Kwantyfikacja obfitości lipidów i ocena rozmieszczenia lipidów w Caenorhabditis elegans za pomocą barwienia czerwienią nilową i czerwienią olejową O
5 marca 2018
Barwienie czerwienią nilową utrwalonych Caenorhabditis elegans jest metodą ilościowego pomiaru neutralnych złogów lipidowych, podczas gdy barwienie czerwienią olejową O ułatwia jakościową ocenę dystrybucji lipidów wśród tkanek.
Ogólnym celem tych metod barwienia jest ilościowe określenie obfitości lipidów wewnątrzkomórkowych i ocena dystrybucji lipidów w różnych tkankach. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania dotyczące metabolizmu lipidów, takie jak to, w jaki sposób lipidy są regulowane genetycznie i biochemicznie oraz które stany chorobowe regulują homeostazę lipidów. Główną zaletą tej techniki jest to, że jest stosunkowo prosta i niedroga do wykonania.
Aby przeprowadzić barwienie lipidów czerwienią nilową, robaki płytkowe na pożywce do wzrostu nicieni lub NGM wysiane późną logarytmią OP50 E.coli i hodują robaki w temperaturze 20 stopni Celsjusza do wczesnego stadium L4. Umyj robaki jednym milimetrem roztworu PBST i przenieś zawiesinę ślimaka do 1,5 mililitrowej probówki do mikrofuge. Odwiruj robaki pod 560-krotnością grawitacji przez jedną minutę.
Następnie usunąć supernatant i powtarzać płukanie PBST, aż E. coli zostanie usunięta z zawiesiny. Następnie do osadu robaka dodać 100 mikrolitrów 40% izopropanolu lub 60% do barwienia ORO i inkubować próbkę w temperaturze pokojowej przez trzy minuty. Dodatek izopropanolu jest kluczowy dla prawidłowej przepuszczalności robaków przed barwieniem.
Odwiruj robaki pod 560-krotnością grawitacji przez jedną minutę i usuń supernatant bez naruszania osadu robaka. Ważne jest, aby zminimalizować ekspozycję na światło podczas etapów wirowania. Teraz, będąc w ciemności, dodaj 600 mikrolitrów wcześniej przygotowanego roztworu roboczego NR do każdej próbki.
Odwróć probówki trzy razy i całkowicie wymieszaj robaki i roztwór. Następnie inkubować próbkę w ciemności w temperaturze pokojowej przez dwie godziny. Po inkubacji odwirować robaki i usunąć supernatant.
Następnie dodaj 600 mikrolitrów PBST i inkubuj próbki w ciemności przez 30 minut, aby usunąć nadmiar plamy NR. Po ponownym odwirowaniu próbek, jak poprzednio, usunąć wszystkie z wyjątkiem około 50 mikrolitrów supernatantu i ponownie zawiesić osad robaka w pozostałym roztworze. Aby przygotować szkiełka do obrazowania, należy odpipetować pięć mikrolitrów zawiesiny ślimakowej na szkiełko mikroskopowe i ostrożnie nałożyć szkiełko nakrywkowe, aby uniknąć uwięzienia pęcherzyków powietrza.
Korzystając z kanału FITC GFP do obrazowania robaków barwionych NR i próbując różnych czasów naświetlania, zobrazuj robaki w pięciokrotnym powiększeniu, aby uchwycić kilka zwierząt w polu widzenia. Następnie przełącz się na 10-krotne powiększenie, aby lepiej określić ilościowo poszczególne robaki. Aby określić ilościowo obrazy, prześlij mikrofotografie do ImageJ.
W menu rozwijanym obrazu dostosuj jasność, kontrast zestawu obrazów i propaguj zmiany na wszystkich obrazach, klikając przycisk Zastosuj. Użyj narzędzia do zaznaczania wielokątów, aby nakreślić granice każdego zobrazowanego robaka, a następnie w menu rozwijanym analizy użyj funkcji pomiaru, aby zakwalifikować intensywność fluorescencji emitowanej przez NR. Dla każdego obrazu zmierz pięć lokalizacji tła i oblicz średnią intensywność fluorescencji tła. Dodaj 600 mikrolitrów roztworu roboczego Oil Red O lub ORO do każdej próbki i trzykrotnie odwróć probówkę, aby dobrze wymieszać robaki i ORO.
Obracać próbki z prędkością 30 obr./min i RT przez dwie godziny. Odwirować próbki przy 560-krotności grawitacji przez jedną minutę i odessać cały supernatant z wyjątkiem 100 mikrolitrów. Następnie użyj 600 mikrolitrów PBST do ponownego zawieszenia próbek i obracaj probówki z prędkością 30 obr./min przez 30 minut, aby usunąć nadmiar zabarwienia OR.
