką końcówką, aby umieścić 25-milimetrowy okrągły szkiełko nakrywkowe na podstawie komory.
Ponownie użyj kleszczyków z cienką końcówką, aby umieścić gumową uszczelkę w podstawie na szkiełku nakrywkowym. Usunąć tkankę zanurzoną w roztworze drugim i umieścić ją na środku szkiełka nakrywkowego. Następnie dodaj kroplę roztworu drugą, około 40 mikrolitrów, na tkankę.
Następnie weź drugie szkiełko nakrywkowe i umieść je na uszczelce. Następnie mocno ściśnij szkiełko nakrywkowe i uszczelkę, wkręcając pierścień blokujący w górną część podstawy. Następnie włóż igłę o rozmiarze 25 przez uszczelkę do portu w podstawie.
Następnie napełnij trzymililitrową strzykawkę jednym punktem pięciu mililitrów roztworu dwa. Następnie zamontuj igłę o rozmiarze 25 na strzykawce i włóż igłę do przeciwległego portu przez uszczelkę. Następnie należy rozpocząć wstrzykiwanie do komory roztworu drugiego i sprawdzić, czy powietrze wewnątrz komory wydostaje się przez drugą igłę o rozmiarze 25.
Gdy komora jest pełna, wyjmij igłę i strzykawkę i umieść uchwyt komory Sykesa-Moore'a na stoliku mikroskopu konfokalnego. Użyj obiektywu 10X, aby ustawić ostrość na tkance umieszczonej w komorze. Następnie ustaw punkt odniesienia dla stolika i przesuwaj stolik mikroskopu w górę iw dół przez płaszczyznę ogniskowej, aby zidentyfikować i ustawić górną i dolną część tkanki.
Ustaw rozmiar kroku na dwa przecinki pięć mikrometrów i zbierz plik obrazu konfokalnego zawierający zestaw obrazów tkanki od góry do dołu. Następnie przenieś tkankę do mikroprobówki zawierającej ponad 20 razy objętość 100% etanolu, aby odwrócić oczyszczanie. Następnie, po każdej godzinnej przerwie, zastąp 70, a następnie 50% etanolem, a na końcu solą fizjologiczną buforowaną fosforanami.
Przechowywać w temperaturze czterech stopni Celsjusza w ciemności do momentu osadzenia. Tutaj, aby pokazać sieć naczyniową łożyska, uzyskano zarówno mikroskopowe, jak i konfokalne obrazy mikroskopowe ludzkiego łożyska. Te mikroskopowe obrazy łożyska pokazują promieniste kosmki, które przeniknęły do miąższu łożyska.
Te obrazy mikroskopowe wskazują na obecność dystalnej części kawałków kosmków kończących się w skupisku kosmków. Następnie, aby pokazać warstwę trofoblastu kosmków, dystalna część kosmków została znakowana immunologicznie. Na zdjęciu zewnętrzna warstwa trofoblastu jest pokazana na zielono, a naczynia włosowate są pokazane na czerwono.
Następnie, aby sprawdzić tkankę łożyska przed i po oczyszczeniu, uzyskano obrazy konfokalne nieoczyszczonych i oczyszczonych tkanek łożyska. Obrazy pokazują, że w przypadku nieoczyszczonej tkanki immunofluorescencję można uchwycić na głębokości 100 mikrometrów lub mniejszej tkanki. Wręcz przeciwnie, w przypadku oczyszczonej tkanki łożyska immunofluorescencja może być uchwycona na znacznie większej głębokości.
Ponadto, aby porównać konwencjonalną tkankę z odwróconymi przezroczystymi skrawkami, oczyszczona tkanka została odwodniona w odwrotnym procesie za pomocą etanolu. Immunohistochemiczne barwienie tkanki łożyska anty CK7 przed i po oczyszczeniu nie wykazuje istotnych zmian w morfologii tkanki spowodowanych oczyszczaniem. Animacja pokazuje, że podbarwiona immunologicznie tkanka kosmków jest rozmieszczona na całej głębokości objętości tkanki.
Gdy poczujesz się komfortowo wykonując procedurę, możesz spodziewać się, że zajmie ona około 18 godzin, podzielonych na trzy dni. Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać, że wymaga ona kilku różnych zestawów umiejętności. Trzeba być w stanie wykonać patologię łożyska, mikroskopię konfokalną.
Musisz być w stanie generować trójwymiarowe renderingi obrazowania i musisz być w stanie być biegły w przetwarzaniu i analizie immunologicznej. Po tej procedurze można przeprowadzić inne metody, takie jak tradycyjna histologia, strona STS lub maldi. Wraz ze swoim rozwojem, technika ta toruje drogę w dziedzinie medycyny matczyno-płodowej, neonatologii i biologii trofoblastów w celu zbadania podstawowych przyczyn leżących u podstaw stanu przedrzucawkowego, słabego wzrostu płodu i niepokoju płodu.
Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak czyścić, renderować i analizować tkankę kosmków łożyskowych. Bardzo dziękuję za obejrzenie filmu i życzę powodzenia w eksperymentach.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Przegląd
To badanie przedstawia protokół do generowania trójwymiarowych renderowań fragmentów drzewca kosmówkowego łożyska, nadających się do analizy sieci naczyniowej. Metoda ma na celu odpowiedzenie na kluczowe pytania dotyczące ograniczenia wzrostu u dzieci i przedwczesnego porodu.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauki
- Biologia
- Biologia naczyniowa
Tło
- Rozumienie sieci naczyniowych w łożysku jest kluczowe dla badań nad ograniczeniami wzrostu.
- Dwuwymiarowa charakterystyka histologiczna jest ograniczona w dostarczaniu wglądu.
- Techniki immunolabelingu i klarowania poprawiają wizualizacje struktur naczyniowych.
- To badanie ma na celu poprawę podejść diagnostycznych i terapeutycznych w naukach przyrodniczych.
Cel badania
- Opracowanie metody analizy sieci naczyniowych w tkankach łożyska.
- Zbadanie czynników przyczyniających się do ograniczenia wzrostu u dzieci i przedwczesnego porodu.
- Zapewnienie jaśniejszego zrozumienia unaczyniownia łożyska.
Zastosowane metody
- Odwracalne klarowanie tkanki z próbek kosmówki łożyska.
- Immunostaining do oznakowywania sieci naczyniowych.
- Renderowanie 3D klarowanej tkanki do wizualizacji.
- Sekcja i odwrotne klarowanie tkanki łożyska.
Główne wyniki
- Udana wizualizacja sieci naczyniowych w tkankach łożyska.
- Zgłębienie zrozumienia strukturalnej organizacji unaczyniownia łożyska.
- Potencjalne implikacje dla diagnozowania i leczenia problemów związanych z wzrostem.
- Demonstracja procedury przez wyszkolony personel.
Wnioski
- Opracowana protokół pozwala na szczegółową analizę sieci naczyniowych w łożysku.
- Ta technika może prowadzić do postępów w zrozumieniu zdrowia łożyska.
- Przyszły badania mogą budować na tych odkryciach, aby rozwiązać krytyczne problemy zdrowotne.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
This method enables detailed three-dimensional analysis of placental vascular networks, supporting mechanistic de-risking in maternal-fetal medicine by clarifying structural determinants of fetal growth restriction and preterm birth. It provides a disease-relevant system for evaluating vascular integrity under pathophysiological conditions such as diabetes, hypertension, and obesity. The approach enhances predictive confidence in target validation by linking placental microstructure to clinical outcomes.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of vascular architecture as a therapeutic target in placental insufficiency.
- Operational Value: Provides quantitative structural metrics such as branch points and volume for target engagement assessment.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates standardized, reproducible vascular network readouts for compound screening in placental models.
- Operational Value: Supports assay scalability through reversible clearing and multiplex immunostaining of endothelial and trophoblast markers.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Maintains disease relevance by preserving human placental tissue architecture for preclinical continuity.
- Operational Value: Facilitates risk-adjusted advancement decisions by correlating vascular phenotypes with maternal metabolic stressors.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into discovery biology by enabling hypothesis testing of vascular targets, progresses to screening via standardized 3D vascular phenotyping, and supports translational research through preserved tissue integrity and biomarker-compatible labeling.
- Discovery Biology: Supports pathway clarification and biological de-risking of vascular targets in placental disease models.
- Screening: Delivers assay readiness through quantitative, reproducible vascular network metrics from cleared tissues.
- Analytics: Generates measurable outputs including capillary volume, branch number, and end points for comparative condition analysis.
- Translational Research: Connects discovery to preclinical validation via human tissue relevance and immunohistochemical fidelity post-clearing.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for vascular phenotyping across gestational and disease-state placental models.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in vascular target validation through direct structural phenotyping.
- Operational Value: Standardization and reproducibility via reversible clearing and synchronized immunostaining protocols.
- Strategic Value: Improved go/no-go decisions by reducing late-stage biological risk in maternal-fetal therapeutics.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets based on vascular network integrity in disease-relevant placental models.
Implementation Considerations
- Requires expertise in placental pathology, immunofluorescence labeling, and confocal microscopy.
- Dependent on tissue clearing infrastructure, Sykes-Moore chambers, and reversible ethanol-based clearing solutions.
- Necessitates cross-team standardization for consistent immunolabeling of CD31 and CK7 across laboratories.
- Involves adaptation considerations for varying placental tissue quality and gestational age.
- Limited by tissue size constraints (~1–2 mm³) and clearing depth (~1 mm) affecting network capture completeness.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Title
1:17
Villous Tree Dissection and Immunofluorescent Staining
3:16
Clarification of the Tissue
4:07
Mounting for Microscopy and Confocal Microscopy
6:04
Reversing the Clearing
6:33
Results: Use of Confocal Microscopy, Immunostaining, and Reverse Clearing to Analyze the Vascularization of Placental Network
8:21
Conclusion
