Name: Trójwymiarowe renderowanie i analiza znakowanych immunologicznie, oczyszczonych ludzkich sieci naczyniowych kosmków łożyskowych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-29T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 33 s
Description: Poznaj metodę trójwymiarowego renderowania i analizy sieci naczyniowych w oczyszczonych, znakowanych immunologicznie ludzkich kosmkach łożyskowych. Technika ta umożliwia badanie przyczyn ograniczenia wzrostu płodu i przedwczesnego porodu.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Ta praca była wspierana przez Biuro Stanu Nowy Jork ds. Osób z Niepełnosprawnością Rozwojową i Analizą Łożyska LLC, New Rochelle, NY.

Ten protokół jest zgodny z wytycznymi komitetu etyki badań na ludziach Instytutu Badań Podstawowych Niepełnosprawności Rozwojowej Stanu Nowy Jork.
1. Rozwarstwienie kosmków
<ol>
	<li>Przepłukać tkankę łożyska utrwalonego w formalinie solą fizjologiczną wzmocnioną fosforanem (PBS)14, aby usunąć formalinę i umieścić na szalce Petriego na etapie mikroskopu preparacyjnego. Użyj skalpela i cienkich kleszczy, aby rozdzielić tkankę łożyska, aby zlokalizować kosmki (białe, nitkowate struktury rozgałęzione). Wyciąć kawałki drzewa kosmków (o długości kilku mm) i przenieść tkankę do mikroprobówki zawierającej ~1 ml PBS.</li>
</ol>
2. Barwienie immunofluorescencyjne
<ol>
	<li>Za pomocą pipety wyjmij PBS i zastąp go nowym. Odstawić na 10 minut z okazjonalnym wirowaniem. Powtórz jeszcze raz. 
	UWAGA: Ten etap i wszystkie dalsze kroki są wykonywane w temperaturze pokojowej, z wyjątkiem inkubacji przeciwciał pierwotnych.</li>
	<li>Za pomocą pipety usuń i zastąp PBS PBS +0,1% Triton-X100 + 2% kozią surowicą (PBS-T-GS) w celu przepuszczalności tkanki i zablokowania niespecyficznego wiązania przeciwciał drugorzędowych. Inkubować przez 30 minut.</li>
	<li>Zastąp PBS-T-GS PBS zawierającym 2% koziej surowicy, zarówno mysi monoklonalny anty-CK7, jak i króliczy anty-CK7.
	<ol>
		<li>Inkubować tkankę przez noc w temperaturze 4 °C.</li>
		<li>Usunąć pozostałe przeciwciała, przemywając PBS-GS przez 10 minut, od czasu do czasu obracając.</li>
		<li>Usunąć PBS-GS i zastąpić PBS-GS zawierającym zarówno kozią anty-mysią IgG sprzężoną z zielonym (520 nm) fluoroforem emitującym zieleń (520 nm), jak i kozią anty-króliczą IgG sprzężoną z fluoroforem emitującym podczerwień (652 nm).</li>
		<li>Usuń przeciwciała, powtarzając krok 2.1.</li>
		<li>Przechowuj tkankę znakowaną immunologicznie w temperaturze pokojowej w ciemności.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Wyjaśnienie tkanki
<ol>
	<li>Przemyć próbki 3 razy PBS w odstępach 10-minutowych.</li>
	<li>Odwodnić tkankę, usuwając PBS za pomocą pipety i zastępując ją 50% etanolem (można również użyć metanolu). Inkubować przez 10 minut. Zastąp świeżym 50% etanolem i inkubuj przez 10 minut. Powtórz to jeszcze raz, w sumie przez 3 inkubacje. Powtórz inkubacje z 70%. Następnie zastąp 100% etanolem i inkubuj przez 15 minut (alternatywnie można użyć metanolu).</li>
	<li>Za pomocą kleszczyków z cienką końcówką przenieś tkankę do świeżej mikroprobówki zawierającej ~ 1 ml roztworu-1 przez 4 godziny.</li>
	<li>Za pomocą kleszczyków z cienką końcówką przenieś tkankę do świeżej mikroprobówki zawierającej Roztwór-2 przez ~ 4 h. 
	UWAGA: Przy przechowywaniu w ciemności immunofluorescencja jest stabilna w temperaturze pokojowej przez co najmniej 6 miesięcy.</li>
	<li>Nie mieszać z żadnym roztworem wodnym (np. medium montażowym), ponieważ spowoduje to utratę klarowności.</li>
</ol>
4. Montaż do mikroskopii
<ol>
	<li>Nie montuj chusteczki między standardowym szkiełkiem podstawowym a szkiełkiem nakrywkowym, ponieważ chusteczka jest miękka i łatwo się odkształca.</li>
	<li>Zapoznaj się z Rysunek 5B i zamontuj tkankę w komorze Sykesa-Moore'a w następujący sposób;
	<ol>
		<li>Za pomocą kleszczyków z cienką końcówką umieść okrągłe szkiełko nakrywkowe o średnicy 25 mm w podstawie studzienki.</li>
		<li>Za pomocą kleszczyków z cienką końcówką umieść gumową uszczelkę w podstawie na szkiełku nakrywkowym.</li>
		<li>Za pomocą pipety umieść kroplę (~40 μl) roztworu-2 na środku szkiełka nakrywkowego.</li>
		<li>Za pomocą kleszczyków z cienką końcówką przenieś kawałek tkanki z roztworu 2 do kropli na środku szkiełka nakrywkowego.</li>
