Name: Obiektywny i powtarzalny test uczenia się węchu i dyskryminacji u myszy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-22T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 33 s
Description: Poznaj protokół treningu behawioralnego myszy w dyskryminacji zapachowej, wykorzystujący asocjację nagrody i kary. Ta metoda umożliwia badanie plastyczności synaptycznej oraz mechanizmów uczenia się w neurobiologii.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ten protokół jest zaadaptowany z poprzednich prac w naszym laboratorium (Huang et al.8). Wszystkie opisane tutaj metody zostały zatwierdzone przez Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami i Użytkowania (ACUC) Baylor College of Medicine. Jest wspierany przez McNair Medical Institute, grant NINDS R01NS078294 dla B.R.A., grant NIH IDDRC U54HD083092, F30DK112571 grantu NIDDK dla JMP oraz grant NINDS F31NS092435 dla CKM.

Wszystkie myszy były używane zgodnie z protokołem zatwierdzonym przez Baylor College of Medicine Institutional Animal Care and Use Committee zgodnie ze standardami NIH. Myszy użyte w tym protokole były wszystkimi dorosłymi myszami (w wieku >6 tygodni) na tle C57BL6/j i obejmowały zarówno samce, jak i samice. Po zadaniach treningowych/etapowych myszy wracają do swojej klatki domowej.
1. Budowa i ogólne zasady korzystania z Operant Learning Box (Rysunek 1B, C)
<ol>
	<li>Zmontuj komorę myszy z podłogą komory. Trzymaj boks treningowy w słabo oświetlonym miejscu o małym natężeniu ruchu, aby uniknąć rozpraszania uwagi.</li>
	<li>Wywierć każdy port wodny z małym otworem na górze, aby igła o rozmiarze 18 mogła dozować wodę do portu.</li>
	<li>Napełnij szklaną fiolkę środkiem zapachowym rozpuszczonym w oleju mineralnym (wymienianym co tydzień) i mocno dokręć nakrętkę.</li>
	<li>Podłącz igłę o rozmiarze 18 do silikonowej rurki. Przebić szklaną nasadkę fiolki igłą o rozmiarze 18 i podłączyć drugi koniec silikonowej rurki do wlotu portów zapachowych.</li>
	<li>Umieść każdą silikonową rurkę w zaworze zapachowym.</li>
	<li>Podłącz przewód podciśnieniowy do portów zapachowych.</li>
	<li>Podłączyć dwie strzykawki o pojemności 10 ml do metalowego pręta mocującego i podłączyć rurkę do strzykawek. Podłącz drugą stronę rurki do igły 18 G. Włóż igłę do wywierconego otworu w otworze nośnym w komorze myszy. Podłącz drugi koniec rurki do zaworu wody.</li>
	<li>Napełnij dwie strzykawki o pojemności 10 ml wodą do picia dla gryzoni.</li>
	<li>Podłączyć przepływomierz powietrza do wlotu powietrza i utrzymywać przepływ powietrza na poziomie 3–5 l/min.</li>
	<li>Podłącz 2 zawory wodne, 2 zawory zapachowe, 2 porty wodne, port zapachowy i zasilanie do systemu interfejsu USB. Podłącz wszystkie zawory do portów "Wyjście", wszystkie porty zapachowe i wodne do portów "Wejściowych". Podłącz wszystkie urządzenia do wyjść zasilania ze skrzynki interfejsu USB, a na koniec podłącz skrzynkę interfejsu USB do zasilania.</li>
	<li>Dostosuj ssanie próżniowe, aby uniknąć zanieczyszczenia krzyżowego zapachów między próbami.</li>
	<li>Użyj rurki specyficznej dla zapachu, aby podłączyć fiolki z nazapachem do komory.</li>
</ol>
2. Przygotowanie myszy: 1–3 dni
<ol>
	<li>Podziel myszy na 3 grupy: kontrolne (bez konieczności treningu węchowego), pseudo-wyszkolone (myszy, które losowo otrzymują nagrodę lub karę) i grupy wyszkolone. Wystaw pseudo-wyszkolone myszy na pudełko treningowe i dostarczanie zapachu, ale nie zapewniaj treningu węchowego, ponieważ wynik nagrody i kary jest losowo powiązany z dostarczonym zapachem. 
	UWAGA: Grupa pseudo-wyszkolona przejdzie przez paradygmat treningowy w ramach etapów "Pseudotreningu". Wytrenowane myszy ukończą wszystkie etapy treningu. Pseudotrening jest opcjonalny, jeśli celem eksperymentu jest zbadanie różnic behawioralnych w dyskryminacji zapachu lub uczeniu się. Przedstawiony tutaj protokół dodaje tę grupę, jeśli eksperymentator chce zbadać różnice neuronalne przed i po treningu. Pseudowyszkolona grupa kontrolowałaby następnie pasywną ekspozycję na zapach i trening niezwiązany z węchem.</li>
	<li>Rozpocznij ograniczenie wody u myszy do 40 ml / kg / dzień. Unikaj utraty masy ciała większej niż 20% wyjściowej masy ciała zwierząt, aby uniknąć stresu (<silna klasa="xfig">Rysunek 2A).</li>
	<li>Waż myszy codziennie, aby upewnić się, że przekraczają 80% masy wyjściowej. Jeśli mysz spadnie poniżej tego progu, wyjmij ją z badania i zapewnij swobodny dostęp do wody.</li>
	<li>Utrzymuj wszystkie czynniki środowiskowe na stałym poziomie w całym protokole, w tym temperaturę, hałas i zapachy zabłąkane (w tym zapachy ciała osobistego i perfum/wody kolońskiej/dezodorantu). 
	UWAGA: Podobnie jak w przypadku wszystkich testów zachowania zwierząt, niewielkie zmiany środowiskowe mogą znacznie wpłynąć na wyniki.</li>
</ol>
3. Instrukcje dla wszystkich etapów
<ol>
	<li>Oprogramowanie do trenowania kodu dla każdego z poniższych etapów. Uruchom oprogramowanie na oprogramowaniu behawioralnym. 
	UWAGA: Kodowanie dla wszystkich etapów jest zawarte w dodatkowych plikach kodowania. Dane dla 20 ścieżek są grupowane jako pojedynczy blok, a wydajność myszy jest wyświetlana między blokami. Ponadto każdy etap może być powtarzany na myszy przez określoną liczbę dni, aż zostaną spełnione kryteria ukończenia.</li>
	<li>Nie trzymaj myszy w pudełku behawioralnym dłużej niż 60 minut dziennie.</li>
	<li>Oczyść odchody myszy z klatki przed przeniesieniem każdej myszy do klatki. Spryskaj i przetrzyj komorę 70% etanolem, aby zminimalizować rozpraszanie zapachu myszy.</li>
</ol>
4. Etap szkolenia 1: Kojarzenie nagrody wodnej z centralnym szturchnięciem nosem, 1–3 dni
