Name: ExCYT: Graficzny interfejs użytkownika usprawniający analizę danych z cytometrii wielowymiarowej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-16T12:30:00.000+00:00
Duration: 5 min 12 s
Description: Poznaj analizę danych cytometrycznych z ExCYT, graficznym interfejsem MATLAB umożliwiającym redukcję wymiarowości, klasteryzację i wizualizację populacji komórkowych bez umiejętności programowania.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy nie mają żadnych podziękowań.

1. Zbieranie i przygotowywanie danych cytometrycznych
<ol>
	<li>Umieść wszystkie pojedyncze plamy w folderze osobno i oznacz nazwą kanału (fluoroforem, nie markerem).</li>
</ol>
2. Import danych i wstępne przetwarzanie
<ol>
	<li>Aby wstrzymać lub zapisać w całym potoku analizy, użyj przycisku Zapisz obszar roboczy w lewym dolnym rogu programu, aby zapisać obszar roboczy jako znak ". MAT', który można później załadować za pomocą przycisku Załaduj obszar roboczy. Nie uruchamiaj więcej niż jednej instancji programu na raz. Dlatego podczas ładowania nowego obszaru roboczego upewnij się, że nie jest uruchomione żadne inne wystąpienie ExCYT.</li>
	<li>Aby rozpocząć potok analizy, najpierw wybierz typ cytometrii (cytometria przepływowa lub cytometria masowa – CYTOF), w obszarze Parametry wyboru pliku wybierz liczbę zdarzeń do pobrania z pliku (w tym przykładzie użyj 2 000). Po pomyślnym zaimportowaniu danych pojawi się okno dialogowe informujące użytkownika, że dane zostały pomyślnie zaimportowane.</li>
	<li>Naciśnij przycisk automatycznej kompensacji, aby przeprowadzić opcjonalny krok automatycznej kompensacji, tak jak to robi Bagwell & Adams9. Zaznacz katalog zawierający pojedyncze plamy. Wybierz niebarwioną próbkę w oknie dialogowym interfejsu użytkownika.
	<ol>
		<li>Umieść bramkę rozproszenia do przodu/bocznego na dowolnej próbce w tym katalogu, która będzie używana do wybierania zdarzeń do obliczenia macierzy kompensacji. Zaleca się użycie do tego celu niebarwionej próbki. W tym momencie zaimplementowano algorytm do ustawiania spójnych progów na 99. percentylu niebarwionej próbki w celu zdefiniowania pozytywnych zdarzeń w każdym z pojedynczych barwień w celu obliczenia macierzy kompensacji. Po zakończeniu tego procesu pojawi się okno dialogowe z informacją, że kompensacja została wykonana.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Następnie naciśnij Populacja bramki i wybierz populacje interesujących komórek, zgodnie z konwencją w analizach cytometrii przepływowej. Po wybraniu opcji Populacja komórek wprowadź liczbę procentową analizy podrzędnej zdarzeń (w tym 10 000 zdarzeń).</li>
	<li>Następnie wybierz kanały numeryczne, które mają być używane do analizy, w polu listy po prawej stronie pola Przetwarzanie wstępne (użyj określonych kanałów pokazanych w przykładzie).</li>
</ol>
3. Analiza t-SNE
<ol>
	<li>Naciśnij przycisk t-SNE, aby program rozpoczął obliczanie zestawu danych o zmniejszonej wymiarowości do wizualizacji w oknie poniżej przycisku t-SNE. Aby zapisać obraz t-SNE, naciśnij Zapisz obraz TSNE. Na komputerze z 8 procesorami @ 3,4 GHz każdy i 8 GM RAM ten krok powinien zająć około 2 minut dla 10 000 zdarzeń, 10 minut dla 50 000 zdarzeń i 20 minut dla 100 000 zdarzeń.</li>
	<li>Aby utworzyć "mapę cieplną t-SNE", jak widać w kilku publikacjach CYTOF10,11, wybierz opcję z menu podręcznego Marker-Specific t-SNE (użyj określonych znaczników CD64 lub CD3, jak pokazano w przykładzie). Pojawi się rysunek przedstawiający reprezentację mapy cieplnej wykresu t-SNE, którą można zapisać w celu wygenerowania figury.</li>