		<li>Umieść drugie szkiełko nakrywkowe na górze uszczelki.</li>
		<li>Wkręć pierścień blokujący w górną część podstawy, ściskając szkiełka nakrywkowe i uszczelkę, aż będą twarde. 
		UWAGA: Uważaj, aby nie dokręcić zbyt mocno, w przeciwnym razie szkiełko nakrywkowe pęknie.</li>
		<li>Włóż igłę o rozmiarze 22 do portu w podstawie i przez uszczelkę.</li>
		<li>Napełnij strzykawkę o pojemności 3 ml ~ 1,5 ml roztworu-2.</li>
		<li>Zamontować igłę o rozmiarze 25 na strzykawce.</li>
		<li>Włożyć igłę strzykawki do przeciwległego portu i przez uszczelkę.</li>
		<li>Upewnij się, że powietrze w komorze wydostaje się przez drugą igłę o rozmiarze 25, delikatnie wstrzyknąć roztwór-2 i napełnić komorę.</li>
		<li>Wyjąć igłę i strzykawkę i umieścić komorę na dużym szklanym szkiełku na stoliku mikroskopu konfokalnego.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Alternatywnie, wytnij niestandardowe studzienki z arkuszy silikonowych PDMS.
	<ol>
		<li>Za pomocą nożyczek wytnij 2 kawałki o wymiarach 25,4 × 25,4 mm z arkusza PDMS.</li>
		<li>Skalpelem naciętym ~ 12,7 × 12,7 mm2 dołki w kawałku.</li>
		<li>Mocno dociśnij element do szkiełka mikroskopowego.</li>
		<li>Napełnij studzienkę do góry roztworem 2.</li>
		<li>Przenieś kawałek tkanki z mikrorurki do środka studzienki.</li>
		<li>Za pomocą kleszczyków z cienką końcówką umieść szkiełko nakrywkowe na górze studzienki tak, aby spód szkiełka nakrywkowego był zwilżony roztworem-2.</li>
		<li>Zamontuj zespół komory Sykesa Moore'a z tkanką na stoliku mikroskopu konfokalnego.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. Mikroskopia konfokalna
<ol>
	<li>Ustaw ostrość tkanki w komorze za pomocą obiektywu 10x.</li>
	<li>Przesuwaj stolik mikroskopu w górę iw dół przez płaszczyznę ogniskowej, aby zmierzyć odległość między górną a dolną częścią tkanki.</li>
	<li>Przesuwaj stolik w krokach co 2,5 μm, aby zebrać plik obrazu konfokalnego zawierający zestaw obrazów przez tkankę od góry do dołu.</li>
</ol>
6. Odwrócenie oczyszczania
<ol>
	<li>Odwróć oczyszczanie, przenosząc tkankę do mikroprobówki zawierającej > 20 razy większą objętość niż 100% etanol. W odstępach 1 h zastąp 70% etanolem, następnie 50% etanolem i na końcu PBS. Przechowywać w temperaturze 4 °C w ciemności. 
	UWAGA: Teraz przetworzyć tkankę pod kątem standardowego zatapiania parafiny, cięcia i barwienia histologicznego lub immunohistochemicznego.</li>
</ol>
7. Dekonwolucja
UWAGA: Dla poniższych kroków, polecenia oprogramowania, zakładki i rozwijane menu są pisane kursywą.
<ol>
	<li>Uruchom oprogramowanie do dekonwolucji i otwórz plik obrazu.</li>
	<li>Wprowadź parametry wymienione w oknie "Summary".
	<ol>
		<li>W polu "Odstępy" wprowadź wymiary woksela x, y i z w μm.</li>
		<li>Dla każdego kanału koloru wybierz z menu rozwijanego barwnik fluorescencyjny używany do barwienia immunologicznego.</li>
		<li>W polu "Modalność" wybierz z menu rozwijanego opcję Skanowanie laserowe konfokalne.</li>
		<li>W przypadku "Soczewki obiektywu" wybierz 10x z menu rozwijanego.</li>
		<li>W przypadku "Medium zanurzeniowego" wybierz Powietrze z menu rozwijanego.</li>
		<li>Kliknij przycisk "Zastosuj".</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Kliknij zakładkę "Deconvolution".</li>
	<li>Kliknij "Dekonwolucja 3D" w menu rozwijanym.</li>
	<li>W oknie '3D -Deconvolution' upewnij się, że ustawienia to: 1) Adaptacyjny żaluzja PSF, 2) Teoretyczny PSF, 3) Użycie (Domyślny adaptacyjny PSF, 10 iteracji, średni szum), 4) Nazwa podstawy.</li>
	<li>Kliknij "zielony przycisk Sprawdź", aby uruchomić program.</li>
	<li>Po zakończeniu powtórz kroki 7.3 -7.6, aby ponownie uruchomić program. Po zakończeniu uruchom go ponownie po raz trzeci i ostatni.</li>
	<li>W oknie "Menedżer danych" kliknij plik poprzedzony prefiksem "10-10-10-".</li>
	<li>Kliknij zakładkę "Plik", a następnie kliknij "Zapisz jako".</li>
	<li>W oknie "Zapisz s" wybierz "8-bitowa liczba całkowita bez znaku" z menu rozwijanego "Typ danych" i kliknij Zapisz.</li>
</ol>
8. Przetwarzanie obrazu
<ol>
	<li>Uruchom oprogramowanie Fidżi.
	<ol>
		<li>Kliknij "Plik", kliknij "Otwórz" i wybierz plik obrazu Deconvolved, a następnie kliknij przycisk "Otwórz" w oknie "Otwórz". </li>
