Name: Kwantyfikacja obfitości lipidów i ocena rozmieszczenia lipidów w Caenorhabditis elegans za pomocą barwienia czerwienią nilową i czerwienią olejową O (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-05T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 46 s
Description: Poznaj metody barwienia czerwienią nilową i czerwienią olejową O do kwantyfikacji lipidów oraz oceny ich rozmieszczenia w tkankach Caenorhabditis elegans. Techniki te są proste, tanie i niezbędne w badaniach metabolizmu lipidów.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była możliwa dzięki grantowi NIH: R01GM109028 (S.P.C.)

1. Barwienie lipidów czerwienią nilową (NR)
<ol>
	<li>Przygotowanie roztworu podstawowego NR o stężeniu 5 mg/ml
	<ol>
		<li>W butelce o pojemności 500 ml dodaj 100 mg proszku NR do 200 ml 100% acetonu.</li>
		<li>Przykryj butelkę folią aluminiową, aby uniknąć ekspozycji na światło.</li>
		<li>Przed użyciem mieszać roztwór przez 2 godziny w ciemności.</li>
		<li>W przypadku długotrwałego stosowania roztwór podstawowy NR należy przechowywać w szczelnie zamkniętej butelce bez ekspozycji na światło. Skaluj roztwór podstawowy NR zgodnie z potrzebami badawczymi. Upewnij się, że ten sam roztwór podstawowy jest używany w eksperymentach z barwieniem NR, aby uzyskać spójne wyniki barwienia i obrazowania.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie roztworu roboczego NR
	<ol>
		<li>Na każdy 1 ml 40% izopropanolu (v/v) dodać 6 μl roztworu podstawowego NR.</li>
		<li>Przygotować 600 μl roztworu roboczego NR dla każdej próbki. 
		UWAGA: Przygotuj świeży roztwór roboczy NR tuż przed barwieniem. W zależności od potrzeb roztworu podstawowego NR należy użyć stożkowej probówki o pojemności 15 ml lub 50 ml.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie robaków do barwienia lipidami NR
	<ol>
		<li>Wyhodować robaki do wczesnego stadium L4 w temperaturze 20 °C na pożywce wzrostowej nicieni (NGM) wysianej późną logarytmiczną OP50 E. coli.</li>
		<li>Zmyj robaki z płytki 1 ml 1x roztworu soli fizjologicznej buforowanej fosforanami + 0,01% roztworu Triton X-100 (PBST) i umieść zawiesinę robaków w probówce do mikrofugi o pojemności 1,5 ml.</li>
		<li>Odwirować robaki przy 560 x g przez 1 minutę. Usunąć supernatant i powtarzać ten krok, aż E. coli zostanie usunięta z zawiesiny.</li>
		<li>Dodać 100 μl 40% izopropanolu do osadu robaka i inkubować go w temperaturze pokojowej przez 3 minuty.</li>
		<li>Odwirować robaki przy 560 x g przez 1 minutę i usunąć supernatant bez naruszania osadu robaka. 
		UWAGA: Użyj większych objętości PBST, aby zmyć robaki z płytek, jeśli używasz większych płytek lub plamisz więcej robaków na płytkę. Nie myj robaków w PBST dłużej niż 15 minut przed utrwaleniem próbki. Wykonaj dodatkowe płukania, jeśli supernatant nie jest oczyszczony z bakterii. Przeprowadzić inkubację w 40% izopropanolu za pomocą nutatora lub kołyski. Zawsze monitoruj probówki, aby upewnić się, że występuje pełne mieszanie próbki.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Barwienie lipidów za pomocą NR
	<ol>
		<li>W ciemności dodać 600 μl roztworu roboczego NR do każdej próbki. Odwróć probówki trzy razy i całkowicie wymieszaj robaki w roztworze NR.</li>
		<li>Obracać próbkę w ciemności w temperaturze pokojowej przez 2 godziny.</li>
		<li>Po inkubacji odwirować robaki przy 560 x g przez 1 minutę i usunąć supernatant.</li>
		<li>Dodać 600 μl PBST i inkubować próbki w ciemności przez 30 minut, aby usunąć nadmiar plamy NR.</li>
		<li>Odwirować próbki o masie 560 x g przez 1 minutę i usunąć całość z wyjątkiem około 50 μl supernatantu. 
		UWAGA: Inkubacja NR nie wymaga mieszania. Na tym etapie często osadzają się robaki.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie preparatów do obrazowania mikroskopowego
	<ol>
		<li>Zawiesić osad robaka w pozostałym supernatancie.</li>
		<li>Umieścić 5 μl zawiesiny robaków na szkiełku mikroskopowym i ostrożnie nałożyć szkiełko nakrywkowe, aby uniknąć uwięzienia pęcherzyków powietrza.</li>
		<li>Uszczelnij szkiełko nakrywkowe lakierem do paznokci przed obrazowaniem robaków.</li>
		<li>Przygotuj tylko kilka slajdów na raz. Zapewni to niezmienność obrazowania NR we wszystkich próbkach. Jakość obrazów wybarwionych NR pogarsza się po 6 godzinach. Dyskretne kropelki lipidów są trudne do zaobserwowania, a fluorescencja tła wzrasta, co zakłóca wykrywanie sygnału NR.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Obrazowanie robaków barwionych NR
	<ol>
		<li>Wyobraź sobie robaki w 5-krotnym powiększeniu, aby uchwycić kilka zwierząt w każdym polu widzenia.</li>
		<li>Przełącz się na 10-krotne powiększenie, aby lepiej określić ilościowo poszczególne robaki.</li>
		<li>Użyj kanału FITC/GFP do obrazowania robaków barwionych NR i wypróbuj różne czasy ekspozycji, aby określić optymalne warunki do oznaczania ilościowego.</li>
		<li>Zapisz pliki w formacie TIF, aby uniknąć utraty danych z powodu kompresji. 
		UWAGA: Typowe czasy naświetlania wahają się od 100 do 1000 ms. Mając optymalny czas naświetlania, należy go używać do wszystkich próbek, aby zachować spójność obrazowania.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Kwantyfikacja obrazu barwienia NR
	<ol>
		<li>Prześlij mikrofotografie do ImageJ. W menu rozwijanym Wtyczki użyj funkcji Bio-Formats, jeśli plik obrazu nie zostanie rozpoznany.</li>
		<li>W menu rozwijanym Obraz, w obszarze funkcji Stosy, użyj opcji Obrazy na stos, aby utworzyć stos obrazów po porównaniu kilku mikrofotografii.</li>
		<li>W tym samym menu rozwijanym dostosuj jasność/kontrast stosu obrazów i propaguj zmiany na wszystkich obrazach, klikając przycisk Zastosuj.</li>
		<li>Użyj narzędzia do zaznaczania wielokątów, aby nakreślić granice każdego zobrazowanego robaka i użyj funkcji Zmierz w menu rozwijanym Analiza, aby określić ilościowo intensywność fluorescencji emitowanej przez NR.</li>
		<li>Dla każdego obrazu zmierz pięć lokalizacji tła i oblicz średnią intensywność fluorescencji tła.</li>
		<li>Odejmij intensywność fluorescencji tła od każdego obrazowanego robaka za pomocą wzoru N = G - (A x B), gdzie N oznacza fluorescencję netto, G - fluorescencję ogólną, A - całkowitą powierzchnię robaka i B - średnią fluorescencję tła.</li>