	<li>Wybiera obszary zainteresowania na wykresach t-SNE przez użytkownika do dalszych analiz za pomocą przycisku Gate t-SNE.</li>
</ol>
4. Analiza skupień
<ol>
	<li>Aby rozpocząć analizę grupowania, wybierz opcję z listy Metoda grupowania (w tym przykładzie nas DBSCAN ze współczynnikiem odległości 5 w oknie dialogowym po prawej stronie pola listy). Naciśnij przycisk Cluster (Klaster).</li>
	<li>Użyj jednej z następujących opcji dla algorytmów automatycznego grupowania, które znajdują się w panelu "Parametry automatycznego grupowania":
	<ol>
		<li>Twarde KMEANS (na t-SNE): Zastosuj grupowanie k-średnich do zredukowanych 2-wymiarowych danych t-SNE i wymaga podania liczby klastrów do algorytmu12.</li>
		<li>Twarde KMEAN (na danych HD): Zastosuj grupowanie k-średnich do oryginalnych danych wielowymiarowych, które zostały przekazane algorytmowi t-SNE. Po raz kolejny algorytmowi należy podać liczbę klastrów.</li>
		<li>DBSCAN: Zastosuj metodę grupowania klastrów, zwaną Densesity-Based Spatial Clustering of Applications with Noise13, która grupuje zredukowane 2-wymiarowe dane t-SNE i wymaga niewymiarowego współczynnika odległości, który określa ogólny rozmiar klastrów. Ten typ algorytmu grupowania dobrze nadaje się do grupowania redukcji t-SNE, ponieważ jest w stanie grupować klastry niesferoidalne, które często występują w zredukowanej reprezentacji t-SNE. Dodatkowo, ze względu na to, że operuje na danych dwuwymiarowych, jest jednym z szybszych algorytmów grupowania.</li>
		<li>Grupowanie hierarchiczne: Zastosuj konwencjonalną metodę grupowania hierarchicznego do danych wielowymiarowych, w których cała euklidesowa macierz odległości jest obliczana między wszystkimi zdarzeniami przed podaniem algorytmowi współczynnika odległości, który określa rozmiar klastra.</li>
		<li>Oparty na grafie sieciowym: Zastosuj metodę grupowania, która została ostatnio wprowadzona do analizy danych cytometrii przepływowej, gdy istnieją rzadkie subpopulacje, które użytkownik chce wykryć11,14. Ta metoda polega na utworzeniu najpierw wykresu, który określa powiązania między wszystkimi zdarzeniami w danych. Ten krok polega na podaniu parametru początkowego w celu utworzenia wykresu, który jest liczbą k najbliższych sąsiadów. Ten parametr zazwyczaj określa rozmiar klastrów. W tym momencie pojawia się kolejne okno dialogowe z prośbą o zastosowanie jednego z 5 algorytmów grupowania, które są stosowane do wykresu. Obejmują one 3 opcje maksymalizacji modularności wykresu, metodę Danona i algorytm grupowania spektralnego14,15,16,17,18. Jeśli ktoś chce ogólnie szybszego rozwiązania do klastrowania, polecamy Spectral Clustering lub Fast Greedy Modularity Maximization. Podczas gdy metody maksymalizacji modularności wraz z metodą Danona określają optymalną liczbę klastrów, klastrowanie spektralne wymaga, aby liczba klastrów została przekazana programowi.</li>
		<li>Samoorganizująca się mapa: Wykorzystaj sztuczną sieć neuronową do grupowania danych wielowymiarowych.</li>
		<li>GMM – Maksymalizacja oczekiwań: Utwórz model mieszaniny Gaussa przy użyciu techniki maksymalizacji oczekiwań (EM) w celu grupowania danych wielowymiarowych. 19 Ten typ metody grupowania wymaga również od użytkownika wprowadzenia liczby klastrów.</li>
