Kwantyfikacja obfitości lipidów i ocena rozmieszczenia lipidów w Caenorhabditis elegans za pomocą barwienia czerwienią nilową i czerwienią olejową O
March 5th, 2018
Barwienie czerwienią nilową utrwalonych Caenorhabditis elegans jest metodą ilościowego pomiaru neutralnych złogów lipidowych, podczas gdy barwienie czerwienią olejową O ułatwia jakościową ocenę dystrybucji lipidów wśród tkanek.
Ogólnym celem tych metod barwienia jest ilościowe określenie obfitości lipidów wewnątrzkomórkowych i ocena dystrybucji lipidów w różnych tkankach. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania dotyczące metabolizmu lipidów, takie jak to, w jaki sposób lipidy są regulowane genetycznie i biochemicznie oraz które stany chorobowe regulują homeostazę lipidów. Główną zaletą tej techniki jest to, że jest stosunkowo prosta i niedroga do wykonania.
Aby przeprowadzić barwienie lipidów czerwienią nilową, robaki płytkowe na pożywce do wzrostu nicieni lub NGM wysiane późną logarytmią OP50 E.coli i hodują robaki w temperaturze 20 stopni Celsjusza do wczesnego stadium L4. Umyj robaki jednym milimetrem roztworu PBST i przenieś zawiesinę ślimaka do 1,5 mililitrowej probówki do mikrofuge. Odwiruj robaki pod 560-krotnością grawitacji przez jedną minutę.
Następnie usunąć supernatant i powtarzać płukanie PBST, aż E. coli zostanie usunięta z zawiesiny. Następnie do osadu robaka dodać 100 mikrolitrów 40% izopropanolu lub 60% do barwienia ORO i inkubować próbkę w temperaturze pokojowej przez trzy minuty. Dodatek izopropanolu jest kluczowy dla prawidłowej przepuszczalności robaków przed barwieniem.
Odwiruj robaki pod 560-krotnością grawitacji przez jedną minutę i usuń supernatant bez naruszania osadu robaka. Ważne jest, aby zminimalizować ekspozycję na światło podczas etapów wirowania. Teraz, będąc w ciemności, dodaj 600 mikrolitrów wcześniej przygotowanego roztworu roboczego NR do każdej próbki.
Odwróć probówki trzy razy i całkowicie wymieszaj robaki i roztwór. Następnie inkubować próbkę w ciemności w temperaturze pokojowej przez dwie godziny. Po inkubacji odwirować robaki i usunąć supernatant.
Następnie dodaj 600 mikrolitrów PBST i inkubuj próbki w ciemności przez 30 minut, aby usunąć nadmiar plamy NR. Po ponownym odwirowaniu próbek, jak poprzednio, usunąć wszystkie z wyjątkiem około 50 mikrolitrów supernatantu i ponownie zawiesić osad robaka w pozostałym roztworze. Aby przygotować szkiełka do obrazowania, należy odpipetować pięć mikrolitrów zawiesiny ślimakowej na szkiełko mikroskopowe i ostrożnie nałożyć szkiełko nakrywkowe, aby uniknąć uwięzienia pęcherzyków powietrza.
Korzystając z kanału FITC GFP do obrazowania robaków barwionych NR i próbując różnych czasów naświetlania, zobrazuj robaki w pięciokrotnym powiększeniu, aby uchwycić kilka zwierząt w polu widzenia. Następnie przełącz się na 10-krotne powiększenie, aby lepiej określić ilościowo poszczególne robaki. Aby określić ilościowo obrazy, prześlij mikrofotografie do ImageJ.
W menu rozwijanym obrazu dostosuj jasność, kontrast zestawu obrazów i propaguj zmiany na wszystkich obrazach, klikając przycisk Zastosuj. Użyj narzędzia do zaznaczania wielokątów, aby nakreślić granice każdego zobrazowanego robaka, a następnie w menu rozwijanym analizy użyj funkcji pomiaru, aby zakwalifikować intensywność fluorescencji emitowanej przez NR. Dla każdego obrazu zmierz pięć lokalizacji tła i oblicz średnią intensywność fluorescencji tła. Dodaj 600 mikrolitrów roztworu roboczego Oil Red O lub ORO do każdej próbki i trzykrotnie odwróć probówkę, aby dobrze wymieszać robaki i ORO.