<ol>
	<li>Na tym etapie skojarz myszy z nagrodą wodną po eksploracji portu wodnego.</li>
	<li>Instrukcje programowania Training Stage 1
	<ol>
		<li>Zaprogramuj ten etap tak, aby korzystał tylko z portu doprowadzającego wodę. Niech mysz otrzyma nagrodę w postaci wody za każde szturchnięcie nosa. 
		UWAGA: Program wyświetli czas trwania próby i całkowitą liczbę nagród w postaci wody, które otrzymała mysz.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Ustaw programowanie pseudoszkolenia Etap 1 tak samo jak Etap szkolenia 1.</li>
	<li>Konfiguracja pudełka i konfiguracja myszy
	<ol>
		<li>Skonfiguruj pole zachowania z portem wodnym pośrodku i bez dostępu do wszystkich portów bocznych. Umieść mysz w komorze. Zamknij komorę myszy i rozpocznij program Stage 1.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Uważaj ten etap za zakończony, gdy mysz wykona 100 prób w ciągu 60 minut. Wyjmij mysz z komory po 60 minutach lub 100 zakończonych próbach (<silna klasa="xfig">Rysunek 2B). 
	UWAGA: Ze względu na indywidualne różnice niektóre myszy w naturalny sposób powstrzymują się od eksploracji pudełka.</li>
	<li>Jeśli potrzebna jest zachęta, ręcznie wlej wodę do portu wodnego. Powtarzaj ten etap do 3 dni. 
	UWAGA: Myszy, które są już wyszkolone, można powtarzać dalej, aby utrzymać parzystość i utrzymać je na ograniczeniu płynów. Możliwe jest również awansowanie całej grupy do etapu 2, gdy średnia grupa osiągnie 100 prób/60 minut. Pozwoli to wszystkim myszom kontynuować trening tego samego dnia.</li>
</ol>
5. Etap szkolenia 2: Kojarzenie nagrody w postaci wody z bocznego portu z centralnym szturchnięciem nosa portu, 1–5 dni
<ol>
	<li>Na tym etapie pozwól myszom wsadzić nos w środkowy port, a następnie natychmiast otrzymaj nagrodę w postaci wody w bocznych portach.</li>
	<li>Konfiguracja pudełka i konfiguracja myszy
	<ol>
		<li>Skonfiguruj ten i każdy kolejny etap z 2 portami wodnymi po bokach i portem zapachowym pośrodku. Umieść mysz w komorze. Zamknij komorę myszy i rozpocznij program Stage 2.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Instrukcje programowania Training Stage 2
	<ol>
		<li>Zapewnij myszy natychmiastową nagrodę w postaci wody po obu stronach po tym, jak nos wbije się w środkowy port dostarczania zapachów. Ustaw parametry wyjściowe dla tego etapu, takie jak czas trwania próby, liczba zainicjowanych prób i liczba nagród w postaci wody otrzymanych w ciągu 5 sekund od szturchnięcia nosem.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Ustaw programowanie pseudoszkolenia Etap 2 tak samo jak Etap szkolenia 2.</li>
	<li>Uznaj ten etap za zakończony, gdy w ciągu 60 minut wykona się co najmniej 40 prób, a co najmniej 25% nagród wodnych otrzyma się w ciągu 5 sekund od środkowego szturchnięcia nosa portu. Usuń mysz po zakończeniu tego etapu (Rysunek 2C). 
	UWAGA: Program szkoleniowy oblicza procent otrzymanych nagród wodnych w odpowiednim czasie, aby określić zakończenie tego etapu. Chociaż myszy różnią się szybkością ukończenia tego etapu, większość myszy osiągnie kryteria ukończenia w ciągu 5 dni. Jeśli jednak mysz nie ukończyła tego etapu w ciągu 5 dni, nie przechodź do następnego etapu. Ta mysz zostanie usunięta z kohorty.</li>
</ol>
6. Etap szkolenia 3: Kojarzenie nagrody wodnej z określonym zapachem i w określonym oknie czasowym, 1–3 dni
<ol>
	<li>Na tym etapie pozwól myszom otrzymać zapach Go (S+) po szturchnięciu nosa w środkowym porcie. Następnie daj nagrodę w postaci wody po wbiciu nosa w boczne otwory wodne w ciągu 5 sekund.</li>
	<li>Instrukcje programowania Training Stage 3
	<ol>
		<li>Dostarcz zapach S+ do środkowego portu zapachowego.</li>
		<li>Dostarcz nagrodę w postaci wody, jeśli mysz przesunie boczne porty w ciągu 5 sekund od dostarczenia zapachu. 
		UWAGA: Program rozpoczyna się od wymagania jedynie szturchnięcia nosa w środkowy port na 100 ms, aby uzyskać nagrodę w postaci wody. Gdy mysz szturchnie środkowy port przez odpowiednią ilość czasu w 80% prób, czas trwania szturchnięcia nosem wymagany do otrzymania nagrody w wodzie wydłuży się o 50 ms do 400 ms.</li>
		<li>Ustaw parametry wyjściowe identyczne jak w etapie 2.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Ustaw instrukcje programowania pseudoszkolenia Etap 3 tak samo, jak Etap szkolenia 3. Nie należy jednak podłączać zapachu S+ do kontrolera dostarczania zapachów, aby upewnić się, że zapach S+ nie jest związany z nagrodą za wodę.</li>
	<li>Konfiguracja pudełka i konfiguracja myszy
	<ol>
		<li>Ustaw tę samą konfigurację w kroku 2.</li>
		<li>Podłącz zapach S+ do kontrolera dostarczania zapachów. Umieść mysz w komorze. Zamknij komorę myszy i rozpocznij program Stage 3. Usuń mysz po zakończeniu tego etapu.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Uznaj ten etap za zakończony, gdy w ciągu 60 minut pojawi się więcej niż 60 nagród (<silna klasa="xfig">Rysunek 2D).</li>
</ol>
7. Etap 4A: Kojarzenie zapachu zakazu (S-) z karą za przerwę, 1-2 dni
<ol>
	<li>Na tym etapie wprowadź myszy w zapach No-Go (S-). Zapewnij karę przerwy dla myszy, które nieprawidłowo podchodzą do portów wodnych po wyczuciu zapachu no-go.</li>
	<li>Szkolenie Etap 4A instrukcje programowania
	<ol>
		<li>Na początku dostarczaj tylko nawaniacz S+ na tym etapie, identycznie jak w etapie 3. Po tym, jak myszy ukończą 40 prób, rozpocznij losowe dostarczanie zapachów, które obejmują zarówno zapachy S+, jak i S-. Zaprogramuj 2-sekundową karę przekroczenia limitu czasu, jeśli mysz spróbuje szukać nagrody w postaci wody po tym, jak zostanie jej przedstawiony zapach No-Go. 