		<li>Kliknij "Obraz/Kolor/Podziel kanały" i przekonwertuj trójkolorowy plik obrazu na trzy nowe pliki zawierające tylko jeden kolor. Zapisz czerwony plik obrazu, który zawiera zestaw obrazów naczyń włosowatych kosmków znakowanych znakowaną immunologicznie. Usuń zielone i niebieskie pliki obrazów.</li>
		<li>Odejmij fluorescencję tła od czerwonego pliku obrazu za pomocą: "Przetwarzaj/Odejmij tło".</li>
		<li>W menu rozwijanym ustaw Promień toczącej się piłki na 10 pikseli.</li>
		<li>Pozostaw 4 opcje menu niezaznaczone i kliknij "OK".</li>
		<li>Kliknij "Tak" w menu Stos procesów.</li>
		<li>Usuń wrodzoną fluorescencję tkanek (autofluorescencję), otwierając menu "Obraz/Dostosuj/Jasność-Kontrast" i dostosowując ustawienia minimalne, maksymalne jasności i kontrastu. Uważaj, aby nie usunąć żadnej immunofluorescencji kapilarnej.</li>
		<li>Zminimalizuj pozostałą nieistotną fluorescencję, otwierając menu "Obraz/Dostosuj/Próg" i dostosowując suwaki tak, aby podświetlić immunofluorescencję kapilarną. Zaznacz pole "Ciemne tło" i kliknij "Zastosuj". W menu rozwijanym "konwertuj na binarne" zaznacz pole "Czarne tło" i kliknij "OK". Zapisz czarno-biały (binarny) plik obrazu do analiz poniżej.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
9. Analiza
<ol>
	<li>Liczenie obiektów i szkieletyzacja.
	<ol>
		<li>Wybierz binarny plik obrazu utworzony w kroku 8.1.8.</li>
		<li>Kliknij "Opcje Analyze/3D OC" i zaznacz tylko pola "Objętość" i "Zapisz wyniki..." w menu rozwijanym. Upewnij się, że pole "Pokaż liczby" nie jest zaznaczone. Kliknij przycisk "OK".</li>
		<li>Kliknij na'Licznik Analizy/Obiektów 3D'. W menu rozwijanym ustaw "Filtr rozmiaru: Min." na 5000. Upewnij się, że pole "Wyklucz obiekty na krawędziach" nie jest zaznaczone. Sprawdź, czy pola "Obiekty", "Statystyki" i "Podsumowanie" są zaznaczone. Kliknij przycisk 'OK'. 
		UWAGA: Może to potrwać kilka minut w zależności od rozmiaru pliku i konfiguracji komputera.</li>
		<li>Zapisz tabelę Statistics (Statystyki) i plik mapy Objects.</li>
		<li>Wybierz plik mapy Obiekty. Kliknij na 'Plugins/Skeleton/Skeletonize 2D-3D', aby zszkieletować sieć kapilarną w pliku binarnym. Kliknij "Plik/Zapisz jako". Wybierz "Tiff..." z menu rozwijanego. W oknie Zapisz jako TIFF dodaj "Skel-" do nazwy pliku mapy obiektów i kliknij przycisk 'Zapisz'.</li>
		<li>Kliknij "Analizuj/Szkielet/Analizuj szkielet 2D-3D". W menu rozwijanym zaakceptuj ustawienia domyślne i kliknij przycisk "OK". Zapisz tabelę "informacji" gałęzi, tabelę "Wyniki" i dwa pliki wyjściowe (-skeletons oznaczone etykietami Skel-Objects i Oznaczone szkielety).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Thornburg, K. L., Kolahi, K., Pierce, M., Valent, A., Drake, R., Louey, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biological+features+of+placental+programming%5BTitle%5D)+AND+%22Placenta%22%5BJournal%5D)">Biological features of placental programming.</a> Placenta. 48, Suppl 1 47-53 (2016).</li>
<li>Misra, D. P., Salafia, C. M., Charles, A. K., Miller, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Birth+weights+smaller+or+larger+than+the+placenta+predict+BMI+and+blood+pressure+at+age+7+years%5BTitle%5D)+AND+%22J+Dev+Orig+Health+Dis%22%5BJournal%5D)">Birth weights smaller or larger than the placenta predict BMI and blood pressure at age 7 years.</a> J Dev Orig Health Dis. 1 (2), 123-130 (2010).</li>
<li>Burton, G. J., Fowden, A. L., Thornburg, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Placental+Origins+of+Chronic+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol+Rev%22%5BJournal%5D)">Placental Origins of Chronic Disease.</a> Physiol Rev. 96 (4), 1509-1565 (2016).</li>
<li>Srinivasan, A. P., Omprakash, B. O. P., Lavanya, K., Subbulakshmi Murugesan, P., Kandaswamy, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+prospective+study+of+villous+capillary+lesions+in+complicated+pregnancies%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pregnancy%22%5BJournal%5D)">A prospective study of villous capillary lesions in complicated pregnancies.</a> J Pregnancy. 2014, 193925(2014).</li>
<li>Jones, C. J. P., Desoye, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+possible+function+for+placental+pericytes%5BTitle%5D)+AND+%22Cells+Tissues+Organs%22%5BJournal%5D)">A new possible function for placental pericytes.</a> Cells Tissues Organs. 194 (1), 76-84 (2011).</li>