		<li>Aby znormalizować intensywność fluorescencji przez rozmiar robaka, podziel fluorescencję netto każdego robaka przez jego całkowitą powierzchnię. Wyniki są podawane jako intensywność fluorescencji, w dowolnych jednostkach (a.u.), na piksel. 
		UWAGA: Unikaj eksportowania obrazów w formacie JPEG. Podczas gdy kompresja sprawia, że przechowywanie plików jest łatwiejsze w zarządzaniu, integralność danych jest zagrożona przez ten format. Upewnij się, że wszystkie obrazy są identycznie modyfikowane i analizowane. Pamiętaj, aby dołączyć podziałkę, aby prawidłowo ocenić rozmiar przy różnych powiększeniach. Aby lepiej zobrazować różnice w intensywności fluorescencji za pomocą ImageJ, zmień typ obrazu z RGB na 8-bitowy i wybierz opcję Ogień z menu tabel wyszukiwania obrazów (LUT). W ten sposób powstaje obraz z mapą cieplną, w którym zwiększona jasność kolorów koreluje ze zwiększoną intensywnością fluorescencji.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Barwienie lipidów czerwienią olejową (ORO)
<ol>
	<li>Przygotowanie roztworu podstawowego ORO
	<ol>
		<li>W butelce o pojemności 250 ml dodaj 500 mg proszku ORO do 100 ml 100% izopropanolu i dobrze wymieszaj.</li>
		<li>Po przygotowaniu roztwór należy przechowywać szczelnie zamknięty, bez ekspozycji na światło.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie roztworu roboczego ORO
	<ol>
		<li>Rozcieńczyć roztwór podstawowy ORO w wodzie (3:2) do 60% izopropanolu.</li>
		<li>Przed użyciem przefiltrować roboczy roztwór ORO przez sterylny filtr strzykawkowy z octanu celulozy 0,2 μm. 
		UWAGA: Aby uzyskać najlepszą jakość roztworu, przygotuj działający roztwór ORO dzień wcześniej i pozostaw do wymieszania na noc. Jeśli jednak roztwór jest potrzebny tego samego dnia, rozcieńczyć i wymieszać roztwór ORO na kołysce przez co najmniej 2 godziny przed użyciem. Przed kołysaniem owiń stożkową rurkę taśmą parafinową, aby uniknąć wycieku roztworu ORO.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie robaków do barwienia lipidów ORO
	<ol>
		<li>Hoduj robaki w temperaturze 20 °C na pożywce wzrostowej nicieni (NGM) wysianej późną logarytmiczną OP50 E. coli do pożądanego etapu życia.</li>
		<li>Dodaj 1 ml roztworu PBST do płytki i mieszaj, aż wszystkie robaki znikną z płytki. Przechyl płytkę i umyj ją 1 ml PBST. Przenieś zawiesinę ślimakową do probówki do mikrofugi o pojemności 1,5 ml.</li>
		<li>Odwirować robaki przy 560 x g przez 1 minutę. Usunąć supernatant bez naruszania osadu i powtórzyć etap przemywania z 1 ml PBST trzy razy. Usunąć cały sklarowany osad z wyjątkiem 100 μl.</li>
		<li>Dodaj 600 μl 40% izopropanolu do granulki robaka i kołysz ją w temperaturze pokojowej przez 3 minuty.</li>
		<li>Odwirować robaki przy 560 x g przez 30 s i usunąć cały supernatant z wyjątkiem 100 μl, nie naruszając osadu robaka. 
		UWAGA: Użyj większych objętości PBST do zmycia robaków z płytek w przypadku barwienia o dużej przepustowości. Nie myj robaków w PBST dłużej niż 15 minut przed utrwaleniem próbki. Wykonaj dodatkowe prania, jeśli supernatant nie jest oczyszczony z bakterii. Przeprowadzić inkubację w 40% izopropanolu za pomocą nutatora lub kołyski. Zawsze monitoruj probówki, aby upewnić się, że występuje pełne mieszanie próbki.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Barwienie lipidów za pomocą ORO
	<ol>
		<li>Do każdej próbki dodać 600 μl roztworu roboczego OR. Odwróć probówkę trzy razy i dobrze wymieszaj robaki w ORO.</li>
		<li>Obracać próbki z prędkością 30 obr./min przez 2 godziny w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Odwirować próbki przy 560 x g przez 1 minutę i usunąć cały supernatant z wyjątkiem 100 μl.</li>
		<li>Ponownie zawiesić próbki w 600 μl PBST i obracać probówki z prędkością 30 obr./min przez 30 minut, aby usunąć nadmiar plamy ORO.</li>
		<li>Odwirować próbki o masie 560 x g przez 1 minutę i usunąć wszystkie próbki supernatantu z wyjątkiem 50 μl.</li>
		<li>Aby lepiej rozróżnić lokalizację linii rozrodczej i komórek jelitowych zwierzęcia, należy wybarwić jądra, dodając 1 μl (2-(4-amidinofenylo)-1H -indolo-6-karboksyamidyny) (DAPI) na każdy 1 ml roztworu roboczego OR. Barwienie ORO należy przeprowadzić przez 2 godziny z dodaniem DAPI przed zamontowaniem szkiełek do obrazowania. Jądra jelitowe są większe, a gonada wyróżnia się rozwijającymi się komórkami rozrodczymi. 
		UWAGA: Po barwieniu ORO robaki mogą przylegać do boków rurki mikrofuge i nie tworzyć zauważalnej osadki. Jeśli tak się stanie, ponownie odwiruj robaki lub pozwól robakom osiąść grawitacyjnie przez co najmniej 10 minut.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie preparatów do obrazowania robaków
	<ol>
		<li>Ponownie zawiesić robaki w pozostałym supernatencie i dobrze wymieszać roztwór.</li>
		<li>Umieścić 5 μl zawiesiny ślimakowej na szkiełku mikroskopowym i ostrożnie umieścić szkiełko nakrywkowe, upewniając się, że nie tworzą się pęcherzyki powietrza.</li>
		<li>Uszczelnij szkiełko nakrywkowe lakierem do paznokci i robakami obrazowymi. 
		UWAGA: Po utrwaleniu i zabarwieniu robaki mogą być bardzo sztywne i trudne do pipetowania. Aby obejść ten problem, należy wykonać pipety o szerokim otworze, odcinając ich końcówki.</li>
		<li>Przechowywać szkiełka w stojaku do mikrowirówek w temperaturze 4 °C przez maksymalnie 24 godziny, jeśli nie obrazują bezpośrednio po barwieniu.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Obrazowanie robaków barwionych metodą ORO
	<ol>
		<li>Użyj kolorowej kamery, aby sfotografować robaki poplamione ORO.</li>
		<li>Użyj 5-krotnego powiększenia, aby sfotografować kilka robaków w jednym polu widzenia.</li>
		<li>Przełącz się na 10-krotne powiększenie, aby lepiej przyjrzeć się pojedynczym robakom.</li>
		<li>Eksportuj obrazy w formacie TIF, aby uniknąć utraty danych z powodu kompresji. 
		UWAGA: W przypadku barwienia za pomocą ORO + DAPI zmień kamerę z obsługą kolorów na taką, która może rejestrować fluorescencję.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Analiza obrazu robaków barwionych metodą ORO
	<ol>