		UWAGA: Aby pomóc w rozróżnieniu Go i No-Go, bocznymi światłami IR można manipulować tak, aby były włączone podczas zapachów Go i wyłączone podczas zapachów No-Go. Światła działają jako drugorzędna wskazówka, aby pomóc myszom w początkowym treningu. Gdy myszy zostaną przeszkolone ze światłami, powinny przejść trening bez świateł, aby potwierdzić, że nauczyły się zadania z zapachami.</li>
		<li>Ustaw parametry wyjściowe, takie jak czas trwania próby, liczba zainicjowanych prób, liczba ukończonych prób, % poprawnych i łączna liczba otrzymanych nagród.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Ustaw instrukcje programowania pseudotreningu Etapu 4A tak samo, jak w Etapie Szkolenia 4S, z wyjątkiem zapachów S+ i S- wyświetlanych losowo od samego początku. Przyznawaj losowo nagrody za wodę lub kary za przerwę w grze, niezależnie od wykonania zadania.</li>
	<li>Konfiguracja pudełka i konfiguracja myszy
	<ol>
		<li>Ustaw konfigurację pudełka tak samo, jak w poprzednim kroku 3.</li>
		<li>Podłącz zarówno S+, jak i S- odor do kontrolera dostarczania zapachów. Umieść mysz w komorze. Zamknij komorę myszy i rozpocznij program Stage 4A. Po tym, jak myszy ukończą 40 prób, przełącz program tak, aby losowo dostarczał zapachy. Usuń mysz po zakończeniu tego etapu.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Etap ten należy uznać za zakończony, gdy przeprowadzono 40 badań, w których > 60% poprawnych odpowiedzi.</li>
</ol>
8. Etap 4B: Kojarzenie zapachu zakazu wstępu (S-) z karą za przerwę, 5–11 dni
<ol>
	<li>Szkolenie Etap 4B instrukcje programowania
	<ol>
		<li>Spraw, aby ten etap był identyczny z etapem 4A, jednak kara za przekroczenie limitu czasu za próbę nagrody w wodzie po S-zapachu wynosi 4 s.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Ustaw instrukcje programowania pseudotreningu na etapie 4B identycznie jak w etapie 4A, jednak nagroda wodna i kara za przerwę są dostarczane losowo na próbę.</li>
	<li>Konfiguracja pudełka i konfiguracja myszy
	<ol>
		<li>Ustaw konfigurację skrzynki taką samą jak w poprzednim etapie 4A.</li>
		<li>Podłącz zarówno S+, jak i S- odor do kontrolera dostarczania zapachów. Umieść mysz w komorze. Zamknij komorę myszy i rozpocznij program Stage 4B. Uznaj ten etap za zakończony, gdy w ciągu 60 minut zostanie przeprowadzonych >100 prób z dokładnością >85% (<silna klasa="xfig">Rysunek 2E)</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Monitoruj maksymalną i minimalną wartość procentową poprawną dla każdej sesji, aby śledzić postępy każdej myszy na tym etapie. Około 85-90% myszy osiąga kryteria ukończenia tego etapu. Wyklucz myszy, które nie ukończą tego etapu, do fazy testowania Go/No-Go.</li>
	<li>(Opcjonalnie) Pod koniec tego etapu zastosuj trening odwrócenia, w którym substancje zapachowe Go/No-Go są przełączane na platformie fiolki z zapachem. Upewnij się, że myszy nie kojarzą się z innym bodźcem, takim jak dźwięk zaworów związanych z bocznymi portami.</li>
</ol>
9. Zadanie testowe Go/No-Go: 1 dzień, 20 minut na mysz dziennie
<ol>
	<li>Potraktuj to jako ostatni etap określania dokładności identyfikacji skojarzeń zapachowych i uczenia się rozróżniania par zapachów. 
	UWAGA: Nowatorskie substancje zapachowe są wykorzystywane do S+/S- w celu sprawdzenia, ile czasu zajmuje zwierzętom nauczenie się nowych skojarzeń. Strukturalnie podobne pary odorantów są używane w celu zwiększenia trudności zadania. Przykłady obejmują 1-butanol kontra 1-pentanol, octan izoamylu kontra maślan izoamylu i + karwon kontra - karwon.</li>
	<li>Instrukcje programowania
	<ol>
		<li>Pozwól oprogramowaniu treningowemu wykryć długość szturchnięcia nosa. Zaprogramuj 300 ms szturchnięcie nosa w środkowym porcie zapachowym, aby wykonać zadanie.</li>
		<li>Ustaw parametry wyjściowe identyczne jak stage 4B, z wyjątkiem tego, że nie używaj żadnych wskazówek świetlnych.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Konfiguracja pudełka i konfiguracja myszy
	<ol>
		<li>Ustaw konfigurację pudełka taką samą jak w poprzednim etapie 4B.</li>
		<li>Podłącz zarówno S+, jak i S- odor do kontrolera dostarczania zapachów. Umieść mysz w komorze. Zamknij komorę myszy i rozpocznij program Stage Go/No-Go. Wystaw myszy, które nauczyły się zadania uczenia węchowego, na nowe pary chemicznie podobnych zapachów. 
		UWAGA: Myszy typu dzikiego z odpowiednią dyskryminacją zapachu osiągają >85% dokładności z nowymi substancjami zapachowymi po około 10-20 blokach lub 200-400 próbach (<silna klasa = "xfig">Rysunek 3A).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Carleton, A., Petreanu, L. T., Lansford, R., Alvarez-Buylla, A., Lledo, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Becoming+a+new+neuron+in+the+adult+olfactory+bulb%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Becoming a new neuron in the adult olfactory bulb.</a> Nat Neurosci. 6 (5), 507-518 (2003).</li>
<li>Petreanu, L., Alvarez-Buylla, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maturation+and+death+of+adult-born+olfactory+bulb+granule+neurons%3A+role+of+olfaction%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Maturation and death of adult-born olfactory bulb granule neurons: role of olfaction.</a> J Neurosci. 22 (14), 6106-6113 (2002).</li>
<li>Yamaguchi, M., Mori, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Critical+period+for+sensory+experience-dependent+survival+of+newly+generated+granule+cells+in+the+adult+mouse+olfactory+bulb%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Critical period for sensory experience-dependent survival of newly generated granule cells in the adult mouse olfactory bulb.</a> PNAS. 102 (27), 9697-9702 (2005).</li>
