Kwantyfikacja obfitości lipidów i ocena rozmieszczenia lipidów w Caenorhabditis elegans za pomocą barwienia czerwienią nilową i czerwienią olejową O
5 marca 2018
Barwienie czerwienią nilową utrwalonych Caenorhabditis elegans jest metodą ilościowego pomiaru neutralnych złogów lipidowych, podczas gdy barwienie czerwienią olejową O ułatwia jakościową ocenę dystrybucji lipidów wśród tkanek.
Ogólnym celem tych metod barwienia jest ilościowe określenie obfitości lipidów wewnątrzkomórkowych i ocena dystrybucji lipidów w różnych tkankach. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania dotyczące metabolizmu lipidów, takie jak to, w jaki sposób lipidy są regulowane genetycznie i biochemicznie oraz które stany chorobowe regulują homeostazę lipidów. Główną zaletą tej techniki jest to, że jest stosunkowo prosta i niedroga do wykonania.
Aby przeprowadzić barwienie lipidów czerwienią nilową, robaki płytkowe na pożywce do wzrostu nicieni lub NGM wysiane późną logarytmią OP50 E.coli i hodują robaki w temperaturze 20 stopni Celsjusza do wczesnego stadium L4. Umyj robaki jednym milimetrem roztworu PBST i przenieś zawiesinę ślimaka do 1,5 mililitrowej probówki do mikrofuge. Odwiruj robaki pod 560-krotnością grawitacji przez jedną minutę.
Następnie usunąć supernatant i powtarzać płukanie PBST, aż E. coli zostanie usunięta z zawiesiny. Następnie do osadu robaka dodać 100 mikrolitrów 40% izopropanolu lub 60% do barwienia ORO i inkubować próbkę w temperaturze pokojowej przez trzy minuty. Dodatek izopropanolu jest kluczowy dla prawidłowej przepuszczalności robaków przed barwieniem.
Odwiruj robaki pod 560-krotnością grawitacji przez jedną minutę i usuń supernatant bez naruszania osadu robaka. Ważne jest, aby zminimalizować ekspozycję na światło podczas etapów wirowania. Teraz, będąc w ciemności, dodaj 600 mikrolitrów wcześniej przygotowanego roztworu roboczego NR do każdej próbki.
Odwróć probówki trzy razy i całkowicie wymieszaj robaki i roztwór. Następnie inkubować próbkę w ciemności w temperaturze pokojowej przez dwie godziny. Po inkubacji odwirować robaki i usunąć supernatant.
Następnie dodaj 600 mikrolitrów PBST i inkubuj próbki w ciemności przez 30 minut, aby usunąć nadmiar plamy NR. Po ponownym odwirowaniu próbek, jak poprzednio, usunąć wszystkie z wyjątkiem około 50 mikrolitrów supernatantu i ponownie zawiesić osad robaka w pozostałym roztworze. Aby przygotować szkiełka do obrazowania, należy odpipetować pięć mikrolitrów zawiesiny ślimakowej na szkiełko mikroskopowe i ostrożnie nałożyć szkiełko nakrywkowe, aby uniknąć uwięzienia pęcherzyków powietrza.
Korzystając z kanału FITC GFP do obrazowania robaków barwionych NR i próbując różnych czasów naświetlania, zobrazuj robaki w pięciokrotnym powiększeniu, aby uchwycić kilka zwierząt w polu widzenia. Następnie przełącz się na 10-krotne powiększenie, aby lepiej określić ilościowo poszczególne robaki. Aby określić ilościowo obrazy, prześlij mikrofotografie do ImageJ.
W menu rozwijanym obrazu dostosuj jasność, kontrast zestawu obrazów i propaguj zmiany na wszystkich obrazach, klikając przycisk Zastosuj. Użyj narzędzia do zaznaczania wielokątów, aby nakreślić granice każdego zobrazowanego robaka, a następnie w menu rozwijanym analizy użyj funkcji pomiaru, aby zakwalifikować intensywność fluorescencji emitowanej przez NR. Dla każdego obrazu zmierz pięć lokalizacji tła i oblicz średnią intensywność fluorescencji tła. Dodaj 600 mikrolitrów roztworu roboczego Oil Red O lub ORO do każdej próbki i trzykrotnie odwróć probówkę, aby dobrze wymieszać robaki i ORO.
