Charakterystyka dynamiki mikrobiomu – przepływy pracy oparte na cytometrii przepływowej od czystych kultur do naturalnych społeczności

Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania z zakresu ekologii mikrobiologicznej i biotechnologii, na przykład, jakie koncepcje ekologiczne napędzają dany ekosystem. Główną zaletą tej techniki jest to, że można ją wykorzystać do zamknięcia szybkiej dynamiki mikrobiomu za pomocą reżimu próbkowania w krótkich odstępach czasu, zachowując przy tym wysoką opłacalność. Metoda ta może być wykorzystana do uzyskania informacji o biotechnologicznych i naturalnych zbiorowiskach mikroorganizmów, a także o mikrobiomach zwierząt i ludzi pod kątem stanu odżywienia i zdrowia.

Procedurę zademonstruje Florian Schattenberg, technik i operator SediMeter w naszym laboratorium. Aby wysuszyć próbkę biogazu, użyj zmodyfikowanej jednomililitrowej końcówki pipety, aby przenieść 200 mikrolitrów lepkiego produktu pofermentacyjnego do dwumililitrowej probówki zawierającej 1,7 mililitra PBS. Po dokładnym wymieszaniu umieść probówki w łaźni ultradźwiękowej na jedną minutę, aby rozpuścić wszelkie duże agregaty komórkowe i przymocować komórki przylegające do resztek komórek roślinnych.

Po sonikacji dokładnie wymieszaj próbkę i przefiltruj komórki przez sitko o porach 50 mikrometrów do plastikowej probówki o pojemności 2 mililitrów. Podzielić filtrat na cztery 400-te mikrolitrowe podwielokrotności i odwirować podwielokrotności dwa razy, za każdym razem całkowicie odrzucając supernatant, aby mechanicznie odwodnić próbkę drobnoustroju tak dokładnie, jak to możliwe. Następnie wysuszyć próbkę w podgrzanej wirówce próżniowej, aby uzyskać stabilny osad i przechowywać go w temperaturze czterech stopni Celsjusza, chroniąc przed światłem.

W celu stabilizacji i utrwalenia próbek osadu czynnego należy odwirować cztery mililitry komórek i ponownie zawiesić osad w czterech mililitrach dwuprocentowego formaldehydu w PBS. Po 30 minutach w temperaturze pokojowej odwirować ustabilizowaną próbkę komórek i utrwalić osad w czterech mililitrach 70% etanolu do przechowywania w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza. Wymieszać i przenieść 0,6 mililitra zawiesiny o stałej zawartości komórek do szklanej probówki zawierającej 1,4 mililitra PBS i po dokładnym wymieszaniu poddać sonikacji przez 10 minut, jak pokazano.

Pod koniec sonikacji zebrać komórki przez odwirowanie i ponownie zawiesić osad w dwóch mililitrach świeżego PBS. Po dokładnym wymieszaniu, poddaj komórki sonikacji, jak właśnie pokazano, przez pięć minut i dostosuj OD 700 nanometrów do 035 ze świeżym PBS. Zebrać komórki przez odwirowanie i ponownie zawiesić osad w jednym mililitrze buforu permeabablacyjnego zawierającego 0,11 molowego kwasu cytrynowego i 4,1 milimolowego kwasu 20, z dokładnym wymieszaniem, przez 20 minut inkubacji w temperaturze pokojowej.

Następnie zebrać komórki przez odwirowanie i dokładnie ponownie zawiesić osad w dwóch mililitrach roztworu barwiącego zawierającego 0,68 mikromolowego DAPI, przez co najmniej 60 minut inkubacji w temperaturze pokojowej, chroniąc przed światłem. W celu kalibracji kulek załaduj mieszankę kulek do kalibracji liniowej do cytometru przepływowego i mierz kulki w sposób ciągły, manipulując pozycjami dyszy i optyki laserowej, aby wstępnie skalibrować przyrząd w zakresie liniowym. Gdy szczyty koralików można dopasować do wstępnie ustawionego szablonu kalibracji, przełącz się na tryb logarytmiczny i załaduj próbkę koralika kalibracji logarytmicznej.

Dopasuj logarytmiczne piki koralików do ich wstępnie ustawionego szablonu kalibracji, aby precyzyjnie dostroić sprzęt instrumentu, i użyj ustawienia wzmocnienia lampy fotopowielacza, aby dokonać wszelkich niezbędnych ostatecznych korekt pozycji koralika Najważniejszym aspektem tej procedury jest utrzymanie spójnych pomiarów, aby umożliwić porównywalność między eksperymentami. Dlatego codzienna kalibracja cytometru i stosowanie kulek w biologicznych powiekach brzusznych ma kluczowe znaczenie dla powodzenia powolnej dializy mikrobiomu cytromowego. Gdy komórki są gotowe, wymieszaj i przefiltruj próbki, a następnie dodaj do komórek logarytmiczną mieszankę kulkową

Teraz wymieszaj i załaduj próbkę do cytometru i utwórz bramkę, która obejmie wybarwione komórki i wykluczy szum i koraliki. Następnie analizuj kolejno zestaw próbek z maksymalną prędkością 3 000 zdarzeń na sekundę, aż do wykrycia 250 000 komórek w bramce komórkowej. Aby przeanalizować dane cytometrii przepływowej, należy opracować szablon bramki głównej do wykorzystania na wszystkich próbkach.