Aby lepiej rozróżnić lokalizację linii rozrodczej zwierząt w komórkach jelitowych, wybarwić jądra, dodając jeden mikrolitr DAPI na każdy mililitr roztworu roboczego OR. Następnie, aby przygotować szkiełka do obrazowania, ponownie zawieś robaki i pozostały supernatant i dobrze wymieszaj roztwór. Umieść pięć mikrolitrów zawiesiny ślimakowej na szkiełku mikroskopowym i ostrożnie nałóż szkiełko nakrywkowe, upewniając się, że nie tworzą się pęcherzyki powietrza.
Aby zobrazować robaki poplamione ORO, użyj kolorowej kamery o pięciokrotnym powiększeniu, aby zobrazować kilka robaków w jednym polu widzenia. Następnie przełącz się na 10-krotne powiększenie, aby lepiej przyjrzeć się pojedynczym robakom. Na koniec, po przesłaniu obrazów do ImageJ i utworzeniu talii obrazów zgodnie z protokołem tekstowym, skategoryzuj obrazy według akumulacji lipidów w całym ciele zwierzęcia lub w określonych tkankach.
SKN-1 dzieli homologię z ssaczym Nrf2 i wykazano, że pośredniczy w utlenianiu kwasów tłuszczowych. Rysunek ten przedstawia aktywowane zwierzęta SKN-1 narażone na warunki, które prowadzą do wzrostu poziomu lipidów. Jak widać na tych obrazach, fluorescencja NR uchwycona za pomocą kanału FITC GFP jest widoczna wzdłuż jelita, ale jest ciemniejsza w świetle głowy, ogona i jelita.
Chociaż łatwo jest skategoryzować robaki według obecności lub braku zależnego od wieku somatycznego wyczerpania tłuszczu lub ASDF, identyfikacja zwierząt ze średnią utratą tłuszczu może być trudna. W porównaniu ze zwierzętami bez ASDF, które wykazują jaskrawoczerwone zabarwienie na całym ciele z kilkoma półprzezroczystymi obszarami, robaki ASDF wykazują zauważalny ubytek tłuszczu w komórkach jelitowych. Zwierzęta w trakcie rozwoju ASDF często wykazują półprzezroczyste miejsca, w których ostatecznie dochodzi do większości utraty tłuszczu.
Co więcej, robaki ASDF mogą nadal wykazywać jaskrawoczerwone zabarwienie w obszarach głowy i ogona, ponieważ fenotyp nie jest definiowany przez całkowitą utratę somatycznego tłuszczu, ale przez rozległe zubożenie tłuszczu w porównaniu ze zwierzętami niestarzejącymi się. Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w ciągu trzech godzin plus czas obrazowania, jeśli zostanie wykonana prawidłowo. Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać o umyciu i przepuszczalności robaków nie później niż 30 minut przed barwieniem.
Zgodnie z tą procedurą można zastosować inne metody, takie jak mikroskopia CARS, w celu porównania rodzaju gatunków lipidów identyfikowanych przez każdą technologię i określenia, która metoda jest lepiej dopasowana do określonych typów pytań. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak określić ilościowo lipidy i ocenić rozkład lipidów w robakach za pomocą barwienia czerwienią Nilową i czerwienią olejową O, a następnie analizy mikrograficznej ImageJ.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Barwienie Nile red utrwalonych Caenorhabditis elegans jest metodą ilościowego pomiaru złogów lipidów obojętnych, podczas gdy barwienie Oil Red O umożliwia jakościową ocenę rozkładu lipidów w tkankach. Techniki te są niezbędne do zrozumienia metabolizmu lipidów oraz jego regulacji.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Biochemia
- Metabolizm lipidów
Wstęp
- Wewnątrzkomórkowa zawartość lipidów jest kluczowa dla funkcjonowania komórki.
- Rozkład lipidów różni się w zależności od tkanki.
- Zrozumienie metabolizmu lipidów może dostarczyć informacji o stanach chorobowych.
- Proste i kosztowo efektywne metody barwienia są korzystne dla prowadzenia badań.
Cel badania
- Ilościowe oznaczenie zawartości lipidów wewnątrzkomórkowych.
- Ocena rozkładu lipidów w tkankach.
- Badanie genetycznej i biochemicznej regulacji lipidów.
Zastosowane metody
- Wyjałowić nicienie na pożywce NGM z wysianymi bakteriami E. coli.
- Hodować nicienie w temperaturze 20 °C do wczesnego stadium L4.
- Przemyć nicienie roztworem PBST.
- Wirować nicienie z prędkością 560 ×g przez jedną minutę.