<li>Maly, A., Goshen, G., Sela, J., Pinelis, A., Stark, M., Maly, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histomorphometric+study+of+placental+villi+vascular+volume+in+toxemia+and+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Pathol%22%5BJournal%5D)">Histomorphometric study of placental villi vascular volume in toxemia and diabetes.</a> Hum Pathol. 36 (10), 1074-1079 (2005).</li>
<li>Ellery, P. M., Cindrova-Davies, T., Jauniaux, E., Ferguson-Smith, A. C., Burton, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+transcriptional+activity+in+the+syncytiotrophoblast+of+the+human+placenta%5BTitle%5D)+AND+%22Placenta%22%5BJournal%5D)">Evidence for transcriptional activity in the syncytiotrophoblast of the human placenta.</a> Placenta. 30 (4), 329-334 (2009).</li>
<li>Jirkovská, M., Kubínová, L., Janáček, J., Kaláb, J. <a target="_blank" href="https://www.ias-iss.org/ojs/IAS/article/view/820">3-D study of vessels in peripheral placental villi.</a> Image Anal Stereol. 26 (3), 165-168 (2011).</li>
<li>Pearce, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Image-Based+Modeling+of+Blood+Flow+and+Oxygen+Transfer+in+Feto-Placental+Capillaries%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+ONE%22%5BJournal%5D)">Image-Based Modeling of Blood Flow and Oxygen Transfer in Feto-Placental Capillaries.</a> PLOS ONE. 11 (10), 0165369(2016).</li>
<li>Plitman Mayo, R., Olsthoorn, J., Charnock-Jones, D. S., Burton, G. J., Oyen, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Computational+modeling+of+the+structure-function+relationship+in+human+placental+terminal+villi%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomech%22%5BJournal%5D)">Computational modeling of the structure-function relationship in human placental terminal villi.</a> J Biomech. 49 (16), 3780-3787 (2016).</li>
<li>Mayhew, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+stereological+perspective+on+placental+morphology+in+normal+and+complicated+pregnancies%5BTitle%5D)+AND+%22J+Anat%22%5BJournal%5D)">A stereological perspective on placental morphology in normal and complicated pregnancies.</a> J Anat. 215 (1), 77-90 (2009).</li>
<li>Teasdale, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gestational+changes+in+the+functional+structure+of+the+human+placenta+in+relation+to+fetal+growth%3A+a+morphometric+study%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Obstet+Gynecol%22%5BJournal%5D)">Gestational changes in the functional structure of the human placenta in relation to fetal growth: a morphometric study.</a> Am J Obstet Gynecol. 137 (5), 560-568 (1980).</li>
<li>Richardson, D. S., Lichtman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.cell.com/cell/abstract/S0092-8674(15)00837-5">Clarifying Tissue Clearing.</a> Cell. 162 (2), 246-257 (2015).</li>
<li>Dulbecco, R., Vogt, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plaque+formation+and+isolation+of+pure+lines+with+poliomyelitis+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Plaque formation and isolation of pure lines with poliomyelitis viruses.</a> J Exp Med. 99 (2), 167-182 (1954).</li>
<li>Gill, J. S., Salafia, C. M., Grebenkov, D., Vvedensky, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+oxygen+transport+in+human+placental+terminal+villi%5BTitle%5D)+AND+%22J+Theor+Biol%22%5BJournal%5D)">Modeling oxygen transport in human placental terminal villi.</a> J Theor Biol. 291, 33-41 (2011).</li>
<li>Plitman Mayo, R., Charnock-Jones, D. S., Burton, G. J., Oyen, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+modeling+of+human+placental+terminal+villi%5BTitle%5D)+AND+%22Placenta%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional modeling of human placental terminal villi.</a> Placenta. 43, 54-60 (2016).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Instytucjonalna Komisja Rewizyjna zatwierdziła pobranie tkanek kosmków łożyskowych w celu utrwalenia formaliny z ciąż przerwanych planowo. Przed wykonaniem zabiegów przeprowadzono krótki przegląd dokumentacji medycznej, w którym zwrócono uwagę na wiek matki, poród i potwierdzono brak jakichkolwiek podstawowych objawów medycznych (np. nadciśnienie, cukrzyca i toczeń) lub płodowych (anomalie strukturalne lub chromosomalne, nieprawidłowy wzrost). Karta katalogowa i wszelkie pobrane próbki zostały oznaczone jedynie ...