Zacznij od załadowania standardowych plików cytometrii przepływowej do odpowiedniego programu do analizy cytometrii przepływowej i kolejno przetwarzaj próbki. Załaduj próbki, kliknij dwukrotnie pomiar i wybierz parametry osi X i Y z odpowiednich menu rozwijanych, aby otworzyć wykres rozproszenia do przodu w porównaniu z fluorescencją DAPI. Użyj narzędzia do rysowania wielokątów, aby odtworzyć poprzednio wygenerowaną bramkę komórki pomiarowej, aby wykluczyć ściegi i szum, a następnie odpowiednio nazwij bramkę.

Przeciągnij wpis bramki komórki na listę wszystkich grup próbek i kliknij dwukrotnie bramkę komórki, aby selektywnie wyświetlić tylko zdarzenia komórki. Zdefiniuj podspołeczności występujące w próbce za pomocą narzędzia bramki eliptycznej i połącz je. Następnie dodaj dodatkowe alokacje podspołeczności i kolejne próbki, aż szablon bramki głównej będzie pasował do wszystkich próbek.

Kontroluj szablon bramki głównej za pomocą metody bocznego skanowania punktowego, aby rozwiązać problem grupowania podspołeczności blisko siebie. Następnie dodaj wszystkie społeczności podrzędne do edytora tabel i ustaw statystykę wyjściową na częstotliwość rodzica. Użyj edytora tabel, aby wyeksportować względną liczebność podspołeczności do odpowiedniego arkusza kalkulacyjnego i dostosuj formatowanie danych zgodnie ze wskazówkami zawartymi w instrukcji paska bocznego.

Następnie, aby zwizualizować dynamikę i korelacje podspołeczności, zainstaluj i załaduj pakiet języka R, a następnie załaduj i znormalizuj plik txt. Wykresy rozproszenia do przodu w porównaniu z fluorescencją DAPI ujawniają stany cyklu komórkowego kultur czystych szczepów w różnych punktach hodowli wsadowej. Użycie matrycy bramki głównej umożliwia następnie ilościowe określenie proporcji komórek z jednym, dwoma lub wieloma chromosomami, ujawniając na przykład zdolność tego reprezentatywnego drobnoustroju do replikacji swoich chromosomów szybciej niż czas generacji.

Badając złożone zbiorowiska drobnoustrojów w czasie, tempo i znaczenie zmian w społecznościach można łatwo zwizualizować za pomocą sekwencji wykresu kropkowego. Dominujące podspołeczności na różnych etapach eksperymentu można jednoznacznie zidentyfikować za pomocą narzędzia do cytometrycznego kodu kreskowego. Połączenie tych danych z rozkładem częstości względnej liczebności podspołeczności pozwala na wybór bramek wykazujących znaczące zmiany liczebności w kluczowych punktach czasowych.

Wizualizacja tych danych na niemetrycznym wielowymiarowym wykresie skalowania może ułatwić głębsze zrozumienie dynamiki społeczności. Społeczności biogazowe mogą potencjalnie stanąć w obliczu niejednorodności przestrzennej ze względu na ograniczenia w mieszaniu. Przykładowe punkty próbkowania społeczności biogazowej wykazują niewielką niejednorodność przestrzenną, ale wyraźną w czasie.

Silne dodatnie lub negatywne korelacje z parametrami abiotycznymi, takimi jak zaciski produktu, mogą pomóc w zrozumieniu i optymalizacji ekosystemów i procesów biotechnologicznych. Ponadto ułatwiają one identyfikację bramek o szczególnym znaczeniu w celu późniejszego sortowania i analizy. Ustalając tę procedurę, zaleca się ocenę różnych procedur utrwalania i barwienia w celu oceny ich wydajności i stabilności dla każdego nowego zestawu próbek.

Po sortowaniu można zastosować dalsze podejścia, takie jak ogrodzenie amplikoniczne, metagenomika i proteomika, aby wybrać najlepsze społeczności, które dostarczają informacji na temat przynależności genetycznej proto do stanów aktywności poza szlakami metabolicznymi. Metoda ta utorowała drogę ekologom mikrobiologicznym i inżynierom bioprocesów do śledzenia dynamiki mikrobiomu, naturalnych i kontrolowanych ekosystemów przy rozsądnych inwestycjach zasobów.