		<li>Prześlij mikrofotografię (fotografie) do ImageJ. W menu rozwijanym Wtyczki użyj funkcji Bio-Formats, jeśli plik obrazu nie zostanie rozpoznany.</li>
		<li>W menu rozwijanym Obraz, w obszarze funkcji Stosy, użyj opcji Obrazy na stos, aby utworzyć stos obrazów po porównaniu kilku mikrofotografii.</li>
		<li>Dostosuj jasność/kontrast w tym samym menu rozwijanym, aby poprawić widoczność kropelek lipidów.</li>
		<li>Kategoryzuj obrazy według akumulacji lipidów w całym ciele zwierzęcia lub w określonych tkankach.</li>
		<li>Aby lepiej ocenić lokalizację lipidów i zidentyfikować niespecyficzne artefakty obrazu za pomocą ImageJ, wybierz funkcję Kolor w menu rozwijanym Obraz i kliknij Stosuj do RGB, aby wyświetlić sygnały każdego komponentu RGB.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Greenspan, P., Mayer, E. P., Fowler, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nile+red%3A+a+selective+fluorescent+stain+for+intracellular+lipid+droplets%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Nile red: a selective fluorescent stain for intracellular lipid droplets.</a> J Cell Biol. 100 (3), 965-973 (1985).</li>
<li>Guo, Y., Cordes, K. R., Farese, R. V., Walther, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid+droplets+at+a+glance%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Lipid droplets at a glance.</a> J Cell Sci. 122 (6), 749-752 (2009).</li>
<li>Horobin, R. W., Kiernan, J. A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHorobin%2C+RW+%22Conn%27s+biological+stains%3A+a+handbook+of+dyes%2C+stains+and+fluorochromes+for+use+in+biology+and+medicine%22">Conn's biological stains: a handbook of dyes, stains and fluorochromes for use in biology and medicine</a>. , BIOS Scientific Publishers. (2002).</li>
<li>Hulme, S. E., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemistry+and+the+worm%3A+Caenorhabditis+elegans+as+a+platform+for+integrating+chemical+and+biological+research%5BTitle%5D)+AND+%22Angew+Chem+Int+Edit%22%5BJournal%5D)">Chemistry and the worm: Caenorhabditis elegans as a platform for integrating chemical and biological research.</a> Angew Chem Int Edit. 50 (21), 4774-4807 (2011).</li>
<li>Khanna, A., Johnson, D. L., Curran, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physiological+roles+for+mafr-1+in+reproduction+and+lipid+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Physiological roles for mafr-1 in reproduction and lipid homeostasis.</a> Cell Rep. 9 (6), 2180-2191 (2014).</li>
<li>Lynn, D. A., Dalton, H. M., Sowa, J. N., Wang, M. C., Soukas, A. A., Curran, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Omega-3+and-6+fatty+acids+allocate+somatic+and+germline+lipids+to+ensure+fitness+during+nutrient+and+oxidative+stress+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22P+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Omega-3 and-6 fatty acids allocate somatic and germline lipids to ensure fitness during nutrient and oxidative stress in Caenorhabditis elegans.</a> P Natl Acad Sci USA. 112 (50), 15378-15383 (2015).</li>
<li>Pang, S., Lynn, D. A., Lo, J. Y., Paek, J., Curran, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SKN-1+and+Nrf2+couples+proline+catabolism+with+lipid+metabolism+during+nutrient+deprivation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">SKN-1 and Nrf2 couples proline catabolism with lipid metabolism during nutrient deprivation.</a> Nat Commun. 5, (2014).</li>
<li>Saltiel, A. R., Kahn, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insulin+signalling+and+the+regulation+of+glucose+and+lipid+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Insulin signalling and the regulation of glucose and lipid metabolism.</a> Nature. 414 (6865), 799-806 (2001).</li>
<li>Witting, M., Schmitt-Kopplin, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Caenorhabditis+elegans+lipidome%3A+A+primer+for+lipid+analysis+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Biochem+Biophys%22%5BJournal%5D)">The Caenorhabditis elegans lipidome: A primer for lipid analysis in Caenorhabditis elegans.</a> Arch Biochem Biophys. 589, 27-37 (2016).</li>
<li>Yen, K., Le, T. T., Bansal, A., Narasimhan, S. D., Cheng, J. X., Tissenbaum, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparative+study+of+fat+storage+quantitation+in+nematode+Caenorhabditis+elegans+using+label+and+label-free+methods%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">A comparative study of fat storage quantitation in nematode Caenorhabditis elegans using label and label-free methods.</a> PloS One. 5 (9), e12810(2010).</li>
<li>Zhang, Y., Zou, X., Ding, Y., Wang, H., Wu, X., Liang, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+genomics+and+functional+study+of+lipid+metabolic+genes+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">Comparative genomics and functional study of lipid metabolic genes in Caenorhabditis elegans.</a> BMC Genomics. 14 (1), 164(2013).</li>
<li>Folick, A., Min, W., Wang, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Label-free+imaging+of+lipid+dynamics+using+Coherent+Anti-stokes+Raman+Scattering+%28CARS%29+and+Stimulated+Raman+Scattering+%28SRS%29+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Genet+Dev%22%5BJournal%5D)">Label-free imaging of lipid dynamics using Coherent Anti-stokes Raman Scattering (CARS) and Stimulated Raman Scattering (SRS) microscopy.</a> Curr Opin Genet Dev. 21 (5), 585-590 (2011).</li>
<li>Pino, E. C., Webster, C. M., Carr, C. E., Soukas, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biochemical+and+high+throughput+microscopic+assessment+of+fat+mass+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Biochemical and high throughput microscopic assessment of fat mass in Caenorhabditis elegans.</a> J Vis Exp. (73), (2013).</li>
<li>O'Rourke, E. J., Soukas, A. A., Carr, C. E., Ruvkun, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((C.+elegans+major+fats+are+stored+in+vesicles+distinct+from+lysosome-related+organelles%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metab%22%5BJournal%5D)">C. elegans major fats are stored in vesicles distinct from lysosome-related organelles.</a> Cell Metab. 10 (5), 430-435 (2009).</li>
</ol>