Nasze zrozumienie rozwijającego się łożyska i jego patologii jest w dużej mierze ograniczone do wnioskowanych relacji przestrzennych między sąsiednimi kosmkami a zamkniętymi naczyniami włosowatymi pochodzącymi z odcinków histologicznych. W tym badaniu zajęliśmy się tym problemem, opracowując środki do generowania trójwymiarowych (3D) renderingów sieci naczyń włosowatych łożyska człowieka, które są odpowiednie do analiz cech sieci kapilarnych (np. rozgałęzienia, solidność). W tym celu połączyliśmy barwienie immunofluorescencyjne z dwoma dostępnymi na rynku produktami do oczyszczania tkanek, Visikol-1 i Visikol-2 (określanymi poniżej jako Roztwór-1 i Roztwór-2).
Łożysko ludzkie to ogromny kompleks naczyń krwionośnych znajdujących się na styku krwi międzykosmkowej matki a rozwijającym się płodem. Rozciągając się od wprowadzenia do płytki kosmówkowej, pępowina rozgałęzia się w sieć tętnic i żył, które rozgałęziają się, pokrywając powierzchnię kosmówki skomplikowaną siecią naczyniową. Ich końce następnie wnikają w dół do wnętrza lub głębokości krążka łożyskowego, gdzie przechodzą kilka kolejnych rozgałęziających się pokoleń i kończą się w końcowych kosmkach i zawartych w nich sieciach naczyń włosowatych, miejscu wymiany gazów, składników odżywczych i odpadów metabolicznych między krwią płodu i matki.
Uszkodzenia sieci naczyń włosowatych łożyska podczas rozwoju mają trwałe konsekwencje dla zdrowia płodu, noworodka i dorosłego dziecka w nagłych wypadkach 1,2,3. Ze względu na patologie związane z ciążą, takie jak poronienia, wewnątrzmaciczne zahamowanie wzrostu, stan przedrzucawkowy i cukrzyca matki 4,5,6 dużą wagę przywiązuje się do opracowania metod pomiaru i charakterystyki sieci naczyń włosowatych kosmków łożyska. Główną przeszkodą jest to, że sieciowe naczynia łożyskowe obejmują szeroki zakres skali. Powierzchniowe sieci naczyniowe mogą mieć nawet 4-5 mm średnicy. Końcowe naczynia włosowate kosmkowe mają średnicę rzędu 10 -20 μm; Łożysko zawiera ponad 300 km naczyń krwionośnych <klasa SUP="xref">7. Obecnie istnieje kilka łatwych w użyciu i szybkich technik, które mogą uchwycić te ekstremalne rozmiary naczyń. Do tej pory tylko niewielka liczba kosmków może być odwzorowana pod mikroskopem. Na przykład Jirkovska i wsp. skupili się na kosmkach łożyskowych w terminie, łącząc mikroskopię konfokalną z seryjnymi przekrojami optycznymi w odstępach 1 μm uzyskanymi z odcinków o grubości 120 μm; Nie podano żadnych danych na temat liczby badanych próbek ani statystyk 8. Zidentyfikowano struktury kapilarne, a kontury kosmków i naczyń włosowatych narysowano ręcznie, a ślady wyeksportowano do analizy obrazu. Podczas gdy autorzy omawiają implikacje swoich odkryć dla "rosnącej sieci naczyniowej kosmków", takie wnioski są problematyczne, gdy badana jest tylko tkanka "donoszona" (36+ tydzień ciąży). Podobnie, Mayo i Pearce i in. polegali na tkance w tym samym wieku, w swoich symulacjach przepływu krwi i transferu tlenu, ale ich analizy były ograniczone tylko do kilku terminów, końcowych kosmków 9,10. Stereologia znalazła również zastosowanie do badania budowy naczyń kosmkowych. Ale znowu, nacisk kładziono na późniejsze ciąże, w których rodzą się żywe niemowlęta z jednym lub więcej powikłaniami ciąży 11,12.
Do niedawna mikroskopia konfokalna była ograniczona do obrazowania do głębokości tkanki 100-200 μm ze względu na absorpcję wzbudzenia i emisji fluorescencji przez leżącą nad nią tkankę 13 . Chociaż oczyszczanie tkanek i histologia 3D zostały szeroko opisane w literaturze i istnieje wiele metod oczyszczania tkanek, wiele z nich nie nadaje się do stosowania z tkankami w ogóle, ponieważ nieodwracalnie uszkadzają morfologię komórkową poprzez nadmierne nawodnienie białek lub usuwanie lipidów. W związku z tym nie jest możliwe sprawdzenie, czy wyniki te wskazują na samą tkankę, a nie artefakty z przetwarzania, podczas gdy nasz proces oczyszczania tkanek jest odwracalną techniką, która jest w stanie zweryfikować w porównaniu z tradycyjną histologią. Oczyszczanie tkanek na ogół obejmuje jedno z trzech głównych podejść: 1) równomierne dopasowanie współczynnika załamania światła (RI) składników tkankowych poprzez zanurzenie w roztworach pasujących RI, które usuwa skumulowane rozpraszanie światła spowodowane soczewkowaniem z powodu ciągłych wahań składników o niskim RI (cytozol) i wysokim RI (białko / lipidy); 2) usuwanie składników lipidowych poprzez zatopienie w hydrożelu i wykorzystanie elektroforezy/dyfuzji do usunięcia składników lipidowych; 3) ekspansja/denaturacja struktury białka w celu umożliwienia zwiększonej penetracji rozpuszczalników w celu zapewnienia jednorodności RI 13. Chociaż podejścia te mogą sprawić, że tkanki staną się przezroczyste i pozwolą na generowanie reprezentacji 3D biomarkerów, te reprezentacje 3D mają wątpliwą wartość kliniczną, ponieważ trudno jest określić, czy obrazy te wskazują na właściwości tkanki, czy na proces oczyszczania tkanek. Z drugiej strony, ponieważ nasze oczyszczanie tkanek jest odwracalne, standardową histologię i/lub immunohistochemię można zastosować do tej samej tkanki, aby ocenić, czy zmiany są klinicznie istotne.
To badanie przedstawia analizę 47 próbek dystalnych kosmków uzyskanych z łącznie 23 klinicznie normalnych i celowo przerwanych ciąż między 9 a 23 zakończonym tygodniem ciąży i dwoma pełnoprawnymi normalnymi porodami. Znakowanie immunofluorescencyjne trofoblastu i śródbłonka umożliwiło ilościową i zautomatyzowaną analizę zmian w sieciach naczyniowych kosmków i ich złożoności.
Za pomocą tego protokołu wyizolowaliśmy i przeanalizowaliśmy kosmki końcowe oraz ich sieci kapilarne na skalę, która wcześniej nie była możliwa. To podejście, zastosowane do rozwoju kosmków i sieci naczyń włosowatych w całej ciąży, pozwoli zidentyfikować te właściwości, które są podstawą narodzin zdrowego dziecka. Zastosowane do badań nad ciążami powikłanymi, wyjaśni również, kiedy i w jaki sposób patologie łożyska modyfikują drzewa kosmkowe i sieci naczyń włosowatych, które pokrywają, oraz jak wpływają one na dobrostan płodu.