Obracać próbki z prędkością 30 obr./min i RT przez dwie godziny. Odwirować próbki przy 560-krotności grawitacji przez jedną minutę i odessać cały supernatant z wyjątkiem 100 mikrolitrów. Następnie użyj 600 mikrolitrów PBST do ponownego zawieszenia próbek i obracaj probówki z prędkością 30 obr./min przez 30 minut, aby usunąć nadmiar zabarwienia OR.
Aby lepiej rozróżnić lokalizację linii rozrodczej zwierząt w komórkach jelitowych, wybarwić jądra, dodając jeden mikrolitr DAPI na każdy mililitr roztworu roboczego OR. Następnie, aby przygotować szkiełka do obrazowania, ponownie zawieś robaki i pozostały supernatant i dobrze wymieszaj roztwór. Umieść pięć mikrolitrów zawiesiny ślimakowej na szkiełku mikroskopowym i ostrożnie nałóż szkiełko nakrywkowe, upewniając się, że nie tworzą się pęcherzyki powietrza.
Aby zobrazować robaki poplamione ORO, użyj kolorowej kamery o pięciokrotnym powiększeniu, aby zobrazować kilka robaków w jednym polu widzenia. Następnie przełącz się na 10-krotne powiększenie, aby lepiej przyjrzeć się pojedynczym robakom. Na koniec, po przesłaniu obrazów do ImageJ i utworzeniu talii obrazów zgodnie z protokołem tekstowym, skategoryzuj obrazy według akumulacji lipidów w całym ciele zwierzęcia lub w określonych tkankach.
SKN-1 dzieli homologię z ssaczym Nrf2 i wykazano, że pośredniczy w utlenianiu kwasów tłuszczowych. Rysunek ten przedstawia aktywowane zwierzęta SKN-1 narażone na warunki, które prowadzą do wzrostu poziomu lipidów. Jak widać na tych obrazach, fluorescencja NR uchwycona za pomocą kanału FITC GFP jest widoczna wzdłuż jelita, ale jest ciemniejsza w świetle głowy, ogona i jelita.
Chociaż łatwo jest skategoryzować robaki według obecności lub braku zależnego od wieku somatycznego wyczerpania tłuszczu lub ASDF, identyfikacja zwierząt ze średnią utratą tłuszczu może być trudna. W porównaniu ze zwierzętami bez ASDF, które wykazują jaskrawoczerwone zabarwienie na całym ciele z kilkoma półprzezroczystymi obszarami, robaki ASDF wykazują zauważalny ubytek tłuszczu w komórkach jelitowych. Zwierzęta w trakcie rozwoju ASDF często wykazują półprzezroczyste miejsca, w których ostatecznie dochodzi do większości utraty tłuszczu.
Co więcej, robaki ASDF mogą nadal wykazywać jaskrawoczerwone zabarwienie w obszarach głowy i ogona, ponieważ fenotyp nie jest definiowany przez całkowitą utratę somatycznego tłuszczu, ale przez rozległe zubożenie tłuszczu w porównaniu ze zwierzętami niestarzejącymi się. Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w ciągu trzech godzin plus czas obrazowania, jeśli zostanie wykonana prawidłowo. Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać o umyciu i przepuszczalności robaków nie później niż 30 minut przed barwieniem.
Zgodnie z tą procedurą można zastosować inne metody, takie jak mikroskopia CARS, w celu porównania rodzaju gatunków lipidów identyfikowanych przez każdą technologię i określenia, która metoda jest lepiej dopasowana do określonych typów pytań. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak określić ilościowo lipidy i ocenić rozkład lipidów w robakach za pomocą barwienia czerwienią Nilową i czerwienią olejową O, a następnie analizy mikrograficznej ImageJ.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Barwienie Nile red fiksowanych Caenorhabditis elegans jest metodą pomiaru ilościowego osadów lipidów neutralnych, podczas gdy barwienie oil red O umożliwia oceny jakościowej dystrybucji lipidów w tkankach. Te techniki są niezbędne do zrozumienia metabolizmu lipidów i jego regulacji.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauki
- Biochemia
- Metabolizm lipidów
Tło
- Liczba lipidów wewnątrzkomórkowych jest kluczowa dla funkcji komórek.