Główne wyniki
- Pomyślna kwantyfikacja złogów lipidów obojętnych.
- Skuteczna ocena jakościowa rozkładu lipidów.
- Wgląd w regulację metabolizmu lipidów.
- Wykazana prostota i efektywność kosztowa metod.
Wnioski
- Barwienie Nile red oraz Oil Red O są wartościowymi technikami.
- Metody te pogłębiają zrozumienie metabolizmu lipidów.
- Stanowią one podstawę dla przyszłych badań nad homeostazą lipidową.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Ilościowa i jakościowa analiza lipidów u Caenorhabditis elegans z wykorzystaniem barwienia Nile Red i Oil Red O stanowi skalowalną i kosztowo efektywną platformę do badania genów oraz szlaków metabolizmu lipidów. Metody te umożliwiają wysokoprzepustowy screening oraz funkcjonalną walidację celów istotnych dla badań nad chorobami metabolicznymi. Ich powtarzalność i dostępność wspierają wczesne etapy odkrywania oraz ograniczanie ryzyka mechanistycznego w procesach badawczych nad homeostazą metaboliczną i energetyczną.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Umożliwia badanie genetycznych i biochemicznych regulatorów metabolizmu lipidów.
- Wspiera walidację funkcjonalną konserwowanych genów lipidowych zaangażowanych w ludzkie choroby.
- Ułatwia ograniczanie ryzyka mechanistycznego poprzez mapowanie rozkładu lipidów w tkankach.
- Zapewnia platformę do szybkiej selekcji celów w szlakach metabolicznych.
Przesiewanie i rozwój testów
- Zapewnia zwalidowane, powtarzalne protokoły barwienia do ilościowego pomiaru lipidów.
- Umożliwia wysokoprzepustowe badanie wpływu genów lub związków na akumulację lipidów.
- Umożliwia zestandaryzowaną kwantyfikację opartą na obrazowaniu z wykorzystaniem narzędzi open-source, takich jak ImageJ.
- Przygotowuje stabilne systemy biologiczne do dalszych etapów przepływu pracy w badaniach fenotypowych.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Jest zgodny z modelami chorób istotnymi dla zespołu metabolicznego i zaburzeń z nim związanych.
- Zapewnia ciągłość od odkryć genetycznych do przedklinicznej walidacji interwencji modulujących lipidy.
- Umożliwia analizę porównawczą z zaawansowaną lipidomiką bez znakowania w celu opracowania biomarkerów translacyjnych.
- Wspiera dostosowany do ryzyka postęp w badaniach nad celami metabolicznymi w oparciu o funkcjonalne fenotypy lipidowe.
Integracja potoków i przepływów pracy
Te metody barwienia i kwantyfikacji integrują wczesne etapy odkrywania i przesiewania, łącząc identyfikację celów genetycznych z walidacją fenotypową oraz opracowywaniem modeli przedklinicznych.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez dotyczących regulacji lipidów oraz mapowanie szlaków w systemie podatnym na manipulacje genetyczne.
- Przesiewanie: Zapewnia powtarzalne, ilościowe odczyty dla badań nad wpływem związków lub perturbacjami genów.
- Analityka: Umożliwia standaryzowane pomiary fluorescencyjne i kolorymetryczne w celu porównania różnych warunków.
- Badania translacyjne: Ułatwia dopasowanie do ludzkich szlaków chorób metabolicznych poprzez analizę konserwowanych genów.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Oferuje szeroko stosowalny, skalowalny schemat postępowania dla portfeli badań nad metabolizmem.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną w walidacji celu i zmniejsza niejednoznaczność mechanistyczną w biologii lipidów.
- Wartość operacyjna: Dostarcza ustandaryzowanych, powtarzalnych i skalowalnych protokołów do oznaczania ilości lipidów.
- Wartość strategiczna: Poprawia decyzje typu go/no-go oraz efektywność kapitałową poprzez umożliwienie wczesnego ograniczania ryzyka w odniesieniu do celów metabolicznych.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację skorygowaną o ryzyko oraz rozwój programów badań nad chorobami metabolicznymi.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymagana biegłość w obchodzeniu się z C. elegans oraz w technikach obrazowania.
- Wymagany dostęp do mikroskopii fluorescencyjnej i kolorymetrycznej oraz oprogramowania do analizy obrazu.
- Konieczna standaryzacja protokołów barwienia, obrazowania i kwantyfikacji pomiędzy zespołami.
- Adaptacja do innych systemów modelowych może wymagać optymalizacji protokołu.
- Ograniczona rozdzielczość w zakresie różnorodności gatunków lipidów; do szczegółowej lipidomiki mogą być potrzebne uzupełniające metody bez znakowania.