<table><tbody><tr><td>10% roztwór formaldehydu (w/v) w wodnym buforze fosforanowym</td><td>Macron Fine Chemicals</td><td>H-121-08</td><td>Ogólny środek utrwalający, formuła gotowa do użycia, należy zachować ostrożność, ponieważ opary są toksyczne</td></tr><tr><td>Ostrza skalpela</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>08-916-5B No. 11</td><td></td></tr><tr><td>Skalpel</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>08-913-5</td><td></td></tr><tr><td>Kleszcze drobnoziarniste</td><td>Usługi</td> <td>mikroskopii elektronowej78354-119</td><td></td></tr><tr><td>Mikroprobówka (1,7 ml)</td><td>PGC Scientifics</td><td>505-201</td><td></td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanami</td><td>Sigma</td><td>D8537</td><td>PBS</td></tr><tr><td>Pipeta</td><td>VWR</td><td>52947-948</td><td>jednorazowa, 3ml pipeta transferowa</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Boehriner Mannheim</td><td>789 704</td><td>Rozcieńczyć do 0,1% z zapasu</td></tr><tr><td>Kozia surowica</td><td>Gibco</td><td>16210-064</td><td>Rozcieńczyć do 2% w roztworze PBS</td></tr><tr><td>Mysi monokloniczny anty-ck7 Keratyna 7 Ab-2 (klon OV-TL 12/30)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>MS-1352-RQ</td><td></td></tr><tr><td>Królik Przeciwciało anty-CD31</td><td>Abcam</td><td>ab28364</td><td></td></tr><tr><td>emitujące zielone (520 nm) fluorochrom&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>A11017</td><td>Alexa-Fluor 488</td></tr><tr><td>fluorochrom emitujący podczerwień (652 nm)</td><td>Invitrogen</td><td>A21072</td><td>Alexa Fluor 633</td></tr><tr><td>Alkohol etylowy 200 proof</td><td>Pharmco-Aaper</td><td>111000200</td><td>Rozcieńczyć do niższych stężeń za pomocą PBS w razie potrzeby</td></tr><tr><td>Rozwiązanie-1</td><td>Visikol Inc.</td><td></td><td>Visikol Histo-1</td></tr><tr><td>Solution-2</td><td>Visikol Inc.</td><td></td><td>Visikol Histo-2</td></tr><tr><td>Komory Skyes-Moore BellCo</td><td>Glass Inc.</td><td>P/N 1943-11111</td><td></td></tr><tr><td>Igła o rozmiarze 25</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>14-826AA</td><td>BD Precision Glide Wymaga</td></tr><tr><td>strzykawki 3 ml</td><td>Jednorazowa strzykawka</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>14-823-40</td> BD arkusze</tr><tr><td>silikonowe PDMS</td> Mikroskop konfokalny <td>McMaster-Carr</td><td>P/N 578T31</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Nikon Inc.</td><td></td><td>Mikroskop konfokalny Nikon C1</td></tr><tr><td>Oprogramowanie do dekonwolucji</td> Media <td>Cybernetyka</td><td></td><td>AutoQuant X22</td></tr><tr>Oprogramowanie <td></td><td></td> do<td>przetwarzania obrazów Fidżi</td><td>za darmo, Oprogramowanie Open source&nbsp; dostępne pod adresem https://fiji.sc</td></tr><tr><td>Hematoxylin</td><td>Leica Biosystems</td><td>3801570</td><td>Komponent 1 SelecTech H& System barwienia</td></tr><tr><td>E Alkoholowa eozyna</td><td>Leica Biosystems</td><td>3801615</td><td>Składnik 2 firmy SelecTech H& System barwienia</td></tr><tr><td>E Blue Buffer</td><td>Leica Biosystems</td><td>3802918</td><td>Komponent 3 firmy SelecTech H& System barwienia</td></tr><tr><td>E Aqua Define MCX</td><td>Leica Biosystems</td><td>3803598</td><td>Komponent 4 firmy SelecTech H& System barwienia E</td></tr><tr><td>System detekcji immunohistochemicznej</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>TL-125-QHD</td><td>UltraVision Quanto Detection System HRP DAB</td></tr></tbody></table>