		<li>Wariacyjne wnioskowanie bayesowskie dla GMM: Utwórz model mieszaniny Gaussa, ale w przeciwieństwie do EM, może on automatycznie określić liczbę składników mieszaniny k.20 Chociaż program wymaga podania liczby klastrów (większej niż oczekiwana liczba klastrów), algorytm sam określi optymalną liczbę.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Aby zbadać określony obszar wykresu t-SNE, naciśnij przycisk Wybierz klaster ręcznie, aby narysować zestaw klastrów zdefiniowanych przez użytkownika. Należy pamiętać, że klastry nie mogą współużytkować członków (tj. każde zdarzenie może należeć tylko do 1 klastra).</li>
</ol>
5. Filtracja klastrowa
<ol>
	<li>Zestawy klastrów zidentyfikowanych ręcznie lub za pomocą jednej z metod automatycznych opisanych powyżej można filtrować w następujący sposób.
	<ol>
		<li>Aby posortować klastry (w panelu Filtr klastrów) według dowolnych znaczników zmierzonych w eksperymencie, wybierz opcję z menu podręcznego Sortuj. Aby ustawić, czy kolejność ma być rosnąca, czy malejąca, naciśnij przycisk Rosnąco/Malejąco po prawej stronie menu podręcznego Sortuj. Spowoduje to zaktualizowanie listy klastrów w polu listy "Klastry (filtracja)" i zmianę ich kolejności w kolejności malejącej wyrażenia mediany klastra tego znacznika. Wartość procentowa oznaczona w polu listy "Klastry (filtracja)" oznacza procent populacji, którą ten klaster reprezentuje.</li>
		<li>Aby ustawić minimalną wartość progową dla danego klastra w określonym kanale, wybierz opcję z menu podręcznego Próg (w tym przykładzie używamy znacznika CD65 i ustawiamy próg na 0,75). Wpisz wartość w polu liczbowym pod wykresem lub użyj suwaka, aby ustawić próg. Po ustawieniu progu naciśnij przycisk Dodaj powyżej progu lub Dodaj poniżej progu, aby określić kierunek progu. Po ustawieniu tego progu zostanie on wyświetlony w polu Progi obok panelu "Filtr klastrów", w którym zostanie wyświetlony znacznik, wartość progowa i kierunek, dzięki czemu użytkownik będzie wiedział, które progi są obecnie stosowane. Na koniec wykres t-SNE zostanie zaktualizowany poprzez rozmycie klastrów, które nie spełniają wymagań filtracji, a pole listy "Klastry (filtracja)" zostanie zaktualizowane, aby pokazać klastry spełniające wymagania filtracji.</li>
		<li>Aby ustawić minimalny próg częstotliwości klastra, wprowadź liczbowy punkt odcięcia w polu Próg częstotliwości klastra (%) w panelu Filtr klastra (w tym przykładzie należy użyć wartości 1%).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
6. Analiza i wizualizacja skupień
<ol>
	<li>Aby wybrać klastry do dalszej analizy i wizualizacji, wybierz klastry w polu listy Klastry (filtracja) i naciśnij przycisk Wybierz à, aby przenieść je do pola listy Analiza klastrów.</li>
	<li>Aby utworzyć mapy cieplne klastrów, wybierz interesujące Cię klastry w polu listy Analiza klastrów i naciśnij przycisk Mapa cieplna klastrów. Po naciśnięciu tego przycisku pojawi się rysunek zawierający mapę cieplną wraz z dendrogramami na osiach klastra i parametrów. Dendrogram na osi pionowej pogrupuje klastry według tych, które są blisko powiązane, podczas gdy dendrogram na osi poziomej pogrupuje znaczniki, które są ze sobą powiązane. Aby zapisać mapę cieplną, naciśnij Plik | Ustawienia eksportu | Eksport.</li>
	<li>Aby utworzyć 'Wysokowymiarowy wykres pudełkowy' lub 'Wysokowymiarowy wykres przepływu', wybierz interesujące klastry w polu listy Analiza skupień i naciśnij przycisk Wysokowymiarowy wykres pudełkowy lub Wysokowymiarowy wykres przepływu. Wykresy te można wykorzystać do wizualnej oceny rozkładu danych kanałów różnych klastrów we wszystkich wymiarach.</li>
	<li>Aby wyświetlić klastry na tradycyjnych wykresach przepływu 2D, wybierz transformację (liniową, log10, arcsinh) i kanał w panelu Konwencjonalny wykres przepływu, a następnie naciśnij przycisk Konwencjonalny wykres przepływu.</li>
</ol>