Obracać próbki z prędkością 30 obr./min i RT przez dwie godziny. Odwirować próbki przy 560-krotności grawitacji przez jedną minutę i odessać cały supernatant z wyjątkiem 100 mikrolitrów. Następnie użyj 600 mikrolitrów PBST do ponownego zawieszenia próbek i obracaj probówki z prędkością 30 obr./min przez 30 minut, aby usunąć nadmiar zabarwienia OR.
Aby lepiej rozróżnić lokalizację linii rozrodczej zwierząt w komórkach jelitowych, wybarwić jądra, dodając jeden mikrolitr DAPI na każdy mililitr roztworu roboczego OR. Następnie, aby przygotować szkiełka do obrazowania, ponownie zawieś robaki i pozostały supernatant i dobrze wymieszaj roztwór. Umieść pięć mikrolitrów zawiesiny ślimakowej na szkiełku mikroskopowym i ostrożnie nałóż szkiełko nakrywkowe, upewniając się, że nie tworzą się pęcherzyki powietrza.
Aby zobrazować robaki poplamione ORO, użyj kolorowej kamery o pięciokrotnym powiększeniu, aby zobrazować kilka robaków w jednym polu widzenia. Następnie przełącz się na 10-krotne powiększenie, aby lepiej przyjrzeć się pojedynczym robakom. Na koniec, po przesłaniu obrazów do ImageJ i utworzeniu talii obrazów zgodnie z protokołem tekstowym, skategoryzuj obrazy według akumulacji lipidów w całym ciele zwierzęcia lub w określonych tkankach.
SKN-1 dzieli homologię z ssaczym Nrf2 i wykazano, że pośredniczy w utlenianiu kwasów tłuszczowych. Rysunek ten przedstawia aktywowane zwierzęta SKN-1 narażone na warunki, które prowadzą do wzrostu poziomu lipidów. Jak widać na tych obrazach, fluorescencja NR uchwycona za pomocą kanału FITC GFP jest widoczna wzdłuż jelita, ale jest ciemniejsza w świetle głowy, ogona i jelita.
Chociaż łatwo jest skategoryzować robaki według obecności lub braku zależnego od wieku somatycznego wyczerpania tłuszczu lub ASDF, identyfikacja zwierząt ze średnią utratą tłuszczu może być trudna. W porównaniu ze zwierzętami bez ASDF, które wykazują jaskrawoczerwone zabarwienie na całym ciele z kilkoma półprzezroczystymi obszarami, robaki ASDF wykazują zauważalny ubytek tłuszczu w komórkach jelitowych. Zwierzęta w trakcie rozwoju ASDF często wykazują półprzezroczyste miejsca, w których ostatecznie dochodzi do większości utraty tłuszczu.
Co więcej, robaki ASDF mogą nadal wykazywać jaskrawoczerwone zabarwienie w obszarach głowy i ogona, ponieważ fenotyp nie jest definiowany przez całkowitą utratę somatycznego tłuszczu, ale przez rozległe zubożenie tłuszczu w porównaniu ze zwierzętami niestarzejącymi się. Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w ciągu trzech godzin plus czas obrazowania, jeśli zostanie wykonana prawidłowo. Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać o umyciu i przepuszczalności robaków nie później niż 30 minut przed barwieniem.
Zgodnie z tą procedurą można zastosować inne metody, takie jak mikroskopia CARS, w celu porównania rodzaju gatunków lipidów identyfikowanych przez każdą technologię i określenia, która metoda jest lepiej dopasowana do określonych typów pytań. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak określić ilościowo lipidy i ocenić rozkład lipidów w robakach za pomocą barwienia czerwienią Nilową i czerwienią olejową O, a następnie analizy mikrograficznej ImageJ.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Przegląd
Barwienie Nile red fiksowanych Caenorhabditis elegans jest metodą pomiaru ilościowego osadów lipidów neutralnych, podczas gdy barwienie oil red O umożliwia oceny jakościowej dystrybucji lipidów w tkankach. Te techniki są niezbędne do zrozumienia metabolizmu lipidów i jego regulacji.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauki
- Biochemia
- Metabolizm lipidów
Tło
- Liczba lipidów wewnątrzkomórkowych jest kluczowa dla funkcji komórek.