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Wzrost wskaźników otyłości i chorób metabolicznych sprawia, że C. elegans jest odpowiednim modelem do badania mechanizmów regulujących akumulację tłuszczu w komórkach i tkankach. Najnowsze dowody sugerują, że zmiany poziomu lipidów są skorelowane z procesami komórkowymi, począwszy od sygnalizacji insuliny8, aktywacji receptorów hormonalnych2 i nastąpi reprodukcja5. W porównaniu z metodami mikroskopii bezznacznikowej i chromatografii, czerwie...

Lipidy są niezbędne do życia. Są integralnymi elementami membran, działają jako wtórne przekaźniki i przetworniki sygnału oraz pełnią kluczowe funkcje w magazynowaniu energii. Kiedy metabolizm lipidów jest rozregulowany, prowadzi to do chorób takich jak otyłość i cukrzyca typu II, które stanowią palące problemy dla zdrowia publicznego9. Caenorhabditis elegans (C. elegans) jest doskonałym organizmem modelowym do badania metabolizmu lipidów, ponieważ ma stosunkowo krótki cykl życia, przezroczyste ciało, znaną linię komórkową i w pełni zsekwencjonowany genom. C. elegans, przede wszystkim hermafrodyta, pozwala naukowcom hodować dużą liczbę zwierząt izogenicznych w krótkich odstępach czasu w celu przeprowadzenia wysokoprzepustowych badań genetycznych w celu zbadania szerokiego wachlarza genów i szlaków metabolicznych4. Podejście to ujawniło wysoki stopień zachowania 273 genów metabolizmu lipidów C. elegans u ludzi, myszy, szczurów i drosophila. Co więcej, ponad 300 genów lipidowych u C. elegans ma ludzkie ortologi, które są związane z chorobami niezwiązanymi z zespołem metabolicznym11. Tradycyjnie, badanie magazynowania lipidów u C. elegans opierało się głównie na testach znakowanych barwnikiem, które dostarczają solidnych informacji na temat akumulacji lipidów. Rzadziej spotykany jest opis lokalizacji lipidów i zmierzone różnice w obfitości lipidów w tkankach. Jednak ostatnie prace wykazały, że dystrybucja lipidów może być równie ważna jak akumulacja lipidów6.
Ostatnio badania zaczęły integrować metody takie jak wysokosprawna chromatografia cieczowa ze spektrometrią mas (HPLC-MS), chromatografia gazowa ze spektrometrią mas (GC-MS) oraz koherentna mikroskopia rozpraszania Ramana (CARS) w celu rozwiązania problemów związanych z podejściami opartymi na barwieniu poprzez bezpośrednią analizę zawartości ekstraktów lipidowych, określonych frakcji lipidowych i złogów lipidowych10,11. Co więcej, mikroskopia CARS ujawniła, że czerwień nilowa może służyć jako wskaźnik akumulacji tłuszczu tylko wtedy, gdy jest używana jako barwnik utrwalający, ponieważ jej użycie jako barwnika życiowego prowadzi do niewłaściwego barwienia organelli autofluorescencyjnych10. Jednak wymagana wiedza techniczna i koszty związane z tymi metodami chromatografii i mikroskopii sprawiają, że ich zastosowanie jest niemożliwe do utrzymania w przypadku wielu pytań badawczych. W tym artykule omawiamy wygodną i niezawodną metodę utrwalania i barwienia obojętnych złogów lipidowych u C. elegans przy użyciu czerwieni nilowej i czerwieni olejowej O w celu rozróżnienia obfitości lipidów w całych zwierzętach i określonych tkankach.
Czerwień nilowa, 9-dietyloamino-5H-benzo[α]fenoksazyno-5-on, to barwnik benzofenoksazonowy, który łatwo rozpuszcza się w różnych rozpuszczalnikach organicznych, ale jest głównie nierozpuszczalny w wodzie. Jest to doskonały barwnik lizochromowy stosowany do barwienia obojętnych lipidów, takich jak trójglicerydy lub estry cholesterolu, ponieważ ma mocny kolor, dobrze rozpuszcza się w lipidach, ma znikomą interakcję z otaczającymi tkankami i jest mniej rozpuszczalny w rozpuszczalniku niż w lipidach. Ma maksima wzbudzenia i emisji odpowiednio 450-500 i 520 nm1. Gdy C. elegans zabarwiony na czerwono Nilem jest obserwowany pod kątem zielonej fluorescencji, dyskretne ciała lipidowe można zaobserwować w jelicie i innych tkankach albo w skupiskach, albo równomiernie rozproszonych, w zależności od genotypu zwierzęcia lub leczenia eksperymentalnego7.
Czerwień olejowa O to lizochrom, rozpuszczalny w tłuszczach barwnik używany do barwienia trójglicerydów i lipoprotein. Nazywany jest barwnikiem azowym, ponieważ jego struktura chemiczna zawiera dwie grupy azowe przyłączone do trzech pierścieni aromatycznych. Jest trudny do jonizacji, co sprawia, że jest dobrze rozpuszczalny w lipidach. Jego kolor plamy jest czerwony, a maksymalna absorpcja światła wynosi 518 nm 3. C. elegans zabarwiony czerwienią olejową O ma czerwone kropelki lipidów, które wyróżniają się na przezroczystym ciele zwierzęcia, co ułatwia jakościową ocenę rozmieszczenia lipidów między różnymi tkankami6.