trójwymiarowe renderowanie i analiza znakowanych immunologicznie, oczyszczonych ludzkich sieci naczyniowych kosmków łożyskowych

Three-dimensional Rendering and Analysis of Immunolabeled, Clarified Human Placental Villous Vascular Networks

Wymiana składników odżywczych i gazów między matką a płodem zachodzi na styku krwi międzykosmkowej matki i rozległej sieci naczyń włosowatych kosmków, która stanowi większość miąższu ludzkiego łożyska. Sieć naczyń włosowatych dystalnych kosmków jest końcem dopływu krwi do płodu po kilku pokoleniach rozgałęzień naczyń wystających z pępowiny. Sieć ta ma ciągłą osłonkę komórkową, warstwę barierową syncytialnego trofoblastu, która zapobiega mieszaniu się krwi płodu z krwią matki, w której jest ona stale kąpana. Naruszenie integralności sieci naczyń włosowatych łożyska, występujące w zaburzeniach takich jak cukrzyca matki, nadciśnienie i otyłość, ma konsekwencje, które stanowią poważne zagrożenie dla zdrowia płodu, niemowlęcia i osoby dorosłej. Aby lepiej zdefiniować strukturalne skutki tych uszkodzeń, opracowano protokół dla tego badania, który rejestruje strukturę sieci kapilarnej rzędu 1 - 2 mm3 , w którym można zbadać jej cechy topologiczne w pełnej złożoności. Aby to osiągnąć, skupiska końcowych kosmków z łożyska są wycinane, a warstwa trofoblastu i śródbłonek naczyń włosowatych są znakowane immunologicznie. Próbki te są następnie klarowane za pomocą nowego procesu oczyszczania tkanek, który umożliwia uzyskanie konfokalnych stosów obrazów do głębokości z- ~1 mm. Trójwymiarowe renderingi tych stosów są następnie przetwarzane i analizowane w celu wygenerowania podstawowych pomiarów sieci kapilarnej, takich jak objętość, liczba gałęzi kapilarnych i punkty końcowe gałęzi kapilarnych, jako walidacja przydatności tego podejścia do charakterystyki sieci kapilarnej.

Wygenerowane renderingi 3D naczyń włosowatych w skupiskach kosmków końcowych ludzkiej łożyska od 8. tygodnia wieku gestacyjnego do terminu porodu zostały przeliczone jako poszczególne skupiska i poddane szkieletyzacji w celu analizy sieciowej. Jednostkami funkcjonalnymi łożyska (Rysunek 1A) są drzewa kosmków, które stanowią przedłużenie naczyń powierzchniowych w miejscu, w którym przeniknęły one do miąższu łożyska (Rysune...

To badanie przedstawia protokół odwracalnego oczyszczania tkanek, barwienia immunologicznego, renderowania 3D i analizy sieci naczyniowych w próbkach ludzkich kosmków łożyskowych rzędu 1 - 2 mm3.

Trójwymiarowe renderowanie i analiza znakowanych immunologicznie, oczyszczonych ludzkich sieci naczyniowych kosmków łożyskowych

Nutrient and gas exchange between mother and fetus occurs at the interface of the maternal intervillous blood and the vast villous capillary network that ...

Ogólnym celem tej procedury jest wygenerowanie trójwymiarowych renderingów fragmentów kosmków łożyskowych, które nadają się do analizy zawartych w nich sieci naczyniowych. Ta metoda może pomóc nam odpowiedzieć na kluczowe pytania w naszej dziedzinie, takie jak to, dlaczego dziecko może mieć ograniczony wzrost lub jaki stres i jak silny mógł być stres, który doprowadził do przedwczesnego porodu. Główną zaletą naszej procedury jest to, że jesteśmy teraz w stanie znakować immunologicznie przezroczystą tkankę kosmków łożyskowych, a następnie wizualizować ich sieci naczyniowe i wykorzystywać te wizualizacje do charakteryzowania i analizy tych sieci naczyniowych.Implikacje tej techniki mogą rozciągać się na wiele diagnoz i terapii, ponieważ większość nauk przyrodniczych opiera się na dwuwymiarowej charakterystyce histologicznej. Procedurę zademonstruje Pani Valerie Schwenko, która przeprowadzi znakowanie immunologiczne i oczyszczenie tkanki łożyska, a następnie Pan Phillip Necaise przeprowadzi sekcję tkanki łożyska, a także odwrotne oczyszczenie tkanki. Aby przygotować się do wycięcia kosmków, najpierw spłucz formalną i utrwaloną tkankę łożyska solą fizjologiczną buforowaną fosforanami.N

three-dimensional-rendering-analysis-immunolabeled-clarified-human

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

Zespół transfuzji bliźniak-bliźniak oraz sekwencja anemii i policytemii u bliźniąt to dwa potencjalnie dewastujące problemy w medycynie perinatalnej. Obie te zaburzenia występują wyłącznie u bliźniąt monochorialnych i wynikają z niezrównoważonego przepływu krwi przez naczyniowe anastomozy łożyskowe. Przedstawiamy prosty protokół służący do dokładnej oceny obecności anastomoz naczyniowych za pomocą wstrzykiwania barwnika do naczyń łożyska po urodzeniu.