- Rozkład lipidów różni się w różnych tkankach.
- Zrozumienie metabolizmu lipidów może informować o stanach chorobowych.
- Proste i tanie metody barwienia są korzystne dla badań.
Cel badania
- Ilościowa ocena zawartości lipidów wewnątrzkomórkowych.
- Ocena dystrybucji lipidów w tkankach.
- Zbadanie genetycznej i biochemicznej regulacji lipidów.
Zastosowane metody
- Ułożenie dżdżownic na pożywce Nematode Growth Medium (NGM) zasianowanej E. coli.
- Wyhodowanie dżdżownic w temperaturze 20 stopni Celsjusza do wczesnego stadium L4.
- Płukanie dżdżownic roztworem PBST.
- Wirowanie dżdżownic w 560 razy większym polu grawitacyjnym przez jedną minutę.
Główne wyniki
- Udana ilościowa ocena osadów lipidów neutralnych.
- Skuteczną jakościową oceną dystrybucji lipidów.
- Wgląd w regulację metabolizmu lipidów.
- Wykazaną prostotę i opłacalność metod.
Wnioski
- Barwienie Nile red i oil red O są wartościowymi technikami.
- Te metody poprawiają zrozumienie metabolizmu lipidów.
- Stanowią podstawę dla przyszłych badań nad homeostazą lipidów.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Quantitative and qualitative lipid analysis in Caenorhabditis elegans using Nile Red and Oil Red O staining provides a scalable, cost-effective platform for interrogating lipid metabolism genes and pathways. These methods enable high-throughput screening and functional target validation relevant to metabolic disease research. Their reproducibility and accessibility support early-stage discovery and mechanistic de-risking in metabolic and energy homeostasis pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of genetic and biochemical regulators of lipid metabolism.
- Supports functional validation of conserved lipid genes implicated in human disease.
- Facilitates mechanistic de-risking by mapping lipid distribution across tissues.
- Provides a platform for rapid triage of metabolic pathway targets.
Screening & Assay Development
- Delivers validated, reproducible staining protocols for quantitative lipid measurement.
- Supports high-throughput screening of gene or compound effects on lipid accumulation.
- Enables standardized image-based quantification using open-source tools like ImageJ.
- Prepares robust biological systems for downstream phenotypic screening workflows.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant models for metabolic syndrome and related disorders.
- Provides continuity from genetic discovery to preclinical validation of lipid-modulating interventions.
- Enables comparative analysis with advanced label-free lipidomics for translational biomarker development.
- Supports risk-adjusted advancement of metabolic targets based on functional lipid phenotypes.
Pipeline & Workflow Integration
These staining and quantification methods integrate at the early discovery and screening stages, bridging genetic target identification with phenotypic validation and preclinical model development.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing on lipid regulation and pathway mapping in a genetically tractable system.
- Screening: Provides reproducible, quantitative readouts for compound or gene perturbation studies.
- Analytics: Enables standardized fluorescence and colorimetric measurements for cross-condition comparison.
- Translational Research: Facilitates alignment with human metabolic disease pathways through conserved gene analysis.
- Enterprise Reuse: Offers a broadly applicable, scalable workflow for metabolic research portfolios.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation and reduces mechanistic ambiguity in lipid biology.
- Operational Value: Delivers standardized, reproducible, and scalable protocols for lipid quantification.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions and capital efficiency by enabling early de-risking of metabolic targets.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of metabolic disease programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in C. elegans handling and imaging techniques.
- Needs access to fluorescence and colorimetric microscopy and image analysis software.
- Demands cross-team standardization of staining, imaging, and quantification protocols.
- Adaptation to other model systems may require protocol optimization.
- Limited in resolving lipid species diversity; complementary label-free methods may be needed for detailed lipidomics.