<li>Rochefort, C., Gheusi, G., Vincent, J. D., Lledo, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enriched+odor+exposure+increases+the+number+of+newborn+neurons+in+the+adult+olfactory+bulb+and+improves+odor+memory%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Enriched odor exposure increases the number of newborn neurons in the adult olfactory bulb and improves odor memory.</a> J Neurosci. 22 (7), 2679-2689 (2002).</li>
<li>Arenkiel, B. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activity-induced+remodeling+of+olfactory+bulb+microcircuits+revealed+by+monosynaptic+tracing%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Activity-induced remodeling of olfactory bulb microcircuits revealed by monosynaptic tracing.</a> PloS one. 6 (12), 29423(2011).</li>
<li>Alonso, M., Viollet, C., Gabellec, M. M., Meas-Yedid, V., Olivo-Marin, J. C., Lledo, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Olfactory+discrimination+learning+increases+the+survival+of+adult-born+neurons+in+the+olfactory+bulb%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Olfactory discrimination learning increases the survival of adult-born neurons in the olfactory bulb.</a> J Neurosci. 26 (41), 10508-10513 (2006).</li>
<li>Quast, K. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+broadening+of+inhibitory+sensory+maps%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Developmental broadening of inhibitory sensory maps.</a> Nat Neurosci. 20 (2), 189(2017).</li>
<li>Huang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Task+learning+promotes+plasticity+of+interneuron+connectivity+maps+in+the+olfactory+bulb%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Task learning promotes plasticity of interneuron connectivity maps in the olfactory bulb.</a> J Neurosci. 36 (34), 8856-8871 (2016).</li>
<li>Arbuckle, E. P., Smith, G. D., Gomez, M. C., Lugo, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Testing+for+odor+discrimination+and+habituation+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Testing for odor discrimination and habituation in mice.</a> J Vis Sci. (99), e52615(2015).</li>
<li>Zou, J., Wang, W., Pan, Y. W., Lu, S., Xia, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+to+measure+olfactory+behavior+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Toxicol%22%5BJournal%5D)">Methods to measure olfactory behavior in mice.</a> Curr Protoc Toxicol. , 11-18 (2015).</li>
<li>Uchida, N., Takahashi, Y. K., Tanifuji, M., Mori, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Odor+maps+in+the+mammalian+olfactory+bulb%3A+domain+organization+and+odorant+structural+features%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Odor maps in the mammalian olfactory bulb: domain organization and odorant structural features.</a> Nat Neurosci. 3 (10), 1035(2000).</li>
<li>Cang, J., Isaacson, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+whole-cell+recording+of+odor-evoked+synaptic+transmission+in+the+rat+olfactory+bulb%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">In vivo whole-cell recording of odor-evoked synaptic transmission in the rat olfactory bulb.</a> J Neurosci. 23 (10), 4108-4116 (2003).</li>
<li>Parthasarathy, K., Bhalla, U. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laterality+and+symmetry+in+rat+olfactory+behavior+and+in+physiology+of+olfactory+input%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Laterality and symmetry in rat olfactory behavior and in physiology of olfactory input.</a> J Neurosci. 33 (13), 5750-5760 (2013).</li>
<li>Rajan, R., Clement, J. P., Bhalla, U. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rats+smell+in+stereo%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Rats smell in stereo.</a> Science. 311 (5761), 666-670 (2006).</li>
<li>Batista-Brito, R., Close, J., Machold, R., Fishell, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+distinct+temporal+origins+of+olfactory+bulb+interneuron+subtypes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The distinct temporal origins of olfactory bulb interneuron subtypes.</a> J Neurosci. 28 (15), 3966-3975 (2008).</li>
<li>Sakamoto, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Continuous+postnatal+neurogenesis+contributes+to+formation+of+the+olfactory+bulb+neural+circuits+and+flexible+olfactory+associative+learning%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Continuous postnatal neurogenesis contributes to formation of the olfactory bulb neural circuits and flexible olfactory associative learning.</a> J Neurosci. 34 (17), 5788-5799 (2014).</li>
<li>Resendez, S. L., Jennings, J. H., Ung, R. L., Namboodiri, V. M. K., Zhou, Z. C., Otis, J. M., Stuber, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+cortical%2C+subcortical%2C+and+deep+brain+neural+circuit+dynamics+during+naturalistic+mammalian+behavior+with+head-mounted+microscopes+and+chronically+implanted+lenses%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Visualization of cortical, subcortical, and deep brain neural circuit dynamics during naturalistic mammalian behavior with head-mounted microscopes and chronically implanted lenses.</a> Nat Protoc. 11 (3), 566(2016).</li>
<li>Park, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((One-step+optogenetics+with+multifunctional+flexible+polymer+fibers%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">One-step optogenetics with multifunctional flexible polymer fibers.</a> Nat Neurosci. 20 (4), 612(2017).</li>
</ol>