- Rozkład lipidów różni się w różnych tkankach.
- Zrozumienie metabolizmu lipidów może informować o stanach chorobowych.
- Proste i tanie metody barwienia są korzystne dla badań.
Cel badania
- Ilościowa ocena zawartości lipidów wewnątrzkomórkowych.
- Ocena dystrybucji lipidów w tkankach.
- Zbadanie genetycznej i biochemicznej regulacji lipidów.
Zastosowane metody
- Ułożenie dżdżownic na pożywce Nematode Growth Medium (NGM) zasianowanej E. coli.
- Wyhodowanie dżdżownic w temperaturze 20 stopni Celsjusza do wczesnego stadium L4.
- Płukanie dżdżownic roztworem PBST.
- Wirowanie dżdżownic w 560 razy większym polu grawitacyjnym przez jedną minutę.
Główne wyniki
- Udana ilościowa ocena osadów lipidów neutralnych.
- Skuteczną jakościową oceną dystrybucji lipidów.
- Wgląd w regulację metabolizmu lipidów.
- Wykazaną prostotę i opłacalność metod.
Wnioski
- Barwienie Nile red i oil red O są wartościowymi technikami.
- Te metody poprawiają zrozumienie metabolizmu lipidów.
- Stanowią podstawę dla przyszłych badań nad homeostazą lipidów.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Quantitative and qualitative lipid analysis in Caenorhabditis elegans using Nile Red and Oil Red O staining provides a scalable, cost-effective platform for interrogating lipid metabolism genes and pathways. These methods enable high-throughput screening and functional target validation relevant to metabolic disease research. Their reproducibility and accessibility support early-stage discovery and mechanistic de-risking in metabolic and energy homeostasis pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of genetic and biochemical regulators of lipid metabolism.
- Supports functional validation of conserved lipid genes implicated in human disease.
- Facilitates mechanistic de-risking by mapping lipid distribution across tissues.
- Provides a platform for rapid triage of metabolic pathway targets.
Screening & Assay Development
- Delivers validated, reproducible staining protocols for quantitative lipid measurement.
- Supports high-throughput screening of gene or compound effects on lipid accumulation.
- Enables standardized image-based quantification using open-source tools like ImageJ.
- Prepares robust biological systems for downstream phenotypic screening workflows.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant models for metabolic syndrome and related disorders.
- Provides continuity from genetic discovery to preclinical validation of lipid-modulating interventions.
- Enables comparative analysis with advanced label-free lipidomics for translational biomarker development.
- Supports risk-adjusted advancement of metabolic targets based on functional lipid phenotypes.
Pipeline & Workflow Integration
These staining and quantification methods integrate at the early discovery and screening stages, bridging genetic target identification with phenotypic validation and preclinical model development.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing on lipid regulation and pathway mapping in a genetically tractable system.
- Screening: Provides reproducible, quantitative readouts for compound or gene perturbation studies.
- Analytics: Enables standardized fluorescence and colorimetric measurements for cross-condition comparison.
- Translational Research: Facilitates alignment with human metabolic disease pathways through conserved gene analysis.
- Enterprise Reuse: Offers a broadly applicable, scalable workflow for metabolic research portfolios.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation and reduces mechanistic ambiguity in lipid biology.
- Operational Value: Delivers standardized, reproducible, and scalable protocols for lipid quantification.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions and capital efficiency by enabling early de-risking of metabolic targets.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of metabolic disease programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in C. elegans handling and imaging techniques.
- Needs access to fluorescence and colorimetric microscopy and image analysis software.
- Demands cross-team standardization of staining, imaging, and quantification protocols.
- Adaptation to other model systems may require protocol optimization.
- Limited in resolving lipid species diversity; complementary label-free methods may be needed for detailed lipidomics.