<ol><li>Benoist, C., Hacohen, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometry%2C+amped+up%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Flow cytometry, amped up.</a> Science. 332 (6030), 677-678 (2011).</li>
<li>Ornatsky, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+multiparametric+analysis+by+mass+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+immunological+methods%22%5BJournal%5D)">Highly multiparametric analysis by mass cytometry.</a> Journal of immunological methods. 361 (1), 1-20 (2010).</li>
<li>Tanner, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometer+with+mass+spectrometer+detection+for+massively+multiplexed+single-cell+biomarker+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Pure+and+Applied+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Flow cytometer with mass spectrometer detection for massively multiplexed single-cell biomarker assay.</a> Pure and Applied Chemistry. 80 (12), 2627-2641 (2008).</li>
<li>Maecker, H. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Standardization+of+cytokine+flow+cytometry+assays%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+immunology%22%5BJournal%5D)">Standardization of cytokine flow cytometry assays.</a> BMC immunology. 6 (1), 13(2005).</li>
<li>Brazma, A., Vilo, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+expression+data+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+letters%22%5BJournal%5D)">Gene expression data analysis.</a> FEBS letters. 480 (1), 17-24 (2000).</li>
<li>Pyne, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+high-dimensional+flow+cytometric+data+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Automated high-dimensional flow cytometric data analysis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 106 (21), 8519-8524 (2009).</li>
<li>Ge, Y., Sealfon, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((flowPeaks%3A+a+fast+unsupervised+clustering+for+flow+cytometry+data+via+K-means+and+density+peak+finding%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">flowPeaks: a fast unsupervised clustering for flow cytometry data via K-means and density peak finding.</a> Bioinformatics. 28 (15), 2052-2058 (2012).</li>
<li>Venkatesh, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determinants+of+perceived+ease+of+use%3A+Integrating+control%2C+intrinsic+motivation%2C+and+emotion+into+the+technology+acceptance+model%5BTitle%5D)+AND+%22Information+systems+research%22%5BJournal%5D)">Determinants of perceived ease of use: Integrating control, intrinsic motivation, and emotion into the technology acceptance model.</a> Information systems research. 11 (4), 342-365 (2000).</li>
<li>Bagwell, C. B., Adams, E. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+spectral+overlap+compensation+for+any+number+of+flow+cytometry+parameters%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+the+New+York+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Fluorescence spectral overlap compensation for any number of flow cytometry parameters.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 677 (1), 167-184 (1993).</li>
<li>Lavin, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Innate+immune+landscape+in+early+lung+adenocarcinoma+by+paired+single-cell+analyses%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Innate immune landscape in early lung adenocarcinoma by paired single-cell analyses.</a> Cell. 169 (4), 750-765 (2017).</li>
<li>Chevrier, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+immune+atlas+of+clear+cell+renal+cell+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">An immune atlas of clear cell renal cell carcinoma.</a> Cell. 169 (4), 736-749 (2017).</li>
<li>Hartigan, J. A., Wong, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Algorithm+AS+136%3A+A+k-means+clustering+algorithm%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+Royal+Statistical+Society.+Series+C+%28Applied+Statistics%29%22%5BJournal%5D)">Algorithm AS 136: A k-means clustering algorithm.</a> Journal of the Royal Statistical Society. Series C (Applied Statistics). 28 (1), 100-108 (1979).</li>
<li>Ester, M., Kriegel, H. P., Sander, J., Xu, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Density-based+spatial+clustering+of+applications+with+noise%5BTitle%5D)+AND+%22International+Conference+Knowledge+Discovery+and+Data+Mining%22%5BJournal%5D)">Density-based spatial clustering of applications with noise.</a> International Conference Knowledge Discovery and Data Mining. 240, (1996).</li>
<li>Levine, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Data-driven+phenotypic+dissection+of+AML+reveals+progenitor-like+cells+that+correlate+with+prognosis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Data-driven phenotypic dissection of AML reveals progenitor-like cells that correlate with prognosis.</a> Cell. 162 (1), 184-197 (2015).</li>
<li>Blondel, V. D., Guillaume, J. L., Lambiotte, R., Lefebvre, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+unfolding+of+communities+in+large+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+statistical+mechanics%3A+theory+and+experiment%22%5BJournal%5D)">Fast unfolding of communities in large networks.</a> Journal of statistical mechanics: theory and experiment. 2008 (10), P10008(2008).</li>
<li>Le Martelot, E., Hankin, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+multi-scale+detection+of+relevant+communities+in+large-scale+networks%5BTitle%5D)+AND+%22The+Computer+Journal%22%5BJournal%5D)">Fast multi-scale detection of relevant communities in large-scale networks.</a> The Computer Journal. 56 (9), 1136-1150 (2013).</li>
<li>Newman, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+algorithm+for+detecting+community+structure+in+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Physical+review+E%22%5BJournal%5D)">Fast algorithm for detecting community structure in networks.</a> Physical review E. 69 (6), 066133(2004).</li>
<li>Hespanha, J. P. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHespanha%2C+JP+%22An+efficient+matlab+algorithm+for+graph+partitioning%22">An efficient matlab algorithm for graph partitioning</a>. , University of California. 1-8 (2004).</li>
<li>Moon, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+expectation-maximization+algorithm%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE+Signal+processing%22%5BJournal%5D)">The expectation-maximization algorithm.</a> IEEE Signal processing. 13 (6), 47-60 (1996).</li>
<li>Bishop, C. M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBishop%2C+CM+%22Pattern+recognition+and+machine+learning%22">Pattern recognition and machine learning</a>. , Springer. (2006).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