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów i brak sprzecznych interesów.

Układ węchowy gryzoni stanowi unikalny model do badania plastyczności zależnej od sensoryki. Tutaj przedstawiamy paradygmat uczenia się węchowego, aby wyszkolić myszy w kojarzeniu par zapachów z nagrodą lub karą. Dzięki temu zadaniu uczenia się, dalsze zmiany w obwodach mogą być badane w kolejnych eksperymentach (elektrofizjologia, obrazowanie neuronów in vivo itp.). Po zakończeniu myszy nauczą się wykonywać proste zadanie związane ze wskazówkami zapachowymi, aby skojarzyć nagrodę w postaci wody z jedny...

Mysi OB, gdzie informacja o zapachu najpierw dostaje się do ośrodkowego układu nerwowego (OUN), stanowi doskonały model do badania zmian strukturalnych zależnych od doświadczenia. Układ OB stale integruje neurony urodzone w wieku dorosłym w sposób zależny od aktywności. Prekursory neuronów urodzone u dorosłych oddzielają się od progenitorów, które wyściełają strefę podkomorową przylegającą do komór bocznych1. Po migracji do OB, te neuronalne prekursory albo przeżywają, różnicują się i integrują jako hamujące komórki ziarniste, albo ulegają apoptozie2. Na selekcję pod kątem losu komórki ma wpływ aktywność węchowa, w tym uczenie węchowe3,4,5,6. Po integracji, w komórkach ziarnistych zachodzą zmiany synaptyczne wywołane uczeniem się w ciągu dwutygodniowego okresu krytycznego7,8. W związku z tym testy uczenia się węchowego są przydatne do zbadania, w jaki sposób plastyczność zależna od doświadczenia wpływa na strukturalną i funkcjonalną reorganizację dojrzałego obwodu mózgu.
Ten protokół oferuje jedno podejście do treningu węchowego za pomocą paradygmatu warunkowania instrumentalnego. W tym zadaniu myszy pozbawione wody są szkolone w kojarzeniu jednego zapachu (zapachu "Go") z nagrodą w postaci wody, a innego zapachu (zapachu "No-Go") z karą przekroczenia limitu czasu próby. Myszy przechodzą przez stopniowaną serię faz treningu w ciągu 2-4 tygodni. Po zakończeniu treningu myszy reagują na zapach Go lub No-Go dyskretnymi, odpowiadającymi im zachowaniami (szukanie nagrody w postaci wody w próbach Go i nie szukanie nagrody w postaci wody w próbach No-Go) (<silna klasa="xfig">Rysunek 1A). Po zakończeniu treningu myszy mogą być dalej poddawane próbom chemicznie podobnych par zapachów, aby przetestować dyskryminację lub zostać przeniesione do badań sprawdzających, w jaki sposób uczenie się węchu zmienia strukturę lub funkcję OB. Chociaż zadania związane z dyskryminacją zapachów zostały już wcześniej opisane, większość z nich opiera się na pomiarach subiektywnych, takich jak liczba wąchanych zapachów między dwoma substancjami zapachowymi9,10. Co więcej, konieczność ludzkiego oceniania takich zadań jest również czasochłonna. Zadanie uczenia się węchu Go/No-Go opisane w tym protokole oferuje bezstronny, bezpośredni pomiar dyskryminacji zapachów i uczenia się węchu.