<table><tbody><tr><td>Mikroskop Imager.M2m</td><td>Zeiss</td><td>n/a</td><td>Mikroskop fluorescencyjny</td></tr><tr><td>Kamera ERC5s</td><td>Axiocam</td><td>n/a</td><td>Kolorowa</td></tr><tr><td>kamera MRm</td><td>Axiocam</td><td>n/a</td><td>Zdolna do fluorescencji</td></tr><tr><td>czerwień nilowa</td><td>Thermo Fisher</td><td>N1142</td><td>Barwnik lipidowy</td></tr><tr><td>czerwony O</td><td>Alfa Aesar</td><td>A12989</td><td>Barwnik lipidowy</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Thermo Fisher</td><td>D1306</td><td>Barwienie DNA</td></tr><tr><td>Alkohol izopropylowy</td><td>BDH</td><td>BDH1133-1LP</td><td>Roztwór utrwalający</td></tr><tr><td>0,2 i mikro; m seterylowy filtr strzykawkowy</td><td>VWR</td><td>28145-477</td><td>Filtr z octanu celulozy</td></tr><tr><td>Wirówka 5430</td><td>Eppendorf</td><td>5428000015</td><td>Wytrząsarka</td></tr> do <tr><td>wirówek Rożen</td> laboratoryjny <td>Quake</td><td>400110Q</td><td>Wytrząsarka</td></tr><tr><td>rurowa</td><td>VWR</td><td>10136-084</td><td>Rotator</td></tr><tr><td>K2HPO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>7758-11-4</td><td>NGM</td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>7778-77-0</td><td>NGM</td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>Alfa Aesar</td><td>7786-30-3</td><td>NGM</td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>10035-04-8</td><td>NGM</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>7647-14-5</td><td>NGM</td></tr><tr><td>Cholesterol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>57-88-5</td><td>NGM</td></tr><tr><td>Peptone</td><td>BD Biosciences</td><td>211677</td><td>NGM</td></tr><tr><td>Agar</td><td>Teknova</td><td>L9110</td><td></td></tr><tr><td>Pożywka</td> NGM LB <td>Sigma-Aldrich</td><td>L3147</td><td>Wzrost bakterii</td></tr></tbody></table>

kwantyfikacja obfitości lipidów i ocena rozmieszczenia lipidów w caenorhabditis elegans za pomocą barwienia czerwienią nilową i czerwienią olejową o