W tym miejscu prezentujemy ExCYT, nowatorski graficzny interfejs użytkownika z algorytmami opartymi na MATLAB w celu usprawnienia analizy danych z cytometrii wielowymiarowej, umożliwiając osobom bez doświadczenia w programowaniu wdrażanie najnowszych algorytmów analizy danych wielowymiarowych. Dostępność tego oprogramowania dla szerszej społeczności naukowej pozwoli naukowcom na eksplorację danych z cytometrii przepływowej w intuicyjny i prosty sposób pracy. Dzięki przeprowadzeniu redukcji wymiarów t-SNE, zastosowaniu me...

Postępy w cytometrii przepływowej, jak również pojawienie się cytometrii masowej, pozwoliły klinicystom i naukowcom szybko zidentyfikować i fenotypowo scharakteryzować biologicznie i klinicznie interesujące próbki z nowymi poziomami rozdzielczości, tworząc duże, wysokowymiarowe zestawy danych, które są bogate w informacje1,2,3. Podczas gdy konwencjonalne metody analizy danych cytometrii przepływowej, takie jak bramkowanie ręczne, były prostsze w przypadku eksperymentów, w których jest niewiele markerów, a markery te mają wizualnie rozpoznawalne populacje, podejście to może nie generować powtarzalnych wyników podczas analizowania zestawów danych o wyższych wymiarach lub tych z markerami barwiącymi się w spektrum. Na przykład w badaniu wieloinstytucjonalnym, w którym przeprowadzano testy barwienia wewnątrzkomórkowego (ICS) w celu oceny odtwarzalności ilościowego określania odpowiedzi limfocytów T specyficznych dla antygenu, pomimo dobrej precyzji międzylaboratoryjnej, analiza, w szczególności bramkowania, wprowadziła istotne źródło zmienności4. Co więcej, proces ręcznego bramkowania populacji interesów, oprócz tego, że jest wysoce subiektywny, jest bardzo czasochłonny i pracochłonny. Jednak problem analizowania wielowymiarowych zbiorów danych w sposób solidny, wydajny i terminowy nie jest niczym nowym w naukach badawczych. Badania ekspresji genów często generują niezwykle wielowymiarowe zestawy danych (często rzędu setek genów), podczas gdy ręczne formy analizy byłyby po prostu niewykonalne. Aby poradzić sobie z analizą tych zestawów danych, włożono wiele pracy w opracowanie narzędzi bioinformatycznych do analizowania danych dotyczących ekspresji genów5. Te podejścia algorytmiczne zostały niedawno przyjęte w analizie danych cytometrycznych, ponieważ liczba parametrów wzrosła i okazały się nieocenione w analizie tych wielowymiarowych zestawów danych6,7.
Pomimo generowania i stosowania różnorodnych algorytmów i pakietów oprogramowania, które pozwalają naukowcom na zastosowanie tych wielowymiarowych podejść bioinformatycznych do danych cytometrii przepływowej, te techniki analityczne nadal pozostają w dużej mierze nieużywane. Chociaż może istnieć wiele czynników, które ograniczyły powszechne zastosowanie tych podejść do danych cytometrycznych8, główną przeszkodą, którą podejrzewamy w stosowaniu tych podejść przez naukowców, jest brak wiedzy obliczeniowej. W rzeczywistości wiele z tych pakietów oprogramowania (tj. flowCore, flowMeans i OpenCyto) jest napisanych tak, aby można je było zaimplementować w językach programowania, takich jak R, które nadal wymagają merytorycznej wiedzy programistycznej. Pakiety oprogramowania, takie jak FlowJo, znalazły uznanie wśród naukowców ze względu na prostotę obsługi i charakter "plug-n-play", a także kompatybilność z systemem operacyjnym PC. Aby zapewnić różnorodność akceptowanych i cennych technik analitycznych naukowcom niezaznajomionym z programowaniem, opracowaliśmy ExCYT, graficzny interfejs użytkownika (GUI), który można łatwo zainstalować na komputerze PC/Mac, który wykorzystuje wiele najnowszych technik, w tym redukcję wymiarowości w celu intuicyjnej wizualizacji, różnorodne metody grupowania cytowane w literaturze, wraz z nowatorskimi funkcjami do zbadania wyników tych algorytmów grupowania z mapami cieplnymi i nowatorskimi wielowymiarowymi wykresami przepływu/skrzynkowymi.
ExCYT to graficzny interfejs użytkownika wbudowany w MATLAB, dlatego może być uruchamiany bezpośrednio w MATLAB lub dostarczany jest instalator, który może być użyty do zainstalowania oprogramowania na dowolnym komputerze PC/Mac. Oprogramowanie jest dostępne pod adresem https://github.com/sidhomj/ExCYT. Przedstawiamy szczegółowy protokół importu danych, ich wstępnego przetwarzania, przeprowadzania redukcji wymiarowości t-SNE, danych klastrowych, sortowania i filtrowania klastrów w oparciu o preferencje użytkownika oraz wyświetlania informacji o interesujących klastrach za pomocą map cieplnych i nowatorskich wysokowymiarowych wykresów przepływowych/pudełkowych (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 1). Osie na wykresach t-SNE są dowolne i w dowolnych jednostkach i jako takie nie zawsze są pokazane na rysunkach dla uproszczenia interfejsu użytkownika. Kolorowanie punktów danych w "mapach cieplnych t-SNE" jest od niebieskiego do żółtego w zależności od sygnału wskazanego znacznika. W rozwiązaniach klastrowych kolor punktu danych jest oparty na dowolnym numerze klastra. Wszystkie części przepływu pracy mogą być realizowane w jednopanelowym graficznym interfejsie użytkownika (<silna klasa="xfig">Rysunek 2 i Tabela 1)". Na koniec zademonstrujemy zastosowanie ExCYT na wcześniej opublikowanych danych badających krajobraz immunologiczny raka nerkowokomórkowego w literaturze, również analizowanych podobnymi metodami. Przykładowy zestaw danych, którego użyliśmy do stworzenia rysunków w tym manuskrypcie wraz z poniższym protokołem, można znaleźć pod adresem https://premium.cytobank.org/cytobank/projects/875, po zarejestrowaniu konta.