<table><tbody><tr><td>Szklana fiolka</td><td>Qorpak</td><td>GLC-01016</td><td></td></tr><tr><td>Rurka silikonowa</td><td>Thermo Scientific</td><td>86000030</td><td></td></tr><tr><td>18 igieł</td><td>BD</td><td>305196</td><td></td></tr><tr><td>1-butanol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>437603</td> Kwas propionowy Sigma Aldrich 402907 <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Komora dla myszy</td><td>Med Associates</td><td>ENV-307W</td><td></td></tr><tr><td>Podłoga komory</td><td>Med Associates</td><td>ENV-307W-GFW</td><td></td></tr><tr><td>Port wodny</td><td>Med Associates</td><td>ENV-313W</td><td>Potrzebujesz dwóch</td></tr><tr><td>bodźców zapachowych</td><td>Med Associates</td><td>ENV-275</td><td>Zawierają 2 zawory do dostarczania zapachów bramy&nbsp;</td></tr><tr><td>Odor Port</td><td>Med Associates</td><td>ENV-375W-NPP</td><td></td></tr><tr><td>USB Interface</td><td>Med Associates</td><td>DIG-703A-USB</td><td></td></tr><tr><td>Komputer stacjonarny z systemem Windows 2000, XP, Vista lub 7</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Przepływomierz</td><td>VWR</td><td>97004-952</td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie behawioralne</td><td>Med Associates</td><td>SOF-735</td><td>To oprogramowanie, które uruchamia każdy etap szkolenia, zostało teraz zastąpione przez Oprogramowanie do przesyłania danych Med-PC V</td></tr><tr><td></td><td>Med Associates</td><td>SOF-731</td><td>To oprogramowanie formatuje dane do</td></tr><tr><td>oprogramowania szkoleniowego</td> Excel <td>Med Associates</td><td>DIG-703A-USB</td><td>To oprogramowanie służy do programowania każdego etapu szkolenia</td></tr><tr><td>Zawór wodny</td><td>Neptune Research</td><td>225P012-11</td><td>Ten zawór służy do zasuwy dopływu wody. Potrzebujesz dwóch</td></tr><tr><td>zaworów zapachowych</td><td>Neptune Research</td><td>360P012-42</td><td>Ten zawór służy do zasuwania dostarczania zapachów. Potrzebujesz dwojga</td></tr></tbody></table>

obiektywny i powtarzalny test uczenia się węchu i dyskryminacji u myszy

An Objective and Reproducible Test of Olfactory Learning and Discrimination in Mice

Węch jest dominującą modalnością sensoryczną u myszy i wpływa na wiele ważnych zachowań, w tym poszukiwanie pożywienia, wykrywanie drapieżników, kojarzenie się i rodzicielstwo. Co ważne, myszy można wyszkolić w zakresie kojarzenia nowych zapachów z określonymi reakcjami behawioralnymi, aby zapewnić wgląd w funkcję obwodu węchowego. Ten protokół szczegółowo opisuje procedurę szkolenia myszy w zadaniu uczenia operacyjnego Go/No-Go. W tym podejściu myszy są szkolone w setkach zautomatyzowanych prób dziennie przez 2-4 tygodnie, a następnie mogą być testowane na nowych parach zapachów Go/No-Go w celu oceny dyskryminacji węchowej lub mogą być wykorzystane do badań nad tym, jak uczenie się zapachu zmienia strukturę lub funkcję obwodu węchowego. Dodatkowo, mysia opuszka węchowa (OB) charakteryzuje się ciągłą integracją neuronów urodzonych w wieku dorosłym. Co ciekawe, uczenie się węchowe zwiększa zarówno przeżywalność, jak i połączenia synaptyczne tych neuronów urodzonych w wieku dorosłym. Dlatego protokół ten można łączyć z innymi technikami biochemicznymi, elektrofizjologicznymi i obrazowania w celu zbadania czynników zależnych od uczenia się i aktywności, które pośredniczą w przetrwaniu i plastyczności neuronów.

Po tym, jak myszy opanowały zadanie uczenia się węchowego, mogą one teraz kojarzyć nowe pary zapachów z nagrodą i karą. Wytrenowane myszy zazwyczaj rozpoczynają zadanie Go/No-Go z dokładnością na poziomie około 50%. Procent poprawnych odpowiedzi można wykreślić w zależności od bloku prób jako krzywą uczenia się dla nowych par zapachów (Rysunek 3A). W ciągu 10 bloków prób, których wykonanie zajmuje większości myszy mniej niż 30 min, myszy są w...

Tutaj szkolimy myszy w zadaniu uczenia asocjacyjnego, aby przetestować rozróżnianie zapachów. Protokół ten pozwala również na badania nad zmianami strukturalnymi w mózgu wywołanymi uczeniem się.

Obiektywny i powtarzalny test uczenia się węchu i dyskryminacji u myszy

Olfaction is the predominant sensory modality in mice and influences many important behaviors, including foraging, predator detection, mating, and ...