Quantification of Lipid Abundance and Evaluation of Lipid Distribution in Caenorhabditis elegans by Nile Red and Oil Red O Staining

Caenorhabditis elegans to wyjątkowy organizm modelowy, w którym można badać metabolizm lipidów i homeostazę energetyczną. Wiele z jego genów lipidowych jest konserwatywnych u ludzi i jest związanych z zespołem metabolicznym lub innymi chorobami. Badanie akumulacji lipidów w tym organizmie można przeprowadzić za pomocą barwników utrwalających lub metod bezznacznikowych. Barwniki utrwalające, takie jak czerwień nilowa i czerwień olejowa O, są niedrogimi, niezawodnymi sposobami ilościowego pomiaru poziomu lipidów i jakościowej obserwacji rozmieszczenia lipidów w tkankach. Co więcej, barwienia te pozwalają na wysokoprzepustowe badania przesiewowe różnych genów i szlaków metabolizmu lipidów. Dodatkowo ich hydrofobowy charakter ułatwia rozpuszczalność lipidów, zmniejsza interakcję z otaczającymi tkankami i zapobiega dysocjacji do rozpuszczalnika. Chociaż metody te są skuteczne w badaniu ogólnej zawartości lipidów, nie dostarczają szczegółowych informacji na temat składu chemicznego i różnorodności złogów lipidowych. Do tych celów lepiej nadają się metody bezznacznikowe, takie jak mikroskopia GC-MS i CARS, niezależnie od ich kosztów.

SKN-1 jest cytoprotekcyjnym czynnikiem transkrypcyjnym typu bZip, wykazującym homologię z ssaczym NRF2, o którym wykazano, że pośredniczy w utlenianiu kwasów tłuszczowych. W zależności od stężenia glukozy w diecie, nicienie z konstytutywnie aktywnym allelem skn-1 wykazują różne poziomy lipidów po barwieniu czerwoną nilą7. Rycina 1A-C przedstawia zwierzęta z aktywnym skn-1 poddane warunkom prowadzącym ...

Barwienie czerwienią nilową utrwalonych Caenorhabditis elegans jest metodą ilościowego pomiaru neutralnych złogów lipidowych, podczas gdy barwienie czerwienią olejową O ułatwia jakościową ocenę dystrybucji lipidów wśród tkanek.

Kwantyfikacja obfitości lipidów i ocena rozmieszczenia lipidów w Caenorhabditis elegans za pomocą barwienia czerwienią nilową i czerwienią olejową O

Caenorhabditis elegans is an exceptional model organism in which to study lipid metabolism and energy homeostasis. Many of its lipid genes are conserved ...