Dokładna i prosta ocena anastomoz naczyniowych w łożysku jednojajuszowym z wykorzystaniem barwnika

Ten film pokazuje tworzenie pierwotnych hodowli ludzkich kosmków łożyskowych i narządów dziesiętnych w warunkach ex vivo. Modele te doskonale nadają się do badania patogenezy na styku człowieka z matką i płodem.

Ustanowienie kultur kosmków i narządów dziesiętnych jako modeli ex vivo ludzkiej granicy matczyno-płodowej

Ten protokół opisuje technikę oceny zmian w unaczynieniu matki podczas ciąży u myszy. Za pomocą metod stereologicznych ocenia się ilościowo przebudowę dziesiętnych tętnic spiralnych, a wyniki potwierdza się jakościowo za pomocą immunohistochemii.

Ocena przebudowy naczyń krwionośnych matki w czasie ciąży w macicy myszy

Opisana jest prosta metoda ustalania pierwotnych ludzkich hodowli łożyskowych (kosmków) i narządów dziesiętnych. Hodowle kosmków i narządów dziesiętnych są nieocenionymi narzędziami do badania patogenezy na styku człowieka z matką i płodem. Wykazano zakażenie fakultatywną bakterią wewnątrzkomórkową Listeria monocytogenes.

Ludzkie posiewy łożyska i narządów dziesiętnych w celu zbadania zakażeń na granicy matczyno-płodowej

Przedstawiamy szczegółową metodę badania fizjologii łożyska u człowieka in vivo w terminie. Metoda łączy pobieranie próbek krwi z naczyń przychodzących i odpływowych po stronie matczynej i płodowej łożyska z pomiarami ultrasonograficznymi objętości przepływu krwi i pobieraniem próbek tkanki łożyska.

Podejście do pobierania próbek z 4 naczyń w integracyjnych badaniach fizjologii łożyska człowieka in vivo

Tutaj prezentujemy adaptację metody pasywnej CLARITY i rekonstrukcji 3D do wizualizacji naczyń włosowatych jajników i naczyń włosowatych pęcherzyków w nienaruszonych jajnikach myszy.

Trójwymiarowa rekonstrukcja architektury naczyniowej jajnika myszy z pasywnym czyszczeniem CLARITY

Progenitorzy śródbłonka pochodzący z indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC-EPs) mają potencjał, aby zrewolucjonizować leczenie chorób sercowo-naczyniowych i umożliwić tworzenie bardziej wiernych modeli chorób sercowo-naczyniowych. W artykule opisano enkapsulację iPSC-EP w trójwymiarowych (3D) mikrośrodowiskach kolagenu oraz analizę ilościową potencjału naczyniowego tych komórek.

Model 3D in vitro i potok obliczeniowy do ilościowego określenia potencjału naczyniopochodnego progenitorów śródbłonka pochodzących z iPSC

Oto protokół hodowli eksplantatów łożyskowych w warunkach stałego przepływu. Podejście to wzmacnia tradycyjne statyczne systemy hodowli kosmków, umożliwiając replikację dynamicznych środowisk fizjologicznych.

Ex vivo Hodowla eksplantatów łożyskowych - naśladowanie dynamicznych warunków w macicy

Perycyty w unaczynieniu siatkówki zostały zbadane za pomocą barwienia immunofluorescencyjnego z receptorem czynnika wzrostu pochodzenia płytkowego β po retro-orbitalnym wstrzyknięciu fluorescencyjnej lektyny pomidorowej. Znakowaną siatkówkę poddano dalszej obróbce metodą oczyszczania tkanek i zamontowano w całości w celu wizualizacji trójwymiarowych widoków perycytów otaczających naczynia krwionośne siatkówki pod mikroskopem konfokalnym.

Wizualizacja 3D perycytów naczyniowych siatkówki myszy za pomocą immunostainingu

Protokół ten opisuje przygotowanie roślin tkanki łożyskowej ludzkich hodowanych na styku powietrze-ciecz do badania infekcji wirusowych.

Ex vivo Hodowla ludzkich implantów łożyskowych do badania transmisji wirusa na styku matka-płod

Ten protokół umożliwia oczyszczanie, charakteryzację i hodowlę pierwotnych trophoblastów pozabłonowych HLA-G+ (EVT) z łożyska podstawnego i błony kosmówkowej ludzkich łożysk końcowych. Pierwotne kultury EVT utrzymują żywotność przez 96 h, co pozwala na współhodowlę z dopasowanymi do próbek komórkami układu odpornościowego matki oraz następcze analizy przepływowe cytometryczne i molekularne ich interakcji.

Oczyszczanie pozabłonkowych trofoblastów HLA-G+ z ludzkich tkanek łożyska w okresie ciąży do fenotypowań i analizy funkcjonalnej

Poznaj metodę trójwymiarowego renderowania i analizy sieci naczyniowych w oczyszczonych, znakowanych immunologicznie ludzkich kosmkach łożyskowych. Technika ta umożliwia badanie przyczyn ograniczenia wzrostu płodu i przedwczesnego porodu.

Trójwymiarowe renderowanie i analiza znakowanych immunologicznie, oczyszczonych ludzkich sieci naczyniowych kosmków łożyskowych

Przeglądaj więcej filmów