Ogólnym celem tego protokołu zachowania jest wyszkolenie myszy tak, aby kojarzyły jeden zapach z nagrodą, a inny zapach z karą. Ta metoda może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie neurobiologii, takie jak uczenie się, plastyczność synaptyczna i dyskryminacja sensoryczna. Główną zaletą tej techniki jest to, że po wytrenowaniu myszy wykonują setki prób w ciągu kilku godzin w celu uzyskania solidnego próbkowania statystycznego.Implikacje tej techniki rozciągają się w kierunku terapii lub diagnozy chorób neurodegeneracyjnych, ponieważ nasilenie dysfunkcji węchu jest predyktorem późniejszego pogorszenia funkcji poznawczych u ludzi. Chociaż ta metoda może zapewnić wgląd w węch, można ją również zastosować do innych systemów, takich jak widzenie lub słuch. Wizualna demonstracja tej metody ma kluczowe znaczenie, ponieważ początkowe kroki zarówno konfiguracji komory behawioralnej, jak i korzystania z oprogramowania są trudne do nauczenia się ze względu na różne porty połączeniowe i etapy szkolenia.Aby rozpocząć, zmontuj komorę myszy z podłogą komory. Trzymaj pudełko treningowe w słabo oświetlonym miejscu o małym natężeniu ruchu, aby uniknąć rozpraszania uwagi. Następnie wywierć każdy port wodny z małym otworem na górze, aby igła o rozmiarze 18 mogła dozować wodę do portu.Napełnij szklaną fiolkę środkiem zapachowym rozpuszczonym w oleju mineralnym i mocno dokręć nakrętkę. Następnie podłącz igłę o rozmiarze 18 do silikonowej rurki. Przebić szklaną nakrętkę fiolki i podłączyć drugi koniec silikonowej rurki do wlotu portów zapachowych.Następnie umieść każdą silikonową rurkę w zaworze zapachowym. Podłącz przewód podciśnieniowy do portów zapachowych. Przymocuj dwie 10-mililitrowe strzykawki do metalowego pręta przytrzymującego i podłącz rurkę do strzykawek.Następnie podłącz drugą stronę rurki do igły o rozmiarze 18. Włóż igłę do wywierconego otworu w otworze nośnym w komorze myszy i podłącz drugi koniec rurki do zaworu wody. Napełnij dwie 10-mililitrowe strzykawki wodą pitną dla gryzoni.Następnie podłącz miernik przepływu powietrza do wlotu powietrza i utrzymuj przepływ powietrza na poziomie od trzech do pięciu litrów na minutę. Podłącz dwa zawory wodne, dwa zawory zapachowe, dwa porty wodne, port zapachowy i zasilanie do systemu interfejsu USB. I na koniec podłącz skrzynkę interfejsu USB do zasilania.Następnie wyreguluj ssanie próżniowe, aby uniknąć zanieczyszczenia krzyżowego zapachów między próbami, i użyj rurki specyficznej dla zapachu, aby podłączyć fiolki z nazapachem do komory. Aby przygotować myszy do treningu, zacznij ograniczać wodę na poziomie 40 mililitrów na kilogram dziennie. Waż myszy codziennie, aby upewnić się, że przekraczają 80% masy wyjściowej i utrzymuj wszystkie czynniki środowiskowe na stałym poziomie przez cały protokół, w tym temperaturę, hałas i zabłąkane zapachy.Wyczyść klatkę przed przeniesieniem do niej każdej myszy. Spryskaj i przetrzyj komorę 70% etanolem, aby zminimalizować rozpraszanie zapachu myszy. W przypadku pierwszego etapu szkolenia skonfiguruj pole zachowania z portem wodnym pośrodku i bez dostępu do wszystkich portów bocznych.Umieść mysz w komorze i zamknij ją. Następnie rozpocznij program pierwszego etapu. Uznaj ten etap za zakończony, gdy mysz wykona 100 prób w ciągu 60 minut.Wyjmij mysz z komory po 60 minutach lub po zakończeniu 100 prób. W przypadku drugiego etapu szkolenia skonfiguruj ten i każdy kolejny etap z dwoma portami wodnymi po bokach i portem zapachowym pośrodku. Umieść mysz w komorze i zamknij ją.Następnie rozpocznij program drugiego etapu. Uznaj ten etap za zakończony, gdy w ciągu 60 minut wykona się co najmniej 40 prób, z co najmniej 25% nagród w postaci wody otrzymanych w ciągu pięciu sekund od pchnięcia centralnego nosa portem. Usuń mysz po zakończeniu tego etapu.W przypadku trzeciego etapu szkolenia podłącz zapach S-plus do kontrolera dostarczania zapachów. Umieść mysz w komorze i zamknij ją. Następnie rozpocznij program trzeciego etapu.Uznaj ten etap za zakończony, gdy w ciągu 60 minut pojawi się więcej niż 60 nagród, i usuń mysz, gdy etap będzie konkurencyjny. W przypadku szkolenia etapu cztery-A ustaw konfigurację pudełka taką samą, jak w poprzednim etapie trzecim. Następnie podłącz zarówno zapach S-plus, jak i S-minus do regulatora dostarczania zapachów.Umieść mysz w komorze i zamknij ją. Następnie rozpocznij program etapu czwartego-A. Gdy mysz wykona 40 prób, przełącz program tak, aby losowo dostarczał zapachy.Usuń mysz po zakończeniu etapu. W przypadku szkolenia na poziomie czwartym-B ten etap powinien być identyczny z etapem czwartym-A. Jednak kara za przerwę w grze za próbę zdobycia wody po zapachu S-minus wynosi cztery sekundy.Podłącz zarówno zapach S-plus, jak i S-minus do kontrolera dostarczania zapachów. Umieść mysz w komorze. Zamknij komorę myszy i rozpocznij stage program four-B.Uznaj ten etap za zakończony, gdy w ciągu 60 minut przeprowadzono ponad 100 prób, z dokładnością większą niż 85%W przypadku testu go/no-go ustaw konfigurację pudełka taką samą, jak w poprzednim etapie czwartym-B. Podłącz zarówno zapach S-plus, jak i S-minus do kontrolera dostarczania zapachów. Następnie umieść mysz w komorze.Rozpocznij etap programu go/no-go, a następnie wystaw mysz, która nauczyła się zadania uczenia się węchu, na nowe pary chemicznie podobnych zapachów. Gdy myszy nauczą się zadania uczenia się węchu, mogą kojarzyć nowe pary zapachów z nagrodą i karą. Te wyszkolone myszy zwykle zaczynają z około 50% dokładnością w zadaniu go/no-go.Procent poprawności można wykreślić za pomocą bloku próbnego jako krzywą uczenia się dla nowych par zapachów. W ciągu 10 prób blokowych myszy są w stanie prawidłowo rozróżnić zapachy, z dokładnością większą niż 85%. To pokazuje, że nasz protokół z powodzeniem wyszkolił myszy typu dzikiego, aby kojarzyły jeden zapach z nagrodą w postaci wody, a inny z karą za przerwę.Gdy myszy nauczą się zadania, pary zapachów można modyfikować, aby zwiększyć lub zmniejszyć trudność zadania. Na przykład zmniejszenie stężenia pary zapachów zwiększa trudność zadania. Myszy są również w stanie zapamiętać poprzednio wyuczone pary zapachów.Po odczekaniu siedmiu dni od nauczenia się zadania, test przypominania pokazuje, że myszy typu dzikiego mogą szybko zapamiętać wcześniej poznane skojarzenia zapachowe. Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać, aby upewnić się, że pożądane substancje zapachowe są prawidłowo podłączone do pudełka behawioralnego. Jest to szczególnie ważne, jeśli wielu eksperymentatorów używa różnych zapachów.Zgodnie z tą procedurą można wykonać inne metody, takie jak mapowanie zapachów, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, takie jak: Jak uczenie się wpływa na sposób, w jaki informacje sensoryczne są reprezentowane przez mózg? Po opracowaniu technika ta utorowała drogę naukowcom z dziedziny neurobiologii do zbadania zmian neuronalnych w układzie węchowym myszy wywołanych uczeniem się. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak nauczyć myszy kojarzyć jeden zapach z nagrodą, a inny zapach z karą.Nie zapominaj, że praca z ostrymi igłami może być niezwykle niebezpieczna, a podczas wykonywania tej procedury należy zawsze zachować środki ostrożności, takie jak prawidłowa utylizacja ostrych narzędzi.