<table><tbody><tr><td>Komputer stacjonarny</td><td>SuperMicro</td><td>Custom Build</td><td>Komputer używany do przeprowadzania analiz</td></tr><tr><td>MATLAB</td><td>Mathworks</td><td>N/A</td><td>Oprogramowanie używane do tworzenia ExCYT</td></tr></tbody></table>

excyt: graficzny interfejs użytkownika usprawniający analizę danych z cytometrii wielowymiarowej

ExCYT: A Graphical User Interface for Streamlining Analysis of High-Dimensional Cytometry Data

Wraz z pojawieniem się cytometrów przepływowych zdolnych do pomiaru coraz większej liczby parametrów, naukowcy kontynuują prace nad większymi panelami do fenotypowego badania cech swoich próbek komórkowych. Jednak ten postęp technologiczny daje wielowymiarowe zestawy danych, które stają się coraz trudniejsze do obiektywnej analizy w tradycyjnych programach bramkowania opartych na ręcznych. Aby lepiej analizować i prezentować dane, naukowcy współpracują z bioinformatykami posiadającymi doświadczenie w analizie danych wielowymiarowych w celu przeanalizowania danych cytometrii przepływowej. Chociaż wykazano, że metody te są bardzo cenne w badaniu cytometrii przepływowej, nie zostały one jeszcze włączone do prostego i łatwego w użyciu pakietu dla naukowców, którzy nie mają doświadczenia w obliczeniach lub programowaniu. Aby zaspokoić tę potrzebę, opracowaliśmy ExCYT, graficzny interfejs użytkownika (GUI) oparty na MATLAB, który usprawnia analizę danych z wysokowymiarowej cytometrii przepływowej, wdrażając powszechnie stosowane techniki analityczne dla danych wysokowymiarowych, w tym redukcję wymiarowości za pomocą t-SNE, różne zautomatyzowane i ręczne metody grupowania, mapy cieplne i nowatorskie wysokowymiarowe wykresy przepływu. Dodatkowo, ExCYT zapewnia tradycyjne opcje bramkowania wybranych populacji będących przedmiotem zainteresowania do dalszej analizy t-SNE i grupowania, a także możliwość stosowania bramek bezpośrednio na powierzchniach t-SNE. Dodatkową zaletą oprogramowania jest praca z plikami FCS z kompensacją lub bez niej. W przypadku, gdy wymagana jest kompensacja po nabyciu, użytkownik może zdecydować się na udostępnienie programowi katalogu pojedynczych plam i próbki niebarwionej. Program wykrywa pozytywne zdarzenia we wszystkich kanałach i wykorzystuje te wybrane dane do bardziej obiektywnego obliczenia macierzy wynagrodzeń. Podsumowując, ExCYT zapewnia kompleksowy potok analityczny, który umożliwia pobieranie danych cytometrii przepływowej w postaci plików FCS i umożliwia każdej osobie, niezależnie od szkolenia obliczeniowego, korzystanie z najnowszych podejść algorytmicznych w zrozumieniu swoich danych.

W celu przetestowania użyteczności ExCYT przeanalizowano wyselekcjonowany zestaw danych opublikowany przez Chevrier et al. pod tytułem „An Immune Atlas of Clear Cell Renal Carcinoma”, w którym grupa badawcza przeprowadziła analizę CyTOF z szerokim panelem immunologicznym na próbkach guzów pobranych od 73 pacjentów11. Do fenotypowej charakterystyki mikrośrodowiska guza wykorzystano dwa oddzielne panele: mieloidalny oraz limfoidalny. Celem naszego badania by...

ExCYT to graficzny interfejs użytkownika (GUI) oparty na MATLAB, który pozwala użytkownikom analizować dane cytometrii przepływowej za pomocą powszechnie stosowanych technik analitycznych dla danych wysokowymiarowych, w tym redukcji wymiarowości za pomocą t-SNE, różnych automatycznych i ręcznych metod grupowania, map cieplnych i nowatorskich wysokowymiarowych wykresów przepływu.

ExCYT: Graficzny interfejs użytkownika usprawniający analizę danych z cytometrii wielowymiarowej

With the advent of flow cytometers capable of measuring an increasing number of parameters, scientists continue to develop larger panels to phenotypically ...

Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie biomedycyny, takie jak zrozumienie fenotypu biologicznie istotnych subpopulacji. Główną zaletą tej techniki jest to, że pozwala osobie bez doświadczenia w programowaniu analizować swoje dane cytometryczne za pomocą najnowszych technik wielowymiarowych. Aby rozpocząć potok analizy, najpierw wybierz typ cytometrii i liczbę zdarzeń do pobrania z pliku.Następnie kliknij pozycję Wypełnienie bramki, wybierz interesujące nas populacje komórek i wprowadź wartość procentową zdarzeń do dalszej analizy. Następnie w polu listy wybierz liczbę kanałów, które mają być używane do analizy. W przypadku t-rozproszonego osadzania sąsiadów lub analizy t-SNE kliknij pozycję t-SNE, aby rozpocząć obliczanie zestawu danych o zmniejszonej wymiarowości.Po obliczeniu zestawu kliknij Zapisz obraz TSNE, a następnie w menu podręcznym t-SNE specyficznym dla znacznika wybierz konkretny znacznik, który Cię interesuje. Pojawi się rysunek przedstawiający reprezentację mapy cieplnej wykresu t-SNE, którą można zapisać w celu wygenerowania figury. Aby rozpocząć analizę grupowania, wybierz opcję z listy Metoda grupowania, a następnie kliknij przycisk Grupowanie.Aby posortować klastry według interesującego Cię znacznika, wybierz odpowiednią opcję z menu podręcznego Sortuj i kliknij opcję Rosnąco, Malejąco, aby zaktualizować listę klastrów w polu listy Klastry. Aby ustawić minimalną wartość progową dla danego klastra w określonym kanale, wybierz opcję z menu kontekstowego Próg i ustaw odpowiedni próg. Po ustawieniu progu kliknij przycisk Dodaj powyżej progu lub Dodaj poniżej progu, aby określić kierunek progu, a następnie wprowadź liczbowe odcięcie w polu Próg częstotliwości klastra w panelu Filtr klastrów, aby ustawić minimalny próg dla częstotliwości klastra.Aby wybrać klastry do dalszej indywidualizacji analizy, wybierz interesujące nas klastry w polu listy Klastry. I użyj przycisku Wybierz, aby przenieść opcje do pola listy Analiza klastrów. Aby utworzyć mapy cieplne klastrów, wybierz interesujące klastry w polu listy Analiza klastrów, a następnie kliknij przycisk Mapa cieplna klastrów.Aby utworzyć wielowymiarowy wykres skrzynkowy lub wielowymiarowy wykres przepływu, zaznacz interesujące nas klastry w polu listy Analiza skupień, a następnie kliknij opcję Wielowymiarowy wykres pudełkowy lub Wielowymiarowy wykres przepływu, aby wizualnie ocenić rozkład danych kanałów różnych klastrów we wszystkich wymiarach. Aby wyświetlić klastry na tradycyjnych wykresach przepływu 2D, wybierz odpowiednią transformację i kanał w panelu Konwencjonalny wykres przepływu, a następnie kliknij opcję Konwencjonalny wykres przepływu. W tym miejscu przedstawiono reprezentatywną analizę t-SNE map cieplnych dla różnych markerów w ramach procesu analizy panelu szpikowego.Korzystając z szybkiej, zachłannej implementacji w ExCYT do grupowania danych ze 100 000 najbliższych sąsiadów, ujawniono 19 subpopulacji komórek. Porównanie oryginalnych map cieplnych z klastrami stworzonymi przez ExCYT pozwoliło na zidentyfikowanie podobnych klastrów komórek szpikowych między dwiema grupami danych. Analiza panelu limfoidalnego z bardziej konwencjonalnym i szybszym podejściem hierarchicznym do grupowania dała podobny rozkład markerów za pomocą map cieplnych t-SNE.Co więcej, grupowanie danych za pomocą hierarchicznego grupowania wykazało podobne skupiska komórek limfoidalnych. Warto zauważyć, że unikalna populacja regulatorowych limfocytów T została również zidentyfikowana za pomocą wielowymiarowego wykresu przepływu. Aby szybko i ilościowo ocenić koasocjacje między markerami, najpierw użyto algorytmu grupowania twardych K-średnich, który narysował 5000 klastrów na dwuwymiarowych danych t-SNE.Następnie wykorzystano medianę wyrażeń wszystkich markerów ze wszystkich gromad, aby stworzyć mapę cieplną z tych gromad, co pozwoliło na łatwą identyfikację koasocjacji, takich jak współasocjacja Tim-3, PD-1, CD38 i 4-1BB. Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać o zapoznaniu się z różnymi parametrami, takimi jak różne metody grupowania, aby w pełni eksplorować badane dane.

excyt-graphical-user-interface-for-streamlining-analysis-high

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Ten film demonstruje test do analizy specyficznych dla antygenu limfocytów T CD8+ na różnych etapach cyklu komórkowego. Znakowane fluorescencyjnie żywe komórki są wybierane za pomocą cytometrii przepływowej, a komórki na różnych etapach cyklu komórkowego są identyfikowane na podstawie zawartości DNA przy użyciu przeciwciał przeciwko białku jądrowemu związanemu z proliferacją komórek i barwienia kwasem nukleinowym.

