Wizualizacja i kwantyfikacja danych z cytometrii wielowymiarowej przy użyciu Cytofast i metod grupowania FlowSOM i Cytosplore

Dane generowane przez cytometrię masową są złożone i muszą być wizualizowane w wydajny i prosty sposób. Cytofast to metoda, która uwydatnia wzorce immunologiczne w populacji komórek odpornościowych i określa podzbiory komórek, które są powiązane z leczeniem klinicznym lub grupami eksperymentalnymi. Cytofast może być stosowany po dowolnej metodzie krystalizacji, takiej jak FlowSOM lub Cytosplore.

Pozwoli Ci to odkryć podzbiór komórek, które są powiązane z leczeniem klinicznym lub grupą eksperymentalną. Dzięki tej metodzie będziesz w stanie na pierwszy rzut oka zobaczyć immunologiczny przegląd danych w sposób ilościowy. Zacznij od utworzenia klastrów za pomocą Cytosplore lub FlowSOM.

Jeśli używasz Cytosplore, prześlij pliki FCS, klikając Pliki i otwórz pliki FCS. Następnie wybierz kofaktor dla transformacji Hyperbolic ArcSinh po wyświetleniu monitu i kliknij dodaj unikalny przykładowy tag jako kanał. Wybierz opcję uruchom HSNE, aby uruchomić poziom HSNE równy trzy i poczekaj na wygenerowanie mapy.

Na pierwszym poziomie HSNE sprawdź komórki, które są dodatnie dla CD161, zaznaczając dodatnie komórki CD161 i klikając prawym przyciskiem myszy powiększenie zaznaczenia. Na drugim poziomie powtórz procedurę, aby osiągnąć trzeci poziom tylko z pozytywnymi zdarzeniami CD161. Po wygenerowaniu ostatniej mapy TSNE zapisz klastry zdefiniowane przez Cytosplore, klikając mapę prawym przyciskiem myszy i wybierając opcję zapisz klastry.

Wybierz katalog plików wyjściowych zgodnie z monitem Cytosplore i zanotuj tę lokalizację, ponieważ będzie ona później używana do ładowania plików FSC do R. Użyj prostej nazwy tylko znaków podczas zmiany nazw plików wyjściowych, co ułatwi identyfikację i dalszą obsługę, a następnie wybierz zapisz. Załaduj pliki do języka R z wyznaczoną funkcją readcytosploreFCS. Aby wyczyścić dane, usuń niektóre parametry, takie jak czas i tło, sprawdzając położenie kolumny związane z jej niepotrzebnymi parametrami i usuwając ją z macierzy.

Następnie zmień kolejność znaczników, tak aby znaczniki pochodzenia były wyświetlane jako pierwsze, a następnie znaczniki funkcjonalne. Połącz plik metadanych z danymi wygenerowanymi z Cytosplore, przesyłając metaplik arkusza kalkulacyjnego zawierający informacje kliniczne. Aby wykonać klastrowanie przez FlowSOM, załaduj nieprzetworzone dane, które zostały wcześniej bramkowane na dodatnich zdarzeniach CD161 w języku R z odczytem.

funkcja flowSet. Wybierz odpowiednie markery biologiczne, wybierając odpowiednie kolumny i przekształcając dane w sposób ArcSinh5. Zastosuj kofaktor liczby pięciu, wybierając cofacter=5 w funkcji.

Grupuj dane za pomocą funkcji FlowSOM i porównaj FlwoSOM i Cytosplore, wybierając grupowanie danych w 10 podzbiorach, takich samych jak dane wyjściowe wcześniej uzyskane przez Cytosplore. Następnie przypisz każdą komórkę do zidentyfikowanego podzbioru i identyfikatora próbki.Załaduj plik metadanych w języku R zawierający przypisanie grupy i połącz go z plikami FCS za pomocą kodu z rękopisu tekstowego. Utwórz listę CF na podstawie ramki danych uzyskanej z FlowSOM.

Następnie zmień kolejność markerów, aby wyglądały podobnie do danych wyjściowych z analizy Cytosplore. Przed utworzeniem map skupień należy wygenerować tabelę zliczania dla każdej próbki przy użyciu funkcji cellCount. Ponieważ niektóre klastry zawierają mniej komórek niż inne, przeskaluj dane na klaster, określając scale=true wewnątrz funkcji, co ułatwia zobaczenie rozproszenia między próbkami.

Wizualizuj dane za pomocą mapy cieplnej, a następnie wizualizuj je za pomocą wykresów pudełkowych, generując liczbę komórek, ale nie skalując danych w celu uzyskania częstotliwości każdego klastra. Na koniec zwizualizuj intensywność wyrażania markerów CD45, CD11c i CD54 poprzez zanotowanie nazw znaczników i uwzględnienie ich w funkcji wykresu MSI. Cytofast uruchamia kilka możliwych wyników, w tym mapę cieplną wszystkich klastrów zidentyfikowanych w analizie i opartych na wyrażeniu znacznika.

Dendrogram na górze reprezentuje hierarchiczne podobieństwo między zidentyfikowanymi klastrami. Na górnym panelu wyświetlana jest kolejna mapa cieplna przedstawiająca względną liczbę odpowiednich podzbiorów w każdej próbce. Tymczasem dendrogram po prawej stronie pokazuje podobieństwo między próbkami w oparciu o częstości podzbiorów, wykazując, że fenotyp komórek NK jest kształtowany przez leczenie PD-L1 trzy dni po wstrzyknięciu.

Połączone mapy cieplne można uzyskać dla FlowSOM, a następnie Cytofast i dla Cytosplore, a następnie Cytofast. Cytofast może być również używany do ilościowego przedstawiania danych i wyświetlania wyników na wykresach pudełkowych. Inną funkcją zawartą w pakiecie Cytofast jest funkcja wykresu MSI, która pokazuje wykres mediany intensywności sygnału dla każdego markera na grupę.

Funkcja ta umożliwia wykrywanie zmian globalnych, takich jak wzrost ekspresji CD54 lub CD11c w komórkach NK z grupy leczonej PD-L1. Technika ta jest szybkim sposobem wizualizacji i ilościowego określania danych i może być wykorzystana do odkrywania nowych odpowiedzi komórkowych po terapii. Po tej metodzie globalny pakiet testowy w języku R może być używany do testowania grupy współzmiennych pod kątem powiązania ze zmiennymi odpowiedzi.

Pokaże to korelację między poszczególnymi podgrupami a wynikiem klinicznym.