an-objective-reproducible-test-olfactory-learning-discrimination

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Fundamentalne, a zarazem unikalne właściwości układu węchowego gryzoni sprawiły, że staje się on coraz częściej przedmiotem badań biologów. Istnieje zatem potrzeba opracowania stosunkowo prostego sposobu oceny jego funkcji. W niniejszej pracy opisujemy czułe testy służące do charakterystyki wrażliwości i preferencji węchowych myszy.

Badanie zachowań węchowych u dorosłych myszy

Upośledzenie funkcji węchu jest powszechną cechą wielu zaburzeń neurodegeneracyjnych, w tym chorób Parkinsona, Alzheimera i Huntingtona. W niniejszym artykule opisujemy zestaw testów do oceny dyskryminacji i wykrywania węchu u myszy, które można wykorzystać do pomiaru zdolności węchowych w mysich modelach chorób neurodegeneracyjnych.

Testy węchowe dla mysich modeli choroby neurodegeneracyjnej

Ten manuskrypt opisuje protokół badania układu węchowego gryzoni. Test przyzwyczajenia/dezhabituacji węchowej pozwoli badaczom określić, czy mysz przyzwyczaja się do wielokrotnie prezentowanego zapachu i czy mysz wykazuje nieprzyzwyczajenie, gdy przedstawia się jej nowy zapach.

Badanie dyskryminacji i habituacji zapachowej u myszy

Przedstawiamy prosty i bezstronny test węchowy na myszach. Dzięki temu protokołowi dyskryminacja węchowa, preferencje, unikanie i wrażliwość na nowy zapach w porównaniu z wodą mogą być oceniane w pojedynczych sesjach behawioralnych. Ta metoda jest wskazana dla pojedynczego eksperymentatora, a analiza opiera się na komputerowym przetwarzaniu wideo.

Proste i wspomagane komputerowo testy węchowe dla myszy

Test rozpoznawania obiektów (ORT) to prosty i skuteczny test do oceny uczenia się i pamięci u myszy. Metodologia została opisana poniżej.

Nowatorski test rozpoznawania obiektów do badania uczenia się i pamięci u myszy

Ten artykuł zawiera szczegółowy opis nowego protokołu błędu oceny myszy. Przedstawiono również dowody na wrażliwość tego zadania węchowego na stan afektywny i omówiono jego użyteczność w różnych dziedzinach badawczych.

Ocena błędu oceny myszy za pomocą zadania kopania węchowego

Ten artykuł zawiera szczegółowy opis testu zakopanego jedzenia i eksperymentu z dyskryminacją zapachów społecznych, aby ocenić wpływ narażenia na wdychane zanieczyszczenia środowiska na funkcje węchowe u myszy.

Badanie wpływu wdychanych zanieczyszczeń środowiska na funkcje węchowe u myszy

Protokół ten opisuje konstrukcję olfaktometru do eksperymentów z zachowaniami węchowymi go/no-go. Instrukcje krok po kroku wraz ze zdjęciami są dostarczane, aby zapewnić pomyślną konstrukcję olfaktometru. Dołączone są również informacje dotyczące rozwiązywania problemów napotkanych podczas procesu.

Konstruowanie olfaktometru do badań zachowań węchowych gryzoni

W tym miejscu przedstawiamy protokół testu preferencji węchowych, który pozwala na ocenę negatywnych uprzedzeń węchowych zarówno wobec apetytywnych, jak i awersyjnych bodźców zapachowych w mysich modelach depresji.

Test preferencji węchowych do pomiaru węchowych uprzedzeń hedonicznych w mysich modelach depresji

Labirynt Lashley III to zadanie polegające na nauce trasy, które nie opiera się na bodźcach awersyjnych ani wskazówkach wizualnych. Stanowi on zatem bardzo atrakcyjną opcję do oceny uczenia się i pamięci, zwłaszcza u starszych myszy lub w sytuacjach, w których istotnym czynnikiem jest stres.

Nauka trasy przy niskim poziomie stresu z wykorzystaniem labiryntu Lashley III u myszy

Poznaj protokół treningu behawioralnego myszy w dyskryminacji zapachowej, wykorzystujący asocjację nagrody i kary. Ta metoda umożliwia badanie plastyczności synaptycznej oraz mechanizmów uczenia się w neurobiologii.

Obiektywny i powtarzalny test uczenia się węchu i dyskryminacji u myszy

Przeglądaj więcej filmów