ExCYT: Graficzny interfejs użytkownika usprawniający analizę danych z cytometrii wielowymiarowej

Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie biomedycyny, takie jak zrozumienie fenotypu biologicznie istotnych subpopulacji. Główną zaletą tej techniki jest to, że pozwala osobie bez doświadczenia w programowaniu analizować swoje dane cytometryczne za pomocą najnowszych technik wielowymiarowych. Aby rozpocząć potok analizy, najpierw wybierz typ cytometrii i liczbę zdarzeń do pobrania z pliku.

Następnie kliknij pozycję Wypełnienie bramki, wybierz interesujące nas populacje komórek i wprowadź wartość procentową zdarzeń do dalszej analizy. Następnie w polu listy wybierz liczbę kanałów, które mają być używane do analizy. W przypadku t-rozproszonego osadzania sąsiadów lub analizy t-SNE kliknij pozycję t-SNE, aby rozpocząć obliczanie zestawu danych o zmniejszonej wymiarowości.

Po obliczeniu zestawu kliknij Zapisz obraz TSNE, a następnie w menu podręcznym t-SNE specyficznym dla znacznika wybierz konkretny znacznik, który Cię interesuje. Pojawi się rysunek przedstawiający reprezentację mapy cieplnej wykresu t-SNE, którą można zapisać w celu wygenerowania figury. Aby rozpocząć analizę grupowania, wybierz opcję z listy Metoda grupowania, a następnie kliknij przycisk Grupowanie.

Aby posortować klastry według interesującego Cię znacznika, wybierz odpowiednią opcję z menu podręcznego Sortuj i kliknij opcję Rosnąco, Malejąco, aby zaktualizować listę klastrów w polu listy Klastry. Aby ustawić minimalną wartość progową dla danego klastra w określonym kanale, wybierz opcję z menu kontekstowego Próg i ustaw odpowiedni próg. Po ustawieniu progu kliknij przycisk Dodaj powyżej progu lub Dodaj poniżej progu, aby określić kierunek progu, a następnie wprowadź liczbowe odcięcie w polu Próg częstotliwości klastra w panelu Filtr klastrów, aby ustawić minimalny próg dla częstotliwości klastra.

Aby wybrać klastry do dalszej indywidualizacji analizy, wybierz interesujące nas klastry w polu listy Klastry. I użyj przycisku Wybierz, aby przenieść opcje do pola listy Analiza klastrów. Aby utworzyć mapy cieplne klastrów, wybierz interesujące klastry w polu listy Analiza klastrów, a następnie kliknij przycisk Mapa cieplna klastrów.

Aby utworzyć wielowymiarowy wykres skrzynkowy lub wielowymiarowy wykres przepływu, zaznacz interesujące nas klastry w polu listy Analiza skupień, a następnie kliknij opcję Wielowymiarowy wykres pudełkowy lub Wielowymiarowy wykres przepływu, aby wizualnie ocenić rozkład danych kanałów różnych klastrów we wszystkich wymiarach. Aby wyświetlić klastry na tradycyjnych wykresach przepływu 2D, wybierz odpowiednią transformację i kanał w panelu Konwencjonalny wykres przepływu, a następnie kliknij opcję Konwencjonalny wykres przepływu. W tym miejscu przedstawiono reprezentatywną analizę t-SNE map cieplnych dla różnych markerów w ramach procesu analizy panelu szpikowego.

Korzystając z szybkiej, zachłannej implementacji w ExCYT do grupowania danych ze 100 000 najbliższych sąsiadów, ujawniono 19 subpopulacji komórek. Porównanie oryginalnych map cieplnych z klastrami stworzonymi przez ExCYT pozwoliło na zidentyfikowanie podobnych klastrów komórek szpikowych między dwiema grupami danych. Analiza panelu limfoidalnego z bardziej konwencjonalnym i szybszym podejściem hierarchicznym do grupowania dała podobny rozkład markerów za pomocą map cieplnych t-SNE.

Co więcej, grupowanie danych za pomocą hierarchicznego grupowania wykazało podobne skupiska komórek limfoidalnych. Warto zauważyć, że unikalna populacja regulatorowych limfocytów T została również zidentyfikowana za pomocą wielowymiarowego wykresu przepływu. Aby szybko i ilościowo ocenić koasocjacje między markerami, najpierw użyto algorytmu grupowania twardych K-średnich, który narysował 5000 klastrów na dwuwymiarowych danych t-SNE.

Następnie wykorzystano medianę wyrażeń wszystkich markerów ze wszystkich gromad, aby stworzyć mapę cieplną z tych gromad, co pozwoliło na łatwą identyfikację koasocjacji, takich jak współasocjacja Tim-3, PD-1, CD38 i 4-1BB. Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać o zapoznaniu się z różnymi parametrami, takimi jak różne metody grupowania, aby w pełni eksplorować badane dane.