Ogólnym celem tych metod barwienia jest ilościowe określenie obfitości lipidów wewnątrzkomórkowych i ocena dystrybucji lipidów w różnych tkankach. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania dotyczące metabolizmu lipidów, takie jak to, w jaki sposób lipidy są regulowane genetycznie i biochemicznie oraz które stany chorobowe regulują homeostazę lipidów. Główną zaletą tej techniki jest to, że jest stosunkowo prosta i niedroga do wykonania.Aby przeprowadzić barwienie lipidów czerwienią nilową, robaki płytkowe na pożywce do wzrostu nicieni lub NGM wysiane późną logarytmią OP50 E.coli i hodują robaki w temperaturze 20 stopni Celsjusza do wczesnego stadium L4. Umyj robaki jednym milimetrem roztworu PBST i przenieś zawiesinę ślimaka do 1,5 mililitrowej probówki do mikrofuge. Odwiruj robaki pod 560-krotnością grawitacji przez jedną minutę.Następnie usunąć supernatant i powtarzać płukanie PBST, aż E. coli zostanie usunięta z zawiesiny. Następnie do osadu robaka dodać 100 mikrolitrów 40% izopropanolu lub 60% do barwienia ORO i inkubować próbkę w temperaturze pokojowej przez trzy minuty. Dodatek izopropanolu jest kluczowy dla prawidłowej przepuszczalności robaków przed barwieniem.Odwiruj robaki pod 560-krotnością grawitacji przez jedną minutę i usuń supernatant bez naruszania osadu robaka. Ważne jest, aby zminimalizować ekspozycję na światło podczas etapów wirowania. Teraz, będąc w ciemności, dodaj 600 mikrolitrów wcześniej przygotowanego roztworu roboczego NR do każdej próbki.Odwróć probówki trzy razy i całkowicie wymieszaj robaki i roztwór. Następnie inkubować próbkę w ciemności w temperaturze pokojowej przez dwie godziny. Po inkubacji odwirować robaki i usunąć supernatant.Następnie dodaj 600 mikrolitrów PBST i inkubuj próbki w ciemności przez 30 minut, aby usunąć nadmiar plamy NR. Po ponownym odwirowaniu próbek, jak poprzednio, usunąć wszystkie z wyjątkiem około 50 mikrolitrów supernatantu i ponownie zawiesić osad robaka w pozostałym roztworze. Aby przygotować szkiełka do obrazowania, należy odpipetować pięć mikrolitrów zawiesiny ślimakowej na szkiełko mikroskopowe i ostrożnie nałożyć szkiełko nakrywkowe, aby uniknąć uwięzienia pęcherzyków powietrza.Korzystając z kanału FITC GFP do obrazowania robaków barwionych NR i próbując różnych czasów naświetlania, zobrazuj robaki w pięciokrotnym powiększeniu, aby uchwycić kilka zwierząt w polu widzenia. Następnie przełącz się na 10-krotne powiększenie, aby lepiej określić ilościowo poszczególne robaki. Aby określić ilościowo obrazy, prześlij mikrofotografie do ImageJ.W menu rozwijanym obrazu dostosuj jasność, kontrast zestawu obrazów i propaguj zmiany na wszystkich obrazach, klikając przycisk Zastosuj. Użyj narzędzia do zaznaczania wielokątów, aby nakreślić granice każdego zobrazowanego robaka, a następnie w menu rozwijanym analizy użyj funkcji pomiaru, aby zakwalifikować intensywność fluorescencji emitowanej przez NR. Dla każdego obrazu zmierz pięć lokalizacji tła i oblicz średnią intensywność fluorescencji tła. Dodaj 600 mikrolitrów roztworu roboczego Oil Red O lub ORO do każdej próbki i trzykrotnie odwróć probówkę, aby dobrze wymieszać robaki i ORO.Obracać próbki z prędkością 30 obr./min i RT przez dwie godziny. Odwirować próbki przy 560-krotności grawitacji przez jedną minutę i odessać cały supernatant z wyjątkiem 100 mikrolitrów. Następnie użyj 600 mikrolitrów PBST do ponownego zawieszenia próbek i obracaj probówki z prędkością 30 obr./min przez 30 minut, aby usunąć nadmiar zabarwienia OR.Aby lepiej rozróżnić lokalizację linii rozrodczej zwierząt w komórkach jelitowych, wybarwić jądra, dodając jeden mikrolitr DAPI na każdy mililitr roztworu roboczego OR. Następnie, aby przygotować szkiełka do obrazowania, ponownie zawieś robaki i pozostały supernatant i dobrze wymieszaj roztwór. Umieść pięć mikrolitrów zawiesiny ślimakowej na szkiełku mikroskopowym i ostrożnie nałóż szkiełko nakrywkowe, upewniając się, że nie tworzą się pęcherzyki powietrza.Aby zobrazować robaki poplamione ORO, użyj kolorowej kamery o pięciokrotnym powiększeniu, aby zobrazować kilka robaków w jednym polu widzenia. Następnie przełącz się na 10-krotne powiększenie, aby lepiej przyjrzeć się pojedynczym robakom. Na koniec, po przesłaniu obrazów do ImageJ i utworzeniu talii obrazów zgodnie z protokołem tekstowym, skategoryzuj obrazy według akumulacji lipidów w całym ciele zwierzęcia lub w określonych tkankach.SKN-1 dzieli homologię z ssaczym Nrf2 i wykazano, że pośredniczy w utlenianiu kwasów tłuszczowych. Rysunek ten przedstawia aktywowane zwierzęta SKN-1 narażone na warunki, które prowadzą do wzrostu poziomu lipidów. Jak widać na tych obrazach, fluorescencja NR uchwycona za pomocą kanału FITC GFP jest widoczna wzdłuż jelita, ale jest ciemniejsza w świetle głowy, ogona i jelita.Chociaż łatwo jest skategoryzować robaki według obecności lub braku zależnego od wieku somatycznego wyczerpania tłuszczu lub ASDF, identyfikacja zwierząt ze średnią utratą tłuszczu może być trudna. W porównaniu ze zwierzętami bez ASDF, które wykazują jaskrawoczerwone zabarwienie na całym ciele z kilkoma półprzezroczystymi obszarami, robaki ASDF wykazują zauważalny ubytek tłuszczu w komórkach jelitowych. Zwierzęta w trakcie rozwoju ASDF często wykazują półprzezroczyste miejsca, w których ostatecznie dochodzi do większości utraty tłuszczu.Co więcej, robaki ASDF mogą nadal wykazywać jaskrawoczerwone zabarwienie w obszarach głowy i ogona, ponieważ fenotyp nie jest definiowany przez całkowitą utratę somatycznego tłuszczu, ale przez rozległe zubożenie tłuszczu w porównaniu ze zwierzętami niestarzejącymi się. Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w ciągu trzech godzin plus czas obrazowania, jeśli zostanie wykonana prawidłowo. Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać o umyciu i przepuszczalności robaków nie później niż 30 minut przed barwieniem.Zgodnie z tą procedurą można zastosować inne metody, takie jak mikroskopia CARS, w celu porównania rodzaju gatunków lipidów identyfikowanych przez każdą technologię i określenia, która metoda jest lepiej dopasowana do określonych typów pytań. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak określić ilościowo lipidy i ocenić rozkład lipidów w robakach za pomocą barwienia czerwienią Nilową i czerwienią olejową O, a następnie analizy mikrograficznej ImageJ.

quantification-lipid-abundance-evaluation-lipid-distribution

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Ten film opisuje protokół barwienia lipidów w całych, utrwalonych robakach za pomocą barwnika Nile Red. Aby zobaczyć neutralne lipidy w rdzeniu kropelek lipidów, zobrazuj zielone widma emisji barwionego C. elegans.

Barwienie czerwienią nilową C. elegans: metoda wizualizacji kropelek lipidów u zwierząt utrwalonych

Ten film demonstruje protokół wykrywania i ilościowego oznaczania neutralnych lipidów w komórkach glonów poprzez barwienie ich czerwonym barwnikiem nilowym.