Test do analizy cyklu komórkowego limfocytów T CD8+ specyficznych dla antygenu

Ten artykuł opisuje pobieranie i przetwarzanie próbek do analizy metodą cytometrii masowej.

Przygotowanie próbki do analizy cytometrii masowej

Analiza cytometryczna przepływu okazała się przydatna do badania czystych kultur i monitorowania dynamiki społeczności mikroorganizmów. Przedstawiamy trzy kompleksowe przepływy pracy, od próbkowania po analizę danych, dla czystych kultur i złożonych społeczności, odpowiednio w przezroczystym podłożu, jak i w trudnych matrycach.

Charakterystyka dynamiki mikrobiomu – przepływy pracy oparte na cytometrii przepływowej od czystych kultur do naturalnych społeczności

Cytofast to narzędzie do wizualizacji używane do analizy wyników z grupowania. Cytofast może być używany do porównywania dwóch metod grupowania: FlowSOM i Cytosplore. Cytofast może szybko wygenerować ilościowy i jakościowy przegląd danych z cytometrii masowej i podkreślić główne różnice między różnymi algorytmami grupowania.

Wizualizacja i kwantyfikacja danych z cytometrii wielowymiarowej przy użyciu Cytofast i metod grupowania FlowSOM i Cytosplore

Prezentowana tutaj jest technika oparta na cytometrii przepływowej, która pozwala na jednoczesny pomiar liczby podziałów komórkowych, fenotypu komórek powierzchniowych i pokrewieństwa komórkowego. Właściwości te można testować statystycznie przy użyciu struktury opartej na permutacjach.

Jednoczesna ocena pokrewieństwa, liczby podziału i fenotypu za pomocą cytometrii przepływowej dla hematopoetycznych komórek macierzystych i progenitorowych

Opisana tutaj jest metoda, która może być użyta do zobrazowania pięciu lub więcej parametrów fluorescencyjnych za pomocą mikroskopii immunofluorescencyjnej. Przedstawiono proces analityczny służący do wyodrębniania pojedynczych komórek z tych obrazów i przeprowadzania analizy pojedynczych komórek za pomocą strategii bramkowania podobnych do cytometrii przepływowej, które mogą identyfikować podzbiory komórek w sekcjach tkanki.

Generowanie i analiza wysokoparametrowych obrazów histologicznych za pomocą cytometrii przepływowej

Ten protokół dostarcza wyczerpujących wytycznych dotyczących konfiguracji i ilościowego monitorowania kokultur, w tym fotoautotroficznych cyjanobakterii wydzielających cukier i drożdży heterotroficznych.

Składanie i kwantyfikacja kokultur łączących drożdże heterotroficzne z fototroficznymi cyjanobakteriami wydzielającymi cukier

Dokładna analiza danych z mikroskopii wielowymiarowej wymaga złożonych procesów pracy. Ten artykuł pokazuje, jak korzystać z oprogramowania Cell-ACDC. Wykorzystuje nowoczesne modele oparte na AI do segmentacji, śledzenia, analizy genetyki komórek oraz ilościowej analizy danych mikroskopowych. Co istotne, uzupełnia te modele innowacyjnym ramowym systemem półautomatycznej korekty wyników modeli.

Analiza danych z mikroskopii wielowymiarowej z wykorzystaniem Cell-ACDC

Analityka wizualna (VA) to nowe podejście do interaktywnej analizy danych. W tym filmie omawiamy problem nadmiaru danych wynikający z wysokoprzepustowych eksperymentów biologicznych i proponujemy VA jako rozwiązanie tego problemu. Film demonstruje analizę w obrębie oraz pomiędzy zestawami danych immunologicznych przy użyciu narzędzia VA o nazwie Tableau.

Ułatwianie analizy danych immunologicznych za pomocą technik analizy wizualnej

Niniejszy artykuł przedstawia metodę opartą na cytometrii przepływowej do badania składu immunologicznego aorty. W pracy zaprezentowano również dodatkową technikę, która umożliwia oddzielne badanie otaczającej osłonki zewnętrznej oraz ściany naczynia. Metoda ta otwiera możliwości przeprowadzania analiz fenotypowych leukocytów aortalnych oraz zastosowania wielu testów immunologicznych w badaniach nad miażdżycą.

Analiza cytometryczna komórek odpornościowych w aortach mysich

Poznaj analizę danych cytometrycznych z ExCYT, graficznym interfejsem MATLAB umożliwiającym redukcję wymiarowości, klasteryzację i wizualizację populacji komórkowych bez umiejętności programowania.

ExCYT: Graficzny interfejs użytkownika usprawniający analizę danych z cytometrii wielowymiarowej

Przeglądaj więcej filmów