Barwienie czerwienią nilową: technika wykrywania i ilościowego oznaczania wewnątrzkomórkowych obojętnych lipidów w algach

Prezentujemy solidne metody biochemiczne i mikroskopowe do badania zapasów lipidów Caenorhabditis elegans. Szybka, prosta procedura barwienia utrwalającego do fluorescencyjnego obrazowania kropelek lipidów wykorzystuje właściwości spektralne lipofilowego barwnika czerwieni nilowej. Następnie przedstawiono pomiar biochemiczny triglicerydów i fosfolipidów z wykorzystaniem ekstrakcji do fazy stałej i chromatografii gazowej ze spektrometrią mas.

Biochemiczna i wysokoprzepustowa ocena mikroskopowa masy tłuszczowej w Caenorhabditis elegans

Opisany jest prosty protokół do określania neutralnej zawartości lipidów w komórkach glonów za pomocą procedury barwienia czerwienią Nilu. Ta oszczędzająca czas technika stanowi alternatywę dla tradycyjnych protokołów kwantyfikacji lipidów opartych na grawimetrii. Został zaprojektowany z myślą o konkretnym zastosowaniu monitorowania wydajności bioprocesów.

Prosty i szybki protokół pomiaru neutralnych lipidów w komórkach glonów za pomocą fluorescencji

Przedstawione tutaj są szczegółowe metody preparowania i barwienia kropelkami lipidów enocytów u larw Drosophila przy użyciu BODIPY 493/503, barwnika fluorescencyjnego specyficznego dla kropelek lipidów.

Rozwarstwienie i barwienie kropelkami lipidów enocytów u larw Drosophila

Mikroskopia stymulowanego rozpraszania Ramana (SRS) umożliwia selektywne, bezznacznikowe obrazowanie określonych cząsteczek chemicznych i została skutecznie wykorzystana do obrazowania cząsteczek lipidów in vivo. W tym miejscu przedstawiamy krótkie wprowadzenie do zasady działania mikroskopii SRS i opisujemy metody jej wykorzystania w obrazowaniu magazynowania lipidów w Caenorhabditis elegans.

Bezznacznikowe obrazowanie dynamiki magazynowania lipidów u Caenorhabditis elegans przy użyciu mikroskopii wymuszonego rozpraszania Ramana

Obecny protokół opisuje metody suplementacji lipidów w kulturach płynnych i na płytkach dla Caenorhabditis elegans, w połączeniu z badaniami podłużnymi i analizą transkrypcji genów z dużej ilości lub kilku robaków i tkanek robaków.

Suplementacja lipidów w celu długowieczności i analizy transkrypcji genów w Caenorhabditis elegans

Tutaj demonstrujemy zoptymalizowany protokół oparty na fluorescencji BODIPY 493/503 do charakterystyki kropelek lipidów w tkance wątroby. Dzięki zastosowaniu projekcji ortogonalnych i rekonstrukcji 3D, fluorofor pozwala na skuteczne rozróżnienie stłuszczenia mikropęcherzykowego i makropęcherzykowego i może stanowić podejście uzupełniające do klasycznych protokołów histologicznych do oceny stłuszczenia wątroby.

Analiza fluorescencyjnie barwionych kropelek lipidów z rekonstrukcją 3D w celu oceny stłuszczenia wątroby

Choroby zwyrodnieniowe oczu, które wpływają na warstwę nabłonka barwnikowego siatkówki, mają pochodzenie monogenowe i poligenowe. Opracowano kilka modeli chorób i aplikację LipidUNet w celu badania mechanizmów choroby, a także potencjalnych interwencji terapeutycznych.

Oparta na uczeniu maszynowym metoda charakterystyki i kwantyfikacji złogów lipidowych LipidUNet przy użyciu nabłonka barwnikowego siatkówki pochodzącego z iPSC

Lipofagia to selektywna forma autofagii, która polega na degradacji kropelek lipidów. Dysfunkcje w tym procesie są związane z rozwojem nowotworów. Jednak dokładne mechanizmy nie są jeszcze w pełni poznane. Protokół ten opisuje ilościowe podejścia do obrazowania, aby lepiej zrozumieć wzajemne zależności między autofagią, metabolizmem lipidów i progresją raka.

Badanie regulacji katabolizmu kropelek lipidów poprzez lipofagię

Tutaj przedstawiamy instrukcje dotyczące skutecznego wykorzystania SegElegans, systemu głębokiego uczenia, który opracowaliśmy do automatycznego segmentowania pojedynczych robaków na mikroskopii szerokopolowej, do późniejszego wykorzystania w oprogramowaniu do analizy obrazów, takiego jak ImageJ. Oferujemy możliwości korzystania z systemu zarówno online, jak i offline.

Automatyczna analiza obrazów fluorescencyjnych C. elegans z użyciem SegElegans

Poznaj metody barwienia czerwienią nilową i czerwienią olejową O do kwantyfikacji lipidów oraz oceny ich rozmieszczenia w tkankach Caenorhabditis elegans. Techniki te są proste, tanie i niezbędne w badaniach metabolizmu lipidów.

Kwantyfikacja obfitości lipidów i ocena rozmieszczenia lipidów w Caenorhabditis elegans za pomocą barwienia czerwienią nilową i czerwienią olejową O (Wideo) | JoVE Journal

Kwantyfikacja obfitości lipidów i ocena rozmieszczenia lipidów w Caenorhabditis elegans za pomocą barwienia czerwienią nilową i czerwienią olejową O

Przeglądaj więcej filmów